INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA
TROPICAL E SUBTROPICAL
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE GENÓTIPOS DE CANA-DEAÇÚCAR AO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO NO SISTEMA
RADICULAR
KARINA IOLANDA SILVA
Orientador: Rafael Vasconcelos Ribeiro
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre
em Agricultura Tropical e Subtropical,
Área de Concentração em Tecnologia da
Produção Agrícola
Campinas, SP
Abril 2014
.
Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e Documentação do
Instituto Agronômico
S586r Silva, Karina Iolanda
Respostas fisiológicas de genótipos de cana-de-açúcar ao peróxido
de hidrogênio no sistema radicular / Karina Iolanda Silva.
Campinas, 2014. 47 fls
Orientador: Rafael Vasconcelos Ribeiro
Dissertação (Mestrado) Agricultura Tropical e Subtropical – Instituto
Agronômico
1. Cana-de-açúcar – variação genótipa 2. Fotossíntese - déficit
Hídrico 3. Metabolismo antioxidante I. Ribeiro, Rafael Vasconcelos
II. Título
CDD. 633.61
-IAC
--
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA
DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO AGRONÔMICO
Pós-Graduação
Av. Barão de Itapura 1481 Caixa Postal 28
13001-970 Campinas, SP - Brasil
(19) 2137-0601
[email protected]
INSTITUTO AGRONÔMICO
Curso de Pós-Graduação
Agricultura
Tropical e Subtropical
Certificado
Título: Respostas
fisiológicas
de genótipos
de Aprovação
de cana-de-açúcar
ao peróxido
de hidrogênio
no sistema
radicular
Aluna: Karina lolanda Silva
Área de Concentração:
Tecnologia da Produção Agrícola
Processo SAA n'': 2.858/2012
Orientador: Dr. Rafael Vasconcelos
Ribeiro
Aprovado pela Banca Examinadora:
Campinas, 28 de abril de 2014
Visto:
~
~ana Parada D,las da Silv~lra
Coordenadora pos-Graduaçao
Instituto Agronomlco
I
À minha mãe Miriam
E às minhas irmãs Kelly e Kátia,
DEDICO
Aos meus avós Francisco e Iolanda
OFEREÇO
iii
AGRADECIMENTOS
- A Deus pelo amparo e por sempre mostrar a direção a seguir.
- Ao Dr. Rafael Vasconcelos Ribeiro pela orientação, amizade, oportunidade, ensinamentos e
conselhos valiosos desde a graduação;
- Ao Dr. Eduardo Caruso Machado pelas conversas, sugestões e auxílio.
- À Dra. Ana Maria M.A. Lagôa pelas sugestões na pré-banca e na banca examinadora.
- Ao Prof. Ricardo Ferraz de Oliveira pela participação da banca examinadora.
- À minha família pelo apoio e carinho.
- Ao Fabrício pelo amor, paciência e auxílio em todos os momentos.
- Aos colegas da fisiologia vegetal Daniela, José Rodrigues, Fernanda, Guilherme, Lílian e
Érick pela ótima convivência, em especial Cristina, Paulo e Neidiquele pelo auxílio na
experimentação em campo e laboratório.
- Aos colegas da PG/IAC Juliana, Augusto, André e Natália pelo companheirismo.
- Ao técnico de apoio Severino Nogueira pelas boas ideias na montagem e condução dos
experimentos.
- Aos professores da PG/IAC, pelos ensinamentos transmitidos.
- À Pós-Graduação e ao Instituto Agronômico pela oportunidade.
- À Capes e à Fapesp pelo suporte financeiro.
- A todos que de uma forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho.
iv
“Quanto mais aumenta nosso conhecimento, mais evidente fica nossa ignorância.”
(John F. Kennedy)
v
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIAÇÕES.............................................................................................
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................
RESUMO...........................................................................................................................
ABSTRACT.......................................................................................................................
1 INTRODUÇÃO..............................................................................................................
2 REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................................
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................
3.1 Material vegetal...........................................................................................................
3.2 Condições experimentais.............................................................................................
3.2.1 Preparo da solução nutritiva.....................................................................................
3.2.2 Condições ambientais...............................................................................................
3.2.3 Tratamento com peróxido de hidrogênio..................................................................
3.3. Quantificação de peróxido de hidrogênio (H2O2) na solução nutritiva e em
material vegetal..........................................................................................................
3.4 Avaliações fisiológicas................................................................................................
3.4.1 Extrato enzimático e atividade de enzimas do sistema antioxidante........................
3.4.2 Proteínas solúveis totais............................................................................................
3.4.3 Peroxidação lipídica..................................................................................................
3.4.4 Condutância hidráulica das raízes.............................................................................
3.4.5 Trocas gasosas e atividade fotoquímica....................................................................
3.4 Delineamento experimental e análises estatísticas......................................................
4 RESULTADOS..............................................................................................................
4.1 Superóxido dismutase (SOD)......................................................................................
4.2 Peróxido de hidrogênio (H2O2)....................................................................................
4.3 Catalase (CAT)............................................................................................................
4.4 Ascorbato peroxidase (APX).......................................................................................
4.5 Proteínas solúveis totais...............................................................................................
4.6 Peroxidação lipídica.....................................................................................................
4.7 Condutância hidráulica das raízes................................................................................
4.8 Trocas gasosas.............................................................................................................
4.9 Atividade fotoquímica.................................................................................................
5 DISCUSSÃO..................................................................................................................
6 CONCLUSÃO................................................................................................................
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................
vii
viii
ix
xii
xiii
1
3
14
14
14
14
15
15
16
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18
19
19
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21
21
21
22
23
23
25
25
26
27
30
38
39
vi
LISTA DE ABREVIAÇÕES
A
Assimilação de CO2
A/CI
Eficiência instantânea de carboxilação
A/gs
Eficiência intrínseca do uso da água
APX
Ascorbato peroxidase
CAT
Catalase
CI
Concentração intercelular de CO2
CTE
Cadeia transportadora de elétrons
ERO
Espécie reativa de oxigênio
ETR
Transporte aparente de elétrons
FSI
Fotossistema I
FSII
Fotossistema II
FV/FM
Eficiência quântica potencial do fotossistema II
gs
Condutância estomática
Lp
Condutância hidráulica das raízes
MDA
Aldeído malônico
Q
Radiação fotossinteticamente ativa
SOD
Superóxido dismutase
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Eficiência quântica potencial do fotossistema II (FV/FM) na folha +1 em
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 e IACSP94-2094 em função
da concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15
minutos de aplicação de H2O2. Cada valor representa a média de três
repetições ± desvio padrão. Letras minúsculas iguais indicam que não
houve diferença estatística entre os tratamentos, enquanto letras maiúsculas
iguais indicam que não houve diferença estatística entre os genótipos
(Tukey, p<0,05)............................................................................................... 28
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Produção de H2O2 pela enzima superóxido dismutase (SOD) por
dismutação do ânion superóxido, e ação desintoxicante das enzimas
catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX), convertendo H 2O2 a
H2O................................................................................................................ 09
Figura 2
Procedimento para avaliação da condutância hidráulica das raízes (Lp)...... 19
Figura 3
Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) nas folhas (a) e nas
raízes (b) em genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e
IACSP94-2094 (○) em função da concentração de H2O2 na solução
nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação de H 2O2. Cada
símbolo representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras
minúsculas distintas indicam diferença estatística entre as concentrações
de H2O2, enquanto os asteriscos indicam diferença estatística entre os
genótipos (Tukey, p<0,05)............................................................................ 21
Figura 4
Concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) nas folhas (a) e nas raízes
(b) de genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094
(○) em função da concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas
realizadas após 15 minutos de aplicação de H2O2. Cada símbolo
representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras minúsculas
distintas indicam diferença estatística entre os tratamentos, enquanto os
asteriscos indicam diferença estatística entre os genótipos (Tukey,
p<0,05).......................................................................................................... 22
Figura 5
Atividade da enzima catalase (CAT) nas folhas (a) e nas raízes (b) de
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em
função da concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas
após 15 minutos de aplicação de H2O2. Cada símbolo representa a média
de três repetições ± desvio padrão. Letras minúsculas distintas indicam
diferença estatística entre os tratamentos, enquanto asteriscos indicam
diferença estatística entre os genótipos (Tukey, p<0,05).............................. 23
Figura 6
Atividade da enzima ascorbato peroxidase (APX) nas folhas (a) e nas
raízes (b) de genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP942094 (○) em função da concentração de H2O2 na solução nutritiva.
Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação de H2O2. Cada símbolo
representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras minúsculas
distintas indicam diferença estatística entre os tratamentos, enquanto
asteriscos indicam diferença estatística entre os genótipos (Tukey,
p<0,05)......................................................................................................... 24
Figura 7
Concentração de proteínas solúveis totais nas folhas (a) e nas raízes (b) de
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em
função da concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas
após 15 minutos de aplicação de H2O2. Cada símbolo representa a média
ix
Figura 8
de três repetições ± desvio padrão. Letras minúsculas iguais indicam que
não houve diferença estatística entre os tratamentos (p>0,05)..................... 24
Concentração de aldeído malônico (MDA) nas folhas (a) e nas raízes (b)
de genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○)
em função da concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas
realizadas após 15 minutos de aplicação de H2O2. Cada símbolo
representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras minúsculas
distintas indicam diferença estatística entre os tratamentos, enquanto
asteriscos indicam diferença estatística entre os genótipos (Tukey,
p<0,05).......................................................................................................... 25
Figura 9
Condutância hidráulica das raízes (Lp) em genótipos de cana-de-açúcar
IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da concentração de
H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de
aplicação de H2O2. Cada ponto representa a média de três repetições ±
desvio padrão. A interação genótipo vs. H2O2 não foi significativa e as
letras comparam as doses de H2O2 considerando as médias compostas
pelos dois genótipos. Asteriscos indicam diferença estatística entre os
genótipos (Tukey, p<0,05)............................................................................ 26
Figura 10
Assimilação de CO2 (A, em a) e condutância estomática (gs, em b) na
folha +1 de genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP942094 (○) em função da concentração de H2O2 na solução nutritiva.
Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação de H2O2. Cada símbolo
representa a média de três repetições ± desvio padrão. Em (a), a interação
genótipo vs. H2O2 não foi significativa e as letras comparam as doses de
H2O2 considerando as médias compostas pelos dois genótipos. Em (b),
letras minúsculas distintas indicam diferença estatística entre os
tratamentos, enquanto asteriscos indicam diferença estatística entre os
genótipos (Tukey, p<0,05)............................................................................ 27
Figura 11
Eficiência instantânea de carboxilação (A/CI, em a) e eficiência intrínseca
do uso da água (A/gs, em b) na folha +1 de genótipos de cana-de-açúcar
IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da concentração de
H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de
aplicação de H2O2. Cada símbolo representa a média de três repetições ±
desvio padrão. A interação genótipo vs. H2O2 não foi significativa e as
letras comparam as doses de H2O2 considerando as médias compostas
pelos dois genótipos. Asteriscos indicam diferença estatística entre os
genótipos (Tukey, p<0,05)............................................................................ 28
Figura 12
Transporte aparente de elétrons (ETR) na folha +1 de genótipos de canade-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da
concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15
minutos de aplicação de H2O2. Cada símbolo representa a média de três
repetições ± desvio padrão. A interação genótipo vs. H2O2 não foi
significativa e as letras comparam as doses de H2O2 considerando as
médias compostas pelos dois genótipos. Asterisco indica diferença
estatística entre os genótipos (Tukey, p<0,05).............................................. 29
x
Figura 13
Reação do sistema antioxidante, trocas gasosas e relações hídricas nas
folhas e nas raízes de genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094
(tolerante ao déficit hídrico) e IACSP94-2101 (sensível ao déficit hídrico)
ao aumento da concentração de H2O2 na solução nutritiva para 3 mmol L1
. SOD: superóxido dismutase; APX: ascorbato peroxidase; CAT:
catalase; MDA: aldeído malônico; Prot: proteínas s. totais; O2-·: ânion
superóxido; H2O2: peróxido de hidrogênio; H2O: água; Lp: condutância
hidráulica das raízes; gs: condutância estomática; A: assimilação de CO2,
A/CI: eficiência instantânea de carboxilação e A/gs: eficiência intrínseca
do uso da água. A cor vermelha indica aumento da atividade/teor; a cor
verde indica manutenção da atividade/teor, a cor azul indica redução da
atividade/teor..............................................................................................
33
Figura 14
Reação do sistema antioxidante, trocas gasosas e relações hídricas nas
folhas e nas raízes de genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094
(tolerante ao déficit hídrico) e IACSP94-2101 (sensível ao déficit hídrico)
ao aumento da concentração de H2O2 na solução nutritiva para 80 mmol
L-1. SOD: superóxido dismutase; APX: ascorbato peroxidase; CAT:
catalase; MDA: aldeído malônico; Prot: proteínas s. totais; O2-·: ânion
superóxido; H2O2: peróxido de hidrogênio; H2O: água; Lp: condutância
hidráulica das raízes; gs: condutância estomática; A: assimilação de CO2,
A/CI: eficiência instantânea de carboxilação e A/gs: eficiência intrínseca
do uso da água. A cor vermelha indica aumento da atividade/teor; a cor
verde indica manutenção da atividade/teor, a cor azul indica redução da
atividade/teor............................................................................................
36
xi
Respostas fisiológicas de genótipos de cana-de-açúcar ao peróxido de hidrogênio no
sistema radicular
RESUMO
A diminuição ou interrupção do fornecimento de água à planta induz o déficit hídrico
afetando diretamente a produtividade da cana-de-açúcar. Nessas condições há geração de
espécies reativas de oxigênio, como H2O2. O objetivo deste trabalho foi testar a hipótese de
que há variação genotípica de cana-de-açúcar em resposta ao H2O2 no meio radicular e que o
genótipo tolerante é capaz de restringir o dano oxidativo, manter o transporte de água para a
parte aérea, reduzindo os efeitos negativos do déficit hídrico na fotossíntese. Os genótipos
IACSP94-2094 (tolerante ao déficit hídrico) e IACSP94-2101 (sensível ao déficit hídrico)
foram crescidos em câmara de crescimento e avaliados em três condições quanto à
disponibilidade de H2O2 em solução nutritiva: controle; 3 mmol L -1 e 80 mmol L-1. Avaliouse as trocas gasosas, a atividade fotoquímica, a condutância hidráulica das raízes e o
metabolismo antioxidante nas raízes e nas folhas após 15 minutos da indução dos tratamentos.
Embora a presença de H2O2 na solução nutritiva tenha reduzido a condutância hidráulica das
raízes, a abertura estomática, o transporte aparente de elétrons e a eficiência instantânea de
carboxilação em ambos os genótipos, IACSP94-2094 apresentou maiores valores dessas
variáveis se comparado a IACSP94-2101. Há variação genotípica em relação à resposta
fisiológica da cana-de-açúcar ao aumento da concentração de H2O2 no sistema radicular,
sendo as alterações observadas nas raízes associadas a modificações na fisiologia da parte
aérea das plantas. O genótipo IACSP94-2094 apresenta o sistema antioxidante radicular mais
efetivo frente ao aumento do H2O2 no meio radicular, independente da concentração de H2O2.
Em baixas concentrações de H2O2, IACSP94-2094 tem o transporte de água e as trocas
gasosas menos afetados quando comparado ao genótipo IACSP94-2101. Essa menor
sensibilidade de IACSP94-2094 em altas concentrações de H2O2 está associada ao aumento
nas atividades da superóxido dismutase nas raízes e nas folhas e catalase nas raízes.
Palavras-chave: condutância hidráulica de raízes, déficit hídrico, fotossíntese, metabolismo
antioxidante, Saccharum spp.
xii
Physiological responses of sugarcane genotypes to hydrogen peroxide in roots
ABSTRACT
Low water supply causes water deficit and affects sugarcane yield. Under such conditions, the
production of reactive oxygen species is enhanced, being H 2O2 one of them. The aim of this
study was to test the hypothesis that sugarcane genotypes respond differently to H 2O2 in root
medium, being the tolerant genotype able to limit the oxidative damage and maintain the
water transport from roots to shoots, reducing the negative effects of water deficit on
photosynthesis. The sugarcane genotypes IACSP94-2094 (drought tolerant) and IACSP942101 (drought sensitive) were grown under growth chamber and evaluated in three conditions
in relation to the H2O2 availability in nutrient solution: control; 3 mmol L-1 and 80 mmol L-1.
Leaf gas exchange, photochemical activity, root hydraulic conductance and antioxidant
metabolism in both roots and leaves were evaluated after 15 minutes of H 2O2 supplying.
Although the H2O2 presence in nutrient solution has reduced the root hydraulic conductance,
stomatal aperture, apparent electron transport rate and instantaneous carboxylation efficiency
in both genotypes, IACSP94-2094 presented higher values of those variables as compared to
IACSP94-2101. There is a significant genotypic variation in relation to the physiological
responses of sugarcane to increasing H2O2 in root tissues, being root changes associated to
modifications in plant shoots. The genotype IACSP94-2094 presents a root antioxidant
system more effective when H2O2 increases in root medium, regardless H2O2 concentration.
Under low H2O2 concentration, the water transport and leaf gas exchange of IACSP94-2094
were less affected as compared to IACSP94-2101. This lower sensitivity of IACSP94-2094
under high H2O2 concentration was associated to increases in superoxide dismutase activity in
roots and leaves and increases in catalase activity in roots.
Keywords: antioxidant metabolism, photosynthesis, root hydraulic conductance, Saccharum
spp., water deficit.
xiii
1 INTRODUÇÃO
A produção da cana-de-açúcar tem aumentado em todo o país e nos próximos anos
serão necessários grandes investimentos financeiros para atender a crescente demanda interna
brasileira de açúcar e etanol (AGRIANUAL, 2013; MAPA, 2014). O Brasil possui
disponibilidade de terras cultiváveis para o plantio da cana-de-açúcar, tecnologia de produção
e a estrutura de distribuição de seus produtos. Porém, no intuito de aumentar as áreas de
plantio, a produção desta cultura está sendo expandida para áreas com clima menos favorável.
Assim, se faz necessária a busca por novos modelos de utilização dos recursos hídricos,
principalmente em locais que apresentem grandes períodos de estiagem (CONAB, 2012;
MAPA, 2014).
A falta de água é um dos principais fatores que prejudicam o pleno desenvolvimento
das culturas. As primeiras respostas das plantas à diminuição do fornecimento de água é a
indução do fechamento estomático e a diminuição da pressão de turgor foliar (TAIZ &
ZEIGER, 2009). Posteriormente, as plantas apresentarão outras alterações morfofisiológicas,
como diminuição da expansão foliar e indução do alongamento de raízes, além da abscisão
foliar. Pode-se considerar que estas alterações mantem o status hídrico das plantas e reduzem
o impacto do déficit hídrico na produção de biomassa (SMIT & SINGELS, 2006). Do ponto
de vista fisiológico, a deficiência hídrica ocasiona diminuição da fotossíntese e reduz a
produção de fotoassimilados. Quando há alteração no balanço redox celular ocasionado pelo
excesso de energia, moléculas tóxicas são produzidas a partir de reações entre o oxigênio
atmosférico e intermediários reduzidos, formando as espécies reativas de oxigênio (EROs),
como o peróxido de hidrogênio (H2O2). As EROs têm sua produção principal nas
mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos e podem induzir, em casos mais severos, a
degradação de proteínas, a peroxidação lipídica bem como danos e alterações no material
genético, afetando componentes chave do metabolismo. Para combater os efeitos deletérios
destes compostos reativos, o sistema antioxidante das plantas é ativado por meio de reações
mediadas por enzimas (BIENERT et al., 2007; GILL & TUTEJA, 2010; ISHIBASHI et al.,
2011).
Em condição de baixa disponibilidade hídrica, o cultivo de genótipos que apresentam
menor inibição da fotossíntese e menor redução do acúmulo de biomassa é uma possível
alternativa para garantir a produtividade em ambientes restritivos (SINCLAIR et al., 2008).
1
Como a deficiência ocorre no solo, as raízes das plantas são os primeiros órgãos afetados e
espera-se que a produção de EROs seja aumentada. Nesse contexto, o metabolismo
antioxidante nas raízes deve ser capaz de metabolizar as EROs, impedindo maiores danos às
trocas gasosas e à produção dos fotoassimilados. Portanto, genótipos tolerantes ao déficit
hídrico devem apresentar uma rápida resposta do sistema antioxidante nas raízes, preservando
o aparato fotossintético. Além dos efeitos diretos das EROs no metabolismo fotossintético,
sabe-se que o H2O2 é um inibidor da atividade das aquaporinas, afetando também o transporte
de água na planta e, consequentemente, o aparato estomático (CHEESEMAN, 2007; QUAN
et al., 2008; SALES et al., 2013).
O presente trabalho tem por objetivo testar a hipótese de que existe variação
genotípica em cana-de-açúcar em resposta ao aumento da concentração de peróxido de
hidrogênio (H2O2) no sistema radicular. Assim, o genótipo tolerante ao déficit hídrico
apresentaria uma resposta do sistema antioxidante radicular mais efetiva frente ao aumento do
H2O2 no meio radicular, reduzindo o impacto negativo dessa ERO no metabolismo das
plantas. Essas apresentariam maior condutância hidráulica das raízes, maior abertura
estomática e fotossíntese se comparadas a plantas de um genótipo sensível ao déficit hídrico.
2
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A cultura da cana-de-açúcar: variações genotípicas frente ao déficit hídrico
O Brasil é o maior produtor da cana-de-açúcar e seu cultivo encontra-se em todas as
regiões do país, destacando-se os estados de Rio de Janeiro, Minas Gerais, Pernambuco,
Alagoas, Paraíba e São Paulo, sendo esse último responsável por mais de 50% de toda a
produção brasileira. A cultura tem sua grande importância na indústria de açúcar e álcool,
anidro e hidratado (LUCCHESI, 2008; IBGE, 2011; CONAB, 2012; MAPA, 2014). A
expansão da produção vem ocorrendo em áreas da região sul, sudeste, centro-oeste e nordeste
do país. Porém, a produtividade das últimas safras tem sido afetada pela má distribuição das
chuvas (AGRIANUAL, 2013). Problemas ocasionados pela estiagem são frequentes em todos
os Estados produtores do Norte e do Nordeste e em regiões do estado de São Paulo, fazendose necessário o uso de técnicas de irrigação, que aumentam o custo da produção (LUCCHESI,
2008; CONAB, 2012; IBGE, 2012).
O cultivo da cultura da cana-de-açúcar é realizado pelo plantio de segmentos do
colmo. Nos 30 primeiros dias de desenvolvimento originam-se as raízes de fixação e a planta
é mantida pelas reservas do colmo e pelos nutrientes e água absorvidos pelas raízes. Após
dois a três meses de plantio o sistema radicular já está desenvolvido e a sua profundidade
varia conforme o genótipo e as condições do local como umidade, temperatura e nutrição do
solo (LUCCHESI, 2008). Plantas ao serem submetidas ao déficit hídrico apresentam
alterações importantes, iniciando com a diminuição do volume celular, aumento na
concentração do protoplasto e sua progressiva desidratação. A primeira e mais sensível reação
ao déficit hídrico é a diminuição da turgescência (LARCHER, 2004). Medidas
osmorregulatórias são iniciadas para auxiliar na manutenção do volume celular e assim
garantir a abertura estomática e a assimilação de CO2. As células produzem nos vacúolos
compostos osmorreguladores que não interferem nas funções enzimáticas e promovem o
ajuste osmótico, garantindo a integridade da membrana, de proteínas e enzimas. A integridade
da membrana e a funcionalidade da célula em geral só pode ser preservada ou recuperada
dependendo do grau de degradação das membranas e de sua capacidade de reparo
(LARCHER, 2004; DESIKAN, 2004; GUIMARÃES et al., 2008; CARLIN & SANTOS,
2009). O ajuste osmótico se desenvolve de forma lenta, possibilitando maior retirada da água
firmemente retida no solo.
3
A expansão foliar e o alongamento de raízes são mais sensíveis ao déficit hídrico por
serem dependentes do turgor celular, que é afetado no início do estresse (BRAY et al., 2000;
TAIZ & ZEIGER, 2009). A diminuição da área foliar exposta à radiação solar é uma resposta
precoce ao déficit hídrico, reduzindo a transpiração e garantindo o suprimento de água por
períodos mais longos (PIMENTEL, 2004; ZHAO, 2013). Em eventos de déficit hídrico mais
prolongado, a abscisão foliar ocorre pelo aumento da síntese de ácido abscísico e do hormônio
etileno. Aumento no crescimento das raízes é possível pela economia de energia e de carbono
através da inibição da expansão foliar. Em solos com baixa umidade, os ápices das raízes
perdem turgor induzindo crescimento preferencial das raízes em direção às áreas do solo
ainda úmidas (BRAY et al., 2000; TAIZ & ZEIGER, 2009).
Em cana-de-açúcar sob déficit hídrico, o primeiro órgão a detectar a falta de água é o
sistema radicular (CRUZ DE CARVALHO, 2008; HEINEN et al., 2009) e quando essa
condição alcança a parte aérea promove decréscimo da condutância estomática (gs), causando
diminuição da transpiração e da assimilação de CO2. O fechamento estomático é uma das
primeiras estratégias para evitar a desidratação (MACHADO et al., 2009) e afeta a
fotossíntese devido à redução do substrato CO2. A interrupção da entrada de CO2 no mesofilo
causa menor carboxilação e assim menor consumo dos produtos da atividade fotoquímica,
NADPH e ATP. Cria-se então uma situação de excesso de pressão energética no aparato
fotoquímico que pode levar à fotoinibição e diminuição da eficiência quântica do fotossistema
II (FSII), como verificado em cana-de-açúcar sob déficit hídrico (SILVA et al., 2007;
RIBEIRO et al., 2013). Na falta de água, a queda da fotossíntese pode ser relacionada também
à redução dos teores de clorofila, diminuição da atividade fotoquímica e bioquímica
(MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013). Em longo prazo, o déficit hídrico afeta o
acúmulo de matéria seca do colmo e de sólidos solúveis no caldo, o perfilhamento e o número
e crescimento de entrenós (SINGELS et al., 2000; ZHAO et al., 2013).
Respostas de aclimatação eficientes podem indicar materiais com potencial de
produção em condições de estresse moderado (MACHADO, et al., 2009; BASNAYAKE et
al., 2012; RIBEIRO et al., 2013). Segundo SMIT & SINGELS (2006) o grau das alterações
morfofisiológicas depende da intensidade da deficiência hídrica e varia conforme o genótipo.
A cana-de-açúcar é uma cultura de genoma híbrido e poliploide, havendo grande variação
genotípica (SOUZA & SLUYS, 2010). As regulações química e hidráulica do crescimento
atuam em conjunto, variando de acordo com o genótipo, com as condições do solo e com a
extensão dos danos pelo estresse (BACON et al., 2002). Neste sentido, o melhoramento
genético da cultura é realizado com o intuito de desenvolver variedades mais produtivas, mais
4
adaptadas a colheitas mecanizadas e com maior tolerância às condições estressantes, como a
restrição hídrica, ataque de pragas e doenças (LANDELL & BRESSIANI, 2008; MANN &
SANTOS, 2009). Nesse contexto, acredita-se que o conhecimento dos mecanismos
fisiológicos responsáveis pelo aumento da eficiência do uso da água e da tolerância ao déficit
hídrico seja essencial para o contínuo desenvolvimento de novas variedades de cana-deaçúcar (INMAN-BAMBER et al., 2005; ZHAO et al., 2013).
2.2 Relações hídricas e aquaporinas
Na parte aérea, a superfície de área foliar é mais ocupada pelas células epidérmicas do
que pelos estômatos. A epiderme é uma camada de células derivadas da protoderme que
protege as folhas da perda de água, de choques mecânicos e da entrada de bactérias e fungos
patogênicos. Para conter a perda de água para o ar circundante da folha, a epiderme produz
uma cutícula externa feita de cera e cutina, que são substâncias lipídicas impermeáveis,
responsáveis pela baixíssima transpiração cuticular. Assim, o caminho usual do vapor de água
da folha para a atmosfera durante a transpiração é através dos estômatos (NOBEL, 1999;
TAIZ & ZEIGER, 2009; NABORS, 2012). O estômato controla a saída do vapor de água
pelas folhas e a entrada de CO2, sendo a abertura estomática controlada pela conformação das
duas células-guardas que circundam o poro estomático. Quando as células-guardas absorvem
água, as paredes externas mais finas se distendem e geram um afastamento entre as células,
permitindo a abertura de um orifício, o ostíolo. Quando as células-guardas estão relativamente
flácidas os estômatos se fecham e assim o grau de hidratação das células define a
conformação dos estômatos (NOBEL, 1999; NABORS, 2012).
O fechamento dos estômatos em resposta à seca é uma típica via de transdução de
sinais. Em condição de perda excessiva de água por transpiração tem-se a participação do
hormônio ácido abscísico (ABA), oriundo de redistribuição, biossíntese ou transferência das
raízes para a parte aérea, chegando às células-guardas e causando o fechamento estomático. O
ABA se liga a proteínas receptoras na membrana das células-guardas e esta ligação induz a
formação de EROs, como o H2O2 sintetizado via NADPH oxidase, causando a abertura de
canais de Ca+2 na membrana celular e induzindo a entrada de cátion no citoplasma. Um
aumento nos níveis de proteínas ativam canais de cálcio adicionais no tonoplasto induzindo a
liberação do cálcio do vacúolo. O Ca+2 acumulado será responsável pela saída de íons Cl- e
inibição da entrada de íons K+ na célula, promovendo a despolarização da membrana. Dentro
das células ocorre o acúmulo de íons Ca+2 e um aumento do pH, despolarizando a membrana.
5
Uma nova saída de K+ e de Cl- dos vacúolos para o citosol reduz a concentração osmótica e
então a água sai da célula alterando a conformação das células-guardas (NOBEL, 1999; PEI
et al., 2000; NABORS, 2012).
A habilidade da planta em manter seu balanço hídrico é fundamental para garantir sua
sobrevivência em condições ambientais adversas. Alterações na disponibilidade hídrica no
solo afetam rapidamente a permeabilidade das células (MAUREL et al., 2008). Afetando
outros níveis de organização, o déficit hídrico pode limitar o desenvolvimento do organismo
em última instância (YORDANOV et al., 2000; MACHADO et al., 2009). A água no
contínuo solo-planta-atmosfera é transportada de acordo com o gradiente de potencial da água
e a demanda evaporativa exige que a água perdida pela transpiração seja reposta para a devida
manutenção de hidratação dos tecidos. Nas raízes, a entrada de água ocorre com maior
facilidade nas regiões onde a resistência ao movimento é menor (MARENCO & LOPES,
2009). O transporte de água longitudinalmente ou de forma axial para a parte aérea se dá pelo
xilema, que possui paredes secundárias espessas e lignificadas, com poros que ligam células
adjacentes facilitando a ascensão da água (NOBEL, 1999). O transporte radial de água se dá
por três rotas: apoplástica, onde a água passa pelos espaços intercelulares; simplástica, na qual
a água entra em contato com o citoplasma e se move célula a célula via plasmodesmo,
estabelecendo um contínuo citoplasmático; e a transcelular, na qual a água atravessa o
plasmalema celular. O transporte simplástico e transcelular são conhecidos como transporte
célula a célula e não é possível distinguir a água que passa separadamente por eles
(STEUDLE & PETERSON, 1998; PIMENTEL, 2004).
A passagem da água por canais específicos foi descoberta na tentativa de explicar o
transporte de água dentro das plantas uma vez que a bicamada lipídica dificulta a passagem da
água. Em 1992, descobriu-se a existência das aquaporinas, proteínas integrais de membrana
que são estruturas presentes na membrana plasmática e que facilitam a passagem da água por
difusão transmembranar (BIENERT et al., 2007). As aquaporinas estão dispostas na
membrana plasmática em arranjos com funcionalidade independentes e são classificadas de
acordo com a similaridade da sequência de nucleotídeos (YE & STEUDLE, 2006), sendo as
mais importantes as subfamílias das proteínas da membrana plasmática (PIP) e das proteínas
do tonoplasto (TIP). Estudos revelaram a presença frequente das aquaporinas nos tecidos dos
feixes vasculares, nas células do parênquima do xilema e nas células companheiras do floema,
sugerindo sua participação no transporte de água entre xilema e floema (KNIPFER et al.,
2011). Assim, a contribuição das aquaporinas está no transporte célula a célula, pela
passagem transcelular e simplástica (STEUDLE, 2000). As aquaporinas facilitam a passagem
6
rápida e passiva da água pelas membranas celulares e são responsáveis por até 95% da
permeabilidade da água na membrana plasmática (HENZLER et al., 2004). Três formas de
regulação do transporte de água mediado pelas aquaporinas são propostas, a saber: (a)
variação na abundância ou expressão das aquaporinas, sendo a forma de regulação mais
importante; (b) movimento destas por sítios celulares; e (c) o estado de abertura/fechamento
(portão) das aquaporinas (SUI et al., 2001; HACHEZ et al., 2012).
A permeabilidade das membranas à água é então definida pela presença de distintas
isoformas de aquaporinas e regulada geneticamente, sendo responsável pela eficiência
diferencial de absorção e transporte via plasmodesmo (KNIPFER et al., 2011). Em condições
normais diz-se que a expressão das aquaporinas apresenta papel importante não apenas nas
relações hídricas no sistema radicular mas também da parte aérea, afetando os processos
fisiológicos relacionados (STEUDLE, 2000; ZHANG et al., 2008; HEINEN et al., 2009).
Como exemplo, verificou-se aumento da expressão de PIPs nas raízes de genótipos de arroz
tolerantes ao déficit hídrico, ao passo que o material sensível não apresentou variação
significativa na expressão de PIPs (LIAN et al., 2006).
2.3 Estresse oxidativo e metabolismo antioxidante
Assim como o déficit hídrico, outros fatores, abióticos e/ou bióticos, interferem na
fotossíntese e são indutores em potencial do estresse oxidativo. Entre estes fatores podem ser
apontadas temperaturas extremas, salinidade, toxidez por metais pesados, deficiências
nutricionais, condições anóxicas e ataque de patógenos (DESIKAN et al., 2004). Devido ao
estresse, a planta apresentará uma redução no uso de energia captada e o estresse oxidativo
terá origem no desbalanço entre a oferta de energia obtida dos fótons absorvidos e a
quantidade de energia efetivamente utilizada pela fotossíntese (CRUZ DE CARVALHO,
2008; CHEESEMAN, 2007).
Moléculas causadoras do estresse oxidativo têm origem no oxigênio que se torna
reativo a partir do fornecimento de energia em sítios de transporte de elétrons e fontes
enzimáticas. Estima-se que entre 1% e 2% do O2 consumido seja desviado para a produção de
EROs em diferentes locais subcelulares (BHATTACHARJEE, 2005). A oxidação da água no
FSII ocorre no complexo de produção de oxigênio, onde a liberação de uma molécula de O 2
requer a oxidação de duas moléculas de água e a remoção de quatro elétrons (TAIZ &
ZEIGER, 2009). A energia luminosa excita a molécula de clorofila resultando em alta energia
de excitação em forma molecular de vida longa, podendo reagir com o oxigênio e formar
7
EROs. Os pigmentos excitados doam energia ao O2, produzindo o radical superóxido (O2-·)
(LAWLOR, 2001). Na respiração mitocondrial, a redução de quatro elétrons produz em
condição normal uma molécula de água pela enzima do complexo IV citocromo oxidase.
Porém, na reação acidental de um elétron com outros componentes do transporte de elétrons
tem-se a formação de EROs e estima-se que entre 1% e 5% do O2 consumido nas
mitocôndrias resulte na produção de EROs (MOLLER, 2001; TAIZ & ZEIGER, 2009). Nos
cloroplastos, o FSI e FSII são os locais principais para a produção do oxigênio singleto e O 2-·.
Nas mitocôndrias, complexo I, ubiquinona e complexo III da cadeia transportadora de
elétrons (CTE) são os principais locais da produção do O2-· (GILL & TUTEJA, 2010).
Em condição de estresse oxidativo os compostos reduzidos do oxigênio atmosférico
alteram o metabolismo celular e um dos resultados é a peroxidação de ácidos graxos
polinsaturados por meio de rupturas ou encurtamento da membrana celular levando ao
aumento de fluidez e da permeabilidade. As proteínas por sua vez reagem direta ou
indiretamente com produtos finais da peroxidação lipídica, levando a modificações e quebra
das cadeias laterais. Outro efeito da presença de espécies reativas é a alteração do DNA,
inclusive o mitocondrial por meio de mutações genéticas (DESIKAN, 2004; TAIZ &
ZEIGER, 2009).
A dismutação de O2-· é facilitada a partir da adição de mais um elétron de outro O2-· e
posterior protonação, resultando na geração do peróxido de hidrogênio (HUNG et al., 2005;
YANG et al., 2007). Esta espécie reativa na presença de metais de transição, como cobre e
ferro, pode reagir e produzir o radical hidroxila (OH·) na chamada reação de Fenton. A OH· é
conhecida como a espécie mais reativa e danosa por reagir com todas as moléculas biológicas
como DNA, lipídios e proteínas, por sua facilidade de difusão entre as membranas e pela falta
de uma enzima antioxidante específica para sua remoção (LAWLOR, 2001; DESIKAN, 2004;
GILL & TUTEJA, 2010). Nestas circunstâncias, as plantas se utilizam de um complexo
sistema antioxidante de defesa contra possíveis danos pela produção das EROs. Este sistema
deve ser eficiente na eliminação de baixas concentrações das EROs e rápido o bastante para
eliminá-las conforme são produzidas (LAWLOR, 2001). Este sistema envolve enzimas como
a superóxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase (NETO, 2005; CRUZ DE
CARVALHO, 2008).
A superóxido dismutase (SOD) é a primeira enzima na linha de defesa do sistema
antioxidante e a mais efetiva, por ser uma enzima onipresente e de alta velocidade de reação.
O produto da SOD através da dismutação de radicais superóxido é o H2O2 (Figura 1), sendo
posteriormente oxidado a O2. As SODs são classificadas conforme seus cofatores: cobre/zinco
8
(Cu/Zn-SOD), manganês (Mn-SOD) e ferro (Fe-SOD), e são localizadas em diferentes
compartimentos celulares. O aumento da atividade de SOD tem sido observado em várias
espécies submetidas a condições estressantes (BIENERT et al., 2007).
O2
SOD
·-
H2O2
APX
CAT
H2O
Figura 1 - Produção de H2O2 pela enzima superóxido dismutase (SOD) por dismutação do
ânion superóxido, e ação desintoxicante das enzimas catalase (CAT) e ascorbato peroxidase
(APX), convertendo H2O2 a H2O.
A ascorbato peroxidase (APX) é uma enzima localizada em todos os compartimentos
de produção de EROs, onde pode funcionar como um regulador de H2O2 em nível celular
(NETO, 2005; CRUZ DE CARVALHO, 2008). A APX tilacoidal e estromal tem sua grande
importância na regulação dos processos redox em plantas, como na síntese de NADPH e na
produção de ATP (LAWLOR, 2001). A APX está envolvida na manutenção do metabolismo
celular no início da condição estressante e na sinalização, por um ajuste fino da concentração
de ERO (MITLER, 2002), pois possui alta afinidade por H2O2 (µM) e a reação contra esta
molécula necessita da ação conjunta dos complexos antioxidantes do ciclo da glutationa.
Assim como a SOD, aumentos da atividade de APXs são observados em condições de
estresse (NETO et al., 2006).
A catalase (CAT) está localizada predominantemente nos peroxissomos, podendo
atuar como um removedor do excesso de H2O2 (na faixa de mM) sob condições estressantes,
apesar de ter menor afinidade com esta ERO comparada a APX. A CAT não tem sua
atividade afetada pelo estado redox das células uma vez que não necessita de redutores
equivalentes para sua função (MITLER, 2002). Pode dismutar grande quantidade de H2O2
com apenas uma molécula e sua grande importância está na remoção de H2O2 gerado nos
peroxissomos por oxidases envolvendo a β-oxidação de ácidos graxos e fotorrespiração. Tem
a capacidade de gerar dismutação direta do H2O2 a água e O2 (GILL & TUTEJA, 2010).
Um aspecto importante é a ação conjunta das enzimas no sistema antioxidante (Figura
1), ocorrendo um balanço entre as enzimas SOD, CAT e APX de forma que na supressão de
uma delas, as outras enzimas compensem sua ação para garantir a efetividade do sistema
9
antioxidante. Embora haja essa característica, CAT e APX não são completamente
redundantes, cada uma tendo seu sítio principal de ação (WILLEKENS et al., 1997). Enfim, o
balanço entre as enzimas SOD e as responsáveis pela eliminação do H2O2 regula a presença
de O2-· e H2O2 nas células (BOWLER et al., 1991).
NAYAR & GUPTA (2006) verificaram que as atividades da SOD e da CAT foram
significativamente maiores nas raízes do que nas folhas de plantas de milho em condições de
estresse hídrico leve, sugerindo diferenças nos mecanismos de defesa dos órgãos. Em pinhãomanso, SILVA et al. (2010) verificaram que a atividade da CAT, APX e SOD foram
estimuladas sob condições de estresse por alta temperatura. NETO et al. (2006) observaram
que a atividade da CAT teve maior participação na eliminação do H 2O2 do que a enzima APX
em folhas e raízes de milho em estresse salino, hipotetizando que a CAT seja a enzima mais
importante na desintoxicação de H2O2 na folhas.
A tolerância à seca pode ser garantida pelo aumento da expressão das enzimas
antioxidantes para combater as EROs em vários compartimentos celulares. No cloroplasto, o
controle da produção e proteção contra EROs se mostrou essencial para a tolerância à seca e
salinidade (MITLER, 2003; MITLER et al., 2004). CIA et al. (2012) verificaram que folhas
do genótipo de cana-de-açúcar sensível à seca apresentaram maior acúmulo de produtos de
peroxidação lipídica e de H2O2 sob déficit hídrico. Já o genótipo tolerante apresentou aumento
da atividade das enzimas CAT e APX. Em folhas de cana-de-açúcar, SALES et al. (2013)
encontraram relação entre os níveis de fotossíntese e a atividade do sistema antioxidante, com
o genótipo tolerante à seca apresentando maior atividade da SOD e APX na fase de
recuperação do estresse. MEDEIROS et al. (2014) também observaram aumento na atividade
de SOD e APX e manutenção da atividade da enzima CAT nas folhas de cana-de-açúcar
submetidas a estresse salino. Também em folhas de cana-de-açúcar, BOARETTO et al.
(2014) reportaram que a enzima CAT foi responsável pela queda dos níveis de H2O2 e a SOD
foi considerada a enzima responsável pelo melhor desempenho do sistema antioxidante e
tolerância da cana-de-açúcar em condição estressante.
Estudos relacionando o sistema antioxidante e as relações hídricas ainda são escassos e
a maioria dos trabalhos que avaliam respostas antioxidantes foca apenas na parte aérea ou no
sistema radicular de forma separada e sem estabelecimento de relação entre esses órgãos. Tal
fato limita a nossa compreensão de como as plantas reagem a situações estressantes quando se
considera a interação entre as relações hídricas e os metabolismos antioxidante e
fotossintético.
10
2.4 Peróxido de hidrogênio em plantas
Em sistemas biológicos, o peróxido de hidrogênio é conhecido como uma ERO com
importantes ações deletérias em organelas e membranas celulares. O grande interesse em
pesquisa com H2O2 tem relação com suas características distintas das outras EROs. O H2O2 é
uma molécula sem carga e não é um radical; é relativamente estável sob condições
fisiológicas; tem meia-vida longa se comparado às outras espécies reativas (ms vs. µs); seu
número de oxidação é intermediário (-1); seu momento dipolo é muito semelhante ao da água
e pode ser convertida à água e oxigênio sem a necessidade de equivalentes de redução
(BIENERT et al., 2006; 2007).
Além dos efeitos deletérios, o H2O2 é conhecido também como uma molécula de
transdução de sinal, atuando como mensageiro secundário, já que um pequeno acúmulo deste
composto é suficiente para o sistema antioxidante agir de forma imediata. Acredita-se que o
H2O2 ative amplificadores de sinal em locais específicos dentro das células (DAT et al.,
2003), ativando receptores de proteína, fatores de transcrição e inibição de fosfatases e
culminando na ativação de rotas de desintoxicação (MITLER, 2002; MITLER et al., 2004).
Além de transdutor de sinal, existem evidências de que o H2O2 seja uma molécula que auxilie
no desenvolvimento, na proliferação e na morte celular (BIENERT et al., 2006; SLESAK et
al., 2007; CRUZ DE CARVALHO, 2008). O H2O2 atua como uma molécula sinalizadora em
processos celulares autócrinos, ou seja, estimulando atividades dentro da célula, como o
fechamento estomático induzido pelo ABA, e parácrinos ou atividades intercelulares
(BIENERT et al., 2006). A molécula passou a ser aceita como um mensageiro secundário
devido a sua relativa longa meia-vida e por sua alta permeabilidade pelas membranas (QUAN
et al., 2008) estando envolvida em várias reações e sinalizações em cascata necessárias ao
crescimento da planta, como na coordenação do funcionamento raiz-parte aérea e no controle
estomático (CHEESEMAN, 2007).
Sabe-se que o H2O2 apresenta dois papéis principais: em baixas concentrações tem
como função a aclimatação e promoção da tolerância à determinada condição de estresse, e
em altas concentrações leva à morte celular programada (GILL & TUTEJA, 2010).
ISHIBASHI et al. (2011) verificaram que a aspersão foliar de solução de H2O2 1 mM em
plantas de soja atrasou os sintomas de déficit hídrico como o amarelecimento e murcha foliar
por manter o conteúdo relativo de água na folha. Esses autores ainda observaram que as
plantas submetidas à seca e à aspersão do H2O2 apresentaram taxa fotossintética e condutância
estomática maiores do que as plantas submetidas à seca e sem aspersão do H 2O2. No entanto,
11
DUNAND et al. (2007) verificaram redução do comprimento de raízes submetidas à 0,5 a 1,0
mM de H2O2. YANG et al. (2007) e JIANG et al. (2013) verificaram aumento na
concentração de cálcio nas raízes devido ao H2O2 (50 µM) e sugeriram uma possível relação
com o fechamento estomático induzido pelo ácido abscísico (ABA). Esta sinalização
antecipada evitaria danos celulares devido à desidratação e seria uma resposta de aclimatação
com impacto positivo na eficiência do uso da água em condição de déficit hídrico passageiro
ou leve.
A concentração do H2O2 na célula é dada pelo influxo e formação intracelular assim
como pelo efluxo e ação desintoxicante do sistema enzimático (BIENERT et al., 2006). O
H2O2 é gerado principalmente nos cloroplastos via reação de Mehler, nas mitocôndrias pelo
transporte de elétrons e nos peroxissomos pela fotorrespiração (CHEESEMAN, 2007). A
produção é mais rápida em peroxissomos e cloroplastos, sendo as mitocôndrias as mais
vulneráveis aos danos oxidativos (CRUZ DE CARVALHO, 2008; ISHIBASHI et al., 2011).
Sabe-se que devido à sua condição estrutural e propriedades físico-químicas muito
semelhantes às da água, o H2O2 tem facilidade no transporte simplástico entre as membranas
através das aquaporinas (JOHNSON et al., 2003; BIENERT et al., 2006; 2007; SLESAK et
al., 2007).
DUNAND et al. (2007) observaram que plantas de Arabidopsis expostas à H2O2 em
solução nutritiva por sete dias tiveram produção de EROs no apoplasto das raízes por ação das
NADPH oxidases da membrana plasmática e acumularam H2O2 na zona de diferenciação.
Outros estudos verificaram que o apoplasto é um importante sítio de alocação de ânion
superóxido sendo convertido espontaneamente ou por SOD extracelular a H 2O2 (BOLWELL
et al., 2001). O citosol, por sua vez, não é tido como um sítio de produção de H2O2, mas como
um dissipador deste, a partir do vazamento para outros compartimentos celulares (SLESAK et
al., 2007).
Pesquisas mostram que o H2O2 diminui a condutância hidráulica de raízes, no entanto,
o mecanismo ainda não é completamente entendido. A primeira hipótese e a mais estudada é a
inibição das aquaporinas pela formação de um portão oxidativo que fecha o canal. O portão
oxidativo seria uma peça importante na regulação do transporte de água através das
membranas celulares em condições de estresse (YE & STEUDLE, 2006; BIENERT et al.,
2007; EHLERT et al., 2009). Supõe-se que os canais de água são fechados quando o radical
hidroxila (OH·), produzido pela reação de Fenton ou outra ERO, oxida-o diretamente,
causando a inibição das aquaporinas. Outra interpretação seria de que a permeabilidade das
12
aquaporinas seja danificada por danos causados pelas EROs, como a peroxidação lipídica (YE
& STEUDLE, 2006; BIENERT et al., 2007; HEINEN et al., 2009).
Com a indução do acúmulo de EROs nas raízes de Arabidopsis, BOURSIAC et al.
(2008) verificaram inibição da capacidade de absorção de água mediada pelas PIPs das raízes.
Além disso, observou que o H2O2 exógeno foi capaz de reduzir a condutância hidráulica das
raízes em até 90% em menos de 15 minutos. O autor sugere que o H2O2 causa uma espécie de
compartimentalização das PIPs, inativando assim sua função e induzindo um mecanismo de
sinalização celular.
13
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
Dois genótipos de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) desenvolvidos pelo Programa
Cana do Instituto Agronômico (PROCANA IAC) foram utilizados: IACSP94-2094, tolerante
ao déficit hídrico, recomendado para solos com baixa disponibilidade de água (LANDELL et
al., 2005; RIBEIRO et al., 2013) e IACSP94-2101, sensível à falta de água, recomendado para
solos com disponibilidade de água média a alta e solos moderadamente drenados (LANDELL
et al., 2005).
Para a obtenção das mudas plantou-se discos de colmo contendo uma gema das
variedades selecionadas. Foram tomados os devidos cuidados quanto à homogeneidade dos
discos contendo as gemas. Os discos foram plantados em substrato comercial composto de
turfa de Sphagnum, vermiculita expandida, calcário dolomítico, gesso agrícola e traços de
fertilizante NPK (Carolina Soil do Brasil, Vera Cruz, Rio Grande do Sul, Brasil) e após 30
dias do plantio, quando as plantas tinham de três a quatro folhas, as mesmas foram
transferidas para solução nutritiva.
3.2 Condições experimentais
3.2.1 Preparo da solução nutritiva
O sistema radicular foi lavado em água deionizada para a remoção do substrato
aderido à superfície da raiz. Posteriormente, as plantas foram transferidas para caixas plásticas
com capacidade para 15 L, contendo solução nutritiva modificada de Sarruge (1975), diluída
¼. Após cinco dias de aclimatação das mudas ao novo ambiente de crescimento, a solução
nutritiva foi renovada, aumentando a concentração dos nutrientes (½ força). Seguindo-se mais
cinco dias nesta condição, a solução foi renovada à força iônica completa e, após aclimatação,
os tratamentos foram iniciados.
As fontes nutricionais e suas respectivas concentrações foram: nitrato de potássio
(101,97 g L-1), nitrato de cálcio (236,15 g L-1), sulfato de magnésio (246,48 g L-1), nitrato de
amônio (80,01 g L-1), di-hidrogênio fosfato de potássio (136,09 g L-1), cloreto de potássio
(111,81 g L-1), ferro EDDHMA (33,33 g L-1), ácido bórico (1,69 g L-1), sulfato de zinco (1,10
14
g L-1), sulfato de cobre (0,16 g L-1), sulfato de manganês (0,92 g L-1) e molibdato de amônio
(2,32 g L-1).
Em relação ao manejo da solução nutritiva, valores de condutividade elétrica da
solução foram mantidos entre 80% e 85% do valor original (1,8 a 2,0 mS cm-1) com o auxílio
de um condutivímetro portátil microprocessado (TEC-4P-MP, Tecnal, Piracicaba, São Paulo,
Brasil). Foram também monitorados o volume da solução nas caixas plásticas e a aeração da
solução foi realizada um compressor de ar. O pH foi mantido entre 5,5 e 6,0 mediante adição
de KOH ou HCl 0,1 mol L-1, sendo medido com pHmetro portátil (TEC-3P-MP, Tecnal,
Piracicaba, São Paulo, Brasil).
3.2.2 Condições ambientais
O experimento foi conduzido em câmara de crescimento modelo PGR15 (Conviron,
Winnipeg, Manitoba, Canadá), com 12 horas de fotoperíodo e as variáveis ambientais
controladas. A temperatura do ar foi de 30/20ºC (dia/noite), a umidade relativa do ar foi
mantida em 80% e a radiação fotossinteticamente ativa (Q) em 800 µmol m-2 s-1, com o
sistema de iluminação situado a aproximadamente de 20 cm acima das plantas.
3.2.3 Tratamentos com peróxido de hidrogênio
O experimento foi estabelecido em caixas plásticas (tratamentos), cada uma
acondicionando oito plantas. No momento da indução dos tratamentos, foi verificado o
volume da solução nutritiva de manutenção das plantas e retirou-se o compressor de ar. Na
administração do H2O2, o mesmo era cuidadosamente solubilizado na solução nutritiva,
evitando contato com a luz. Os tratamentos foram estabelecidos com o objetivo de induzir
condições contrastantes, sendo uma com baixa e outra com alta concentração de H2O2 na
solução nutritiva. Para isso, foram necessários testes para verificar a sensibilidade das trocas
gasosas da cana-de-açúcar ao H2O2. Em testes preliminares foram avaliados os efeitos de
solução nutritiva com concentrações de H2O2 variando entre 0,25 e 90 mmol L-1. Com base
nas avaliações de trocas gasosas, optou-se por utilizar soluções com concentração baixa (4,5
mmol L-1) e alta (90 mmol L-1) de H2O2. Ao quantificar por método volumétrico as
concentrações reais de H2O2 na solução nutritiva, constatou-se uma pequena variação entre os
valores planejados e os estabelecidos: 4,5 vs. 3 mmol L-1 (baixa concentração) e 90 vs. 80
15
mmol L-1 (alta concentração). Nesse estudo, serão consideradas as concentrações
efetivamente obtidas de H2O2 na solução nutritiva, i.e., 3 e 80 mmol L-1.
3.3 Quantificação do peróxido de hidrogênio (H2O2) na solução nutritiva e em material
vegetal
Para a confirmação das concentrações utilizadas em solução nutritiva dos tratamentos
com peróxido de hidrogênio foi utilizado o método volumétrico de Iodometria, segundo
BACCAN et al. (2001). Esta técnica de oxidação se estabelece na titulação do iodo produzido
e liberado a partir da ação redutora de íons iodeto sobre o peróxido de hidrogênio em meio
ácido. O procedimento foi iniciado com a coleta e transferência de alíquota de 25 mL da
solução nutritiva para erlenmeyer de 250 mL. Adicionou-se 10 mL de ácido sulfúrico (H2SO4)
2 mol L-1 para evitar a formação de iodato. Em seguida, acrescentou-se 1 grama de iodeto de
potássio (KI), responsável por evitar perdas do iodo por volatilização, formando íons
triiodeto. Catalisou-se a reação com a adição de três gotas de solução de molibdato de amônio
[(NH4)6 Mo7 O24. 4 H2O)], 3% (m/v) e pH 7,0. A titulação foi realizada com solução-padrão
de tiossulfato de sódio (Na2S2O3) 0,1 mol L-1 e 3 mL de solução de amido como indicador,
que garante à solução uma coloração que varia de azul intensa à marrom escura devido à
formação de complexos de adsorção com o iodo. O ponto final foi verificado pela mudança da
cor marrom escura para incolor. A concentração de peróxido de hidrogênio na solução
nutritiva, determinada em mol L-1, foi obtida considerando-se que 2 moles de iodeto reagem
com 1 mol de H2O2 (massa molar = 34,01 g mol-1 ) para produzir 1 mol de I2, que por sua vez
reage com 2 moles de tiossulfato de sódio.
A determinação de H2O2 em material vegetal foi realizada seguindo o método de
ALEXIEVA et al. (2001). Coletou-se o homogeneizado obtido de 0,1 g de tecido vegetal
fresco moído em nitrogênio líquido com 0,02 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) e 1 mL de
TCA 0,1% (p/v). O extrato foi centrifugado a 10.000 rpm e 4ºC por 15 minutos. O meio de
reação foi constituído de 0,8 mL de KI 1 mol L-1, 0,2 mL de tampão fosfato de potássio e 0,2
mL do extrato bruto. Os microtubos permaneceram no escuro e no gelo por 1 hora, e após este
período a leitura de absorbância foi feita a 390 nm. A curva de calibração foi confeccionada
com pontos de 0 a 15 µg mL-1 de H2O2 e o resultado foi expresso em µmol H2O2 g-1 MF.
16
3.4 Avaliações fisiológicas
3.4.1 Extrato enzimático e atividade de enzimas do sistema antioxidante
Para obtenção do extrato, macerou-se em almofariz 0,2 g de massa fresca de tecido
vegetal (folha ou raiz) com nitrogênio líquido, 0,02 g de PVPP 1% e 2 mL de meio de
extração contendo tampão fosfato de potássio 0,1 mol L-1 pH 6,8, etilenodiaminotetracético
(EDTA) 0,1 mmol L-1 e fluoreto de fenilmetilsulfônico (PMSF) 1 mmol L-1. Após
centrifugação do homogeneizado a 15.000 g por 15 minutos e 4ºC, coletou-se o sobrenadante
(extrato bruto) que foi conservado em banho de gelo até o momento das determinações.
Para a determinação da atividade da enzima superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1)
foi utilizado o método de GIANNOPOLITIS & RIES (1977). Os meios de reação eram
constituídos por 1,5 mL de tampão fosfato de sódio 100 mmol L -1 pH 7,8, 0,78 mL de
metionina 50 mmol L-1, 0,06 mL de EDTA 5 mmol L-1, 0,345 mL de água deionizada e 0,030
mL do extrato bruto. Em seguida, adicionou-se 0,06 mL de riboflavina 100 µmol L-1 e 0,225
mL de cloreto de azul de nitrotetrazólio (NBT) 1 mmol L -1. Um grupo de tubos foi exposto à
luz de lâmpada fluorescente (30 W) por 4 minutos, e o outro grupo permaneceu no escuro. A
absorbância foi medida a 560 nm. Uma unidade de SOD é a quantidade da enzima necessária
para inibir em 50% a fotorredução do NBT e a unidade de sua atividade é expressa em U min1
mg-1 de proteína.
A atividade da enzima catalase (CAT, EC 1.11.1.6) foi quantificada utilizando o
método de HAVIR & MCHALE (1987). O meio de reação era constituído por 1,5 mL de
tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1 pH 6,8, 1,1 mL de água deionizada e 0,3 mL de
solução de H2O2 125 mmol L-1. Os tubos foram tampados e levados a banho-maria a 25ºC por
2 minutos. Adicionou-se 0,1 mL do extrato bruto e acompanhou-se o decréscimo na
absorbância a 240 nm no tempo de 1 minuto a 25ºC. A atividade da CAT foi calculada
utilizando-se o coeficiente de extinção molar 36 M -1 cm -1 e expressa em µmol min-1 mg-1 de
proteína.
A quantificação da atividade da enzima ascorbato peroxidase (APX, EC 1.11.1.11) foi
feita seguindo o método de NAKANO & ASADA (1981). O meio de reação era constituído
por 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1 pH 6,0, 0,86 mL de água deionizada,
0,24 mL de ácido ascórbico 10 mmol L-1 e 0,3 mL de solução de H2O2 10 mmol L-1. Os tubos
seguiram para banho-maria a 25ºC por 2 minutos, e em seguida, adicionou-se 0,1 mL do
extrato bruto e acompanhou-se o decréscimo da absorbância a 290 nm no tempo de 1 minuto
17
a 25ºC. A atividade da APX foi calculada utilizando-se o coeficiente de extinção molar 2,8
mM-1 cm -1 e expressa em µmol min-1 mg-1 de proteína.
3.4.2 Proteínas solúveis totais
A quantificação de proteínas solúveis totais seguiu o protocolo modificado de
BRADFORD (1976). O reagente corante de proteína (Bradford reagent Sigma, B6916 Coomassie brilliant blue, BG-250) foi preparado na razão de 1:4 de água deionizada. A
amostra para a determinação foi preparada coletando-se em tubo de ensaio 0,03 mL do extrato
enzimático, 0,07 mL de água deionizada e 3 mL do reagente de Bradford diluído. A leitura de
absorbância foi feita a 595 nm. A curva padrão foi feita com quatro concentrações de
albumina de soro bovino (BSA): 0,002, 0,005, 0,010 e 0,020 mg. O resultado foi expresso em
mg g-1 MF.
3.4.3 Peroxidação lipídica
A avaliação da peroxidação lipídica pela quantificação do aldeído malônico produzido
foi feita segundo o método de CAKMAK & HOST (1991). Para a obtenção do extrato, uma
amostra de 0,160 g de massa fresca do tecido vegetal foi macerada em 1,5 mL de solução de
ácido tricloroacético (TCA) 0,1% (p/v) em almofariz, e em seguida, centrifugada a 10.000
rpm por 15 minutos e o sobrenadante recolhido. Transferiu-se 0,5 mL do extrato para um tubo
de ensaio com rosca contendo 1,5 mL da solução de ácido tiobarbitúrico 0,5% (TBA). Os
tubos foram incubados em banho-maria a 90ºC por 20 minutos, com agitação. A reação foi
interrompida em banho de gelo, e após resfriamento o conteúdo de cada tubo foi transferido
para microtubo de 2 mL e centrifugado a 10.000 rpm por 10 minutos. Posteriormente, os
microtubos permaneceram em repouso por 30 minutos em temperatura ambiente, e em
seguida leu-se a absorbância da amostra em 532 nm e 600 nm para descontar a absorbância
inespecífica a 600 nm. Para calcular a quantidade de MDA na amostra considerou-se o
coeficiente de absortividade do MDA de 155 mM -1 cm-1 e o resultado foi expresso em nmol g1
MF.
18
3.4.4 Condutância hidráulica das raízes
Avaliações da condutância hidráulica (Lp) das raízes foram realizadas segundo o
procedimento descrito por AROCA et al. (2001) e ilustrado na Figura 2. A planta foi
transferida da caixa plástica com solução nutritiva de manutenção para um recipiente de
plástico contendo 300 mL da mesma solução nutritiva em que as plantas estavam. Em seguida
cortou-se a planta a aproximadamente 5 cm abaixo das folhas. A extremidade cortada
permaneceu no lado externo da câmara, em contato com algodão (seco e previamente pesado)
inserido em um tubete de plástico para permitir a coleta da seiva exsudada. O segmento da
planta na solução foi selada em câmara de pressão do tipo Scholander (modelo 3005, Soil
Moisture Equipment Corp., Goleta, Califórnia, EUA) de modo a impedir a passagem de ar.
As pressões exercidas foram de 0,2, 0,4 e 0,6 MPa e os tempos em cada pressão variaram de 8
a 12 minutos. O algodão úmido foi pesado ao final (massa final) e substituído a cada aumento
de pressão. Por fim, as raízes foram armazenadas em solução de etanol 80% para posterior
quantificação da área radicular com o auxílio do software Safira (EMBRAPA, 2013). As
medidas foram realizadas no meio do fotoperíodo para evitar diferenças de Lp ocasionadas
pela mudança do período do dia, sendo Lp calculado pela relação entre o fluxo de exsudação e
a pressão aplicada corrigida para a área radicular, sendo expresso em mmol m-2 s-1 MPa-1.
 Aplicação de pressão por alguns minutos
Algodão seco em tubete de plástico
 Corte da parte aérea
Superfície de corte
 Absorção da
seiva pelo algodão
 Transferência das raízes
em solução para bomba de
pressão
Solução nutritiva mais H2O2
 Coleta das raízes para quantificação da área radicular
Figura 2 – Procedimento para avaliação da condutância hidráulica das raízes (Lp).
19
3.4.5 Trocas gasosas e atividade fotoquímica
As trocas gasosas foram medidas com um analisador de gases por infravermelho
modelo Li-6400 (Licor, Lincoln, Nebrasca, EUA) acoplado a um fluorômetro modulado
(6400-40 LCF, Licor, Lincoln, Nebrasca, EUA). As variáveis analisadas nas folhas foram:
assimilação de CO2 (A), condutância estomática (gs) e concentração intercelular de CO2 (CI).
Estas variáveis foram medidas sob condições de alta radiação (Q = 2000 μmol m-2 s-1) e
concentração de CO2 do ar mantida a 380 μmol mol-1, de acordo com MACHADO et al.
(2009). Foram calculadas a eficiência intrínseca do uso da água (A/gs) e a eficiência
instantânea de carboxilação (A/CI) (MACHADO et al., 2009). Medidas simultâneas de trocas
gasosas e da emissão de fluorescência da clorofila foram realizadas, sendo o transporte
aparente de elétrons (ETR) estimado. Em tecidos adaptados ao escuro por 30 minutos com
auxílio de papel alumínio, estimou-se a eficiência quântica potencial do fotossistema II
(FV/FM). Os cálculos foram realizados de acordo com ROHÁCEK (2002).
As avaliações foram realizadas 15 minutos após a aplicação de H2O2 em solução
nutritiva, na primeira folha totalmente expandida e com a lígula aparente (folha +1), no terço
médio do limbo foliar. A diferença de pressão de vapor entre a folha e o ar (VPD L) foi de
2,2±0,3 kPa e a temperatura foliar (T f) foi de 29,1±0,3 ºC durante as avaliações.
3.4 Delineamento experimental e análises estatísticas
O delineamento experimental foi em blocos casualizados em esquema fatorial 2
(genótipos) x 3 (concentrações de H2O2). Os dados foram submetidos à análise de variância
(ANAVA) e quando detectada diferença significativa, as médias (n=3) foram comparadas
pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
20
4 RESULTADOS
4.1 Superóxido dismutase (SOD)
Folhas do genótipo IACSP94-2101 não apresentaram variações significativas na
atividade da SOD após 15 minutos de exposição de H2O2, independente da concentração
(Figura 3a). Já o genótipo IACSP94-2094 teve aumento da atividade da SOD foliar na
concentração de 80 mmol L-1 (Figura 3a). O genótipo IACSP94-2101 apresentou a maior
atividade foliar da enzima nas plantas controle se comparado ao genótipo IACSP94-2094. Em
raízes, houve aumento da atividade da SOD apenas em IACSP94-2094 com 80 mmol L-1
-1
-1
SOD (U min mg prot.)
(Figura 3b).
100
(a)
80
IACSP94-2101
IACSP94-2094
* (b)
a
60
40
*
a ab
20 b a
0
03
a
a
bb
a a
80
03
-1
H2O2 (mmol L )
a
80
Figura 3 - Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) nas folhas (a) e nas raízes (b) de
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da
concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação
de H2O2. Cada símbolo representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras
minúsculas distintas indicam diferença estatística entre as concentrações de H2O2, enquanto
os asteriscos indicam diferença estatística entre os genótipos (Tukey, p<0,05).
4.2 Peróxido de hidrogênio (H2O2)
Após 15 minutos da aplicação de H2O2 na solução nutritiva, o teor de H2O2
determinado nas folhas foi maior nas plantas submetidas ao tratamento de 80 mmol L-1, se
comparadas às plantas controle e às tratadas com 3 mmol L-1 (Figura 4a). Nas raízes, os dois
21
genótipos apresentaram aumento importante no teor de H2O2 no tratamento de 80 mmol L-1,
sendo observados maiores valores em IACSP94-2094 (Figura 4b).
-1
H2O2 (mol g MF)
3
(a)
IACSP94-2101
IACSP94-2094
(b)
*
2
a
1
0
*
b ab
a
b c
a
03
bb
a
bb
80
03
-1
H2O2 (mmol L )
80
Figura 4 - Concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) nas folhas (a) e nas raízes (b) de
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da
concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação
de H2O2. Cada símbolo representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras
minúsculas distintas indicam diferença estatística entre os tratamentos, enquanto os asteriscos
indicam diferença estatística entre os genótipos (Tukey, p<0,05).
4.3 Catalase (CAT)
Na avaliação de CAT em folhas verificou-se que apenas o genótipo IACSP94-2101
apresentou alterações, como menor atividade no tratamento de 80 mmol L-1 após 15 minutos
de tratamento (Figura 5a). Os genótipos apresentaram diferenças na atividade da enzima nas
plantas controle e tratadas com 3 mmol L-1 de H2O2, sendo que as maiores atividades foram
verificadas em IACSP94-2101. De forma evidente verificou-se aumento significativo na
atividade da CAT nas raízes de IACSP94-2094 quando expostas a 80 mmol L-1 (Figura 5b).
Nessa condição, a atividade da CAT foi 6 vezes maior na IACSP94-2094 quando comparada
à IACSP94-2101.
22
(a)
15
*
*
-1
-1
CAT (mol min mg prot.)
20
10 a
5
0
IACSP94-2101
IACSP94-2094
a
a
ab
b
*
a
*
a ab
bb
b
03
(b)
80
03
-1
H2O2 (mmol L )
b
80
Figura 5 - Atividade da enzima catalase (CAT) nas folhas (a) e nas raízes (b) de genótipos de
cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da concentração de H2O2
na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação de H2O2. Cada símbolo
representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras minúsculas distintas indicam
diferença estatística entre os tratamentos, enquanto asteriscos indicam diferença estatística
entre os genótipos (Tukey, p<0,05).
4.4 Ascorbato peroxidase (APX)
O genótipo IACSP94-2101 apresentou queda da atividade de APX nas folhas em 3 e
80 mmol L-1, ao passo que IACSP94-2094 apresentou queda na atividade apenas no
tratamento com maior concentração de H2O2 (Figura 6a). Comparando os genótipos, pôde-se
constatar que IACSP94-2094 apresentou maior atividade da enzima nas plantas controle e nas
tratadas com 3 mmol L-1. Em raízes, IACSP94-2101 apresentou redução severa na atividade
da APX em 80 mmol L-1; entretanto, com médias superiores ao do genótipo IACSP94-2094
nas plantas controle e tratadas com 3 mmol L-1 (Figura 6b). IACSP94-2094 apresentou
redução na atividade da APX apenas em 80 mmol L-1 (Figura 6b).
4.5 Proteínas solúveis totais
Os genótipos apresentaram teores similares de proteínas, tanto nas folhas como nas
raízes (Figura 7). Em relação ao tratamento com H2O2, não foram observadas respostas
significativas tanto em folhas como em raízes após 15 minutos de exposição (Figura 7).
23
IACSP94-2101
IACSP94-2094
(a)
*
-1
8
*a
4
(b)
*a
-1
APX (mol min mg prot.)
12
*a
b
0 a
03
a
b
b
a
b
b
ab
80
03
-1
H2O2 (mmol L )
80
-1
Proteínas s. totais (mg g MF)
Figura 6 - Atividade da enzima ascorbato peroxidase (APX) nas folhas (a) e nas raízes (b) de
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da
concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação
de H2O2. Cada símbolo representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras
minúsculas distintas indicam diferença estatística entre os tratamentos, enquanto asteriscos
indicam diferença estatística entre os genótipos (Tukey, p<0,05).
10
(a)
8 aa
6 aa
4
(b)
a
a
a
2
0
IACSP94-2101
IACSP94-2094
a
aa
03
80
03
-1
H2O2 (mmol L )
a
a
80
Figura 7 - Concentração de proteínas solúveis totais nas folhas (a) e nas raízes (b) de
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da
concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação
de H2O2. Cada símbolo representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras
minúsculas iguais indicam que não houve diferença estatística entre os tratamentos (p>0,05).
24
4.6 Peroxidação lipídica
Em relação à peroxidação lipídica, não foram verificadas variações significativas nas
folhas em função do tratamento com H2O2, em ambos os genótipos (Figura 8a). Nas raízes, o
genótipo IACSP94-2101 não apresentou mudança em relação às plantas controle após 15
minutos de tratamento (Figura 8b). Já o genótipo IACSP94-2094 apresentou aumento na
peroxidação das raízes apenas em 3 mmol L-1. Embora com significado estatístico, esse
resultado é inconsistente uma vez que a peroxidação lipídica em 80 mmol L -1 foi inferior à
observada em 3 mmol L-1. Em 80 mmol L-1 de H2O2, o genótipo IACSP94-2094 apresentou
menor dano de membrana nas raízes se comparado ao IACSP94-2101 (Figura 8b).
(a)
IACSP94-2101
IACSP94-2094
(b)
30
-1
MDA (nmol g MF)
40
a
a a
20
a
10 a a
0
*
*
aa
a
b
03
a
80
03
-1
H2O2 (mmol L )
b
80
Figura 8 - Concentração de aldeído malônico (MDA) nas folhas (a) e nas raízes (b) de
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da
concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação
de H2O2. Cada símbolo representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras
minúsculas distintas indicam diferença estatística entre os tratamentos, enquanto asteriscos
indicam diferença estatística entre os genótipos (Tukey, p<0,05).
4.7 Condutância hidráulica das raízes
A condutância hidráulica das raízes foi reduzida com o aumento da concentração de
H2O2 em ambos os genótipos (Figura 9). Todavia, IACSP94-2101 apresentou queda de Lp de
46% em 3 mmol L-1 e de 85% em 80 mmol L-1, enquanto que IACSP94-2094 apresentou
redução de Lp de 27% em 3 mmol L-1 e de 60% em 80 mmol L-1. Logo, o genótipo IACSP94-
25
2094 tem Lp menos afetado pela aplicação de H2O2 e apresenta maiores valores que
-2
-1
-1
Lp (mmol m s MPa )
IACSP94-2101 em ambos os tratamentos com H2O2 (Figura 9).
2,5
2,0
1,5
IACSP94-2101
IACSP94-2094
*
1,0
*
0,5
0,0 a b
03
c
80
H2O2 (mmol L )
-1
Figura 9 - Condutância hidráulica de raízes (Lp) em genótipos de cana-de-açúcar IACSP942101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da concentração de H2O2 na solução nutritiva.
Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação de H2O2. Cada ponto representa a média de
três repetições ± desvio padrão. A interação genótipo vs. H2O2 não foi significativa e as letras
comparam as doses de H2O2 considerando as médias compostas pelos dois genótipos.
Asteriscos indicam diferença estatística entre os genótipos (Tukey, p<0,05).
4.8 Trocas gasosas
Houve redução da assimilação de CO2 com o aumento da dose de H2O2 na solução
nutritiva, em ambos os genótipos (Figura 10a). Todavia, as redução em A foi sempre menor
em IACSP94-2094 se comparado ao IACSP94-2101, sendo cerca de 4% vs. 30% em 3 mmol
L-1 e de 45% vs. 64% em 80 mmol L-1. IACSP94-2094 ainda apresentou maiores valores de
fotossíntese se comparado ao IACSP94-2101 após 15 minutos de tratamento com H2O2
(Figura 10a). Na análise da condutância estomática, verificou-se queda conforme o aumento
da dose de H2O2 na solução nutritiva para ambos os genótipos (Figura 10b). Embora tenha
apresentado maior condutância estomática do que IACSP94-2094 nas plantas controle, houve
maior redução de gs em IACSP94-2101 quando tratada com H2O2 (Figura 10b).
26
*
-2
-1
20
0,20
(a)
16
12
IACSP94-2101
IACSP94-2094
*
0
0,15
b
b
ab
03
0,10
a
c
80
03
-1
H2O2 (mmol L )
c
0,05
-1
4
*a
-2
8
(b)
gs (mol m s )
A (mol m s )
24
c
80
0,00
Figura 10 - Assimilação de CO2 (A, em a) e condutância estomática (gs, em b) na folha +1 de
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da
concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação
de H2O2. Cada símbolo representa a média de três repetições ± desvio padrão. Em (a), a
interação genótipo vs. H2O2 não foi significativa e as letras comparam as doses de H2O2
considerando as médias compostas pelos dois genótipos. Em (b), letras minúsculas distintas
indicam diferença estatística entre os tratamentos, enquanto asteriscos indicam diferença
estatística entre os genótipos (Tukey, p<0,05).
Após 15 minutos de tratamento ambos os genótipos apresentaram redução de A/CI em
80 mmol L-1 (Figura 11a), variando entre -32% (IACSP94-2094) e -37% (IACSP94-2101).
Em relação à eficiência do uso da água, verificou-se aumento de A/gs em ambos os genótipos
quando tratados com H2O2 (Figura 11b). Os valores médios de A/CI e A/gs em IACSP942094 foram sempre superiores aos de IACSP94-2101 quando as plantas foram submetidas ao
H2O2.
4.9 Atividade fotoquímica
Não houve decréscimo da eficiência quântica potencial do fotossistema II (FV/FM) nas
plantas submetidas às diferentes concentrações de H 2O2, sendo os valores similares em ambos
os genótipos (Tabela 1).
27
-1
-1
-2
2,5
2,0
250
(a)
*
*
200
*
1,0
100
50
aa
03
b
ba
80
03
-1
H2O2 (mmol L )
-1
0,0
*
(b)
150
1,5
0,5
IACSP94-2101
IACSP94-2094
A/gs (mol mol )
A/CI (mol m s Pa )
3,0
a
0
80
Figura 11 - Eficiência instantânea de carboxilação (A/CI, em a) e eficiência intrínseca do uso
da água (A/gs, em b) na folha +1 de genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2101 (●) e
IACSP94-2094 (○) em função da concentração de H2O2 na solução nutritiva. Medidas
realizadas após 15 minutos de aplicação de H2O2. Cada símbolo representa a média de três
repetições ± desvio padrão. A interação genótipo vs. H2O2 não foi significativa e as letras
comparam as doses de H2O2 considerando as médias compostas pelos dois genótipos.
Asteriscos indicam diferença estatística entre os genótipos (Tukey, p<0,05).
Tabela 1 - Eficiência quântica potencial do fotossistema II (Fv/Fm) na folha +1 de genótipos
de cana-de-açúcar IACSP94-2101 e IACSP94-2094 em função da concentração de H2O2 na
solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação de H2O2.
Tratamentos
IACSP94-2101
IACSP94-2094
Controle
0,770 ± 0,003 aA
0,772 ± 0,006 aA
3 mmol L-1
0,763 ± 0,011 aA
0,766 ± 0,004 aA
80 mmol L-1
0,771 ± 0,005 aA
0,760 ± 0,005 aA
Cada valor representa a média de três repetições ± desvio padrão. Letras minúsculas iguais indicam
que não houve diferença estatística entre os tratamentos, enquanto letras maiúsculas iguais indicam
que não houve diferença entre os genótipos (p>0,05).
O transporte aparente de elétrons (ETR) foi reduzido pelo aumento da concentração de
H2O2 na solução nutritiva após 15 minutos de exposição, em ambos os genótipos (Figura 12).
No entanto, a redução de ETR foi menor em IACSP94-2094 quando comparado a IACSP942101, principalmente no tratamento com 80 mmol L-1 (-25% vs. -38%). IACSP94-2094 teve
maior ETR que IACSP94-2101 quando tratado com 80 mmol L-1 de H2O2.
28
-2
-1
ETR (mol m s )
150
IACSP94-2101
IACSP94-2094
120
*
90
60
30
0
ab
c
03
80
H2O2 (mmol L )
-1
Figura 12 - Transporte aparente de elétrons (ETR) na folha +1 de genótipos de cana-deaçúcar IACSP94-2101 (●) e IACSP94-2094 (○) em função da concentração de H2O2 na
solução nutritiva. Medidas realizadas após 15 minutos de aplicação de H2O2. Cada símbolo
representa a média de três repetições ± desvio padrão. A interação genótipo vs. H2O2 não foi
significativa e as letras comparam as doses de H2O2 considerando as médias compostas pelos
dois genótipos. Asterisco indica diferença estatística entre os genótipos (Tukey, p<0,05).
29
5 DISCUSSÃO
Os resultados revelaram que a aplicação de H2O2 na solução nutritiva afetou
significativamente as plantas de cana-de-açúcar. Todavia, os efeitos foram dependentes da
concentração de H2O2 usada e também do genótipo de cana-de-açúcar considerado. A
discussão dos resultados será feita em três etapas e na primeira consideraremos os efeitos
esperados da aplicação de H2O2 no sistema radicular das plantas. Na segunda e terceira etapas
trataremos de como baixas e altas concentrações, respectivamente, afetam a fisiologia da
cana-de-açúcar, dando ênfase às variações genotípicas.
Em geral, a aplicação do H2O2 na solução nutritiva é reconhecida e sinalizada pelo
sistema radicular gerando um estresse oxidativo ainda no apoplasto pelo acúmulo de ânion
superóxido, promovendo assim a formação de outras EROs (BIENERT et al., 2006;
BOLWELL et al., 2001). O acúmulo de EROs nas raízes desencadeia uma resposta
antioxidante (LAWLOR, 2001; CRUZ DE CARVALHO, 2008) e a primeira enzima a agir é a
superóxido dismutase, responsável pela dismutação do ânion superóxido e geração de H2O2
(BIENERT, 2007). A degradação do H2O2 é obtida pela ação das enzimas catalase e ascorbato
peroxidase, sendo essa última mais importante na presença de baixas concentrações do H2O2.
A catalase, por sua vez, atua na eliminação de altas concentrações de H 2O2, tendo a função
principal de composto desintoxicante (MITLER, 2002). De acordo com o grau do estresse
gerado danos celulares podem ocorrer, como a degradação de proteínas e da membrana
plasmática, que serão maiores ou menores dependendo da capacidade do sistema antioxidante
em degradar o H2O2 (DESIKAN, 2004; GILL & TUTEJA, 2010).
O transporte das EROs é provavelmente inexistente na maioria dos casos, visto a curta
meia vida destas, o que impossibilitaria seu transporte à longas distâncias. Porém, se existe
alguma ERO capaz de ser transportada a pequenas distâncias no xilema pelo fluxo
transpiratório é o H2O2 devido a sua maior meia vida de alguns milissegundos comparada às
outras EROs (MULINEAUX et al., 2006; SLESAK et al., 2007). A presença do H2O2 na raiz
poderia afetar de alguma forma o transporte de água por entre as membranas celulares por
inativação das proteínas de transporte de água, as aquaporinas. Com a perda de função das
aquaporinas, a condutância hidráulica é reduzida e assim há redução no fluxo de água na
planta (YE & STEUDLE, 2006; BIENERT et al., 2007; POU et al., 2013).
Na condição de baixa disponibilidade hídrica a abertura estomática é reduzida para
evitar perda excessiva de vapor de água para a atmosfera. No entanto, o fechamento
30
estomático afeta também a assimilação de CO2 devido à menor disponibilidade de CO2,
causando inicialmente um desbalanço entre a atividade fotoquímica e a bioquímica
(LAWLOR, 2001; CRUZ DE CARVALHO, 2008). Dessa forma, há acúmulo de
intermediários reduzidos na cadeira transportadora de elétrons nos tilacóides e aumento da
produção de EROs nas folhas. Nesse contexto, a atividade fotoquímica e bioquímica da
fotossíntese pode ser reduzida e tal redução será regulada pela capacidade do sistema
antioxidante nas folhas. Organismos menos sensíveis à falta de água possivelmente
apresentam maior fluxo de água na planta e por isso podem ser menos afetados quando se
considera a abertura estomática e a assimilação de CO2 (MACHADO et al., 2009). Além da
manutenção do fluxo de água, o sistema antioxidante de genótipos menos sensíveis deve ser
efetivo para impedir ou minimizar os efeitos deletérios gerados pelo estresse oxidativo
(MITLER et al., 2004).
Quando consideradas as respostas da cana-de-açúcar à baixa concentração de H2O2 na
solução nutritiva, não houve aumento na atividade da enzima SOD na raiz em ambos os
genótipos, sugerindo que não houve a geração de estresse oxidativo no sistema radicular
(Figura 3b). Esta interpretação pode ser confirmada pela ausência de alteração na quantidade
de H2O2 no tecido radicular e da manutenção ou mesmo redução da atividade das enzimas
responsáveis por sua eliminação, CAT e APX (Figuras 4b, 5b e 6b). Embora tenha sido
verificado aumento na concentração de MDA no genótipo IACSP94-2094, aparentemente este
aumento foi inconsistente e os teores de proteína nas raízes dos genótipos permaneceram
inalterados (Figuras 8b e 7b).
A condutância hidráulica das raízes (Lp) foi reduzida com a aplicação de 3 mmol L -1
de H2O2 em ambos os genótipos, com consequente decréscimo da condutância estomática e da
assimilação de CO2 (Figuras 9, 10b, 10a). A redução de Lp poderia ser explicada pela inibição
do fluxo de água através das aquaporinas causado pelo H2O2 (EHLERT et al., 2009). No
entanto, Lp foi reduzido sem que houvesse aumento do teor de H2O2 nas raízes, sugerindo a
sensibilidade das raízes ao aumento da concentração de H2O2 no substrato de crescimento,
i.e., na solução nutritiva. A redução da fotossíntese foi associada à menor abertura estomática
e de ETR (Figuras 10b e 12). Como não houve redução no teor de clorofila (dados não
apresentados) e FV/FM permaneceu inalterado em ambos os genótipos (Tabela 1), pode-se
sugerir que a redução de ETR representa um mecanismo fisiológico relacionado ao
fechamento dos centros de reação do FSII para evitar o excesso de pressão energética nos
fotossistemas. Ainda, as reações de carboxilação da fotossíntese parecem não ter sido afetadas
31
pela aplicação de 3 mmol L-1 de H2O2 na solução nutritiva, conforme indicado pela relação
A/CI (Figura 11a).
Mesmo com a redução de ETR, os resultados sugerem a ocorrência de alteração no
balanço redox nas folhas de IACSP94-2101, a qual estaria associada ao excesso de pressão
energética no aparato fotoquímico. De fato, houve redução na atividade da APX e aumento do
teor de H2O2 nas folhas de IACSP94-2101 (Figuras 4a e 6a). Ainda que trabalhos citem que
concentrações de H2O2 consideradas normais em folhas geralmente são menores que 0,1 µmol
g-1 MF (VELJOVIK-JOVANOVIC et al., 2002), podendo a chegar a 5 µmol g-1 MF
(CHESSEMAN, 2006), teores ao redor de 0,5 µmol g-1 MF foram suficientes para gerar
alterações na atividade das enzimas do sistema antioxidante nesse estudo. Nas folhas, o
genótipo IACSP94-2094 apresentou aumento na atividade da enzima SOD, porém, esta não
causou mudanças no teor de H2O2 (Figuras 3a e 4a). Esta resposta está de acordo com a
ausência de alteração das atividades da APX e da CAT (Figuras 5a e 6a). No genótipo
IACSP94-2101, a concentração de SOD nas folhas não foi alterada apesar de um pequeno
aumento na concentração de H2O2 e a justificativa desse aumento seria a inibição da atividade
da APX (Figuras 3a, 4a e 6a). A enzima APX é encontrada substancialmente nos cloroplastos,
onde ocorre constantemente a oxidação e redução de glutationa e ascorbato necessários no
ciclo do ascorbato-glutationa. A remoção do H2O2 é obtida por ação da APX que oxida
ascorbato a monodeidroascorbato (GILL & TUTEJA, 2010). Mesmo com o aumento no teor
de H2O2 em IACSP94-2101, não houve dano de membrana e o teor de proteínas foliares
permaneceu inalterado (Figuras 7a e 8a).
Com base nessas respostas fisiológicas, pode-se sugerir um modelo de como o
aumento da concentração de H2O2 na solução nutritiva afeta genótipos de cana-de-açúcar com
tolerância diferencial ao déficit hídrico (Figura 13). A principal diferença entre os genótipos
diz respeito à sensibilidade ao H2O2, sendo o material tolerante à seca (IACSP94-2094)
menos afetado quando considerados Lp, gs e A se comparado ao genótipo sensível IACSP942101 (Figuras 9 e 10a,b). Além da menor sensibilidade, IACSP94-2094 apresentou aumento
da atividade da SOD nas folhas enquanto IACSP94-2101 teve redução da atividade da APX e
aumento do teor de H2O2 nas folhas (Figura 13).
32
IACSP94-2101
SENSÍVEL
IACSP94-2094
TOLERANTE
·¯
·¯
O2
O2
HO
HO
2
2
HO
HO
2 2
2 2
·¯
·¯
O2
O2
HO
HO
2
2
=
Figura 13 - Reação do sistema antioxidante, trocas gasosas e relações hídricas nas folhas e
nas raízes de genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (tolerante ao déficit hídrico) e
IACSP94-2101 (sensível ao déficit hídrico) ao aumento da concentração de H2O2 na solução
nutritiva (3 mmol L-1). SOD: superóxido dismutase; APX: ascorbato peroxidase; CAT:
catalase; MDA: aldeído malônico; Prot: proteínas s. totais; O2 -·: ânion superóxido; H2O2:
peróxido de hidrogênio; H2O: água; Lp: condutância hidráulica de raízes; gs: condutância
estomática; A: assimilação de CO2, A/CI: eficiência instantânea de carboxilação e A/gs:
eficiência intrínseca do uso da água. A cor verde indica aumento da atividade/teor; a cor
amarela indica manutenção da atividade/teor, a cor vermelha indica redução da atividade/teor.
Quando considerada a alta concentração de H2O2 na solução nutritiva, houve aumento
na atividade da enzima SOD nas raízes do genótipo IACSP94-2094 (Figura 3b), indicando
estresse oxidativo. Como consequência, houve aumento na concentração de H2O2 nas raízes
de IACSP94-2094 (Figura 4b) e a via de desintoxicação do H2O2 ativada foi pela enzima
CAT, já que a atividade da APX foi reduzida (Figura 6b). Sabe-se que a catalase tem como
função primordial a eliminação de H2O2 (MITLER, 2002; GILL & TUTEJA, 2010), que
chegou a concentrações ao redor de 2 mol g-1 MF nas raízes de IACSP94-2094 (Figura 5b).
Pode-se considerar que a ação do sistema antioxidante foi efetiva no impedimento de danos
33
de membrana já que não houve alteração nas concentrações de MDA e o teor de proteínas
permaneceu estável (Figuras 7b e 8b).
Nas raízes do genótipo IACSP94-2101, houve acúmulo de H2O2 e este não foi gerado
por dismutação via atividade da SOD (Figuras 3b e 4b). Uma possível explicação seria a
dismutação espontânea do ânion superóxido a H2O2 (BOLWELL et al., 2001), todavia, os
resultados indicam que houve acúmulo de H2O2 devido à redução das atividades da APX e
CAT nas raízes de IACSP94-2101 (Figuras 4b, 5b e 6b). Apesar disso, o teor de proteínas
permaneceu estável, assim como o nível de peroxidação lipídica (Figuras 7b e 8b). Seria
possível que uma análise posterior (após horas de tratamento) da integridade de membranas e
do teor proteico revelasse danos celulares significativos e assim as respostas fisiológicas
observadas nesse estudo representam as primeiras reações do metabolismo, antes da
ocorrência de um estresse oxidativo severo.
A redução da atividade da APX nas raízes de IACSP94-2101 poderia estar relacionada
à oxidação não enzimática do ascorbato, o seu substrato. Como produto da oxidação do
ascorbato, há também a produção de H2O2, o que contribuiria para o aumento dessa ERO nos
tecidos (DEBOLT et al., 2007). Além disso, a própria APX assim como outras peroxidases
produzem transitoriamente H2O2 na presença de ferro III (BINDSCHEDER et al., 2006). Em
relação à inibição da CAT, POLIDOROS & SCANDALIOS (1999) reportaram que altas
concentrações de H2O2 podem levar a uma “explosão” oxidativa, causando uma inibição
sistêmica da expressão gênica de CAT.
As altas concentrações de H2O2 nas raízes causaram redução de Lp em ambos os
genótipos, com consequências para gs e A (Figuras 9 e 10a,b). A redução de Lp estaria
associada à inibição das aquaporinas mediada pelo aumento do teor de H 2O2 nas raízes dos
dois genótipos estudados (BOURSIAC et al., 2008). Apesar de IACSP94-2094 ter acumulado
mais H2O2 na raiz, a inibição da Lp foi menor quando comparado a IACSP94-2101 (Figuras
4b e 9). Logo, o genótipo IACSP94-2101 apresenta maior sensibilidade de Lp ao acúmulo de
H2O2. Seria razoável supor que exista uma sensibilidade diferencial dos tipos de aquaporinas
presentes nas raízes dos genótipos ao H2O2, de forma que a presença ou abundância de um
determinado tipo cause variação na sensibilidade ao H2O2. Neste estudo, há evidências de que
a condição estressante no sistema radicular é sinalizada hidraulicamente, via redução do
transporte de água e consequente fechamento estomático.
Além da redução da atividade fotoquímica, houve também redução da eficiência de
carboxilação da fotossíntese nas plantas tratadas com 80 mmol L -1 de H2O2 (Figuras 11a e
12). Uma vez que a fotossíntese é reduzida e há pressão energética no aparato fotoquímico,
34
com acúmulo de intermediários reduzidos, a produção de EROs nos cloroplastos é uma
consequência do metabolismo oxigênico (BIEHLER & FOCK, 1996). Tal como constatado
em baixa concentração de H2O2, o decréscimo de ETR parece ser uma resposta fisiológica
para reduzir a produção de EROs e impedir maiores danos. Evidências nesse sentido são a
manutenção de FV/FM, dos teores de clorofila e de MDA nas folhas (Tabela 1; Figura 8a).
Além dessas, a relação ETR/A foi sempre na média de 10 mol mol-1, sugerindo que mesmo
com redução de ETR havia elétrons suficientes para permitir a fixação do CO 2. Portanto, a
fotossíntese dos genótipos estudados foi inibida por limitações de origem difusiva (estômatos)
e bioquímica (carboxilação).
Assim como no sistema radicular, verificou-se que a alta concentração do H2O2 na
solução nutritiva aumentou a atividade da enzima SOD nas folhas de IACSP94-2094 (Figura
4a), indicando que houve produção de superóxido na parte aérea. Como produto da atividade
da SOD, houve aumento no teor de H2O2 nas folhas de IACSP94-2094 e as enzimas APX e
CAT não foram ativadas para remover essa ERO (Figuras 4a, 5a e 6a). O genótipo IACSP942101 não apresentou alterações na atividade da SOD e houve aumento do teor de H 2O2 nas
folhas associado à redução nas atividades da APX e CAT quando as plantas foram expostas a
80 mmol L-1 de H2O2 na solução nutritiva (Figuras 4a, 5a e 6a). Não foram detectados danos
de membrana e houve manutenção na concentração de proteínas solúveis totais em ambos os
genótipos (Figuras 7a e 8a).
Nesse estudo também é proposto um modelo de como as plantas de cana-de-açúcar
reagem à concentração elevada de H2O2 no substrato de crescimento, tendo como base as
respostas fisiológicas detectadas nas raízes e nas folhas (Figura 14). Basicamente, as
diferenças entre o genótipo tolerante (IACSP94-2094) e o sensível (IACSP94-2101) residem
na indução da atividade da SOD nas folhas e raízes e da CAT nas raízes das plantas tolerantes
e na sensibilidade da CAT nas plantas sensíveis. Enquanto a SOD é a primeira enzima a atuar
no sistema antioxidante das plantas dismutando superóxido, as catalases atuam como primeira
enzima na desintoxicação do H2O2, sendo posteriormente seguida pela APX que atua na
presença do H2O2 apenas em concentrações baixas. A CAT está localizada principalmente nos
peroxissomos e atua rapidamente evitando a dispersão do H2O2 para outros compartimentos
celulares (MITLER, 2002; YABUTA et al., 2002).
35
IACSP94-2101
SENSÍVEL
IACSP94-2094
TOLERANTE
·¯
·¯
O2
O2
HO
HO
2
2
HO
HO
2 2
2 2
·¯
·¯
O2
O2
HO
HO
2
2
=
Figura 14 - Reação do sistema antioxidante, trocas gasosas e relações hídricas nas folhas e
nas raízes de genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (tolerante ao déficit hídrico) e
IACSP94-2101 (sensível ao déficit hídrico) ao aumento da concentração de H 2O2 na solução
nutritiva (80 mmol L-1). SOD: superóxido dismutase; APX: ascorbato peroxidase; CAT:
catalase; MDA: aldeído malônico; Prot: proteínas s. totais; O 2 -·: ânion superóxido; H2O2:
peróxido de hidrogênio; H2O: água; Lp: condutância hidráulica de raízes; gs: condutância
estomática; A: assimilação de CO2, A/CI: eficiência instantânea de carboxilação e A/gs:
eficiência intrínseca do uso da água. A cor verde indica aumento da atividade/teor; a cor
amarela indica manutenção da atividade/teor, a cor vermelha indica redução da atividade/teor.
De uma forma geral, as respostas antioxidantes de IACSP94-2094 parecem ter como
intuito o rápido controle do estado redox celular, sendo ativadas mesmo em baixas
concentrações de H2O2 no substrato (Figura 13). Esse mecanismo de controle ocorre no
sistema radicular e nas folhas para evitar dano oxidativo, sendo uma característica do
genótipo que tem tolerância ao déficit hídrico. Por outro lado, pode-se sugerir a menor
efetividade do sistema antioxidante enzimático no genótipo sensível à seca, com IACSP94-
36
2101 apresentando maior sensibilidade das relações hídricas e da fotossíntese ao aumento de
H2O2 no substrato (Figuras 4b e 10a,b).
A estratégia de aumentar a disponibilidade de H2O2 no meio radicular e induzir o
aumento de EROs no sistema radicular das plantas poderia simular a ocorrência de um déficit
hídrico, uma vez que estresses abióticos também levam ao estresse oxidativo (CRUZ DE
CARVALHO, 2008). A condição com menor concentração de H2O2 estaria mais próxima de
uma condição real de cultivo de cana-de-açúcar, onde o déficit hídrico é induzido mais
lentamente. Nesse contexto, as respostas fisiológicas apresentadas pelo genótipo IACSP942094 estão de acordo com a sua tolerância à seca reportada por MACHADO et al. (2009) e
RIBEIRO et al. (2013). Em uma condição de estresse agudo, simulada pela maior
concentração de H2O2 no substrato, ambos os genótipos teriam dificuldades na manutenção do
balanço hídrico e da fotossíntese, sendo o crescimento limitado. Mesmo sendo severamente
afetado, o genótipo IACSP94-2094 ainda assim apresentaria maior fotossíntese do que
IACSP94-2101, sendo essa resposta associada à maior atividade fotoquímica e bioquímica
(Figuras 10a, 11a e 12). De fato, RIBEIRO et al. (2013) reportou a resistência do aparato
fotossintético de IACSP94-2094 em condição de deficiência hídrica, enquanto SALES et al.
(2013) observaram também rápida recuperação da fotossíntese nesse genótipo após a
ocorrência de estresses simultâneos de seca e baixa temperatura. Tal recuperação foi
associada à maior atividade da SOD e da APX em IACSP94-2094 quando comparado ao
genótipo sensível (SALES et al., 2013).
Evidentemente, as respostas fisiológicas tratadas nesse estudo dizem respeito à reação
do metabolismo das plantas após 15 minutos do aumento da concentração de H 2O2 na solução
nutritiva, sendo melhorada a nossa compreensão sobre os eventos iniciais associados à
indução do estresse oxidativo nas raízes de cana-de-açúcar. Para uma melhor extrapolação dos
resultados obtidos nesse estudo para a condição de campo em que as plantas são cultivadas,
torna-se necessária a análise temporal mais longa, na escala de dias. Como há poucos relatos
na literatura sobre a conexão entre o metabolismo antioxidante, as relações hídricas e o
metabolismo fotossintético em plantas, especialmente quando consideradas as raízes e as
folhas, a nossa discussão sobre as respostas observadas é limitada. Por outro lado, esta
constatação revela uma área na fisiologia de plantas que merece maior atenção, colaborando
para uma visão sistêmica do metabolismo vegetal.
37
6 CONCLUSÃO
Há variação genotípica em relação à resposta fisiológica da cana-de-açúcar ao
aumento da concentração de peróxido de hidrogênio no sistema radicular, sendo as alterações
observadas nas raízes associadas a modificações na fisiologia da parte aérea das plantas. O
genótipo IACSP94-2094, tolerante ao déficit hídrico, apresenta o sistema antioxidante
radicular mais efetivo frente ao aumento do H2O2 no meio radicular, independente da
concentração de H2O2. Em baixas concentrações de H2O2, IACSP94-2094 tem o transporte de
água e as trocas gasosas menos afetados quando comparado ao genótipo IACSP94-2101,
sensível ao déficit hídrico. Essa menor sensibilidade de IACSP94-2094 em altas
concentrações de H2O2 está associada ao aumento nas atividades da SOD nas raízes e nas
folhas e CAT nas raízes.
38
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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