ALINE ANDRADE FREUND
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DAS ATAXIAS
ESPINOCEREBELARES TIPO 1, 2, 3, 6 E 7:
ESTUDO POPULACIONAL E EM INDIVÍDUOS
COM SUSPEITA CLÍNICA
Tese apresentada como requisito à obtenção do
título de Doutor em Ciências da Saúde, do Curso
de Pós-Graduação em Medicina Interna e
Ciências da Saúde, do Setor de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Lineu César Werneck
Curitiba
2007
Livros Grátis
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ALINE ANDRADE FREUND
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DAS ATAXIAS
ESPINOCEREBELARES TIPO 1, 2, 3, 6 E 7:
ESTUDO POPULACIONAL E EM INDIVÍDUOS
COM SUSPEITA CLÍNICA
Tese apresentada como requisito à obtenção do
título de Doutor em Ciências da Saúde, do Curso
de Pós-Graduação em Medicina Interna e
Ciências da Saúde, do Setor de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Lineu César Werneck
Curitiba
2007
AGRADECIMENTOS
O dicionário Michaelis da língua portuguesa explica que gratidão é a qualidade
de quem é grato, é agradecimento e reconhecimento. Segundo o “Pequeno Tratado das
Grandes Virtudes” de André Comte-Sponville, “A gratidão é a mais agradável das
virtudes; não é, no entanto, a mais fácil. A gratidão é um mistério, não pelo prazer que
temos com ela, mas pelo obstáculo que com ela vencemos. É a mais agradável das
virtudes, e o mais virtuoso dos prazeres.”
Assim sendo é com imensa alegria e com profundo reconhecimento que
agradeço ao orientador Dr. Lineu César Werneck pela confiança. Foi com quem aprendi
que a ciência vai além da curiosidade.
Agradeço à CAPES, CNPq e Fundação Araucária, instituições que permitiram a
viabilidade prática tão bem como a possibilidade de dedicar-me a este trabalho.
Agradeço ao Dr. Hélio Teive e a sua equipe de residentes que contribuíram com
a amostra de pacientes.
Agradeço à Dra. Rosana Hermínia Scola e ao Dr. Paulo Lorenzoni que
clarearam algumas idéias auxiliando em alguns momentos difíceis.
Agradeço o apoio de minhas queridas amigas do laboratório Raquel, Eunice e
Nyvia pelos chás acompanhados de divertidas conversas indispensáveis para preencher
o coração!
Agradeço à Dra. Elvira que além da amizade, alegria e do norte profissional, foi
alguém que nunca me deixou esmorecer e que me mostrou, com seu exemplo, um
caminho nobre para ser humano!
Agradeço às minhas grandes amigas pessoais Lupe Furtado e Magda Clara pelo
carinho de sempre e pelas horas infindáveis filosofando sobre a vida e a ciência.
Agradeço aos meus pais pelo amor e pela vida!
Ao meu marido pela compreensão, companhia, amor mas principalmente pelo
bom-humor com o qual sempre soube conduzir as nossas vidas trazendo leveza para os
momentos mais impossíveis! Muito obrigada!
Enfim, a Deus por tudo!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................................. II
LISTA DE TABELAS ...............................................................................................................................III
LISTA DE ABREVIATURAS...................................................................................................................IV
RESUMO ...................................................................................................................................................VI
ABSTRACT ............................................................................................................................................. VII
I. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................8
1.1.
Ataxias hereditárias..............................................................................................................9
1.2. Ataxias cerebelares autossômicas dominantes (ACAD) ............................................................10
1.2.2. Sinais e sintomas clínicos presentes nas AEC subtipos 1, 2, 3, 6 e 7 ................................................. 15
1.2.3. Gene e proteína envolvidos nas AEC subtipos 1, 2, 3, 6 e 7 .............................................................. 17
1.2.4. Tratamento atual e perspectivas sobre patogênese e tratamento......................................................... 21
1.3. Importância do estudo em população assintomática .................................................................25
1.4. Princípio de Hardy-Weinberg....................................................................................................26
II.
OBJETIVOS .....................................................................................................................................30
2.1. Objetivo principal ......................................................................................................................31
2.2. Objetivos secundários:...............................................................................................................31
III.
MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................32
3.1 População e amostra ..................................................................................................................33
3.2. Protocolos..................................................................................................................................35
3.2.1. Extração de DNA ............................................................................................................................... 35
3.2.2. Amplificação dos genes de interesse .................................................................................................. 36
3.2.3 Detecção do produto de amplificação.................................................................................................. 39
3.3. Análise de resultados .................................................................................................................40
IV.
RESULTADOS...........................................................................................................................42
4.1. Produtos de amplificação ..........................................................................................................43
4.2. Definição dos alelos...................................................................................................................44
4.3. Freqüência alélica .....................................................................................................................49
4.4. Equilíbrio de Hardy-Weinberg e heterozigosidade ...................................................................52
4.5. Análise Clínica...........................................................................................................................56
V.
DISCUSSÃO ....................................................................................................................................62
5.1. Considerações sobre a metodologia de análise de fragmento em eletroforese de capilar ........63
5.2. Importância do estudo populacional .........................................................................................67
5.3. Metodologia para diagnóstico molecular ..................................................................................73
VI. CONCLUSÕES....................................................................................................................................77
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................................79
VIII. APÊNDICES .....................................................................................................................................97
Apêndice 1: Instrumento de coleta de dados para grupo controle ...................................................98
Apêndice 2: Instrumento de coleta de dados para pacientes............................................................99
Apêndice 3: Termo de consentimento informado livre e esclarecido - Pacientes...........................100
Apêndice 4: Termo de consentimento informado livre e esclarecido – Grupo Controle................103
Apêndice 5: Comitê de ética e de pesquisa em seres humanos.......................................................106
Apêndice 6: Representação gráfica da amostra de pacientes ........................................................108
Apêndice 7: Lista de reagentes .......................................................................................................109
Apêndice 8: Preparo de soluções....................................................................................................110
Apêndice 9: Características clínicas da amostra de 56 pacientes analisados................................111
I
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: DOENÇAS COM REPETIÇÕES EXPANDIDAS ..................................................................................18
FIGURA 2: QUADRO DE PUNNET PARA EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG. ................................................28
FIGURA 3: LOCALIZAÇÃO DE ANELAMENTO DOS INICIADORES NO LOCUS ATXN 3. .....................................38
FIGURA 4: LOCALIZAÇÃO DE ANELAMENTO DOS INICIADORES NO LOCUS ATXN 7. .....................................39
FIGURA 5: AMPLIFICAÇÃO DOS ALELOS DE TAMANHO NORMAL PARA OS GENES ATXN1, ATXN2, ATXN3,
ATXN6 E ATXN7.............................................................................................................................43
FIGURA 6: AMPLIFICAÇÃO DOS ALELOS ANORMALMENTE EXPANDIDOS OBSERVADOS NA AMOSTRA DE
PACIENTES PARA ATAXIA ESPINOCEREBELAR 2, 3, 6 E 7....................................................................44
II
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: GENÉTICA MOLECULAR DAS ATAXIAS CEREBELARES AUTOSSÔMICAS DOMINANTES .................13
TABELA 2: LIMITE DE REPETIÇÕES DAS PRINCIPAIS ATAXIAS CEREBELARES ...............................................15
TABELA 3: CÁLCULO DAS REPETIÇÕES CAG EM CADA LOCUS ....................................................................41
TABELA 4: MÉDIA (± DP) E VARIÂNCIA DOS ALELOS EM PARES DE BASE (PB) ENTRE CONTROLES E
PACIENTES ANALISADOS PARA ATAXIA ESPINOCEREBELAR 1............................................................45
TABELA 5: MÉDIA (± DP) E VARIÂNCIA DOS ALELOS EM PARES DE BASE (PB) ENTRE CONTROLES E
PACIENTES ANALISADOS PARA ATAXIA ESPINOCEREBELAR 2.............................................................46
TABELA 6: MÉDIA (± DP) E VARIÂNCIA DOS ALELOS EM PARES DE BASE (PB) ENTRE CONTROLES E
PACIENTES ANALISADOS PARA ATAXIA ESPINOCEREBELAR 3.............................................................47
TABELA 7: MÉDIA (± DP) E VARIÂNCIA DOS ALELOS EM PARES DE BASE (PB) ENTRE CONTROLES E
PACIENTES ANALISADOS PARA ATAXIA ESPINOCEREBELAR 6.............................................................48
TABELA 8: MÉDIA (± DP) E VARIÂNCIA DOS ALELOS EM PARES DE BASE (PB) ENTRE CONTROLES E
PACIENTES ANALISADOS PARA ATAXIA ESPINOCEREBELAR 7.............................................................48
TABELA 9: MÉDIA (±DP) EM PB DE CINCO REPETIÇÕES DE CORRIDA ELETROFORÉTICA EM CINCO AMOSTRAS
DIFERENTES PARA OS CINCO LOCI ......................................................................................................50
TABELA 10: FREQÜÊNCIA ALÉLICA % (± EP%) NOS CINCO LOCI ANALISADOS PARA ATAXIA
ESPINOCEREBELAR 1, 2, 3, 6 E 7 ENTRE CONTROLES E PACIENTES......................................................51
TABELA 11: FREQÜÊNCIA DAS DOENÇAS NOS 115 INDIVÍDUOS COM SUSPEITA CLÍNICA ..............................52
TABELA 12: NÚMEROS DE INDIVÍDUOS OBSERVADOS E ESPERADOS PARA OS POSSÍVEIS GENÓTIPOS DO GENE
ATXN 1 NA AMOSTRA DO GRUPO CONTROLE. ....................................................................................53
TABELA 13: NÚMEROS DE INDIVÍDUOS OBSERVADOS E ESPERADOS PARA OS POSSÍVEIS GENÓTIPOS DO GENE
ATXN 2 NA AMOSTRA DO GRUPO CONTROLE. ....................................................................................54
TABELA 14: NÚMEROS DE INDIVÍDUOS OBSERVADOS E ESPERADOS PARA OS POSSÍVEIS GENÓTIPOS DO GENE
ATXN 3 NA AMOSTRA DO GRUPO CONTROLE. ....................................................................................54
TABELA 15: NÚMEROS DE INDIVÍDUOS OBSERVADOS E ESPERADOS PARA OS POSSÍVEIS GENÓTIPOS DO GENE
CACNA 1 NA AMOSTRA DO GRUPO CONTROLE. .................................................................................55
TABELA 16: NÚMEROS DE INDIVÍDUOS OBSERVADOS E ESPERADOS PARA OS POSSÍVEIS GENÓTIPOS DO GENE
ATXN 7 NA AMOSTRA DO GRUPO CONTROLE. ....................................................................................55
TABELA 17: PROBABILIDADE OBTIDA APÓS APLICAÇÃO DO TESTE DO QUI QUADRADO (χ2) NO QUAL A
HIPÓTESE NULA É QUE NÃO HÁ DIFERENÇA SIGNIFICATIVA ENTRE AS FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS
OBSERVADAS E ESPERADAS NOS CINCO LOCI ANALISADOS (EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG)......56
TABELA 18: HETEROZIGOSIDADE OBTIDA NOS CINCO LOCI ANALISADOS. ...................................................56
TABELA 19: DADOS GERAIS DE INDIVÍDUOS COM AS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DA AMOSTRA DOS 56
PACIENTES ANALISADOS ....................................................................................................................58
TABELA 20: COMPARAÇÃO ENTRE DIAGNÓSTICO MOLECULAR E CLÍNICO DOS 115 PACIENTES PARA AEC 1,
AEC 2, AEC 3, AEC 6 E AEC 7 ........................................................................................................60
TABELA 21: NÚMERO DE PACIENTES COM A RESPECTIVA SUSPEITA CLÍNICA E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA
AMOSTRA TOTAL DE 115 PACIENTES..................................................................................................61
TABELA 22: TESTE “T” PARA AMOSTRAS INDEPENDENTES COMPARANDO A MÉDIA DOS ALELOS DE TODOS
OS 115 PACIENTES E DA POPULAÇÃO ASSINTOMÁTICA (CONTROLES). ...............................................61
TABELA 23: FREQÜÊNCIAS DE ATAXIA ESPINOCEREBELAR DESCRITAS NA POPULAÇÃO BRASILEIRA...........72
III
LISTA DE ABREVIATURAS
A= Adenina
ACAD= Ataxia Cerebelar Autossômica Dominante
AEC= Ataxia Espinocerebelar
AXH= Alanina- Aminoácido não epecificado-Histidina
ATXN= ataxin (ataxina)
C= Citosina
CAG= Citosina-Adenina-Guanina
CCD= Charge-Coupled Device (Dispositivo de Carga Acoplado)
CEP= Comitê de Ética e Pesquisa em Seres Humanos
DH= Doença de Huntington
DM= Distrofia miotônica
DMJ= Doença de Machado - Joseph
DNA= Desoxiribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico)
dNTPs = nucleotídeos (A, T, C, G)
DP= Desvio Padrão
DRPLA= Dentatorubropallidoluysian Atrophy (Atrofia dentatorubropalidoluisana)
EA= Episodic Ataxia (Ataxia Episódica)
EDTA =Ácido etilenodiamino tetracético
EP= Erro padrão
EPM= epilepsia mioclônica progressiva
FAM= fluorescência azul
G= Guanina
H= Heterozigosidade
HC-UFPR= Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná
IV
HW= Hardy-Weinberg
NED=fluorescência amarela
OMIM= Online Mendelian Inheritance of Man (Herança Mendeliana Humana online)
PAGE= Polyacrylamide gel electrophoresis (Eletroforese em gel de poliacrilamda)
pb= pares de base
PCR= Polimerase chain reaction (Reação em cadeia da polimerase)
Q= aminoácido glutamina
RNA= Ribonucleic acid (Ácido ribonucléico)
RNAm= RNA mensageiro
RNAi= RNA de interferência
ROX= fluorescência vermelha
SBMA= Spinal and bulbar muscular atrophy (Atrofia muscular bulbo espinal)
SDS= Sodium Dodecyl sulfate (N-Dodecil sulfato de sódio)
shRNA= small hairpins RNA (pequenos grampos de RNA)
SLE= Solução de Lise de Eritrócitos
T= Timina
TE= Tris - EDTA
UTR= Untranslated region (Região não traduzida)
VIC=fluorescência verde
VPP= Valor preditivo positivo
VPN = Valor preditivo negativo
Taq= Termophilus acquaticus
TRIS= Hidroximetil-aminometano
V
RESUMO
As ataxias espinocerebelares (AEC) são doenças neurodegenerativas nas quais
os pacientes apresentam sinais e sintomas semelhantes decorrente do comprometimento
do cerebelo e suas conexões. A análise da repetição (CAG)n nos loci de AEC 1, AEC 2,
AEC 3, AEC 6 e AEC 7 foi realizada para definir o tamanho e as freqüências dos alelos.
Esta análise é importante para compreensão molecular, determinação da variação
normal dos alelos na população do Paraná, utilidade diagnóstica e determinação da
frequência das doenças. A amostra consiste em 154 doadores de sangue da população
do Paraná e 115 pacientes com suspeita clínica de ataxia. Os produtos de PCR foram
submetidos à eletroforese em capilar. Em doadores de sangue o tamanho das repetições
e os respectivos alelos mais freqüentes foram: AEC 1 de 19 a 36, sendo o alelo 30 mais
freqüente (32,29%); AEC 2, de 2 a 28, com o alelo 20 mais freqüente (86,44%); AEC 3,
de 12 a 34, e mais freqüentes os alelos 12 e 20 (26,57% e 27,96% respectivamente);
AEC 6, de 2 a 13, sendo mais frequente o alelo 8 (39,59%) e AEC 7, de 2 a 10, sendo
mais frequente o alelo 4 (70,61%). Nenhum desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg foi
detectado. Nos pacientes com ataxia, o tamanho das repetições foram: AEC 1 de 23 a 36
com nenhum alelo expandido acima do normal; AEC 2 de 14 a 56 repetições com 4
alelos expandidos acima do normal; AEC 3 de 12 a 74 repetições com onze alelos
expandidos acima do normal; AEC 6 de 2 a 21 repetições com um único alelo
expandido acima do normal e AEC 7 de 2 a 50 repetições com dois alelos expandidos
em níveis anormais. A ataxia mais freqüente entre os pacientes foi a AEC 3 (21,74%),
seguido AEC 2 (5,22%), AEC 7 (2,61%), AEC 6 (0,87%) e nenhum caso de AEC 1. A
sensibilidade da metodologia foi 62,22 %, a especificidade 90,00 %, o valor preditivo
positivo (VPP) 80,00 % e o valor preditivo negativo (VPN) foi 78,75 %. Os dados
estatísticos auxiliaram na definição dos alelos e freqüências, demonstrando
reprodutibilidade e confiabilidade metodológica. A análise genética da população
assegurou a qualidade técnica além de demonstrar estabilidade alélica na população não
afetada. A metodologia utilizada no estudo atual é útil em discriminar clinicamente
indivíduos normais e afetados para o diagnóstico molecular, distinguindo geneticamente
os cinco subtipos de ataxia.
VI
ABSTRACT
The spinocerebellar ataxia (SCA) are neurodegenerative illnesses which the
patients present similar signals and symptoms due to the compromising of the
cerebellum and its connections. The trinucleotide (CAG)n repeats was done at the SCA
1, SCA 2, SCA 3, SCA 6 and SCA 7 to identify allele size ranges and frequencies. This
analysis is important for molecular understanding, determination of the normal range of
the alelles in normal population of Paraná, for diagnostic purpose and determination of
disease frequency. The sample consisted of 154 blood donors from Southern Brazil
(Paraná) and 115 patients with a clinical suspicion of ataxia. PCR products were
submitted to capillary electrophoresis. In the blood donors, the size ranges and most
frequent alleles for the five loci were: SCA 1, 19 to 36 bp and allele 30 is the most
frequent (32.29%); SCA 2, 6 to 28 bp and the most frequent is allele 20 (84.44%); SCA
3, 12 to 34 bp and allele 12 and 20 are the most frequent (26.57% e 27.96%
respectively); SCA 6, 2 to 13 bp and the most frequent is allele 8 (39.50%) and SCA 7,
2 to 10 bp and the most frequent is allele 4 (70.61%). No deviations from HW
equilibrium were detected. In the patients, the size ranges for the five loci were: SCA 1,
23 to 36 bp with no expanded alleles above normal population; SCA 2, 14 to 56 bp with
four expanded alleles higher than normal controls; SCA 3, 12 to 74 bp with 11
expanded alleles above normal population; SCA 6, 2 to 21 bp with one expanded allele
above normal population and SCA 7, 2 to 50 bp with two expanded alleles at abnormal
levels. The most frequent ataxia among patients is SCA 3 (21.74%) followed by SCA 2
(5.22%), SCA 7 (2.61%) e SCA 6 (0.87%) and no case of SCA 1. The sensitivity of the
methodology was 62.22 %, specificity 90.00 %, predictive positive value (VPP) 80.00%
and the predictive negative value (VPN) was 78.75%. The statistical data was useful for
defining alleles and their frequencies, showing reprodutibility and methodological
confidence. Population genetic analysis ensured the technical quality of the assay and
demonstrated allelic stability in the population not affected. The methodology used in
the present study can be usefull to distinguish between clinically normal individuals and
affected individuals by molecular diagnosis at the five loci analyzed.
VII
I. INTRODUÇÃO
8
Ataxia na terminologia de origem grega significa “fora de controle”. O termo
médico “ataxia” refere-se a distúrbios no controle da postura do corpo, na coordenação
motora, no controle da fala e nos movimentos oculares. O termo ataxia locomotora tem
sido empregado desde o século XIX, significando mais comumente incoordenação
motora [HARDING, 1983].
As ataxias cerebelares são ocasionadas pelo comprometimento do cerebelo e
suas conexões. Este comprometimento pode ser atribuído a causas primárias no caso das
ataxias congênitas e hereditárias; ou a causas secundárias em ataxias decorrentes de
doenças como a esclerose múltipla, tumores, doença vascular encefálica, drogas,
infecções, além de síndrome paraneoplásicas, doenças endócrinas e doenças autoimunes [HARDING, 1983].
Em 1863, Nicolaus Friedreich descreveu o primeiro tipo de ataxia primária
hereditária com sintomas clínicos de ataxia, cifoescoliose e pé cavo. A partir de então
outros autores passaram a descrever diversos sintomas distintos de ataxia, surgindo
então as primeiras classificações das doenças cerebelares
[FRIEDREICH, 1863 apud ALBANO,
2000].
1.1.Ataxias hereditárias
As ataxias hereditárias são doenças neurodegenerativas nas quais os pacientes
apresentam clinicamente ataxia, sintomas inespecíficos e em muitos casos um padrão de
herança específico. Estas ataxias são separadas em ataxias hereditárias de início precoce
e de início tardio. São consideradas ataxias hereditárias de início precoce aquelas que se
iniciam antes dos 20 anos (ex: ataxia de Friedreich). Entre estas encontram-se também
as ataxias associadas a distúrbios metabólicos e a defeitos de reparação do DNA (ex:
ataxia telangiectásica) e as ataxias congênitas [HARDING, 1983].
9
A grande heterogeneidade clínica e também anátomo-patológica dos diferentes
tipos de ataxias hereditárias
[KLOCKGETHER e cols., 2000 apud TEIVE 2005]
diagnóstico baseado somente nos achados clínicos
[SCHÖLS e cols., 2004].
torna difícil o
Atualmente, o uso
das técnicas moleculares permite diagnosticar e detectar vários loci causadores de
ataxias hereditárias. Dessa forma, é possível a utilização de uma classificação baseada
no padrão de herança (autossômica recessiva, autossômica dominante, ligada ao X e
mitocondrial), no defeito genético, no mecanismo de desenvolvimento da doença
(patofisiologia e patologia), e nas manifestações clínicas e no prognóstico [PILCH e cols., 2002
apud TEIVE, 2005; PULST, 2003 apud TEIVE, 2005].
1.2. Ataxias cerebelares autossômicas dominantes (ACAD)
As ACAD também são conhecidas como ataxias espinocerebelares (AEC) e tem
uma incidência de cerca de 1 a 3 casos para cada 100.000 habitantes
[SCHÖLS e cols., 2004].
Os pacientes com AEC apresentam os primeiros sintomas geralmente na fase adulta.
Em uma mesma família podem existir afetados nas diferentes gerações. Normalmente
indivíduos afetados são heterozigotos para o gene.
A mais comum das AEC é a doença de Machado-Joseph (DMJ), também
chamada de ataxia autossômica dominante tipo 3, ou ainda ataxia espinocerebelar tipo 3
(AEC 3). A DMJ é encontrada nos principais estudos epidemiológicos mundiais, sendo
até o presente momento a forma mais comum de AEC encontrada no Brasil [JARDIM e cols.,
2001; LOPES-CENDES e cols., 1997; SILVEIRA e cols. 1996; TEIVE e cols., 2001].
A DMJ recebe esse nome
porque originalmente foi descrita na família Machado, descendentes de emigrantes
portugueses açorianos radicados em Massachussets, e na família Joseph, descendentes
de José Bastiana, originário dos Açores
[NAKANO e cols., 1972 apud TEIVE, 2005; ROSENBERG e cols.,
1976 apud TEIVE, 2005; WOODS e SHAUMBURG, 1972; apud TEIVE, 2005].
10
A característica das mutações mais freqüentes que desencadeiam AEC é o
aumento do número de repetições de uma determinada seqüência de nucleotídeos acima
do encontrado em pessoas sem histórico da doença. O aumento de repetições do
trinucletídeo CAG é a causa mais freqüente de AEC (Tabela 1).
As expansões dinâmicas, como são conhecidas essas mutações, decorrem da
instabilidade do DNA repetido num mesmo locus, ocasionando maior propensão a
deslizes da enzima DNA polimerase. Estes deslizes acarretam a inserção de mais
nucleotídeos nesse segmento, favorecendo a expansão. Assim, a ocorrência da primeira
mutação aumenta a chance de novos deslizes nesses sítios, levando a mais expansões e
mais deslizes
[RICHARDS e cols., 1992].
Acredita-se que a base biológica das repetições na
expansão seja a instabilidade das repetições durante a divisão celular tanto na meiose
quanto na mitose
[DEKA e cols., 1999; TAKIYAMA e cols., 1995; TAKIYAMA e cols., 1999].
Esta
instabilidade gera, pelo processo de contração e conversão gênica, diferentes populações
celulares com diferentes números de repetições formando um mosaico de células. A
instabilidade na meiose ocasiona o mosaicismo gonadal observado no esperma de
pacientes. Durante a transmissão estes pacientes apresentam tendência ao aumento do
tamanho da expansão através das gerações. Este mosaicismo quando ocorre durante a
mitose, é detectado em células somáticas (mosaicismo somático) incluindo linfócitos,
células musculares e sistema nervoso central, porém é menos acentuado que o
mosaicismo gonadal [KAMEYA e cols., 1995; MACIEL e cols., 1997; STEVANIN e cols., 2000].
Vários autores descrevem que na maior parte dessas doenças causadas por
aumento no número de repetições, há diferenças quanto à gravidade das manifestações
clínicas e a idade de início dos sintomas dependendo de qual genitor a alelo expandido é
herdado. Entre as AEC, quando a transmissão é paterna, verifica-se uma tendência ao
aumento no numero de repetições nos filhos, ao contrário de quando o alelo expandido é
11
transmitido pela mãe, no qual essa tendência não é observada. Portanto, esta
transmissão paterna implica em manifestações clínicas mais graves nos filhos que
muitas vezes podem apresentar os primeiros sintomas de ataxia anterior aos pais.
Normalmente, quanto mais grave e quanto mais cedo se dá o início dos sintomas, maior
é o número das repetições. Esta observação é conhecida como antecipação de sintomas
e é comum nas doenças de expansão [FRASER, 1998 apud ALBANO, 2000].
1.2.1. Distribuição geográfica das AEC
A prevalência das ataxias hereditárias é variável ao redor do mundo. Em Cuba, a
prevalência de AEC 2 é a mais elevada do mundo sendo em média de 43 casos por
100.000 habitantes [VELÁZQUEZ-PÉREZ e cols., 2001] e em Portugal, no arquipélago dos Açores,
a DMJ apresenta prevalência de 1 para 2402
(10/01/2008).
[LIMA e cols. 1997 em http://www.aaadmj.com/doenca.php]
No Brasil, nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Goiás e do Espírito Santo,
foram encontradas 33 famílias com AEC. Dentro dessas famílias existem 426 pacientes
afetados, com prevalência média de 6,55 casos por 100.000 habitantes
apud TEIVE, 2005].
[CASSA e cols., 1996
No estado do Rio Grande do Sul foram avaliados 66 casos de AEC sendo
a proporção de casos de doença de Machado Joseph (DMJ) mais alta em relação às
outras AEC estimando-se como 1,8/100.000 e 0,2/100.000 respectivamente, sugerindo
um efeito fundador açoriano [JARDIM e cols., 2001; SILVEIRA e cols., 1996].
Observa-se uma correlação entre origem étnica e a prevalência de determinada mutação
que causa AEC. A prevalência das diferentes ataxias variam conforme o país e as
características étnicas. Dessa forma, a freqüência alélica das expansões também é
característica para cada população
[BRUSCO e cols., 2004; DRYER e cols., 2003; LIMA e cols., 2005;
MARUYAMA e cols., 2002; MOSELEY e cols., 1998; SALEEM e cols., 2000; SCHÖLS e cols., 1997; SCHÖLS e cols., 2004;
SHIMIZU e cols., 2004; SILVEIRA e cols., 2002; STOREY e cols., 2000; TANG e cols., 2000; TAKANO e cols., 1998; VAN DE
WARRENBURG e cols., 2002; ZORTEA e cols., 2004].
Dentro das AEC, as mais freqüentes ao redor do
12
mundo são os subtipos de AEC 1 (6%), AEC 2 (15%), AEC 3/DMJ (21%), AEC 6
(15%) e AEC 7 (5%) [BIRD e cols., 2007 em http://www.geneclinics.org/profiles/ataxias/details.html#diffdx] (10/01/08).
Tabela 1: Genética molecular das ataxias cerebelares autossômicas dominantes
Doença
Locus
Gene/ Proteína
AEC 1
6p23
ATXN1/ataxina -1
AEC 2
12q23-24.1
ATXN2/ataxina -2
MJD/ AEC 3
14q21
ATXN3/ataxina - 3
AEC 4
16q24
Desconhecida
AEC 5
11p11-q11
AEC 6
19p13
CACNA1/ Canal de Cálcio
AEC 7
3p21.2-12
ATXN7/Ataxina -7
AEC 8
13p21
KLHL1AS/?
SPTBN2/ Cadeia β da espectrina do
cérebro
AEC 10
22q13
ATXN10/Ataxina - 10
AEC 11
15q14-21.3
Desconhecida
PPP2R2B/ Proteína Serina/treonina
Mutação
Ref. Bibliográfica
CAG/resíduo
poliglutamina
RICH e cols., 1987
CAG/resíduo
poliglutamina
GISPERT e cols., 1993
CAG/resíduo
poliglutamina
KAWAGUCHI e cols., 1994
Desconhecida
FLANIGAN e cols., 1996
Desconhecida
IKEDA e cols., 2006
CAG/resíduo
poliglutamina
ISHIKAWA e cols., 1997
CAG/resíduo
poliglutamina
CTG/3´UTR
BENOMAR e cols., 1994
VINCENT e cols., 2000
Expansão ATTCT /
íntron 9
MATSUURA e cols., 2000
Desconhecida
WORTH e cols., 1999
CAG/ não traduzida
HOLMES e cols., 1999
FUJIGASAKI e cols. 2001
Desconhecida
HERMAN-BERT e cols., 2000
WATERS e cols. 2006
AEC 12
5q31-33
AEC 13
19q13.3-13.4
KCNC3/ Canal de potássio
AEC 14
19q13.4
PRKCG/ proteína quinase C (γ)
AEC 15
3 p24.2
Desconhecida
Desconhecida
KNIGHT e cols., 2003
AEC 16
3p26.2
CNTN4/ Contactina- 4
Desconhecida
MIURA e cols. 2006
fosfatase 2A, (subunidade β)
Mutação de ponto no
exon 4
YAMASHITA e cols., 2000
CAG/resíduo
AEC 17
6q27
TBP/TFIID
AEC 19
1p21-q21
SCA19/?
Desconhecida
VERBEEK e cols. 2002,
SCHELHAAS e cols. 2004
AEC 20
11 centromérico
SCA20/?
Desconhecida
KNIGHT e cols. 2004
AEC 21
7p21-15
SCA21/?
Desconhecida
VUILLAUME e cols. 2002
Desconhecida
VAN SWIETEN e cols. 2003
AEC 27
13q34
DRPLA
12p13.31
EA 1
12p13
EA 2
19p13
FGF14/Fator de crescimento de
fibroblasto 14
poliglutamina
DRPLA/ Proteína relacionada a
CAG/resíduo
atrofina-1
poliglutamina
KCNA1/Canal de potássio subfamília A
membro 1
CACNA1A/Canalde cálcio tipo P/Q
subunidade α 1A
NAKAMURA e cols. 2001
NAGAFUCHI e cols., 1994
Mutação de ponto
LITT e cols., 1994
Mutação de ponto
DIRIONG e cols. 1995
OPHOFF, e cols. 1996
AEC-Ataxia espinocerebelar SCA - spinocerebellar ataxia; EA - episodic ataxia; DRPLA Dentatorubral-Pallidoluysian Atrophy
Retirado do site: [BIRD e cols., 2007 em http://www.geneclinics.org/profiles/ataxias/details.html#diffdx] (10/01/08).
13
A análise das mutações em uma amostra da população brasileira mostra o perfil
das mutações mais freqüentes, caracterizando a população, que apresenta um alto índice
de miscigenação. Assim sendo, no Brasil, um estudo realizado por LOPES-CENDES
em 1997, mostrou a freqüência das mutações que causam AEC 1, AEC 2, MJD/AEC 3
e DRPLA em 328 pacientes brasileiros de diferentes regiões do país (Rio Grande do
Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e Bahia). A
freqüência de AEC 1 foi 3%, AEC 2 em 6%, DMJ/AEC 3 foi 30% e nenhuma mutação
foi encontrada para DRPLA.
Existe um limite de repetições CAG característico de cada uma das AEC para
pessoas normais e para indivíduos que apresentam a doença. Além disso, encontram-se
alelos intermediários em estudos com famílias. A presença desses grupos distintos de
alelos evidencia a importância da definição da faixa de repetições CAG para indivíduos
normais e pacientes. Indivíduos com alelos intermediários podem não manifestar
clinicamente a doença enquanto outros indivíduos com o mesmo alelo intermediário
podem apresentar sinais e sintomas, podendo ser considerados alelos com penetrância
reduzida
[ANDREW e cols., 1997].
Esta faixa de repetição CAG também pode variar de
população para população.
Na doença de Huntington (DH), doença que apresenta o mesmo tipo de mutação,
e com maior incidência nas populações mundiais sendo mais bem caracterizada que as
ataxias, os alelos intermediários são definidos segundo três critérios:
1- Número de repetições CAG responsáveis em gerar novas mutações
(premutação);
2- Número de repetições CAG acima do encontrado em indivíduos normais,
porém, com número de repetição menor que o encontrado em pacientes;
14
3- Encontrados em indivíduos assintomáticos
[GOLDBERG e cols., 1993 apud ANDREW e
cols., 1997]
Através de dados encontrados na literatura foi possível definir uma faixa entre
alelos de tamanho normal, intermediário e expandido, útil para o diagnóstico molecular
(Tabela 2).
Tabela 2: Limite de repetições das principais ataxias cerebelares
Doença
Repetições
Normal
Intermediário
Expandido
Ref. Bibliográfica
AEC 1
CAG
6-39
36-41
39-81
MATILLA e cols., 1993
ZHULKE e cols., 2002
AEC 2
CAG
14-31
32-34
34-57
CANCEL e col.s.,1997
DMJ
CAG
13-41
46-56
62-84
GIUNTI e cols., 1995;
TAKIYAMA e cols., 1995
VAN ALFEN e cols., 2001
AEC 6
CAG
4-16
19-20
21-27
ZUCHENKO e cols., 1996
AEC 7
CAG
4-17
28-36
37->300
STEVANIN e cols., 1998
1.2.2. Sinais e sintomas clínicos presentes nas AEC subtipos 1, 2, 3, 6 e 7
Na AEC tipo 1 frequentemente o início é após a idade de 20 anos,
manifestando-se com ataxia de marcha, disartria, nistagmo, fraqueza muscular,
hiperreflexia e oftalmoparesia. Ocorre piora progressiva da ataxia e lentidão dos
movimentos sacádicos oculares. Podem estar associado os sintomas de paralisia bulbar
e distonia
[BANFI ecols., 1994; ARRUDA e TEIVE, 1997].
Histologicamente há perda neuronal e
gliose do núcleo denteado, da ponte, do pedúnculo cerebelar médio e das olivas
[KAMEYA
e cols., 1995].
A AEC tipo 2 é caracterizada por apresentar ataxia cerebelar associada a
disartria, tremores, hipo/arreflexia profunda dos membros superiores e também nos
membros inferiores (definindo a presença de neuropatia periférica associada),
fasciculações de face e de membros e pela presença de movimentos oculares sacádicos
lentos
[ARRUDA e TEIVE, 1997].
Neuropatológicamente a AEC do tipo 2 é caracterizada por
15
apresentar atrofia cerebelar, com perda das células de Purkinje e das células granulares,
perda de neurônios olivares, da substância negra e das células do corno anterior da
medula espinhal [PULST e cols., 2003 apud TEIVE, 2005].
A AEC tipo 3 (DMJ) foi originalmente descrita apresentando sintomas de
degeneração nigro-espino-denteada, com oftalmoplegia nuclear e degeneração estriatonigral
[NAKANO e cols.., 1972 apud TEIVE, 2005 ; ROSENBERG e cols.,1976 apud TEIVE, 2005; WOODS e
SHAUMBURG, 1972 apud TEIVE, 2005].
Os principais sintomas são ataxia cerebelar, oftalmoplegia
progressiva externa associada a graus variados de sinais piramidais, sinais
extrapiramidais e neuropatia periférica. Também podem ser encontrados ataxia
cerebelar, associada ao parkinsonismo, distúrbios da motilidade ocular extrínseca,
fasciculações musculares, perda dos reflexos profundos, nistagmo e respostas cutâneoplantares extensoras. Os exames neuro-patológicos demonstraram perda neuronal e
gliose na substância negra, núcleos pontinos, núcleo vestibular, colunas de Clarke e
cornos anteriores da medula espinhal [COUTINHO e ANDRADE, 1978; COUTINHO e cols., 1982; PAULSON
e SUBRAMONY, 2003 apud TEIVE, 2005].
A AEC tipo 6 caracteriza-se por apresentar ataxia cerebelar “pura”, podendo
estar associada a disartria, nistagmo e perda de sensibilidade profunda. Muitos pacientes
apresentam episódios vertiginosos intensos, precedendo o início da ataxia. Em outros
casos, paralelamente ao quadro de ataxia cerebelar lentamente progressivo, existem
episódios intermitentes de ataxia (que correspondem a ataxia episódica tipo 2). De uma
forma geral, a AEC 6 apresenta evolução lentamente progressiva, com início do quadro
clínico ao redor dos 50 anos de idade [PULST, 2003 apud TEIVE, 2005]. Estudos de neuroimagem
revelam atrofia cerebelar e o exame anátomo-patológico demonstra perda das células de
Purkinje do córtex cerebelar e também gliose do complexo olivar inferior.
[ISHIKAWA e
cols., 2001 apud TEIVE, 2005].
16
Na forma de AEC tipo 7 encontra-se a associação de ataxia cerebelar com
déficit visual progressivo, decorrente de degeneração da retina (distrofia macular).
Podem
estar
associados
sinais
piramidais,
oftalmoplegia,
parkinsonismo
e
particularmente movimentos sacádicos lentos. Os sintomas podem ter seu início na
infância ou até os 60 anos de idade, com uma progressão muito mais rápida quando o
início é mais precoce. Do ponto de vista neuropatológico existe degeneração
olivopontocerebelar associada a perda de células ganglionares da retina
[ANDREW e cols.,
1997; STEVANIN e cols., 2000]
1.2.3. Gene e proteína envolvidos nas AEC subtipos 1, 2, 3, 6 e 7
A expansão da repetição no DNA implica em mecanismos diferentes de
patogenicidade dependendo do local no gene onde essas expansões se encontram, se
esta região será traduzida em proteína ou não, qual a seqüência, qual o gene, qual a
função (Figura 1). A determinação da base molecular de doenças de repetição CAG
pode permitir delinear a base de eventos moleculares que causam a doença. Estes
eventos parecem ser característicos de cada região [PAULSON e SUBRAMONY, 2002]
Os subtipos de AEC de maior interesse no presente trabalho são os de maior
incidência nas populações. Assim, foram selecionadas as ataxias espinocerebelares
(com seus respectivos números no Online Mendelian Inheritance in Man - OMIM) dos
subtipos 1 (OMIM 164400), 2 (OMIM 183090), 3 (OMIM 109150), 6 (OMIM 183086)
e 7 (OMIM 164500) que apresentam como mutação o aumento do número de repetições
CAG em loci distintos. Esta região é traduzida em um resíduo de poliglutamina maior
do que o esperado, gerando uma proteína anômala capaz de formar agregados que
muitas vezes irão se localizar no núcleo da célula. Estas inclusões têm sido ultimamente
correlacionadas com a sobrevivência neuronal
[SOONG e PAULSON, 2007]
e não com o início
da patogênese das doenças neurodegenerativas com expansão CAG como se acreditava
17
anteriormente [ZOGHBI e ORR, 2000]. As inclusões parecem refletir uma resposta protetora no
neurônio na qual os agregados protéicos apresentam uma estrutura inerte
[SOONG e
PAULSON, 2007].
Figura 1: Doenças com repetições expandidas - O mecanismo molecular da doença é determinado pela
repetição na seqüência, tamanho e posição, qual gene e qual função. As seqüências repetidas para cada
doença estão mostradas nos parênteses. As ataxias estão sublinhadas. [Adaptado de PAULSON e
SUBRAMONY, 2002]
O gene ATXN1 apresenta 450 kb do DNA genômico e está organizado em 9
exons. Os primeiros sete exons fazem parte da região 5’ não traduzida, enquanto que os
dois últimos contém a região codificadora de 7.277 pb e a região 3’não traduzida. Os
primeiros quatro exons não codificadores apresentam sítios para processamento
alternativo em vários tecidos [BANFI e cols., 1996].
A proteína ataxina 1 está presente no cérebro e em vários outros tecidos não
neurais. Nos tecidos não neurais, a proteína encontra-se basicamente no citoplasma
enquanto nos neurônios a proteína está presente no núcleo. Nas células de Purkinje do
cerebelo, a ataxina 1 encontra-se predominantemente no núcleo
[SERVADIO e cols., 1995].
A
ataxina 1 apresenta um domínio AXH (Alanina – aminoácido não especificado Histidina) dimérico com estrutura β pregueada semelhante a outras proteínas com sítios
18
de ligação ao RNA. Este domínio AXH parece também ter interações distintas com
outras proteínas, apresentando um processo peculiar e ainda desconhecido dentro da
célula
[CHEN e cols., 2004].
Em 2005, IRWIN e cols. demonstraram que a ataxina 1 normal
tem papel no processamento do RNA, provavelmente auxiliando o transporte desta
molécula para o exterior do núcleo. Estudos com regulação da transcrição em cultivo
celular e em Drosófilas evidenciaram que a proteína mutada inibe a transcrição através
da diminuição de função do domínio AXH envolvido na modulação do processo
transcricional (repressor transcricional)
2002; TSUDA e cols., 2005].
[DE CHIARA e cols., 2005; LAM e cols., 2006; OKAZAWA e cols.,
Além disso, o resíduo de poliglutamina aumentado ocasiona um
agregado de proteínas dentro da célula diminuindo a degradação pela via normal (via
ubiquitina-proteasoma) [VERHOEF e cols., 2002]. Outro achado importante é que o aumento de
número de repetições CAG na ataxina 1 diminui a atividade do proteasomo o que estaria
diretamente ligado a degeneração celular encontrada na AEC 1 [PARK e cols., 2005].
O gene ATXN 2 contém 25 exons e abrange aproximadamente 130 kb. A
repetição CAG encontra-se no exon 1 [SAHBA e cols. 1998].
A ataxina 2 é uma proteína de 1.313 aminoácidos (150 KDa) que normalmente é
expressa em todas as células do organismo. Encontra-se em concentração elevada nas
células de Purkinje do cerebelo e substância negra. Níveis de ataxina 2 aumentam com a
idade e na AEC 2. A localização celular de ataxina 2 parece estar no Complexo de
Golgi. Quando há aumento do resíduo de poliglutamina na ataxina 2, o funcionamento
do complexo de Golgi fica prejudicado e encontram-se microagregados citoplasmáticos
de proteína. Verifica-se perda de células de Purkinje devido à morte celular levando a
deficiência funcional e anatômica [HUYNH e cols., 2003]. Estudos mais recentes revelam que a
proteína ataxina 2 apresenta interação com a proteína citoplasmática ligadora de poli A
e também apresenta domínio para interação com RNA mensageiro estando associada a
19
ribossomos
[RALSER e cols., 2005].
Dessa forma a ataxina 2 mutada poderia estar intervindo
de maneira indireta ou direta, respectivamente, na tradução de alguns RNAs
mensageiros em particular [STTATERFIELD e PALLANK, 2006].
O gene ATXN 3 apresenta 48.240 pb com 11 exons
[ICHIKAWA e cols., 2001].
A
proteína ataxina 3 encontra-se dispersa no citoplasma. O aumento do resíduo de
poliglutamina leva a formação de um agregado
[IKEDA e cols., 1996; SISODIA e cols., 1998].
A
ataxina 3 mutada adota uma conformação característica capaz de ligar-se a matriz
nuclear expondo o resíduo de glutamina
[PEREZ e cols., 1999].
Assim como na ataxina 1, a
correlação com a via ubiquitina-proteasoma também foi observada por WARRICK e
cols. em 2005 sendo uma proteína com repetições CAG normal, supressora da
neurodegeneração. A ataxina 3 é uma proteína que apresenta um domínio denominado
Josefina caracterizado por uma hélice flexível em forma de grampo onde se localiza o
sítio ativo. O domínio Josefina possui atividade proteolítica por interagir com cadeias de
poliubiquitinas. Esta descoberta associada à modificação pós traducional pela
ubiquitinação da sua própria molécula e conseqüente degradação pela via proteasoma,
faz um elo entre as proteínas com resíduo de poliglutaminas e vias dependentes de
ubiquitina como possível patogênese da doença
[BERKE e cols., 2005; NICASTRO e cols., 2005;
NICASTRO e cols., 2006].
O gene da proteína do canal de cálcio (CACNA1) apresenta 300 kb com 47
exons. O seqüenciamento de todos os exons e adjacências mostrou grande variação
polimórfica incluindo a repetição CAG na região 3’ não traduzida [OPHOFF e cols., 1996]. Esta
variabilidade gênica pode resultar em subunidades distintas que formam o poro do canal
devido a possíveis processamentos alternativos do RNA mensageiro afetando a
estabilidade do mesmo, bem como a funcionalidade do canal
2004].
[JURKAT-ROTT e LEHMANN,
Quando há um resíduo de poliglutamina expandido esta proteína acumula-se no
20
citoplasma celular, principalmente das células de Purkinje. Esta inclusão não está
ubiquitinilada ao contrário da maioria dos agregados observados nas outras ataxias
[ISHIKAWA e cols., 1999].
O gene ATXN7 apresenta 140 Kb e 13 exons [MICHALIK e cols., 1999]. A ataxina 7 faz
parte da família de proteínas acetiltransferase de histonas e apresenta uma localização
nuclear
[McMAHON e cols., 2005].
A proteína mutante apresenta expansão no resíduo de
poliglutamina o que ocasiona mudança na sua conformação. A inclusão nuclear contém
a proteína anômala, ubiquitina, proteínas de “heat-shock” e subunidades do proteasoma
[LEBRE e cols., 2001; LATOUCHE e cols., 2007].
1.2.4. Tratamento atual e perspectivas sobre patogênese e tratamento
Não há até o momento tratamentos definidos para as diferentes formas de AEC
existindo, entretanto, inúmeros relatos de testes terapêuticos, com medicações
colinérgicas, serotoninérgicas, gabaminérgicas e também dopaminérgicas. Algumas
formas raras de AEC episódica podem responder ao uso de acetazolamida [KLOCKGETHER,
2000 apud TEIVE, 2005].
Alguns pacientes apresentam nível reduzido da coenzima Q10 (CoQ10) nos
tecidos musculares. A CoQ10, ou ubiquinona, é uma substância cuja função celular é de
receptor de elétrons dos complexos I e II da cadeia respiratória da mitocôndria. É,
portanto, um agente antioxidante fundamental nas células que sofrem estresse oxidativo
como no caso de doenças neurodegenerativas. Estes pacientes podem se beneficiar com
a suplementação de CoQ10 apesar dessa reposta terapêutica ser controversa. Além
disso, a CoQ10 não evita a neurodegeneração, porém o declínio funcional torna-se mais
lento [BAKER e TARNOPOLSKI, 2003; LITTARRU e TIANO, 2005; MONTERO e cols., 2007; SHULTS, 2003]
A grande questão que se faz atualmente é como as proteínas anômalas que
apresentam esse resíduo de poliglutamina expandido estão envolvidas na etiologia da
doença. A relação exata entre o dobramento protéico, o processo de agregação e a
21
formação de inclusões macroscópicas permanece obscura. Acredita-se que as interações
protéicas no início da agregação das proteínas anômalas com resíduo de poliglutamina
(poli Q) parecem ser fundamentais para desencadear a toxicidade celular. Existem dois
processos de interação inicial:
1- pequenos oligômeros da proteína mutante interagindo com proteínas celulares
e também com outras proteínas poli Q promovendo a toxicidade;
2- grandes complexos fibrilares com as proteínas com tratos poli Q expandidos
formando agregados relativamente neutros a célula [BEHRENDS e cols.; 2006; BULONE e cols., 2006;
NAGAI e cols., 2007].
Outra questão ainda sem resposta é exatamente porque as proteínas com tratos
expandidos de poli Q são tóxicas ao neurônio. Vários pesquisadores têm descoberto que
as proteínas poli Q desempenham suas funções em importantes vias metabólicas tais
como interação com fatores transcricionais, modulação da tradução protéica e controle
do dobramento e degradação protéica através da via ubiquitina-proteasomo
[BERKE e cols.,
2005; EVERT e cols., 2000; LA SPADA e TAYLOR, 2003; LATOUCHE e cols., 2007; LEBRE e cols., 2001; MICHALIK e
BROECKHOVEN, 2003; NICASTRO e cols., 2005; NICASTRO e cols., 2006; PARK e cols., 2005. VERHOEF e cols., 2002].
Portanto alterações dessas funções como no caso das proteínas com expansão, leva a um
desequilíbrio em vias que mantêm o controle de qualidade da célula. Assim diferentes
proteínas celulares passam a ser mal elaboradas desencadeando um efeito crônico e
possivelmente deletério para o neurônio. Três vias parecem estar envolvidas nas
doenças de expansão: chaperoninas moleculares, ubiquitina-proteasomo e autofagia
[SOONG e PAULSON, 2007].
As chaperoninas moleculares parecem suprimir a toxicidade dos resíduos poli Q
expandidos participando da síntese de proteínas nascentes e prevenindo a agregação e
toxicidade das mesmas [BEHRENDS e cols., 2006]
22
A via normal de ubiquitina-proteasomo é a mais importante via de regulação da
atividade protéica. A degradação protéica precisa ocorrer no momento exato e em
resposta a eventos celulares. A ubiquitina é uma molécula protéica pequena (76
aminoácidos) e o proteasoma é um complexo cilíndrico capaz de reconhecer e clivar
uma proteína ubiquitinilada. Resumidamente, para que uma determinada proteína seja
degradada, uma cascata de reações ocorre, levando a poli-ubiquitinilação da mesma. O
complexo proteína-ubiquitina é reconhecido pelo proteasoma que libera a ubiquitina
para reciclagem e desdobra a proteína para clivagem em pequenos peptídeos e
aminoácidos. Além da degradação, a ubiquitinação de uma proteína desencadeia uma
série de processos celulares como o reparo do DNA, a formação de endocitos no caso de
proteínas de membrana, a tradução e a ativação (ou inibição) da transcrição. Estes
processos são respostas bioquímicas da célula para tentar corrigir uma proteína mal
elaborada e manter a sua homeostasia, evitando assim a presença de proteínas anômalas
e não funcionais. A ineficácia da correção leva a formação de agregados protéicos que
evoluem a complexos amilóides
[HERSHKO e CIECHANOVER., 1991 apud ALBERTS e cols., 1994;
RECHSTEINER e cols., 1992 apud ALBERTS e cols., 1994].
A função do proteasomo diminui com a idade
ao mesmo tempo em que há o surgimento dos sintomas de AEC. Dentro do processo da
via ubiquitina-proteasomo as proteínas com resíduo de poliglutamina parecem
desempenhar alguma função ainda não bem estabelecida [HUNTER e cols 2007; RODRIGUES e cols
2007; RUBINSZTEIN, 2006; TRUANT e cols 2006; VALERA e cols 2007; SOONG e PAULSON, 2007].
A autofagia tem sido estudada em diversas doenças neurodegenerativas
relacionadas com a idade e com a presença de acúmulos ubiquitinilados
[KOMATSU e cols.,
2006].
Achados recentes estão de acordo com o modelo que postula interações
aberrantes proteína-proteína. Proteínas poli Q expandidas, fragmentos proteolíticos,
componentes transcricionais e proteínas da cromatina que formam complexos
23
oligoméricos depletando certos fatores transcricionais e outras proteínas importantes no
núcleo. Este evento acarreta alterações na atividade de promotores, perturba a
modificação da cromatina por acetil transferases e leva a um mecanismo patogênico de
desregulação transcricional [LAM e clos., 2006; RUBINSZTEIN, 2006; SERRA e cols.2006].
A maior contribuição que todos os estudos podem oferecer é a compreensão da
doença objetivando um tratamento preciso. Várias estratégias terapêuticas têm sido
buscadas pelos pesquisadores para tratamento das doenças de expansão de
poliglutamina. Como descrito previamente, a expressão deste tipo de proteína anômala
acarreta desequilíbrio celular através de alterações no metabolismo que provavelmente
resultam na neurodegeneração. Cada etapa relacionada com o possível processo de
patogênese tem sido alvo para estudos terapêuticos entre eles: supressão da expressão
do gene mutado por RNA de interferência; inibição do mau dobramento e agregação da
proteína; promoção da degradação protéica; ativação da transcrição; ativação da função
mitocondrial; inibição da morte da célula neuronal e neuroproteção por fatores
neurotróficos e modelos knockout. A padronização de estudos pré-clinicos e o
desenvolvimento de biomarcadores para avaliar a eficácia terapêutica na triagem clínica
serão necessárias para o desenvolvimento de drogas úteis nas doenças de expansão. Para
tanto, a definição do diagnóstico com auxílio de técnicas moleculares torna-se uma
etapa importante para a possível orientação terapêutica
[COLOMER GOULD; 2005; LATOUCHE
ecols, 2007; SHULMAN e cols. 2003; STEVANIN e cols., 2000; XIA e cols., 2004].
O uso do RNA de interferência (RNAi) surgiu com grande potencial terapêutico
nas doenças neurodegenerativas principalmente de transmissão autossômica dominante.
Existe uma certa eficácia em usar vetores virais expressando pequenos grampos de
RNA (shRNA) contra genes terapêuticamente relevantes em modelos de ratos
transgênicos para doenças neurodegenerativas tais como AEC, Esclerose lateral
amiotrófica, Doença de Huntington e amiloidose. Muito embora o uso do vetor viral
24
para RNAi apresente limitações principalmente no que diz respeito ao uso em humanos,
estudos mais recentes têm desenvolvido um vetor não viral para “entrega” do RNAi
como alternativa terapêutica para estas doenças
[FARAH, 2007; RODRIGUEZ-LEBRON e GONZALEZ-
ALEGRE, 2006].
1.3. Importância do estudo em população assintomática
No caso de doenças de expansão o estudo da variabilidade alélica da repetição
de trinucleotideos CAG em população normal mostrou-se bastante controverso. Vários
autores verificaram que há heterogeneidade do mecanismo mutacional nos diferentes
loci de repetições. Entre eles diferentes genes que apresentam regiões de repetição
CAG, com características moleculares e de patogenicidade semelhantes, não
necessariamente possuem os mesmos padrões dinâmicos [ANDRES e cols., 2002; BERTRANTPETIT
e CALAFELL, 2001 apud LIMA e cols., 2005; COSTA e cols., 2002; DEKA e cols., 1995].
Observa-se que alelos expandidos são mantidos na população humana ao longo
das gerações. PRESTES e cols. em 2007 realizaram uma comparação entre o valor
adaptativo de pacientes com DMJ com seus parentes não afetados pela doença e com a
população normal chegando à conclusão de que pacientes com a DMJ apresentam valor
adaptativo maior. A tendência mutacional a favor das expansões sugere que a maioria
dos casos de novas mutações decorreria da existência de um número elevado de
repetições dentro da normalidade. Estes alelos normais, porém com número maior de
repetições, ou ainda a existência de alelos intermediários na população não afetada
seriam reservatórios para geração de novos alelos expandidos
[RUBINSZTEIN e cols., 1994].
De
acordo com isso, vários autores associaram a prevalência de uma doença de expansão de
trinucleotídeo em uma população específica, com alelos de tamanhos maiores no
respectivo locus ou alelos intermediários na população não afetada como é observado na
25
doença de Huntington (DH) e distrofia miotônica (DM) [COSTA e cols., 2002; DAVIES e cols., 1992;
DEKA e cols., 1999; GOLDMAN e cols., 1994; RASKIN e cols. 2000; WATKINS e cols., 1995; ZERYLNICK e cols., 1995].
Entretanto, a capacidade de correlacionar a prevalência de uma determinada
doença de expansão com a freqüência de alelos normais de tamanho mais elevado no
respectivo gene depende diretamente do perfil epidemiológico dessas doenças. Com o
objetivo de compreender melhor a dinâmica no locus da DMJ e trazer maior
discernimento sobre o mecanismo molecular de mutação no qual se encontram os alelos
expandidos no gene, LIMA e cols. em 2005 estudaram o polimorfismo de alelos
normais (selvagens). Os dados encontrados não evidenciaram nenhuma correlação entre
a presença dos alelos normais com número de repetições aumentados e a alta incidência
da doença além da inexistência de alelos intermediários na população.
O estudo da freqüência dos alelos e da distribuição genotípica em uma
população pode ser efetuado com o princípio de Hardy-Weinberg.
1.4. Princípio de Hardy-Weinberg
O
princípio
de
Hardy-Weinberg
foi
demonstrado
independentemente
e
simultaneamente, pelo matemático inglês Godfrey Harold Hardy e pelo geneticista
alemão Wilhelm Weinberg em 1908.
Em genética de população a palavra “população” significa um grupo de indivíduos
da mesma espécie vivendo dentro de uma área geográfica restrita o suficiente para que
todos os membros possam se acasalar ao acaso (Panmixia). Sempre existirá uma certa
“estruturação geográfica” geralmente provocada pelo ambiente (ex.: cidades são
separadas por desertos e montanhas). Grandes populações, com características
mendelianas e estruturadas geograficamente, são interessantes porque é no interior delas
que as freqüências alélicas não variam ao longo das gerações. Independe de um gene ser
26
raro ou freqüente, sua freqüência permanecerá a mesma desde que determinadas
condições sejam mantidas. O modelo matemático que define essa hipótese
determinando as freqüências genotípicas para crescimento ao acaso da população é o
princípio (ou lei ou equilíbrio) de Hardy-Weinberg (HW)
[NEEL e SCHULL, 1954 apud
BEIGUELMAN, 1990; LI, 1972 apud BEIGUELMAN, 1990; DOBZHANSKY, 1970 apud HARTL, 1998; SPIESS, 1977 apud
HARTL, 1998; WRIGHT, 1969 apud HARTL, 1998].
Existem oito premissas que deverão estar presentes em uma determinada população
para que o princípio de Hardy-Weinberg possa ser verificado:
1. A população deve ser infinita;
2. Apresentar reprodução sexuada;
3. Os indivíduos acasalam-se ao acaso (panmixia);
4. Os indivíduos devem ser diplóides;
5. Não haver sobreposição de gerações;
6. A taxa de mutações deve ser baixa;
7. As migrações são desprezíveis;
8. A seleção natural não ocorre nos alelos analisados
No caso mais simples de um único locus com dois alelos A e a com freqüências de p
e q, respectivamente, o princípio de HW prediz que as freqüências genotípicas para o
homozigoto AA será p², para o heterozigoto Aa será 2pq e para o homozigoto aa será q²
[DOBZHANSKY, 1970 apud HARTL, 1998; SPIESS, 1977 apud HARTL, 1998; WRIGHT, 1969 apud HARTL, 1998] (Figura
2).
27
Fêmeas
A (p)
a (q)
A (p)
AA (p²)
Aa (pq)
a (q)
aA (qp)
aa (q²)
Machos
Figura 2: Quadro de Punnet para equilíbrio de Hardy-Weinberg. Adaptado de [HARTL, 1998]
A constância nas freqüências alélicas é a conseqüência mais importante do princípio
de HW. A constância alélica significa que a ausência de forças evolutivas (deriva
genética, fluxo gênico, seleção natural e mutação) manterá as freqüências através das
gerações. O processo de transmissão mendeliana mantém as freqüências alélicas
constantes e então conserva a distribuição da variabilidade genética da forma como ela é
[DOBZHANSKY, 1970 apud HARTL, 1998; SPIESS, 1977 apud HARTL, 1998; WRIGHT, 1969 apud HARTL, 1998].
O estudo da variabilidade genética é útil para reconstituir a evolução de um
grupo de organismos. As pesquisas sobre polimorfismos genéticos são úteis na busca de
relações genéticas entre sub-populações de uma espécie. A idéia é que sub-populações
compartilhem alelos através de migração de modo que alelos comuns podem ser
provenientes de um ancestral comum. Além disso, os polimorfismos também são úteis
como marcadores genéticos podendo estar ligados a um gene nocivo associado a uma
doença ao longo de gerações. Em uma família, com histórico de uma determinada
doença presente através de gerações, é possível determinar uma linhagem de
marcadores associados que co-segregam com o gene causador da doença
[DOBZHANSKY,
1970 apud HARTL, 1998; SPIESS, 1977 apud HARTL, 1998; WRIGHT, 1969 apud HARTL, 1998].
Uma análise de cada gene em população normal é necessária para se ter um
conhecimento maior sobre uma possível associação entre a representação biológica da
epidemiologia das doenças de expansão e o perfil alélico desta população assintomática.
[ABADE e cols., 2000 apud LIMA e cols., 2005; SANTOS e cols., 2000 apud LIMA e cols., 2005]
Sendo assim, é de
28
fundamental importância a análise em grupo controle para determinação da freqüência
alélica na população, e como uma análise preliminar para fornecer informação sobre
possíveis associações moleculares e de origem e manutenção da doença na população.
Além disso, também é importante salientar que cada população humana pode apresentar
um perfil genético próprio e diferente das demais populações.
29
II. OBJETIVOS
30
2.1. Objetivo principal
O presente estudo visa determinar o genótipo das repetições CAG nos genes ATXN
1, 2, 3, 6 e 7 em uma amostra da população normal e de pacientes para utilização no
diagnóstico molecular de pacientes com suspeita de ataxia.
2.2. Objetivos secundários:
1. Definir tamanho em pares de base (pb) e desvio padrão de cada alelo;
2. Definir a freqüência alélica nos genes ATXN 1, ATXN 2, ATXN 3,
ATXN 6 e ATXN 7 na amostra da população não afetada;
3. Verificar se as distribuições genotípicas estão de acordo com o
Equilíbrio de Hardy-Weinberg para interpretações populacionis e
metodológicas;
4.
Definir a freqüência alélica e detectar alelos expandidos nos genes
ATXN 1, ATXN 2, ATXN 3, ATXN 6 e ATXN 7 na amostra de
pacientes;
5. Oferecer subsídios para avaliar a diversidade dos alelos na população
normal e o processo de evolução molecular para manutenção do gene
nesta população comparando com a amostra de pacientes.
31
III.
MATERIAIS E MÉTODOS
32
3.1 População e amostra
O diagnóstico molecular para AEC 1, AEC 2, AEC 3, AEC 6 e AEC 7 foi
realizado em 143 indivíduos com história clínica de ataxia cerebelar do Serviço de
Neurologia (Ambulatórios e Internamento) do Hospital de Clínicas da Universidade
Federal do Paraná (HC-UFPR). Paralelamente ao estudo dos pacientes foi analisado um
grupo controle com 154 indivíduos não aparentados da população normal, obtidos
aleatoriamente no Banco de Sangue do HC-UFPR. Os indivíduos que aceitaram
participar do grupo controle apresentaram idade acima de 18 anos, não relataram serem
portadores ou ter qualquer doença genética, hereditária ou mal formações na família,
nem terem sido expostos à radiação ou a agentes tóxicos. Os dados de controles e
pacientes foram levantados conforme Instrumento de Coleta de Dados presente no
Apêndice (Apêndices 1 e 2, respectivamente).
A amostra de doadores de sangue consiste em 90 homens e 64 mulheres não
aparentados com idade média de 32,29 ± 10,63 anos. Com esta média de idade, essa
amostra pode conter indivíduos que poderão manifestar clinicamente sinais e sintomas
de ataxia no futuro. Assim, no momento da coleta foi questionado sobre doenças
diagnosticadas na família para posterior análise caso houvesse necessidade. Nenhum
caso de indivíduos com ataxia diagnosticada foi informado. A naturalidade de 129
indivíduos desta amostra é paranaense. Os 25 indivíduos restantes residem no Estado do
Paraná há mais de 10 anos (um do Acre, um da Bahia, um do Ceará, dois de Minas
Gerais, dois do Rio de Janeiro, um de Rondônia, dois do Rio Grande do Sul, dez de
Santa Catarina, cinco de São Paulo). Além disso, esta amostra apresenta 72,46% de
Euro-Brasileiros, 2,17 % de Afro-Brasileiros, 23,19% de miscigenados e 2,17% de
Ameríndios. O termo de consentimento assinado foi obtido de cada indivíduo sendo o
33
projeto aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas em Seres Humanos do HC – CEP
775.005/2004-01 (Apêndices 3 a 5)
Para as amostras de sangue que deram entrada no laboratório cujos pacientes
apresentavam suspeita clínica de ataxia, foram levantados alguns dados presentes no
prontuário. Estes dados estão especificados no Apêndice 2 do Instrumento de Coleta de
Dados. Dessa forma foi possível identificar pacientes e respectivos familiares presentes
na amostra de indivíduos com suspeita clínica de AEC. Existem 11 famílias nas quais
apenas um indivíduo participou da amostra submetida aos cálculos estatísticos. A
reconstituição do heredograma não foi possível por não haver dados disponíveis
suficientes. Assim, dos 143 indivíduos, somente 115 não aparentados foram analisados
evitando algumas das distorções possíveis no cálculo de freqüência alélica e da
freqüência dos diferentes subtipos de ataxia no HC-UFPR (Apêndice 6).
Apenas 56 indivíduos dos 115 da amostra tiveram os dados clínicos avaliados
pelos prontuários analisados. Isto permitiu averiguar a idade de início dos sintomas, os
principais sintomas e quando a transmissão é paterna ou materna nesses indivíduos.
Estes 56 pacientes com dados clínicos disponíveis indicam a seguinte suspeita clínica:
cinco pacientes para ataxia espinocerebelar do tipo 2; 16 pacientes para DMJ; um para
ataxia espinocerebelar tipo 4; três para ataxia espinocerebelar do tipo 6; dois para ataxia
espinocerebelar do tipo 7; três com suspeita de ataxia espinocerebelar tipo 10; um
paciente com síndrome do neurônio motor associado a síndrome cerebelar; um com
polineuropatia periférica motora; um com suspeita de epilepsia mioclônica; um para
tremor essencial; dois pacientes com ataxia esporádica; dois ataxia de Freidreich; um
para ataxia cerebelar recessiva e 17 pacientes com diagnóstico clínico a esclarecer.
Além destes 56 pacientes, existem 59 pacientes sem dados clínicos disponíveis.
Estes 59 pacientes apresentam nos registro do laboratório a seguinte suspeita clínica:
34
dois pacientes para ataxia espinocerebelar do tipo 2; 14 pacientes para DMJ; dois para
ataxia espinocerebelar do tipo 6; um para ataxia espinocerebelar do tipo 7; um para
ataxia espinocerebelar tipo 8; quatro com suspeita de ataxia espinocerebelar tipo 10; um
para ataxia congênita e 34 com diagnóstico a esclarecer.
3.2. Protocolos
A fórmula e o preparo das soluções, bem como a origem do material utilizado
podem ser encontrados na “Lista de reagentes” e “Preparo de soluções” (Apêndice 7 e
8).
3.2.1. Extração de DNA
A técnica de extração de DNA por Fenol – Clorofórmio descrita por SAMBROOK e
cols., 1989, modificada, foi o método de escolha para realização deste trabalho. Esta
técnica proporciona um produto limpo, garantindo a amplificação de regiões repetitivas
como é o caso das expansões CAG e a detecção por fluorescência.
O sangue foi coletado em tubo com EDTA 5% (BD Vacutainer) e centrifugado por
15 minutos a 5000 rpm. Em tubos Eppendorf separou-se a nata de leucócitos e
adicionou-se 1 mL de Solução de Lise de Eritrócitos 10X (SLE 10X). Após
homogeneização os tubos Eppendorf foram centrifugados a 12000 rpm durante 10
minutos e o sobrenadante foi descartado. Estas duas últimas etapas foram repetidas por
mais duas vezes. Ao precipitado adicionou-se proteínase K na concentração final
1mg/mL e Dodecilsulfato de Sódio (SDS) para concentração final 0,5%. Após misturar
por inversão, os tubos foram incubados em banho-maria de 550C por 2 horas no
mínimo. Decorrido o tempo, 500µl de fenol saturado pH 8,0 foi adicionado. As
amostras foram homogeneizadas e centrifugadas em 12000 rpm por 10 minutos. A fase
aquosa (superior) foi retirada para tubo Eppendorf limpo e 500µl de fenol saturado pH
35
8,0 e 400µl de clorofórmio foram adicionados. Novamente as amostras foram
homogeneizadas e centrifugadas (12000 rpm por 10 minutos) e a fase aquosa (superior)
foi transferida para outro tubo Eppendorf limpo. Adicionou-se ao sobrenadante 300µl
de Acetato de Sódio 3M na amostra. Após homogeneização a amostra foi centrifugada
(12000 rpm por 10 minutos). Despejou-se o sobrenadante sobre etanol absoluto gelado.
O tubo foi invertido lentamente por várias vezes até precipitar o DNA. Lavou-se o
precipitado com 500µl etanol 70% gelado e desprezou-se o sobrenadante. Após secar o
DNA, adicionou-se de 50 a 200 µl de TE (Solução de Tris-EDTA), dependendo do
tamanho do precipitado do DNA.
3.2.2. Amplificação dos genes de interesse
A amplificação foi realizada pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) que foi descrita por Kary Mullis na década de 1980. A PCR possibilita a
produção de numerosas cópias de seqüências especificas de DNA.
O número de repetições CAG de indivíduos assintomáticos está dentro de um
limite que abrange alelos distintos chamados de normais. Devido ao menor tamanho
destes alelos em relação aos alelos expandidos, a enzima apresenta uma atividade maior,
gerando um aumento na concentração do produto de amplificação de alelos ditos
normais. Esta amplificação preferencial de alelos normais em relação aos alelos
expandidos pode acarretar em resultados “falso negativo”. Conhecendo este fato, foi
imprescindível a padronização prévia dos protocolos de amplificação usando ambos
alelos (normais e expandidos) obtidos através de amostras de indivíduos que haviam
sido tipados para estes genes por outros laboratórios.
Diferentes marcadores fluorescentes foram selecionados com base nos tamanhos
dos alelos de indivíduos assintomáticos descritos previamente
[DORSCHNER e cols., 2002].
36
Assim, garantiu-se que loci cujos alelos possam apresentar o mesmo tamanho, recebam
fluoróforos distintos (FAM, VIC e NED).
Cada indivíduo foi submetido a um total de três reações de PCR. Uma reação
triplex para AEC 1, AEC 2 e AEC 6; outra reação para AEC 3 e uma terceira reação
para amplificação de AEC 7. Foram utilizados nessas reações 10 a 30 ng de DNA
genômico com volume final de 15 µL. As condições de PCR foram realizadas no
termociclador MJ research PTC model (MJ research,inc. Watertown, MA, USA).
O protocolo de amplificação para as expansões CAG em AEC 1, AEC 2 e AEC
6 foi padronizado como uma reação triplex visando à amplificação concomitante das
respectivas três regiões de interesse em um único tubo. Para esta reação foi utilizado o
sistema Accuprime DNA polimerase da Invitrogen/Stratagene, La Jolla, CA, USA. A
reação de PCR continha 1X tampão BII (2 mM de cada nucleotídeo; 1,5 mM de MgCl2;
200mM Tris-HCl pH 8,4), 1,5U Accuprime Taq DNA polimerase e 1,5 pmol de cada
iniciador (universal e reverso). As seqüências utilizadas foram: para AEC 1
(1F_FAM_AACTGGAAATGTGGACGTAC
[KAMEYA
e
cols.,
1995],
AEC
2R_CGGGCTTGCGGACATTGG)
2
e
1R_CAACATGGGCAGTCTGAG)
(2F_VIC_GGGCCCCTCACCATGTCG
[PULST
e
(6F_NED_CACGTGTCCTATTCCCCTGTCATCC
cols.,
1996]
e
AEC
e
6
e
6R_TGGGTACCTCCGGAGGGCCGCTGGTG) [ZHUCHENKO e cols., 1996]. As condições no
termociclador foram de 1 ciclo a 96°C por 10 minutos; 32 ciclos de três temperaturas
sendo: 1 minuto a 94°C para desnaturação, rampa de 0,2oC/segundo, 1 minuto e 30
segundos a 61°C para anelamento e 1 minuto e 30 segundos a 68°C; e 1 ciclo de 1 hora
a 68°C para extensão final.
A reação de amplificação para as expansões CAG para a AEC 3 foi realizada
com 200 mM de cada nucleotídeo, 1X tampão de PCR (10mM Tris-HCl; pH9,0),
37
50mM KCl e 0,1% Triton X); 1,5 mM de MgCl2 25mM e 1,5 U Taq DNA polimerase.
A seqüência de iniciadores foi desenhada para este estudo (Programa DNAStar) e 12
pmol de cada iniciador para o locus AEC 3 (3F_NED_CTGGCCTTTCACATGG e
3R_CCAGTCACTACTTTGATTCGTG) foi utilizado (Figura 3). No termociclador, as
condições utilizadas foram padronizadas pela metodologia de PCR-Touchdown
cols., 1991]
[DON e
e foram de 1 ciclo de 10 minutos a 95°C; 5 ciclos de três temperaturas de 1
minuto a 95°C para desnaturação, 1 minuto a 59°C para anelamento, 1 minuto e 30
segundos a 72°C para extensão; 20 ciclos de três temperaturas de 1 minuto a 95°C para
desnaturação, 1 minuto a 60°C para anelamento, 1 minuto e 30 segundos a 72°C para
extensão; 7 ciclos de três temperaturas de 1 minuto a 95°C para desnaturação, 1 minuto
a 61°C para anelamento, 1 minuto e 30 segundos a 72°C para extensão; e 1 ciclo de 1
hora a 72°C para extensão final.
5’atctgtatcagactaactgctcttgcattcttttaataccagtgactactttgattcgtgaaacaatgtattttccttatgaa
tagtttttctcatggtgtatttattcttttaagttttgttttttaaatatacttcacttttgaatgtttcagacagcagcaaaagcagc
aacagcagcagcagcagcagcagcagggggacctatcaggacagagttcacatccatgtgaaaggccagccac
cagttcaggagcacttgggagtgatctaggtaaggcctgctcaccattcatcat 3’
Figura 3: Localização de anelamento dos iniciadores no locus ATXN 3. Em laranja encontram-se os
iniciadores que flanqueiam a região de interesse e em azul encontra-se a região de repetição da trinca
CAG.
A amplificação para as expansões CAG do locus AEC 7 foi realizada com 200
mM de cada nucleotídeo, 0,7 X tampão de PCR (10mM Tris-HCl; pH9,0), 50mM KCl e
0.1% Triton X); 1,5 mM de MgCl2 e 1,5 U Taq DNA polimerase e 4% de DMSO. A
seqüência de iniciadores também foi desenhada para este estudo (Programa DNAStar) e
15
pmol
de
cada
iniciador
(7F_VIC_TTGTAGGAGCGGAAAGAATGTC
e
7R_CTTCAGGACTGGGCAGAGG) foram utilizados (Figura 4). O programa para
amplificação desta região também foi padronizado pela metodologia de PCR-
38
Touchdown
[DON e cols., 1991]
sendo: 1 ciclo de 10 minuto a 96°C, 5 ciclos de três
temperaturas de 1 minuto a 95°C para desnaturação, 1 minuto a 51°C para anelamento e
1 minuto e 30 segundos a 72°C extensão; 21 ciclos de três temperaturas de 1 minuto a
95°C para desnaturação, 1 minuto a 52°C para anelamento, 1 minuto e 30 segundos a
72°C para extensão; e 7 ciclos de 1 minuto a 95°C para desnaturação, 1 minuto a 55°C
para anelamento, 1minuto e 30 segundos a 72°C para extensão; e por fim uma extensão
final de 72°C por 1 hora.
5’ctggcgcctccttaaaaaacggcccccgcgcgactctttcccccttttttttgttacattgtaggagcggaaagaatg
tcggagcgggccgcggatgacgtcaggggggagccgcgccgcgcggcggcggcggcgggcggagcagcggc
cgcggccgcccggcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagccgccgcctccgcagccccagcggcagc
agcacccgccaccgccgccacggcgcacacggccggaggacggcgggcccggcgccgcctccacctcggccgc
cgcaatggcgacggtcggggagcgcaggcctctgcccagtcctgaagtgatgctgggacagtcgtggaatctgtgg
gtagaggcttccaaacttcatgggaagacggtgagtgtccacgccctcct 3’
Figura 4: Localização de anelamento dos iniciadores no locus ATXN 7. Em laranja encontram-se os
iniciadores que flanqueiam a região de interesse e em azul encontra-se a região de repetição da trinca
CAG.
3.2.3 Detecção do produto de amplificação
Para detecção do produto de amplificação, foi preparado para cada indivíduo
uma mistura de 1 µL da reação de PCR na proporção de 1:6 com formamida deionisada
e 0,25 µl do marcador de tamanho e peso molecular GS-500 ROX para um volume final
de 6µl. Após desnaturação (94o C por 3 minutos) e rápido resfriamento em gelo (3
minutos), as amostras foram injetadas no seqüenciador automático ABI PRISM 3100
Avant Genetic analyzer (Hitachi High Technologies Corporation – Tokio/Japão) com
arranjo de capilar de 36 cm x 50 µm contendo Performance Optimized Polymer-4
(POP-4 Applied Biosiystems) por 5 segundos de injeção. Os alelos foram detectados em
câmara CCD devido à marcação dos iniciadores com fluoróforos distintos (FAM, VIC e
NED). Os dados foram capturados no Software ABI Data Collection. O tamanho dos
alelos foi definido comparando-se ao marcador GS-500 ROX pelo Genemapper v3.1.
39
3.3. Análise de resultados
A determinação das repetições CAG em cada alelo foi definida a partir do
tamanho em pares de base (pb) obtido nas etapas anteriores. O tamanho do produto de
amplificação para os alelos de cada locus de cada indivíduo foi capturado
automaticamente a partir do programa Genemapper do seqüenciador automático ABI
PRISM 3100 Avant. Este resultado de tamanho em pb foi obtido através do cálculo
comparativo da eletroforese concomitante da amostra com o marcador de tamanho e
peso molecular GS-500 ROX.
Para cada alelo, o tamanho em pares de base (pb) fornecido pelo aparelho incluía
a repetição CAG mais uma região residual onde ocorre o anelamento dos iniciadores.
Assim, verifica-se que para AEC 1, AEC 2, AEC 3, AEC 6 e AEC 7 a região residual,
sem as repetições CAG, apresenta 123 pb, 61 pb, 165 pb, 103 pb e 252 pb,
respectivamente.
Objetivando definir os alelos de forma fidedigna, todos os indivíduos que
apresentaram um tamanho em pb aproximado do valor teórico para um determinado
alelo foram agrupados em diferentes tabelas. Isto foi realizado para cada alelo dos cinco
loci. Usando análise estatística do tamanho em pares de base, foram obtidas as médias,
os desvios padrões (DP) e as variâncias de cada alelo para as duas amostras
populacionais em análise: indivíduos clinicamente normais e pacientes com suspeita
clínica de ataxia.
Um segundo cálculo foi realizado para obtenção do número de repetições CAG
com auxílio de planilha do Excell. O número de repetições CAG foi definido através da
subtração do tamanho fornecido pelo aparelho com a região residual, e dividido por três,
em virtude dos três nucleotídeos da unidade de repetição CAG. Cada alelo representa o
40
número de repetição CAG. O cálculo para a obtenção do número das repetições CAG
fica definido como explicitado na tabela 3.
Desses resultados, foi possível realizar análise estatística com auxílio do
programa SSPS v. 13.0 e cálculos do princípio de Hardy-Weinberg (HW) e de
heterozigosidade (H) com auxílio do programa GENEPOP (version 3.4) [RAYMOND
e
ROUSSET 1995].
Tabela 3: Cálculo das repetições CAG em cada locus
Doença/Gene
Produto de Amplificação (pb)
Número de repetições CAG
AEC 1/ATXN1
Repetições (CAG)n + 123
(Produto de Amplificação - 123)/3
AEC 2/ATXN2
Repetições (CAG)n + 61
(Produto de Amplificação - 61)/3
DMJ/ATXN3
Repetições (CAG)n + 165
(Produto de Amplificação -165)/3
AEC 6/CACNA1
Repetições (CAG)n + 103
(Produto de Amplificação - 103)/3
AEC 7/ATXN7
Repetições (CAG)n + 252
(Produto de Amplificação - 252)/3
41
IV. RESULTADOS
42
4.1. Produtos de amplificação
Os alelos analisados de tamanho normal, nas reações de PCR resultaram em um
produto de amplificação consistente, com picos precisos, sem resíduos no fundo do
eletroferograma (Figura 5).
Figura 5: Amplificação dos alelos de tamanho normal para os genes ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN6
e ATXN7- picos precisos, sem resíduos no fundo do eletroferograma
Nos alelos expandidos anormais, que foram observados na amostra dos
pacientes, verificam-se bandas de mosaicismo somático e de “stutter” que também estão
presentes em eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Entretanto, um pico
dominante evidente foi observado em relação aos outros de acordo com a amplitude e a
área do mesmo. Este é o pico referente ao alelo mais representativo encontrado em cada
paciente (Figura 6).
43
Figura 6: Amplificação dos alelos anormalmente expandidos observados na amostra de pacientes para
Ataxia Espinocerebelar 2, 3, 6 e 7.
4.2. Definição dos alelos
Indivíduos com o mesmo alelo apresentaram pequenas diferenças no tamanho
em pares de base (pb) a partir de valores teóricos, isto é, o número de repetições do
trinucleotídeo CAG somado ao produto de amplificação residual específico para cada
locus como descrito previamente.
A variabilidade inter-ensaio para o mesmo alelo entre os diferentes indivíduos
para cada locus AEC, foi entre 0,12 a 1,08 pb para indivíduos clinicamente normais.
Entre os alelos mais freqüentes de todos os loci a maior variância foi observada no alelo
5 do locus AEC 7. A amostra de pacientes apresentou variabilidade inter-ensaio entre
0,11 a 1,66 pb (Tabela 4 a 8).
44
Tabela 4: Média (±
± DP) e variância dos alelos em pares de base (pb) entre controles
e pacientes analisados para ataxia espinocerebelar 1.
AEC 1
Controles
Pacientes
Alelos
Média (pb) ± DP
Var
N
Alelos
Média (pb) ± DP
Var
N
19
180,45
0
1
19
-
0
-
20
183,36
0
1
20
-
0
-
23
193
0
1
23
193
0
1
24
196,04
0
1
24
-
0
-
25
199
0
1
25
198
0
1
26
201,36 ± 0,56
0,31
9
26
201,67±0,58
0,33
5
27
204,31 ± 0,54
0,29
9
27
204,93±0,70
0,49
5
28
206,7 ± 0,75
0,56
22
28
207,03 ± 0,72
0,54
11
29
210,07 ± 0,48
0,23
87
29
210,38±0,60
0,36
63
30
212,86±0,28
0,08
99
30
212,94 ± 0,43
0,2
86
31
215,70±0,34
0,14
33
31
215,76±0,44
0,2
17
32
218,57±0,51
0,26
25
32
218,63 ± 0,57
0,32
27
33
221,18±0,37
0,14
9
33
221,42 ± 0,45
0,2
9
34
223,89 ± 0,31
0,1
4
34
-
0
-
35
227,12 ± 0,5
0,25
3
35
228
0
1
36
230,03±0,07
0,01
3
36
230,39 ± 0,9
0,81
4
N= número de cromossomos. - não detectado. Var = variância.
45
Tabela 5: Média (±
± DP) e variância dos alelos em pares de base (pb) entre controles
e pacientes analisados para ataxia espinocerebelar 2.
AEC 2
Controles
Pacientes
Alelos
Média (pb) ± DP
Var
N
Alelos
Média (pb) ± DP
Var
N
6
79
0
1
6
-
0
-
14
-
0
-
14
103
0
1
15
106
0
1
15
105
0
1
17
111
0
1
17
110,98±0,04
0,01
5
18
116,21
0
1
18
-
0
-
19
-
0
-
19
116,9±0,06
0,04
2
20
119,98±0,25
0,06
266
20
119,84±0,24
0,06
195
21
122,97 ± 0,36
0,13
23
21
123,52±0,18
0,01
16
22
125,63 ± 0,87
0,76
3
22
125
0
1
24
128
0
2
24
-
0
-
25
135
0
6
25
134,66±0,48
0,23
2
26
136,89
0
1
26
-
0
-
27
140,55
0
1
27
-
0
-
28
143,74
0
1
28
143,63±0,54
0,29
2
37
171
0
1
38
173
0
3
43
190
0
1
56
228
0
1
N= número de cromossomos. - não detectado. Var = variância. Alelos expandidos
encontram-se em negrito
46
Tabela 6: Média (±
± DP) e variância dos alelos em pares de base (pb) entre
controles e pacientes analisados para ataxia espinocerebelar 3.
AEC 3
Controles
Pacientes
Alelos
Média (pb) ± DP
Var
N
Alelos
Média (pb) ± DP
Var
N
12
196,94 ± 0,29
0,08
82
12
197,13 ± 0,4
0,16
47
13
199,55 ± 0,57
0,71
1
13
199,37 ± 0,7
0,49
4
14
-
0
-
14
201,63
0
1
15
206
0
4
15
214,44
0
1
16
207,97
0
2
16
208,52 ± 0,29
0,09
7
17
211,98 ± 0,73
0,53
7
17
212,60 ± 1,14
1,3
10
18
215,41 ± 1,03
1,06
34
18
214,84 ± 0,87
0,76
26
19
217,99 ± 1,07
1,14
12
19
217,08 ± 0,48
0,23
12
20
222,03 ± 0,35
0,12
87
20
222,23 ± 0,2
0,04
38
21
224,23 ± 1,08
1,17
18
21
223,99 ± 0,18
0,01
17
22
227,33 ± 0,92
0,85
4
22
226,83 ± 1,01
1,02
7
23
230,48 ± 0,96
0,92
4
23
230,33 ± 1,00
0,99
8
24
233,3 ± 0,28
0,08
38
24
233,6 ± 0,31
0,96
14
25
235,94 ± 0,51
0,26
7
25
236,46 ± 0,21
0,05
6
26
238,88 ± 0,97
0,94
2
26
238,82 ± 0,05
0,002
5
27
241,48
0,55
1
27
240,95
0
1
28
245
0
2
28
-
0
-
29
246,93
0,17
1
29
246,64
0
1
34
262
0
2
34
-
0
-
62
347,66 ± 0,93
0,87
2
64
354,32 ± 0,28
0,08
2
65
357,79 ± 0,26
0,66
4
66
360,83 ± 0,76
0,56
3
67
363,17 ± 1,66
2,76
2
68
365,68 ± 0,89
0,8
4
69
370
0
3
70
372,23±0,32
0,11
2
71
374,7
0
1
72
377,5
0
1
74
383
0
1
N= número de cromossomos. - não detectado. Var = variância. Alelos expandidos
encontram-se em negrito
47
Tabela 7: Média (±
± DP) e variância dos alelos em pares de base (pb) entre controles
e pacientes analisados para ataxia espinocerebelar 6.
AEC 6
Controles
Pacientes
Alelos
Média (pb) ± DP
Var
N
Alelos
Média (pb) ± DP
Var
N
2
107,93 ± 0,6
0,36
6
2
108,06±0,82
0,67
6
4
115,66 ± 0,31
0,1
25
4
115,48±0,11
0,01
3
5
116,57
0
1
5
116,97±0.09
0,01
12
8
127,88 ± 0,37
0,14
122
8
127,67±0.54
0,29
81
9
130,81 ± 0,38
0,14
57
9
130,77±0.42
0,17
33
10
133,84 ± 0,55
0,3
90
10
133,77±0.40
0,16
77
11
136,49 ± 0,72
0,52
6
11
136,41±0,82
0,68
16
12
-
-
-
12
140
0
1
13
143
0
1
13
-
-
-
21
167
0
1
N= número de cromossomos. - não detectado. Var = variância. Alelos expandidos
encontram-se em negrito
Tabela 8: Média (±
± DP) e variância dos alelos em pares de base (pb) entre controles
e pacientes analisados para ataxia espinocerebelar 7.
AEC 7
Controles
Pacientes
Alelos
Média (pb) ± DP
Var
N
Alelos
Média (pb) ± DP
Var
N
2
257,17 ± 0,9
0,81
4
2
257
0
2
4
265,19 ± 0,58
0,34
218
4
265,40±0,44
0,19
142
5
267,71 ± 1,05
1,1
26
5
267,55±0,52
0,27
27
6
270,91 ± 0,67
0,45
49
6
271,15±0,34
0,11
46
7
273,66 ± 0,51
0,26
8
7
274,26±0,57
0,01
10
8
276,68 ± 0,12
0,01
2
8
-
-
-
10
283,3
0
1
10
-
-
-
39
370,37±0,52
0,27
2
50
419,51
0
1
N= número de cromossomos. - não detectado. Var = variância. Alelos expandidos
encontram-se em negrito
48
A variabilidade intra-ensaio foi obtida repetindo cinco vezes a corrida
eletroforética de um mesmo produto de amplificação de cinco indivíduos diferentes para
os cinco loci. Esta variabilidade também foi calculada com intervalo de confiança de
95% e foi entre 0,02 a 0,69 pb (Tabela 9).
A partir desses resultados foi possível definir o limite de variação de tamanho
em pares de base para cada alelo de cada locus no programa do aparelho ABI 3100
Avant e proceder com os cálculos de freqüência e de estudo populacional.
4.3. Freqüência alélica
Na amostra de indivíduos clinicamente normais o número de repetição CAG
variou entre 19 até 36 para AEC 1 (média 29,80 ± 2,02) com 16 alelos diferentes. Na
AEC 2, o número de repetições CAG variou entre 6 a 28 (média 20,18 ± 1,35) com 12
alelos distintos. Em AEC 3 o número de repetições CAG variou de 12 a 34 repetições
com 18 alelos diferentes e com alta dispersão entre esses alelos (média 18,64 ± 4,57).
No grupo controle o tamanho dos alelos em AEC 6 variou entre 2 a 13 repetições
(média 8,52 ± 1,68) com 8 alelos diferentes. O tamanho dos alelos para AEC 7 variou
de 2 a 10 repetições (média 4,87±1,11) com 7 alelos diferentes (Tabela 10).
49
Tabela 9: Média (±DP) em pb de cinco repetições de corrida eletroforética em cinco amostras diferentes para os cinco loci .
Amostra I
Loci
Amostra II
Amostra III
Amostra IV
Amostra V
Alelo I: 29
Alelo II:30
Alelo I: 30
Alelo II: 30
Alelo I: 30
Alelo II: 31
Alelo I: 30
Alelo II: 31
Alelo I: 29
Alelo II:30
209,63 ± 0,2
212,19 ± 0,25
212,29 ± 0,21
212,29 ± 0,21
212,34 ± 0,04
214,65 ± 0,69
212,30 ± 0,13
216,16 ± 0,06
209,41 ± 0,05
212,29 ± 0,06
Alelo I: 20
Alelo II: 20
Alelo I: 20
Alelo II: 20
Alelo I: 25
Alelo II: 28
Alelo I: 20
Alelo II: 21
Alelo I: 20
Alelo II: 20
119,30 ± 0,08
119,30 ± 0,08
119,09 ± 0,09
119,09 ± 0,09
133,91± 0,04
142,54 ± 0,30
119,07± 0,10
122,10 ± 0,06
119,00 ± 0,05
119,00 ± 0,05
Alelo I: 12
Alelo II: 27
Alelo I: 20
Alelo II: 20
Alelo I: 12
Alelo II: 20
Alelo I: 12
Alelo II: 12
Alelo I: 12
Alelo II: 12
197,36 ± 0,02
254,28 ± 0,19
222,35 ± 0,11
222,35 ± 0,11
197,32 ± 0,03
222,19 ± 0,02
197,29 ± 0,02
197,29 ± 0,02
197,36 ± 0,10
197,36 ± 0,10
AEC 6
Alelo I: 8
Alelo II: 10
Alelo I: 10
Alelo II: 10
Alelo I: 5
Alelo II: 10
Alelo I: 8
Alelo II: 8
Alelo I: 9
Alelo II: 9
127,92 ± 0,06
133,68 ± 0,07
133,67 ± 0,04
133,67 ± 0,04
116,48 ± 0,04
133,71 ± 0,04
127,88 ± 0,03
127,88 ± 0,03
130,7 ± 0,02
130,7 ± 0,02
AEC 7
Alelo I: 4
Alelo II: 6
Alelo I: 2
Alelo II: 4
Alelo I: 4
Alelo II: 4
Alelo I: 4
Alelo II: 6
Alelo I: 4
Alelo II: 6
265,42 ± 0,06
271,16 ± 0,05
257,73 ± 0,06
265,36 ± 0,06
265,36 ± 0,08
265,36 ± 0,08
265,47 ± 0,04
271,26 ± 0,1
265,39 ± 0,12
271,3 ± 0,07
AEC 1
AEC 2
AEC 3
50
Tabela 10: Freqüência alélica % (±
± EP%) nos cinco loci analisados para Ataxia
espinocerebelar 1, 2, 3, 6 e 7 entre controles e pacientes.
AEC 1
AEC 2
AEC 3
Alelos
Controles
Pacientes
Alelos
Controles
Pacientes
Alelos
Controles
Pacientes
19
0,35 ± 0,34
-
6
0,35 ± 0,34
-
12
26,57 ± 2,53
20,43 ± 2.89
20
0,35 ± 0,34
-
14
0,35 ± 0,34
0,43 ± 0,48
13
0,35 ± 0,34
1,74 ± 0,93
23
0,35 ± 0,34
0,54±0,54
15
0,35 ± 0,34
0,43 ± 0,48
14
-
0,43 ± 0,48
24
0,35 ± 0,34
-
17
0,35 ± 0,34
2,17 ± 1,06
15
1,4 ± 0,67
0,43 ± 0,48
25
0,35 ± 0,34
0,54±0,54
19
0,35 ± 0,34
0,87 ± 0,67
16
0,7 ± 0,48
3,04 ± 1,23
26
2,78 ± 0,94
2,15±1,06
20
84,44±1,95
84,35 ± 2,64
17
2,45 ± 0,88
4,34 ± 1,46
27
2,78 ± 0,94
2,15±1,06
21
7,29 ± 1,48
7,00 ± 1,85
18
10,84 ± 1,78
11,3 ± 2,27
28
7,29 ± 1,48
4,84±1,57
22
1,04 ± 0,57
0,43 ± 0,48
19
3,85 ± 1,10
5,22 ± 1,60
29
28,11±2,56
27,42±3,27
23
0,69 ± 0,47
-
20
27,96 ± 2,57
16,52 ± 2,67
30
32,29±2,66
37,1±3,54
25
1,74 ± 0,74
0,87 ± 0,67
21
5,94 ± 1,35
7,39±1,88
31
10,76±1,77
7,53±1,93
26
0,35 ± 0,34
-
22
1,4 ± 0,67
3,04 ± 1,23
32
7,99 ± 1,54
11,83±2,37
27
0,35 ± 0,34
-
23
1,4 ± 0,67
3,47 ± 1,32
33
2,78 ± 0,94
3,76±1,39
28
0,35 ± 0,34
0,87 ± 0,67
24
12,24 ± 1,87
6,09 ± 1,72
34
1,39 ± 0,67
-
37
-
0,43 ± 0,48
25
2,1 ± 0,82
2,61 ± 1,14
35
1,04 ± 0,58
0,54±0,54
38
-
1,30 ± 0,82
26
0,7 ± 0,48
2,17 ± 1,05
36
1,04 ± 0,58
1,6±0,92
43
-
0,43 ± 0,48
27
0,35 ± 0,34
0,43 ± 0,48
56
-
0,43 ± 0,48
28
0,7 ± 0,48
-
29
0,35 ± 0,34
0,43 ± 0,48
34
0,7 ± 0,48
-
AEC 6
AEC 7
Alelos
Controles
Pacientes
Alelos
Controls
Pacientes
62
-
0,87 ± 0,67
2
2,08 ± 0,81
2,66±1.17
2
1,15 ± 0,67
2,17 ± 1,34
64
-
0,87 ± 0,67
4
7,98 ± 1,54
1,06±0.75
4
70,61 ± 2,88
64,38 ± 4,38
65
-
1,74 ± 0,94
5
0,35 ± 0,34
5,32±1.64
5
8,4 ± 1,75
10,00 ± 2,75
66
-
1,30 ± 0,81
8
39,59±2,79
35,11±3.48
6
16,03 ± 2,32
18,26 ± 3,54
67
-
0,87 ± 0,67
9
18,4 ± 2,21
14,36±2.56
7
2,67 ± 1,02
3,48 ± 1,68
68
-
1,74 ± 0,94
10
29,17±2,59
33,52 ± 3,44
8
0,76 ± 0,55
-
69
-
1,30 ± 0,81
11
2,08 ± 0,81
6,91 ± 1,85
10
0,38 ± 0,39
-
70
-
1,03 ± 0,72
12
-
0,53 ± 0,53
39
-
0,87 ± 0,85
71
-
0,43 ± 0,48
13
0,35 ± 0,34
-
50
-
0,43 ± 0,60
72
-
0,43 ± 0,48
21
-
0,53 ± 0,53
74
-
0,43 ± 0,48
– não detectado. Alelos expandidos encontram-se em negrito.
51
Entre pacientes o número dos alelos variou de 23 a 36 repetições em AEC 1
(media 29,96 ± 1,74) com os 12 alelos diferentes. Nenhum alelo expandido foi
encontrado no locus AEC 1. No locus AEC 2 o tamanho dos alelos variou de 14 a 56
repetições (média 20,65 ± 3,83). O locus AEC 2 mostrou quatro alelos expandidos em
seis pacientes. O locus AEC 3 tem o tamanho dos alelos variando de 12 a 74 repetições
com 28 alelos diferentes (média de 24,65 ± 16,93). Há 11 alelos expandidos em 25
pacientes. O tamanho entre os alelos em AEC 6 variou de 2 a 21 repetições (8,75± 2,04)
com 9 alelos diferentes. Somente um alelo expandido para o locus AEC 6 foi
encontrado em apenas um paciente. Estes pacientes no locus AEC 7 apresentaram o
tamanho dos alelos variando de 2 a 50 repetições (média 5,60 ± 6,12) e dois alelos
expandidos foram encontrados em três pacientes (Tabela 10).
Das AEC pesquisadas, a ataxia mais freqüente entre os pacientes é AEC 3,
seguido de AEC 2, AEC 7 e AEC 6. Nenhum caso de AEC 1 foi encontrado (Tabela
11).
Tabela 11: Freqüência das doenças nos 115 indivíduos com suspeita clínica
Doença
Freqüência (%)
Número de indivíduos
AEC 1
0
0
AEC 2
5,22
6
AEC 3
21,74
25
AEC 6
0,87
1
AEC 7
2,61
3
Todos os indivíduos que apresentaram expansão são heterozigotos apresentando
um alelo normal e o outro alelo expandido.
4.4. Equilíbrio de Hardy-Weinberg e heterozigosidade
Nas tabelas 12 a 16 encontram-se os principais genótipos na amostra de
controles para os genes das ataxias estudadas. Encontram-se também os respectivos
52
números de indivíduos observados e os números de indivíduos esperados. O cálculo
para o número de indivíduos esperados foi realizado de acordo com o equilíbrio de
Hardy – Weinberg (HW).
Tabela 12: Números de indivíduos observados e esperados para os possíveis
genótipos do gene ATXN 1 na amostra do grupo controle.
Genótipos
28/27
29/27
29/28
29/29
30/26
30/28
30/29
30/30
31/29
31/30
32/29
32/30
32/31
32/32
33/29
33/31
34/30
36/30
Outros
TOTAL
Observado
2
2
7
9
5
9
27
14
11
11
7
7
2
2
3
3
2
2
29
154
Esperado
0,585
2,258
5,927
11,289
2,592
6,805
26,247
14,906
8,749
10,045
6,491
7,453
2,484
0,882
2,258
0,864
1,296
0,972
41,897
154
53
Tabela 13: Números de indivíduos observados e esperados para os possíveis
genótipos do gene ATXN 2 na amostra do grupo controle.
Genótipos Observado Esperado
111
108,449
20/20
14
18,293
21/20
2
0,732
21/21
2
2,613
22/20
2
1,742
24/20
4
4,355
25/20
19
17,816
Outros
TOTAL
154
154
Tabela 14: Números de indivíduos observados e esperados para os possíveis
genótipos do gene ATXN 3 na amostra do grupo controle.
Genótipos
12/12
17/12
18/12
18/18
19/12
20/12
20/18
20/19
20/20
21/12
21/20
23/20
24/12
24/18
24/20
24/24
Outros
TOTAL
Observado
10
3
10
5
3
15
7
4
15
6
8
2
13
4
7
2
80
154
Esperado
10,000
1,867
8,267
1,632
2,933
21,333
8,702
3,088
11,088
4,533
4,772
1,123
9,333
3,807
9,825
2,088
49,609
154
54
Tabela 15: Números de indivíduos observados e esperados para os possíveis
genótipos do gene CACNA 1 na amostra do grupo controle.
Genótipos Observado Esperado
4
2,383
8/2
10
9,136
8/5
21
22,443
8/8
4
4,247
9/5
23
21,052
9/8
5
4,801
9/9
8
6,732
10/5
30
33,366
10/8
14
15,512
10/9
15
12,146
10/10
3
2,383
11/8
35
19,799
Outros
TOTAL
154
154,000
Tabela 16: Números de indivíduos observados e esperados para os possíveis
genótipos do gene ATXN 7 na amostra do grupo controle.
Genótipos
4/2
4/4
5/4
6/4
6/5
7/4
8/4
Outros
TOTAL
Observado
2
60
18
36
4
6
2
26
154
Esperado
2,126
65,211
15,594
29,770
3,540
4,962
1,418
31,379
154,000
Calculando-se o Qui-quadrado foi possível determinar se há diferença
significativa entre o observado e o esperado. Em nenhuma situação, a probabilidade
obtida após cálculo no Qui-quadrado foi significante, indicando não haver nenhum
desvio no equilíbrio de HW em nenhuma das distribuições genotípicas encontradas dos
cinco loci analisados (Tabela 17).
55
Tabela 17: Probabilidade obtida após aplicação do teste do Qui Quadrado (χ
χ2) no
qual a hipótese nula é que não há diferença significativa entre as freqüências
genotípicas observadas e esperadas nos cinco loci analisados (Equilíbrio de HardyWeinberg).
Loci
χ2
p
Graus de Liberdade
AEC 1
12,87
0,80
18
AEC 2
2,10
0,83
5
AEC 3
20,13
0,33
18
AEC 6
4,73
0,97
12
AEC 7
5,04
0,65
7
Os dados do heterozigosidade (H) que mostram a diversidade entre indivíduos
dentro desta amostra para os cinco loci encontram-se na Tabela 18.
Tabela 18: Heterozigosidade obtida nos cinco loci analisados.
Loci
Heterozigosidade (H)
AEC 1
0,79
AEC 2
0,24
AEC 3
0,82
AEC 6
0,72
AEC 7
0,47
4.5. Análise Clínica
Muitos dos 115 pacientes que deram entrada no Hospital de Clínicas a fim de
contribuir com a amostra pertencem a outros centros de diagnóstico clínico. Assim
sendo, não existe rastreabilidade dentro do Hospital de Clínicas para avaliação dos
dados clínicos de todos esses indivíduos. Portanto, a análise clínica foi realizada
somente em 56 pacientes cujos prontuários foram encontrados entre os 115 indivíduos
da amostra com suspeita clínica. Destes 56 indivíduos, 31 são do sexo masculino (55,36
%) e 25 do sexo feminino (44,64 %) cujos principais sinais neurológicos foram marcha
56
atáxica (49 pacientes) e disartria (45 pacientes) (Tabela 19). Maiores detalhes clínicos
dos pacientes estão descritos no Apêndice 9.
57
Tabela 19: Dados gerais de indivíduos com as características clínicas da amostra dos 56 pacientes analisados
Subtipos
Diagnóstico
de AEC
Molecular
Média de
Idade
Sexo
F
Mutações Herdadas
M
Mãe
Pai
(±DP) -
Principais Sinais Neurológicos
Marcha
Disartria
Atáxica
Tremor
Nistagmo/
Movimentos
Sinais
Intensional
Oftalmoplegia
Sacádicos
Piramidais /
Lentos
Espasticidade
0
0
0
0
Início Sint.
AEC 1
0
0
0
0
0
0
0
0
AEC 2
5 (8,93)
31,83±10,32
3 (50)
3 (50)
4 (0,93)
1 (0,29)
4 (3,5)
6 (4,82)
1 (0,29)
1 (0,5)
4 (0,93)
0
AEC 3
14 (25,01)
35,08±9,05
6 (40)
8 (60)
6 (1,82)
8 (2,57)
13 (11,38)
13 (10,45)
2 (0,57)
12 (6)
3 (0,7)
3 (0,48)
AEC 6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
AEC 7
3 (5,36)
34,67±16,16
0
3 (100)
1 (0,30)
2 (0,64)
3 (2,62)
3 (2,41)
1 (0,29)
1 (0,5)
1 (0,23)
2 (0,32)
Normal
34 (60,71)
29,25±13,98
16 (48)
17(52)
5 (1,52)
7 (2,25)
29 (25,38)
23 (18,48)
12 (3,43)
14 (7)
5 (1,16)
4 (0,64)
TOTAL
56 (100)
31,26±12,43
25 (44,64)
31(55,35)
17(30,36)
18(32,14)
49 (87,5)
45(80,36)
16(28,57)
28(50,0)
13(23,21)
9(16,07)
Os números em parênteses representam as freqüências (%).
58
A idade média foi 31,26 ± 12,43 anos. O diagnóstico molecular foi
confirmado pela eletroforese de capilar em 22 pacientes sendo: cinco pacientes
para AEC 2, quatorze pacientes AEC 3 e três pacientes em AEC 7. Em onze
pacientes cujos alelos expandidos foram encontrados, a doença foi transmitida pela
mãe e a idade média de início dos sintomas foi 38,45 ± 7,19. Em outros onze
pacientes os alelos expandidos foram transmitidos pelo pai e a média de idade de
início dos sintomas foi 27,73 ± 9,14. O teste “t” para amostras independentes
comparando a idade média de início dos sintomas entre os sexos dos genitores
transmissores da doença mostra diferenças significativas entre o sexo do genitor
que transmite o gene (t=3,05; p=0,006; α=95%). A manifestação é mais precoce
quando o sexo do genitor é masculino.
Comparando-se o diagnóstico molecular com o diagnóstico clínico foi
possível estabelecer uma relação entre eles determinando se existe diferença
significativa entre as duas formas de diagnóstico (Tabela 20). Além disso, foi
possível calcular a sensibilidade, a especificidade, o valor preditivo positivo (VPP)
e o valor preditivo negativo (VPN) do teste. Os valores contidos na tabela 20
referem-se a todos os 115 pacientes uma vez que estes foram submetidos ao teste
molecular por apresentarem alguma suspeita clínica de ataxia, isto é, o teste foi
realizado em indivíduos com sintoma de ataxia. Entretanto, é muito importante
salientar que sendo o Hospital de Clínicas um centro de referência, muitos
pacientes são encaminhados com suspeita de ataxia, porém sem a precisa definição
do diagnóstico clínico em virtude da grande sobreposição de sinais e sintomas,
tornando a amostra de pacientes bastante heterogênea.
59
Tabela 20: Comparação entre diagnóstico molecular e clínico dos 115
pacientes para AEC 1, AEC 2, AEC 3, AEC 6 e AEC 7
Diagnóstico Molecular
Suspeita clínica para pelo menos um dos
Expansão
Sem expansão
28 (a)
17 (b)
45 (a+b)
7 (c)
63 (d)
70 (c+d)
80 (b+d)
115
subtipos analisados
Outras ataxias e Diagnóstico a esclarecer
35 (a+c)
2
χ = 32,86
p = 0,000
Sensibilidade: a/(a+c) = 80,00 %
VPP: a/(a+b) = 62,22 %
Especificidade: d/(b+d) = 78,75 %
VPN: d/(c+d) = 90,00 %
Estatisticamente há diferenças significativas entre os dois diagnósticos
(χ2=32,86; p=0,00). Em 45 indivíduos clinicamente positivos, somente 28 foram
confirmados pelo diagnóstico molecular e sete indivíduos, que apresentaram
expansão, não foram definidos clinicamente com nenhum dos subtipos de ataxia
estudado, isto é, apenas o diagnóstico molecular foi capaz de detectá-los (Tabela
21).
O teste de “t” para amostras independentes foi usado para comparar as
médias dos alelos entre pacientes e o grupo controle. Estes resultados mostraram
diferenças significativas para os loci de AEC 2 e AEC 3 (Tabela 22).
60
Tabela 21: Número de pacientes com a respectiva suspeita clínica e diagnóstico
molecular da amostra total de 115 pacientes.
Suspeita Clínica
Diagnóstico Molecular
AEC 1
Número
de casos Confirmada
-
Sem alelos
AEC 1 AEC 2 AEC 3 AEC 6 AEC 7 expandidos
-
AEC 2
7
71,4%
-
5
-
-
-
2
AEC 3
30
66,7%
-
-
20
-
-
10
AEC 6
5
20%
-
-
-
1
-
4
AEC 7
3
66,7%
-
-
-
-
2
1
Diagnóstico a esclarecer
70
-
-
1
5
-
1
63
Total
115
-
-
6
25
1
3
80
Outras
AEC
e
– não detectado. Indivíduos confirmados somente pelo diagnóstico molecular encontram-se em
negrito.
Tabela 22: Teste “t” para amostras independentes comparando a média dos
alelos de todos os 115 pacientes e da população assintomática (Controles).
MC
MP
NC
NP
DPC DPP
t
p
Valor F
p
AEC 1C vs. AEC 1P
29,81
29,97
308
230
2,02 1,68
-0,94
0,35
1,44
0,004
AEC 2 C vs. AEC 2 P
20,18
20,84
308
230
1,35 4,13
-2,26
0,025 9,36
0,00
AEC 3 C vs. AEC 3 P
18,48
24,75
308
230
4,5
0,00
AEC 6 C vs. AEC 6 P
8,51
8,89
308
230
1,68 2,64
-1,87
0,062 2,46
0,00
0,00
AEC 7 C vs. AEC 7 P
4,5
5,2
308
230
0,99 5,12
-1,79
0,076 26,45
0,00
17,22 -5,23
14,63
C- Controles; P- Pacientes; M- média; N- número de cromossomos; DP- desvio padrão; gl- graus de
liberdade; p- probabilidade. Valores de p significantes encontram-se em negrito.
61
V. DISCUSSÃO
62
5.1. Considerações sobre a metodologia de análise de fragmento em eletroforese de
capilar
O genoma de mamíferos apresenta quantidades enormes de seqüências de
DNA repetitivas sendo, em sua maioria, identificadas como trechos de uma única
unidade que se repete subseqüentemente. Esta unidade de repetição quando varia
de 2 a 6 pb é conhecida como microsatélites. O estudo de microsatélites tem sido
útil para comparações genéticas e para mapeamento do genoma devido a
características como o alto grau de polimorfismo e por estarem distribuídos em
várias regiões ao longo do genoma. Muito embora as regiões de microsatélites
estejam distribuídas em maior parte nas regiões espaçadoras de genes, estas podem
também estar presentes em genes funcionais encontrando-se tanto na região não
codificadora (intron) quanto na região codificadora (exon)
[BROOK e cols., 1992;
CUMMINGS e ZOGHBI, 2000; DAVID e cols., 1997; KOOB e cols., 1999; LA SPADA e cols., 1991; ORR e cols., 1993;
PULST e cols., 1996].
O diagnóstico molecular destas doenças de expansão é muitas vezes
bastante controverso por questões éticas e por faltar um tratamento definitivo e
específico. Entretanto, a possibilidade de diagnóstico oferece ao clínico e ao
paciente e seus familiares, o esclarecimento do possível prognóstico contribuindo
também para o aconselhamento genético e planejamento familiar. Além disso, o
diagnóstico molecular também oferece uma perspectiva para que possíveis
estratégias terapêuticas possam ser adotadas em um futuro, à medida que estudos
moleculares entre outros forem desvendando os processos celulares de degeneração
e os tratamentos para as mesmas [SCHÖLS e cols., 2004].
A metodologia de análise de fragmento em eletroforese de capilar tem sido
utilizada para determinação do número de repetições em algumas doenças de
expansão
[LE e cols., 1997].
A partir de uma análise cuidadosa é possível diferenciar
63
indivíduos com o número normal de repetições do indivíduo com número
expandido e também de indivíduos que apresentam alelos intermediários.
Neste estudo, pequenas variações no tamanho em pares de base (pb) foram
observadas entre indivíduos que apresentam o mesmo alelo a partir de valores
teóricos. Esta variação é provavelmente ocasionada por fatores tais como a
temperatura de eletroforese, o número do lote do polímero e o tempo de uso do
capilar
[LARSEN e cols., 1997; LE e cols., 1997; ROSENBLUM e cols., 1997].
Para definir os alelos de
forma fidedigna foi necessário separar indivíduos com alelos de tamanho em pares
de base aproximado e calcular a média, o desvio e a variância de cada alelo em
cada locus. Verificam-se pequenas diferenças no desvio e na variância para um
mesmo alelo, que de modo algum compromete a interpretação dos resultados. Este
resultado significa que os protocolos definidos apresentam reprodutibilidade,
credibilidade e precisão metodológica.
Os métodos de diagnóstico utilizados para definir alelos em regiões de
repetição têm sido publicados geralmente comparando a eletroforese de capilar
com experimentos em gel de poliacrilamida (PAGE). Há uma discrepância no
tamanho do produto de amplificação entre estas metodologias. Observa-se que
dados obtidos em eletroforese de capilar apresentam tamanho dos alelos
virtualmente menor. Este fato deve-se a migração mais rápida em eletroforese de
capilar, acarretando em um ou dois alelos (representados pelos picos no gráfico) a
menos do que é obtido na PAGE [LARSEN e cols., 1997; LE e cols., 1997; DORSCHNER e cols., 2002].
Os fatores que contribuem para estas discrepâncias podem ser efeitos “crosslinked” que é maior na PAGE porque há maior resistência na corrida do produto de
amplificação quando comparada ao polímero da eletroforese de capilar. Outros
fatores podem ser: o efeito eletro–osmótico associado à duração da capacidade
64
desnaturante do polímero e as diferenças na estrutura secundária entre os produtos
de amplificação e os marcadores de peso e tamanho molecular [ROSENBLUM
1997].
e cols.,
As diferenças de estrutura são importantes uma vez que o tamanho dos alelos
é definido através de cálculo matemático pelo programa comparando o marcador
com o fragmento amplificado através de corrida concomitante.
No presente estudo verificou-se a presença do alelo de 36 repetições no
locus ATXN 1 em indivíduos assintomáticos e em indivíduos com suspeita clínica
da doença. O gene ATXN 1 apresenta na seqüência do DNA de alelos normais uma
interrupção da região de repetição CAG com a trinca CAT. Alelos expandidos não
apresentam esta interrupção. Esta trinca CAT no interior das repetições CAG
parece ser a responsável em manter a estabilidade dos alelos normais durante a
replicação do DNA. Alelos normais para este gene apresentam a faixa de 6 a 39
repetições CAG com interrupções de 1 a 4 trincas CAT na região. Alelos
expandidos apresentam 39 a 81 repetições sem interrupções CAT
1993].
[MATILLA e cols.,
Analisando indivíduos com o alelo de 39 repetições CAG, ZHULKE e cols.
em 2002 verificaram que quando não há a interrupção CAT existe manifestação
clínica da doença. Entretanto, quando a trinca CAT está presente, indivíduos com
39 repetições são fenotipicamente normais. Alelos intermediários variam de 36 a
41 repetições CAG. Indivíduos tipados para esta alelo de 36 repetições não
necessariamente apresentarão sinais e sintomas de AEC 1, possivelmente sendo um
alelo de penetrância reduzida. A presença deste alelo em indivíduos assintomáticos
pode ser um indício que pacientes apresentando 36 repetições CAG são normais
para AEC 1. Evidentemente, o sequenciamento deste gene nesses indivíduos e o
acompanhamento clínico nos casos com suspeita clínica para AEC 1 é
indispensável.
65
Além disso, em AEC 2 também é observado que indivíduos com alelos
intermediários de 32 e 33 repetições CAG, a presença da trinca CAA no interior
das repetições, confere um fenótipo normal [IMBERT e cols., 1996].
Toda esta especulação pode levar a compreensão exata de como alelos
intermediários são estáveis evitando o surgimento de alelos expandidos. Outro fato
interessante é que alelos intermediários apresentam uma ambigüidade entre a
possibilidade do fenótipo normal e doente sendo importante elucidar possíveis
elementos cis envolvidos com mecanismos moleculares que podem levar à um ou
ao outro fenótipo.
Em AEC 2 o alelo mais freqüente é o de 20 repetições CAG (86,44%). Em
outras populações o alelo descrito como mais freqüente, sendo 94 % do total de
alelos, apresenta 22 repetições [IMBERT e cols.,
1996; SANPEI e cols., 1996; PULST e cols., 1996].
Para o locus ATXN 3 o número de repetições CAG variou de 12 a 34 repetições
sendo os alelos com 12 e 20 repetições CAG (54,53% somados) os mais
freqüentes. A análise deste locus em famílias brasileiras com história clínica de
Doença de Machado Joseph (DMJ) realizado por LOPES-CENDES e cols., 1997
mostrou que o tamanho dos alelos variou de 12 a 33 repetições CAG. Este mesmo
locus em outras populações apresentou os alelos de 14 e 23 repetições CAG como
mais freqüentes, sendo de 48,4% a freqüência dos dois alelos somados [LIMPRASERT e
cols., 1996].
As comparações de freqüências alélicas devem ser feitas com estudos
populacionais
que
utilizem
a
metodologia
de
eletroforese
de
capilar.
Provavelmente as diferenças observadas entre o tamanho dos alelos deste estudo e
os de outros autores como os citados são ocasionadas por diferenças nas
metodologias. Devido à freqüência similar, pode tratar-se do mesmo alelo.
66
A melhor forma de definir o número exato de repetições é o isolamento do
gene por clonagem molecular, com subseqüente seqüênciamento. Isto deve ser
feito com pelo menos alguns indivíduos da amostra. Assim, é possível realizar o
cálculo de correção do número de repetições CAG através da correlação dos
resultados das amostras de controles e de indivíduos com suspeita clínica
analisados por EC e por sequenciamento.
5.2. Importância do estudo populacional
Além das diferenças metodológicas, existe ainda a variabilidade
populacional das repetições uma vez que cada população humana pode apresentar
um perfil genético próprio e diferente das demais como é verificado no presente
trabalho.
Na população brasileira, no locus ATXN 1 a faixa de alelos normais foi
descrita entre 29 a 37 repetições CAG
[JARDIM e cols., 2001; SILVEIRA e cols., 2002].
Neste
estudo foram encontrados alelos na população do Paraná com menos de 29
repetições em ambas as amostras (Tabela 4). Em ATXN 2 não foi descrito ainda em
outras populações [CANCEL e cols., 1997] o alelo de 6 repetições CAG que foi observado
na população assintomática deste estudo (Tabela 5). Na população brasileira a faixa
de alelos varia para este locus de 19 a 24 repetições
2002] enquanto
[JARDIM e cols., 2001; SILVEIRA e cols.,
que este estudo apresentou a variação dos alelos normais de 6 a 28. O
locus da DMJ apresentou alelos expandidos variando de 62 a 74 repetições CAG.
Alelos expandidos de 62-65 repetições não foram encontrados nem por JARDIM e
cols. em 2001 em populações brasileiras do Rio Grande do Sul e nem por
SILVEIRA e cols. em 2002. Estes alelos expandidos podem se tratar de alelos com
penetrância reduzida porque não são encontrados em todas as populações de
pacientes embora já tenham sido descritos em pacientes com a doença [GIUNTI
e cols.,
67
1995].
A variação alélica encontrada no locus CACNA 1 assim como em ATXN 7
revela a presença de alelos de 2 repetições CAG que não foram descritos em
literatura ainda. Além disso, neste trabalho, o numero máximo de repetições nos
alelos normais em ATXN 7 foi até 10 repetições CAG. O gene ATXN 7 apresenta
menor variabilidade do que descrito em literatura onde podemos encontrar até 17
repetições dentro da normalidade [DAVID e cols., 1997].
Neste estudo nenhum alelo intermediário foi observado na amostra da
população não afetada para AEC 2, AEC 3, AEC 6 e AEC 7. Entretanto, em
estudos com famílias apresentando sintomas das ataxias espinocerebelares 1, 2, 3, 6
e 7 observam-se a presença de alelos de tamanho intermediário
[PULST e cols., 1996;
RANUM e cols., 1995; TAKIYAMA e cols., 1994; VAN ALFEN e cols., 2001; ZUHLKE e cols., 2002].
Provavelmente, alelos intermediários são tão raros quanto os alelos expandidos,
sendo encontrados somente em famílias de afetados com a doença.
Na AEC 3, estudos realizados na população assintomática Portuguesa
mostraram que não houve nenhuma correlação significativa entre a freqüência da
DMJ e as freqüências dos alelos normais maiores. Esta análise foi realizada
levando-se em consideração o número de repetições de tamanhos pequenos, médios
ou grandes (>27 repetições CAG) entre diferentes subgrupos da população [ANDRES e
cols., 2002; LIMA e cols., 2005].
A maioria dos cromossomos mutados em pacientes com AEC 3 encontrados
em diferentes populações do mundo apresenta um haplótipo comum e um segundo
haplótipo associado a um pequeno grupo de pacientes. Dois outros haplótipos
foram encontrados em poucas famílias com a doença. Todos estes haplótipos
podem ter se derivado de um único haplótipo original que foi alterado em
decorrência das mutações em microssatélites
[GASPAR e cols., 2001].
Os estudos que
associam haplótipos intragênicos com a instabilidade do tamanho das repetições
68
CAG no cromossomo normal no locus AEC 3 não sustentam a hipótese de que
alelos intermediários dariam origem aos alelos expandidos
[MACIEL e cols., 1999].
Os
resultados do estudo atual, no qual nenhum alelo expandido ou intermediário foi
encontrado na população normal para AEC 3, concorda com os estudos
haplotípicos citados acima. Porém, é importante levar em consideração que o
tamanho da amostra que é pequeno. A distribuição da DMJ é atribuída a uma
elevada taxa de alelos mutados originalmente e não ao processo de contração
gênica e conseqüente expansão. Isso poderia explicar as freqüências alélicas
observadas neste trabalho. Este dado está de acordo com o modelo que postula a
presença de poucos eventos mutacionais do quais a maioria dos pacientes da DMJ
ao redor do mundo teria se originado [ANDRES e cols., 2002]. Além disso, acredita-se que
a origem da doença de Machado Joseph no Brasil é provavelmente devida a um
efeito fundador quando o gene responsável foi trazido durante a época das
navegações Portuguesas. Neste tempo, por causa das perseguições religiosas, o
alelo mutado causador da DMJ poderia ter se dispersado, sendo a causa da
incidência elevada da doença no Brasil, nos Estados Unidos e na maior parte do
mundo ocidental
cols., 1996].
[HARDING, 1993; LIMPRASERT e cols., 1996; LOPES CENDES e cols., 1997; SILVEIRA e
Tal fator corrobora a freqüência elevada da doença encontrada no estudo
atual.
Curiosamente, associada ao estudo populacional está a análise de estrutura
secundária do transcrito de RNA mensageiro (RNAm) de doenças de expansão
com o trinucleotídeo CAG. Em 2004, MICHLEWSKI e KRZYOSIAK, publicaram
um artigo comparando a estrutura secundária de diferentes transcritos de RNAm do
locus ATXN 3. Estes autores concluíram que a variante genética apresentando o
nucleotídeo C (Citosina) logo após as repetições CAG confere maior instabilidade
69
destas regiões. Esta instabilidade facilita o aumento da variabilidade no locus
ATXN 3. Esta rica fonte de variabilidade para evolução aumenta o risco de gerar
alelos patogênicos. Esta variante C, como é chamada, está presente em humanos
associada principalmente, mas não exclusivamente, a alelos mutados (isto é,
expandidos). É rara nos chimpanzés e ausente em outros primatas, espécies onde
não são observados alelos expandidos
[LIMPRASERT e cols., 1996].
Este resultado
corrobora com o pressuposto de que evolutivamente a espécie humana apresentaria
taxa de alelos mutados originalmente elevada e um único haplótipo original teria
sido alterado em decorrência das mutações em microssatélite [ANDRES e cols., 2002; LIMA
e cols., 2005].
Entretanto, existem outros loci gênicos com características moleculares
semelhantes (repetições CAG em regiões codificadoras) que apresentam
mecanismos diferentes na dinâmica das repetições como o que ocorre na doença de
Huntington (DH) em que alelos intermediários e expandidos são observados em
população normal
[COSTA e cols., 2002; RASKIN e cols., 2000].
Estes valores intermediários
tenderiam a desencadear o aumento de repetições levando à expansão. Assim como
na DH, existem estudos com a amostra de indivíduos clinicamente normais para
DMJ em diferentes populações, que sustentam a idéia de que a presença de alelos
de tamanho igual ou maior que 27 repetições CAG está correlacionada com maior
prevalência da DMJ nos pacientes
[TAKANO e cols., 1998].
De acordo com o presente
estudo foram encontrados alelos com tamanho igual ou maior que 27 repetições de
AEC 3. Há um interesse epidemiológico na freqüência destes alelos uma vez que
estes parecem estar em haplótipos com alto potencial para desencadear as
expansões, como se fossem reservatórios através dos quais ocorreriam mais
expansões por conversão gênica [BAUER e cols., 2005; CHATTOPADHYAY e cols., 2003; DAVID e cols.,
70
1997; LIMPRASERT e cols., 1996; MACIEL e cols., 1997; MITTAL e cols., 2005].
Alelos com tamanho
maior que 27 repetições CAG também são observados em populações como
Portugueses, Americanos, Japoneses e Africanos; populações que apresentam
incidência elevada de pacientes com DMJ [KAWAGUCHI e cols., 1994; LIMPRASERT e cols., 1996;
TEIVE e ARRUDA, 2004].
Nenhuma correlação poderá ser feita no locus ATXN 3 apenas com os dados
encontrados neste trabalho pois: nos pacientes a DMJ é forma mais comum de
ataxia e na amostra controle não existem alelos intermediários (46 a 56 repetições
CAG) e foram observados alelos normais de tamanhos elevados (2,1 % dos alelos
variam de 27 a 34 repetições CAG). Um estudo com uma amostra populacional
maior, na qual possa haver uma estratificação por regiões com incidências distintas
de DMJ, por exemplo, poderia levar a uma correlação positiva ou negativa entre a
maior incidência da doença com alelos normais cujo número de repetições CAG
são maiores que 27.
O presente estudo fornece subsídio para compreender a origem das
mutações nos loci ATXN 1, ATXN 2, ATXN 3, ATXN 6 e ATXN 7. Entretanto, um
estudo haplotípico incluindo outros sítios desses loci deveria ser realizado em
ambas as amostras.
A freqüência dos subtipos de AEC 1, 2, 3, 6 e 7 encontrada por este estudo
é semelhante às encontradas por LOPES-CENDES e cols. em 1997 (AEC 1χ2=2,38/p=0,12; AEC 2-χ2=0,24/p=0,62 e AEC 3-χ2=0,05/p=0,83); JARDIM e
cols. em 2001 (AEC 3 -χ2=0,17/p=0,68 e AEC 7-χ2=3,59/p=0,06). Em SILVEIRA
e cols. em 2002 as freqüências são semelhantes em AEC 3 (χ2=1,43/p=0,23) e
AEC 6 (χ2=0,31/p=0,58) porém diferentes em AEC 2 (χ2=6,51/p=0,01)e AEC 7
(χ2=4,85/p=0,03) (Tabela 23). As diferenças entre esses resultados podem ser
71
devidas a distinção dos loci analisados e provavelmente por se tratar de amostra de
pacientes brasileiros de diferentes estados do país. Estes resultados estão de acordo
com o que se postula por diversos autores quanto à variabilidade de alelos e de
freqüência dos subtipos de ataxia nas diferentes populações. Além disso, esta
diferença evidencia ainda mais a importância do estudo populacional em diferentes
regiões brasileiras devido à diversificação na constituição étnica do país.
Tabela 23: Freqüências de ataxia espinocerebelar descritas na população
brasileira
Frequencias (%)
Doenças
Resultado
Lopes
–
atual
Cendes e cols.,
População
Silveira
e
Jardim e cols.,
Bird,
2007
cols., 2002
2001
População
1997
Portugueses
População
Mundial
Brasileira
População
e Brasileiros
Brasileira (Rio
(Paraná)
Brasileira
Grande do Sul)
AEC 1
0
3
-
-
6
AEC 2
5,22
6
3
-
15
AEC 3
21,74
30
63
92
21
AEC 6
0,87
-
1
-
15
AEC 7
2,61
-
1
2
5
Outros
69,56
61
32
6
38
- não analisado
Através dessa análise populacional minuciosa foi possível identificar uma
faixa normal de repetições CAG para indivíduos assintomáticos. Além disso, foi
possível definir freqüências populacionais para os cinco genes, caracterizando
melhor a população na qual o teste será empregado na rotina do laboratório. O fato
de nenhum alelo intermediário ou expandido ter sido encontrado nesta população
normal é relevante para o diagnóstico molecular. Tendo em vista a importância do
estudo populacional, considera-se a informação da variação de alelos dentro da
normalidade fornecida por este trabalho um início para compreender a dinâmica de
todos os cinco loci na população do sul do Brasil.
72
A população de indivíduos controles está em equilíbrio de HW para todos
os loci analisados, o que assegura a qualidade técnica deste experimento uma vez
que uma amostra populacional em ambientes constantes, sem migrações intensas e
com baixo índice de consangüinidade deve estar em equilíbrio de Hardy-Weinberg
(HW) ou aproximar-se dele
BEIGUELMAN].
[NEEL e SCHULL, 1954 apud BEIGUELMAN, 1990; LI, 1972 apud
Além do equilíbrio HW os dados de heterozigosidade (H) também
caracterizaram a população quanto à quantidade de heterozigotos para cada gene.
Este índice é mais um dado que assegura a qualidade do experimento. A
heterozigosidade (H) encontrada neste estudo para os loci AEC 1, AEC 2, AEC 3,
AEC 6 e AEC 7 foi H=0,79; H=0,24; H=0,82; H=0,72; H=0,47 respectivamente.
Heterozigosidade semelhante foi encontrada por SILVEIRA e cols. em 2002 para
os mesmos loci (AEC 1-H=0,78; AEC 2-H=0,15; AEC 3-H=0,73; AEC 6-H=0,68;
AEC 7-H=0,37). Heterozigosidade similar para o locus ATXN 3 é descrita em
outras populações do mundo (H=0,84 e H=0,86 [LIMPRASERT e cols., 1996]. Este resultado
associado a ausência de desvio do equilíbrio de HW indica que a região de
repetições (CAG)n no gene da DMJ pode ser usada como um marcador nos estudos
de genética de população [LIMA e cols., 2005].
5.3. Metodologia para diagnóstico molecular
A análise de uma amostra de indivíduos com suspeita clínica da doença
permitiu definir a faixa de alelos que podem caracterizar indivíduos afetados,
distinguindo esses dois grupos para utilidades diagnósticas. A diferença na média
dos alelos entre as amostras de doadores de sangue e pacientes com suspeita clínica
de ataxia mostrada pelo cálculo do teste “t” evidencia este fato. Encontrou-se
diferença significativa nos subtipos AEC 2 e DMJ cujas médias de repetições CAG
de pacientes é mais elevada (AEC 2 e DMJ).
73
Como descrito anteriormente, o início da doença nos filhos ocorre em idade
mais jovem quando o sexo do genitor transmissor do alelo expandido é masculino
[KLOCKGETHER e cols 2000 apud TEIVE, 2005].
à instabilidade do DNA
Isto ocorre pela dinâmica das expansões devido
[DEKA e cols., 1999; RICHARDS e cols.., 1992; TAKIYAMA e cols.,1995].
O
teste “t” para amostras independentes comparando a idade média de início dos
sintomas entre os sexos dos genitores transmissores da doença mostra diferenças
significativas entre o sexo do genitor que transmite o gene. O resultado mostra que
o início da doença nos filhos ocorre em idade mais jovem quando o sexo do genitor
transmissor do alelo expandido é masculino. Este dado está de acordo com o que se
observa na literatura.
Os valores de especificidade, sensibilidade, valor preditivo positivo (VPP) e
valor preditivo negativo (VPN) foram obtidos comparando o resultado molecular
com o diagnóstico clínico. Devido à sobreposição dos fenótipos entre os diferentes
subtipos de ataxia o diagnóstico baseado somente no exame clínico torna-se muito
difícil. Este painel para os 5 genes responsáveis em causar ataxia espinocerebelar 1,
2, 3, 6 e 7 descrito neste estudo, pôde distinguir os verdadeiros resultados negativos
(especificidade) em 78,75 % e os verdadeiros resultados positivos (sensibilidade)
em 80,00 % dos pacientes analisados clinicamente. Este resultado de sensibilidade
significa que, embora 20,00 % dos pacientes tenham ataxia clinicamente,
provavelmente a causa não se deva a nenhum dos 5 genes analisados. Nestes casos,
outros testes genéticos, assim como o suporte do clínico para a confirmação do
diagnóstico serão substanciais para conclusão diagnóstica. O VPP indica que
62,22% dos casos com diagnóstico clínico deverão ser confirmados pelo
diagnóstico molecular para um dos cinco subtipos analisados. O VPN indica que
90,00 % dos pacientes com suspeita clínica de outras ataxias ou com diagnóstico a
74
esclarecer apresentarão resultado molecular negativo para os subtipos analisados. A
relevância deste resultado é que 10,00 % dos pacientes foram detectados e
diferenciados somente pelo diagnóstico molecular.
Qualquer resultado molecular positivo evidencia que a causa da ataxia é de
fato o subtipo no qual o alelo expandido foi detectado (alta especificidade e o VPP)
[GUEDES e GUEDES, 1988; SOUNIS, 1975; VIEIRA, 2003].
Outro fator importante é que tecnicamente pode haver amplificação
preferencial do alelo normal [LARSEN
ROSENBLUM e cols., 1997].
e cols., 1997; LE e cols., 1997; DORSCHNER e cols., 2002;
Este fato pode não evidenciar a expansão em alguns pacientes
principalmente nos casos de AEC 2 e AEC 7 juvenil cujo número de repetições
pode ser bastante elevado
[SCHÖLS e cols., 2004]
fugindo a linearidade e a sensibilidade
do método. Entretanto, a metodologia utilizada no presente estudo definiu os
protocolos com alelos normais e alelos expandidos. Este fato associado aos
resultados populacionais indicam que provavelmente a maior parte dos alelos
responsáveis em causar o fenótipo de ataxia espinocerebelar 1, 2, 3, 6 ou 7 pôde ser
detectado.
No total dos 115 pacientes estudados, o diagnóstico molecular foi
confirmado em 35 pacientes sendo seis para AEC 2, 25 para AEC 3, um para AEC
6 e três para AEC 7. Os demais 80 pacientes não apresentaram alelos expandidos
nos loci analisados.
Dos 115 pacientes, 56 foram analisados clinicamente e apresentaram
sobreposição de sintomas clínicos, como se espera em doenças neurodegenerativas,
devido à heterogeneidade clínica. O diagnóstico molecular foi confirmado pela
eletroforese de capilar em 22 pacientes dos 56 (cinco pacientes para AEC 2,
quatorze pacientes para DMJ e três pacientes para AEC 7) representando 62,86%
75
do total de alelos expandidos encontrados na amostra de 115 indivíduos com
suspeita clínica.
Apesar do número pequenos de indivíduos com expansão detectada em
AEC 2 (cinco) a mutação foi transmitida em 80,00% (quatro) dos casos pela mãe.
Portanto, para diferenciar indivíduos afetados pelos subtipos estudados e
indivíduos normais, podemos recorrer ao resultado do presente trabalho que definiu
a faixa de normalidade para cada um dos subtipos e encontrou alelos expandidos
em pacientes. Pacientes que apresentarem clinicamente sintomas gerais de ataxia,
em alguns casos no início da doença onde há grande dificuldade para o clínico
distinguir os subtipos, este diagnóstico será importante principalmente quando
terapêuticamente se tornar viável o tratamento específico para cada um dos subtipos. O diagnóstico baseado somente nos achados clínicos é bastante controverso e
a metodologia mostrou-se útil tanto na distinção entre os subtipos quanto na
confirmação ou exclusão de outros casos com sintomas semelhantes. Além do que
foi descrito em literatura, este trabalho fornece dados próprios de investigação úteis
para a população Paranaense não só em âmbito de diagnóstico molecular e
diferencial, mas também para serem usados em estudos de evolução molecular dos
genes em questão.
76
VI. CONCLUSÕES
77
6.1. Principal
O genótipo das repetições CAG nos genes ATXN 1, 2, 3, 6 e 7 em indivíduos da
população normal e de pacientes foi determinado sendo possível discriminar
clinicamente indivíduos normais e afetados para o diagnóstico molecular,
distinguindo geneticamente os cinco subtipos de ataxia.
6.2. Secundárias:
Originais:
a. Na população normal alelos ainda não descritos em literatura foram
encontrados e a freqüência populacional dos alelos tão bem como a faixa
de normalidade foi definida para população paranaense
b. As distribuições genotípicas estão de acordo com Equilíbrio de HardyWeinberg evidenciando a qualidade técnica, além de demonstrar
estabilidade alélica na população não afetada.
c. Foi possível averiguar a freqüência dos alelos de ataxias no Paraná em
indivíduos não aparentados com suspeita clínica.
d. A ausência de alelos intermediários na população normal pode ser mais
um indício que, evolutivamente, os alelos mutados não decorrem do
processo de conversão e contração gênica nestes loci.
Confirmatórias:
a. Foi possível definir os alelos de cada um dos cinco loci a partir do tamanho
em pares de base (pb).
b. Alelos expandidos foram detectados em AEC 2, AEC 3, AEC 6 e AEC 7 na
amostra de pacientes. A freqüência alélica e da incidência da doença pôde
ser calculada.
78
VII. REFERÊNCIAS
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96
VIII. APÊNDICES
97
Apêndice 1: Instrumento de coleta de dados para grupo controle
GRUPO CONTROLE
Nome:
Sexo:
feminino
masculino
Naturalidade:
Data de Nascimento:
/
/
/
/
Estado Civil:
Grupo Étnico:
Escolaridade:
Profissão:
Endereço:
Bairro:
Cidade
CEP:
UF:
Telefone:
Doença:
Doença na família:
Observações:
Data:
98
Apêndice 2: Instrumento de coleta de dados para pacientes
PACIENTES
Nome:
Sexo:
feminino
masculino
Data de Nascimento:
Naturalidade:
Estado Civil:
Grupo Étnico:
Número do Registro:
Escolaridade:
Profissão:
/
/
/
/
Endereço:
Bairro:
Cidade
CEP:
UF:
Telefone:
Suspeita Clínica:
Casos na Família:
Observações:
Data:
99
Apêndice 3: Termo de consentimento informado livre e esclarecido - Pacientes
MODELO DE TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO LIVRE E
ESCLARECIDO – GRUPO DE ESTUDO
Título do Projeto: ESTUDO MOLECULAR DAS ATAXIAS
CEREBELARES.
Investigador: Lineu César Werneck
Local da Pesquisa: Serviço de Neurologia, Hospital de Clínicas da Universidade Federal do
Paraná.
Endereço e telefone: Rua Gal. Carneiro, 161 – Sala 310 – Fone 360-1800, Ramal 6261.
Você está sendo convidado (a) a participar de uma pesquisa, coordenada por um profissional de saúde agora denominado pesquisador. Para
poder participar, é necessário que você leia este documento com atenção. Ele pode conter palavras que você não entende. Por favor peça aos
responsáveis pelo estudo para explicar qualquer palavra ou procedimento que você não entenda claramente.
O propósito deste documento é dar a você as informações sobre a pesquisa e, se assinado, dará a sua permissão para participar no estudo. O
documento descreve o objetivo, procedimentos, benefícios e eventuais riscos ou desconfortos caso queira participar. Você só deve participar do
estudo se você quiser. Você pode se recusar a participar ou se retirar deste estudo a qualquer momento.
INTRODUÇÃO
As ataxias cerebelares são doenças hereditárias, que afetam o cerebelo (órgão do sistema nervoso central que coordena os movimentos) ou
suas conexões, determinando dificuldades na execução dos movimentos, marcha ou palavra. Não existe um tratamento definitivo para essas
doenças e ainda faltam conhecimentos para compreender como os sintomas são produzidos a partir das alterações no DNA. As alterações no
DNA são variáveis, existindo repetições de segmentos do DNA, que pode variar em cada família. Essas repetições poderão ter relação com a
intensidade dos sintomas e a época do aparecimento da doença. Para que essas repetições de segmento do DNA sejam valorizadas, é
necessário que exista uma correlação dos sintomas com tipo de alteração, comparando com uma população normal.
PROPÓSITO DO ESTUDO
Pretende verificar o número de repetições de um determinado segmento do DNA, a fim de estudar qual é a sua relação com os sintomas,
comparando com as repetições de uma população normal.
Ao mesmo tempo pretende organizar uma biblioteca de DNA (banco de DNA), que poderá ser utilizado no futuro, caso não seja encontrada
no momento uma alteração no seu exame e possibilite novos testes, a medida que a ciência for se desenvolvendo.
SELEÇÃO
Para que você seja elegível para o estudo, deverá ser portador de uma ataxia cerebelar
progressiva comprovada por história clínica e exame neurológico, ter investigação
neurológica e por neuroimagem negativa para outras causas de ataxia, devendo ser excluídas
as doenças tóxico infecciosas que determinem sintomas semelhantes.
PROCEDIMENTOS
1. Inicialmente será realizada uma avaliação clínica com exame neurológico por um dos
membros da equipe ou do Serviço de Neurologia, com registro de seus dados.
2. Investigação laboratorial para afastar outras doenças que podem simular ataxia
cerebelar degenerativa, como exames de sangue rotineiros, neuroimagem, líquido
cefalorraquidiano ou testes eletrofisiológico, dependendo dos dados colhidos na
avaliação clínica.
100
3. Em seguida serão colhidos 20 ml (centímetros cúbicos) de sangue, que será
propriamente identificado para controle do laboratório.
4. Esse sangue será enviado ao Laboratório de Biologia Molecular da Neurologia, de
onde será extraído o seu DNA.
5. O DNA será armazenado em “freezer” com a devida identificação.
6. Posteriormente serão feitas a amplificações e classificação de segmentos do DNA que
interessam ao estudo, através de métodos de laboratório específicos para as diversas
ataxias cerebelares degenerativas.
7. O restante do DNA será armazenado para futuras análises e pesquisas, pois
eventualmente é possível que nenhuma das ataxias testadas no momento seja positiva
e você possua uma forma diferente ainda não descrita. Acompanhando a literatura,
conforme forem sendo descritas, será feito o teste em seu material.
Este procedimento não determinará nenhum dano, além do desconforto da picada da agulha
para retirada do sangue, que será realizado com técnicas padrões e com material estéril.
Participando desse estudo, você estará ajudando a conhecer a incidência da doença na
população Brasileira, bem como eventualmente ajudar na elucidação do mecanismo de
produção dos sintomas e talvez no desenvolvimento de um tratamento.
Se desejar, poderemos fornecer os dados encontrados, mediante solicitação por escrito.
PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA:
Sua decisão em participar deste estudo é voluntária. Você pode decidir não participar no
estudo. Uma vez que você decidiu participar do estudo, você pode retirar seu consentimento e
participação a qualquer momento. Para tanto, deverá comunicar por escrito, solicitando o
restante da amostra do DNA existente e que não foi utilizado. Se você decidir não continuar
no estudo e retirar sua participação, você não será punido ou perderá qualquer benefício ao
qual você tem direito.
CUSTOS
Não haverá nenhum custo a você relacionado aos procedimentos previstos no estudo.
PAGAMENTO PELA PARTICIPAÇÃO
Sua participação é voluntária, portanto você não será pago por sua participação neste estudo.
PERMISSÃO PARA REVISÃO DE REGISTROS, CONFIDENCIALIDADE E
ACESSO AOS REGISTROS:
O Investigador responsável pelo estudo e equipe irão coletar informações sobre você. Em
todos esses registros um código substituirá seu nome. Todos os dados coletados serão
mantidos de forma confidencial. Os dados coletados serão usados para a avaliação do estudo,
membros das Autoridades de Saúde ou do Comitê de Ética, podem revisar os dados
fornecidos. Os dados também podem ser usados em publicações científicas sobre o assunto
pesquisado. Porém, sua identidade não será revelada em qualquer circunstância.
Você tem direito de acesso aos seus dados. Você pode discutir esta questão mais adiante com
seu médico do estudo.
CONTATO PARA PERGUNTAS
Se você ou seus parentes tiver (em) alguma dúvida com relação ao estudo, direitos do
paciente, ou no caso de danos relacionados ao estudo, você deve contatar o Investigador do
101
estudo ou sua equipe. Se você tiver dúvidas sobre seus direitos como um paciente de
pesquisa, você pode contatar Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos (CEP) do
Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná, pelo telefone: 360-1800. O CEP
trata-se de um grupo de indivíduos com conhecimento científicos e não científicos que
realizam a revisão ética inicial e continuada do estudo de pesquisa para o mantê-lo seguro e
proteger seus direitos.
DECLARAÇÃO DE CONSENTIMENTO DO PACIENTE:
Eu li e discuti com o investigador responsável pelo presente estudo os detalhes descritos neste
documento. Entendo que eu sou livre para aceitar ou recusar, e que eu posso interromper
minha participação a qualquer momento sem dar uma razão. Eu concordo que os dados
coletados para o estudo sejam usados para o propósito acima descrito.
Eu entendi a informação apresentada neste termo de consentimento. Eu tive a oportunidade
para fazer perguntas e todas as minhas perguntas foram respondidas.
Eu receberei uma cópia assinada e datada deste Documento de Consentimento Informado.
NOME DO PACIENTE
ASSINATURA
DATA
NOME DO RESPONSÁVEL
(Se menor ou incapacitado)
ASSINATURA
DATA
NOME DO INVESTIGADOR
(Pessoa que tomou o TCLE)
ASSINATURA
DATA
102
Apêndice 4: Termo de consentimento informado livre e esclarecido – Grupo
Controle
MODÊLO DE TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO LIVRE E
ESCLARECIDO – GRUPO CONTROLE
Título do Projeto: ESTUDO MOLECULAR DAS ATAXIAS
CEREBELARES.
Investigador: Lineu César Werneck
Local da Pesquisa: Serviço de Neurologia, Hospital de Clínicas da Universidade Federal do
Paraná.
Endereço e telefone: Rua Gal. Carneiro, 161 – Sala 310 – Fone 360-1800, Ramal 6261.
Você está sendo convidado (a) a participar de uma pesquisa, coordenada por um profissional de saúde agora denominado pesquisador. Para
poder participar, é necessário que você leia este documento com atenção. Ele pode conter palavras que você não entende. Por favor peça aos
responsáveis pelo estudo para explicar qualquer palavra ou procedimento que você não entenda claramente.
O propósito deste documento é dar a você as informações sobre a pesquisa e, se assinado, dará a sua permissão para participar no estudo. O
documento descreve o objetivo, procedimentos, benefícios e eventuais riscos ou desconfortos caso queira participar. Você só deve participar do
estudo se você quiser. Você pode se recusar a participar ou se retirar deste estudo a qualquer momento.
INTRODUÇÃO
As ataxias cerebelares são doenças hereditárias, que afetam o cerebelo (órgão do sistema nervoso central que coordena os movimentos) ou
suas conexões, determinando dificuldades na execução dos movimentos, marcha ou palavra. Não existe um tratamento definitivo para essas
doenças e ainda faltam conhecimentos para compreender como os sintomas são produzidos a partir das alterações no DNA. As alterações no
DNA são variáveis, existindo repetições de segmentos do DNA, que pode variar em cada família. Essas repetições poderão ter relação com a
intensidade dos sintomas e a época do aparecimento da doença. Para que essas repetições de segmento do DNA sejam valorizadas, será
necessário saber qual o valor normal em uma população normal, isto é, que não seja portadora da doença. Isso vale para esta doença, bem
como para outras doenças que poderão incidir na população em geral.
PROPÓSITO DO ESTUDO
Pretende verificar o número de repetições de um determinado segmento do DNA, a fim de estudar qual é o número normal que existe na
população normal, para comparar com pacientes portadores de ataxias.
Ao mesmo tempo pretende organizar uma biblioteca de DNA (banco de DNA), que poderá ser utilizado no futuro como controle para outras
doenças hereditárias.
SELEÇÃO
Para que você seja elegível para o estudo, deverá ter idade acima de 18 anos, gozar de boa
saúde, não ter nenhuma doença conhecida, não ser portador ou ter conhecimento de qualquer
doença genética, hereditária ou mal formações na sua família, não ter sido exposto à radiação
ou a agentes tóxicos.
PROCEDIMENTOS
8. Inicialmente será preenchido um formulário com seus dados (Nome, idade, sexo,
profissão, endereço).
9. Em seguida serão colhidos 20 ml (centímetros cúbicos) de sangue, que será
propriamente identificado para controle do laboratório.
103
10. Esse sangue será enviado ao Laboratório de Biologia Molecular da Neurologia, de
onde será extraído o seu DNA.
11. O DNA será armazenado em “freezer”.
12. Posteriormente serão feitas a amplificações e identificações de segmentos do DNA
que interessa ao estudo, através de métodos de laboratório específicos.
13. O restante do DNA será armazenado para futuras análises e pesquisas, a fim de servir
como grupo controle em outras doenças genéticas.
Este procedimento não determinará nenhum dano, além do desconforto da picada da agulha
para retirada do sangue, que será realizado com técnicas padrões e com material estéril.
Participando desse estudo, você estará ajudando a conhecer o padrão normal de DNA na
população normal, comparando com as ataxias cerebelares e outras doenças que porventura o
seu sangue venha a ser utilizado como controle.
Se desejar, poderemos fornecer os dados encontrados, mediante solicitação por escrito.
PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA:
Sua decisão em participar deste estudo é voluntária. Você pode decidir não participar no
estudo. Uma vez que você decidiu participar do estudo, você pode retirar seu consentimento e
participação a qualquer momento. Para tanto, deverá comunicar por escrito, solicitando o
restante da amostra do DNA existente e que não foi utilizado. Se você decidir não continuar
no estudo e retirar sua participação, você não será punido ou perderá qualquer benefício ao
qual você tem direito.
CUSTOS
Não haverá nenhum custo a você relacionado aos procedimentos previstos no estudo.
PAGAMENTO PELA PARTICIPAÇÃO
Sua participação é voluntária, portanto você não será pago por sua participação neste estudo.
PERMISSÃO PARA REVISÃO DE REGISTROS, CONFIDENCIALIDADE E
ACESSO AOS REGISTROS:
O Investigador responsável pelo estudo e equipe irão coletar informações sobre você. Em
todos esses registros um código substituirá seu nome. Todos os dados coletados serão
mantidos de forma confidencial. Os dados coletados serão usados para a avaliação do estudo,
membros das Autoridades de Saúde ou do Comitê de Ética, podem revisar os dados
fornecidos. Os dados também podem ser usados em publicações científicas sobre o assunto
pesquisado. Porém, sua identidade não será revelada em qualquer circunstância.
Você tem direito de acesso aos seus dados. Você pode discutir esta questão mais adiante com
seu médico do estudo.
CONTATO PARA PERGUNTAS
Se você ou seus parentes tiver (em) alguma dúvida com relação ao estudo, direitos do
paciente, ou no caso de danos relacionados ao estudo, você deve contatar o Investigador do
estudo ou sua equipe. Se você tiver dúvidas sobre seus direitos como um paciente de
pesquisa, você pode contatar Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos (CEP) do
Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná, pelo telefone: 360-1800. O CEP
trata-se de um grupo de indivíduos com conhecimento científicos e não científicos que
104
realizam a revisão ética inicial e continuada do estudo de pesquisa para o mantê-lo seguro e
proteger seus direitos.
DECLARAÇÃO DE CONSENTIMENTO DO PACIENTE:
Eu li e discuti com o investigador responsável pelo presente estudo os detalhes descritos neste
documento. Entendo que eu sou livre para aceitar ou recusar, e que eu posso interromper
minha participação a qualquer momento sem dar uma razão. Eu concordo que os dados
coletados para o estudo sejam usados para o propósito acima descrito.
Eu entendi a informação apresentada neste termo de consentimento. Eu tive a oportunidade
para fazer perguntas e todas as minhas perguntas foram respondidas.
Eu receberei uma cópia assinada e datada deste Documento de Consentimento Informado.
NOME DO PACIENTE
ASSINATURA
DATA
NOME DO RESPONSÁVEL
(Se menor ou incapacitado)
ASSINATURA
DATA
NOME DO INVESTIGADOR
(Pessoa que tomou o TCLE)
ASSINATURA
DATA
105
Apêndice 5: Comitê de ética e de pesquisa em seres humanos
106
107
Apêndice 6: Representação gráfica da amostra de pacientes
108
Apêndice 7: Lista de reagentes
Amersham-Pharmacia Biotech: dNTPs- Amershan Pharmacia Biotech inc.,
Piscataway, NJ, USA.
Applied Biosystems: Hi-Di Formamide, Performance Optimized Polymer 4 (POP
4), GS – 500
ROX, Arranjo de 4 capilares para ABI PRISM 3100 Avant,
Iniciadores marcados com fluorescência FAM, VIC e NED- Foster City, CA, USA.
Invitrogen: Proteinase K, Ácido Bórico, SDS, 10mg/mL, TRIS, EDTA,
Accuprime DNA polimerase Systems -Invitrogen, Stratagene, La Jolla, CA, USA.
Merck: Ácido Clorídrico, Acetato de Sódio, Carbonato de Sódio, Cloreto de
Cálcio, Cloreto de Potássio, Cloreto de Sódio, Clorofórmio, Etanol absoluto, Fenol,
Hidróxido de Sódio
Millipore: Aparelho para obtenção de água ultra pura (água reagente Tipo I)
Promega: YT1 DNA polimerase (respectivo Tampão 10X e MgCl2 25mM)Madison, WI, USA.
Sigma: Acetato de amônia, Cloreto de Magnésio, DMSO, Glicerol
109
Apêndice 8: Preparo de soluções
Solução de Lise de Eritrócitos (SLE): TRIS pH7,6 10 mM; MgCl2 5mM e NaCl
10mM
Proteinase K 5mg/mL: Dissolver 10mg de proteinase K em 1 mL de Tampão TE
e adicionar 1 mL de glicerol estéril. Armazenar a – 20oC.
SDS 10 %: Dissover 10 g de SDS em água destilada e deionizada (q.s.p. 100ml)
com auxílio do Banho Maria a 55oC. Armazenar 4 oC. Aquecer a solução no
momento de uso
Fenol Saturado: Liquefazer o fenol a 65 oC. Depois de liquefeito, adicionar a
mesma quantidade de Tris 50mM pH 10,0 e deixar agitando durante a noite. Deixar
em repouso por 30 minutos e retirar a fase aquosa (fase superior). Adicionar a
mesma quantidade de Tris HCl 50 mM pH 8,0 e deixar agitando por 2 h. Decorrido
o tempo esperar 30 minutos e medir o pH do fenol (fase inferior) que deverá ser em
torno de 8,0. Caso não esteja em torno de 8,0 repetir as duas etapas acima.
Acetato de Sódio 3M: Dissolver 24,1 g de acetato de sódio em água destilada e
deionizada q.s.p.100mL
Etanol 70%: Misturar 70 mL de etanol absoluto em 30mL de água destilada e
deionizada
Tampão TE: TRIS pH 7,6 10mM e EDTA pH 8,0 0,1 mM
110
Apêndice 9: Características clínicas da amostra de 56 pacientes analisados
Principais Sintomas
o
N DNA
Diag Clin
Diag Mol
7
Ataxia
DMJ
Sexo
F
Idade Mut herd
47 Mãe
Alt Marcha
+
Disartria
Tremor
Nistagmo
+
-
+
19
Ataxia
normal
F
54 -
45
DMJ
DMJ
F
25 Pai
Mov Sac
-
Espast
-
+
-
+
-
-
-
+
+
-
+
-
-
46
AEC 6
normal
M
35 Pai
+
+
-
+
-
-
47
AEC 10
normal
F
36 Pai
+
+
-
+
-
-
49
AEC 3
normal
F
10 -
+
+
-
+
-
-
51
Ataxia
normal
M
32 -
+
+
+
-
-
-
53
Ataxia
DMJ
F
37 Pai
+
+
-
+
-
-
54
Ataxia
AEC 2
F
14 Pai
+
+
-
-
+
-
79
AEC 2
normal
F
12 -
+
+
-
-
+
-
95
PNP mot
normal
M
38 -
+
-
+
-
-
-
117
DMJ
DMJ
M
40 Pai
+
+
-
+
-
-
119
DMJ
normal
F
27 Mãe
+
-
+
-
-
-
120
DMJ
DMJ
F
49 Mãe
+
+
+
+
-
-
121
AEC 7
AEC 7
M
16 Pai
+
+
+
-
-
-
140
DMJ
DMJ
F
42 Mãe
-
+
-
-
+
-
141
DMJ
DMJ
M
26 Pai
+
+
-
+
-
-
151
AEC 6
normal
M
50 Mãe
+
+
-
+
-
-
170
Ataxia
normal
M
23 Pai
+
+
-
-
+
-
171
Friedreich
normal
M
9 -
+
-
-
-
-
-
193
Freidreich
normal
F
35 Mãe
+
+
-
+
-
-
217
Hipoβptnmia
normal
F
11 -
+
-
+
-
-
-
222
Ataxia
DMJ
M
39 Pai
+
+
-
+
-
-
DMJ
DMJ
M
33 Pai
+
+
-
+
-
+
247
Sind cerebe
248
e motora
normal
F
46 -
+
+
-
+
-
-
269
Ataxia
normal
M
46 Mãe
+
+
-
+
-
-
310
DMJ
DMJ
F
30 Mãe
+
+
+
-
+
+
311
DMJ
DMJ
M
34 Mãe
+
+
-
+
+
-
325
DMJ
DMJ
M
19 Pai
+
+
-
+
-
-
368
DMJ
DMJ
M
32 Pai
+
+
-
+
-
+
379
Ataxia
normal
M
25 Pai
+
+
-
-
+
-
387
AEC 6
normal
F
26 -
+
+
+
-
-
-
392
DMJ
normal
F
42
-
+
-
-
-
-
396
Esporádica
normal
F
20 Pai
+
+
+
+
-
-
400
mioclonica
normal
M
25 -
+
-
+
-
-
-
-
Epilepsia
401
Ataxia
normal
M
39 -
-
-
+
-
-
-
416
DMJ
normal
F
32 Mãe
+
+
-
+
-
-
429
Ataxia
normal
F
6 -
+
+
-
+
-
-
430
Essencial
normal
M
14 -
-
-
+
-
-
-
433
Atx. Espast..
normal
M
7 -
+
+
-
-
-
-
Tremor
111
Continuação
Tabela 11
No DNA
Diag Mol
Principais Sintomas
Sexo
Idade Mut herd
Alt Marcha
Disartria
Tremor
Nistagmo
Mov Sac
Espast
453
Ataxia
normal
M
48 Pai
+
+
+
+
-
+
472
AEC 2
AEC 2
M
33 Mãe
+
+
+
-
-
-
475
AEC 2
AEC 2
M
38 Mãe
+
+
-
-
+
-
479
AEC 2
AEC 2
F
38 Mãe
-
+
-
+
+
-
490
AEC 2
AEC 2
M
26 Mãe
+
+
-
-
+
-
507
Ataxia
normal
F
20 -
+
+
-
-
+
+
547
AEC 7
AEC 7
M
44 Mãe
+
+
-
+
-
+
565
AEC 10
normal
M
40 Pai
+
+
-
+
-
-
574
Ataxia
normal
M
35 -
+
+
-
-
-
-
580
AEC 10
normal
F
48 -
+
+
+
+
-
+
615
AEC 4
normal
F
30 -
-
+
-
-
+
+
627
Atx. Reces.
normal
M
15 -
+
+
-
-
-
-
650
Ataxia
normal
F
19 -
-
-
-
+
-
-
665
DMJ
DMJ
M
42 Mãe
+
-
-
+
-
-
706
DMJ
normal
M
37 -
+
-
-
-
-
-
783
Ataxia
AEC 7
M
24 Pai
TOTAL
+
+
-
-
+
+
49
45
16
28
13
9
- não informado; + presença; M=masculino; F=feminino;
112
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