Microscopia Eletrônica
em Biologia
Márcia Attias
Instituto de Biofísica UFRJ
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Um pouco de história
2
Amostras biológicas e o ME
„
Células:
Frágeis
„ Hidratadas
„ Muito espessas para o feixe de elétrons
„ Ambiente no interior do ME: vácuo e calor
„
3
4
Porque as células não podem
ser observadas vivas no
Microscópio Eletrônico ?
„
„
„
„
Não pode haver água na coluna do
microscópio
As células têm de ser resistentes ao
feixe
As células precisam apresentar
contraste
As células têm de ser cortadas em fatias
finas
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FIXAÇÃO
Preservação da integridade
morfológica x molecular
6
Fixação de amostras
„
Fixar é matar a célula preservando sua
estrutura
Pode ser Química ou
„ Física: congelamento
„
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Fixadores químicos
„
Permanganato de Potássio (KMnO4)
8
Contrastação negativa
Estruturas macromoleculares
Células
vírus
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Fixadores químicos
„
Formaldeído
Instável, preparado a partir de
paraformaldeído. Não forma ligações
cruzadas. Degrada rapidamente em metanol
„ Preserva antigenicidade da amostra
„ Penetração rápida
„
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Fixadores químicos
„
OsO4 – tetróxido de
ósmio
Liga-se aos ácidos graxos
insaturados
„ Age como contrastante
„ Age como mordente
„
Famous first electron micrograph of an intact cell was published in The
Journal of Experimental Medicine in March 1945, in "A Study of Tissue
Culture Cells by Electron Microscopy," by Keith R. Porter, Albert
Claude, and Ernest F. Fullam. The cell is a cultured fibroblast
originating from a chick embryo, which was grown by Porter on
polyvinyl film, then peeled off and transferred to a wire specimen grid.
The cell was fixed with osmium tetroxide, washed and then dried in
order to prevent evaporation in the electron microscopeUs vacuum
chamber. Magnified 1600 times
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Fixadores químicos
Glutaraldeído (Sabatini, 1963)
Forma ligações cruzadas com proteínas
„ Melhor preservação estrutural
„ Penetração mais lenta que o formaldeído
„
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Soluções tampão
„
Os fixadores são sempre diluídos em
soluções tampão para
Manter o equilíbrio osmótico do material
„ Manter o pH próximo ao fisiológico
„
„
Tampões mais comuns
Fosfato de Sódio
„ Cacodilato de Sódio
„
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Perguntas mais frequentes
„
„
„
„
„
„
„
„
„
Que fixador usar? Fixar por imersão ou por perfusão?
Qual a concentração de Glutaraldeído, formaldeído,
tetróxido de ósmio?
Recomenda-se adicionar o ferrocianeto de potássio na pósfixação?
Sacarose, NaCl, ácido tânico. Qual seu papel na fixação?
Quanto tempo se deve deixar a amostra no fixador?
Quanto tempo se deve lavar para retirar o fixador?
A que temperatura deve ser a fixação?
Que tamanho deve ter a amostra?
Como selecionar o tampão?
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Fixação Química por
imersão
„
É a mais utilizada. O protocolo padrão
compreende as seguintes etapas:
„
„
„
„
„
„
„
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
fixação primária
lavagem
pós-fixação (ou fixação secundária)
lavagem
desidratação
infiltração em resina
polimerização da resina
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Passo a passo da fixação
?
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Amostras precisam ser bem
pequenas
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Palavra chave:
DIFUSÃO
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Proteção contra vapores e soluções
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Pós-Fixação
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DESIDRATAÇÃO
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Desidratação
A amostra é passada por
concentrações crescentes de
etanol ou acetona
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Infiltração em resina
Em seguida, o fluido de transição será
substituído por uma resina líquida.
Resina no estado líquido
„ Este processo é feito gradualmente ao
longo de 24 horas.
„
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Tipos de resina
„
EPOXI
„
„
„
Hidrofóbicas
Polímeros de trama
mais fechada
Polimerização a 60oC
„
METACRILATOS
„
„
„
Hidrofílicas
Polímeros de trama
mais aberta
Polimerização a baixa
temperatura sob U.V.
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• Quando as amostras estiverem
completamente infiltradas na resina
elas serão distribuídas em moldes e
levadas à estufa...
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„
„
Na estufa a resina se solidificará.
Os blocos contendo as amostras podem
ser retirados e desenformados.
48 horas
60oC
28
„
Em seguida, os blocos são preparados
para serem cortados em fatias
ultrafinas.
Número de identificação
amostra
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Ultramicrotomia
As amostras precisam ser cortadas em seções ultrafinas para que o
feixe de elétrons possa atravessá-las. Isto é feito num ultramicrótomo
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braço
bloco
espelho d´água
diamante
O bloco é preso no braço do instrumento. A cada oscilação do
braço, há um pequeno avanço. Ao passar pelo gume de diamante
da faca, uma fina fatia flutua sobre o espelho d´água
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33
Os cortes flutuam sobre um
espelho d´água
Cortes ultrafinos (60 a 100 nm)
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Os cortes são recolhidos em
telas de cobre
Cada tela tem 3 mm de diâmetro !
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A grade é então inserida no
microscópio eletrônico de
transmissão
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1965
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Considerações sobre fixação
química
„
De acordo com os fixadores e soluções
utilizados é possível identificar
seletivamente espécies moleculares ou
proteínas, havendo metodologias
específicas para a localização ou realce de
vários componentes celulares.
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Princípios da Fixação a frio
„
„
„
Congelamento “instantâneo” do momento
celular
Evita: sofrimento, difusão de solutos,
deformação osmótica, alteração
bioquímica
Problemas: velocidade de fixação em
função da espessura da amostra
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Métodos de congelamento
„
Criofratura
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Métodos de congelamento
„
Plunge Freezing
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Métodos de congelamento
„
Congelamento por
Alta pressão (High
pressure freezing)
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Crio-Substituição
(freeze substitution)
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Crio-eletronmicroscopia
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