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Seleção assistida por marcador molecular para identificação de genótipos
de tomateiro resistentes ao vira-cabeça
Ildon Rodrigues do Nascimento1; Wilson Roberto Maluf2; Antônia Reis Figueira3; Cícero Bezerra
Menezes4; Marcos Ventura Faria1; Juliano Tadeu Vilela de Resende1; Douglas Willian
Nogueira2; Mikel R Stevens5; Cacilda Márcia D. Rios Faria1.
1
2
UNICENTRO - Departamento de Agronomia - Guarapuava–PR. Departamento de Agricultura, UFLA, Lavras–MG.
3
5
Sakata Seed Sudamerica, Bragança Paulista. Plant and Animal Science Department, Brigham Young University,
Provo, UT, USA.
RESUMO
Foram avaliadas populações de tomateiro quanto à resistência ao vira-cabeça, utilizando o
marcador molecular SCAR co-dominante “Sw-421”. Avaliaram-se 60 plantas das seguintes
populações: BPX 385Epl#15, BPX 385Epl#23, BPX 385Epl#08, BPX 385Epl#28 e BPX
385Epl#04, mais as testemunhas resistentes (Stevens, TOM-584, TOM-585) e suscetível
(Santa Clara). As testemunhas resistentes e suscetível apresentaram banda de 940 pb e de
900 pb, respectivamente. As populações BPX 385E-pl#15, BPX 385E-pl#08 e BPX 385E-pl#04
apresentaram 37,5%, 100% e 50%, respectivamente, de plantas com uma única banda de 940
bp, típica de genótipos homozigotos resistentes. Duas bandas (heterozigotos) foram
observadas em 43,8% e 4,2% das plantas das populações BPX 385Epl#15 e BPX 385Epl#23,
respectivamente. Padrões de banda (900 bp) correspondentes ao genótipo homozigoto
suscetível foram observados em 18,8%, 95,8%, 100% e 50% das plantas das populações BPX
385Epl#15, BPX 385Epl#23, BPX 385 Epl#28 e BPX 385E-pl#04, respectivamente.
Palavras-chave: Lycopersicon esculentum, Tospovirus, resistência genética, seleção indireta.
ABSTRACT- Molecular marker assisted selection for identification of tomato genotypes
with resistance to tospovirus
The objective of this experiment was to access resistance to tospovirus in tomato populations,
with molecular marker co-dominant SCAR 'Sw-421'. The following populations were acessed:
(BPX 385Epl#15, BPX 385Epl#23, BPX 385Epl#08, BPX 385Epl#28 and BPX 385Epl#04) the
checks resistance (Stevens, TOM-584, TOM-585) and susceptible (Santa Clara). A total of 60
plants were screened. The resistant and the susceptible checks showed respective bands with
940 bp and 900bp. Populations BPX 385E-pl#15, BPX 385E-pl#08 e BPX 385E-pl#04, showed
37.5, 100 and 50 % plants with a single 940bp band, typical of homozygous resistant genotypes.
Two bands (heterozygous genotypes) were observed in 43.8 and 4.2% of the plants in
populations BPX 385Epl#15 e BPX 385Epl#23, respectively. One 900bp-band pattern, typical of
2
homozygous susceptible genotypes, was observed in 18.8, 95.8, 100 and 50% of the plants in
populations BPX 385Epl#15, BPX 385Epl#23, BPX 385 Epl#28 e BPX 385E-pl#04, respectively.
Key words: Lycopersicon esculentum, Tospovirus, genetic resistance, indirect selection.
INTRODUÇÃO
As principais fontes de resistência utilizadas no controle genético do vira cabeça são as
cultivares Rey de los Tempranos (resistência proveniente de L. esculentum) e Stevens
(resistência proveniente de L. peruvianum) (JULIATTI & MALUF, 1995). Na cultivar Stevens a
resistência é controlada por um alelo dominante (Sw-5) (STEVENS et al, 1992), enquanto na
cultivar Rey de los Tempranos a resistência é controlada por pelo menos 1 a 3 genes com
interação alélica do tipo dominância parcial (JULIATTI & MALUF, 1995). O gene com o alelo
Sw-5 foi mapeado através de marcador RAPD, no cromossomo 9 (STEVENS et al, 1995).
STEVENS et al (1996) desenvolveram o marcador co-dominante ‘UBC 421’, situado a uma
distância 1,0 cM do gene Sw-5, obtido a partir de um primer decâmero de RAPD (ACG GCC
CAC C), que mostra uma banda de 940pb (banda 421R) nos materiais resistentes e uma
banda de 900pb (banda 421S) nos suscetíveis. Recentemente, o marcador ‘UBC 421’ foi
convertido em um marcador também co-dominante do tipo SCAR (primers de 20 pb ‘Sw-421-1
e Sw-421-2’). O trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência do marcador SCAR (Sw-421) em
selecionar plantas resistentes (homozigotas e heterozigotas) e suscetíveis em populações de
cruzamentos com a cultivar Stevens e avançadas por retrocruzamentos.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Virologia da UFLA, em Lavras-MG e na HortiAgro
Sementes Ltda., em Ijaci–MG. Populações isogênicas e segregantes de tomateiro para o alelo
Sw-5 foram cultivadas em bandejas de isopor de 128 células. Após avaliação, plantas individuais
de cada população foram transplantadas para estufas para obtenção de sementes. O DNA de
folíolos das plantas foi extraído por microextração e as reações de PCR foram realizadas por
metodologias adaptadas de FERREIRA & GRATTAPAGLIA (1998). O produto de cada reação
foi corado e a fixação dos fragmentos foi feita em gel de agarose. Foram utilizados padrões de
resistência (cultivar Stevens e as linhagens BPX339G-004; TOM-585; TOM-584 e BPX339F-07),
de suscetibilidade (cultivar Santa Clara e as linhagens BPX339F-050-01; BPX339G-065-01;
BPX339E-050-02; BPX339F-06; BPX339E-065-02 e BPX363C-04-02) e padrões heterozigotos
(linhagens BPX339G-045-01 e BPX362C-18-01). Além das testemunhas, foram avaliadas 60
plantas de diferentes populações de tomateiro que são quase isogênicas às cultivares Santa
Clara e/ou Angela Gigante, mas segregantes para o gene Sw-5.
3
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O marcador molecular do tipo SCAR ‘Sw-421’ mostrou-se altamente eficiente em
selecionar plantas homozigotas resistentes (Sw-5/Sw-5) e suscetíveis (Sw-5+/Sw-5+) (Figura 1).
Nos genótipos resistentes (Stevens, TOM-584 e TOM-585) houve a amplificação de um
fragmento de DNA com 940 pb, caracterizando-os como homozigotos. Bandas de 900 pb
foram observadas na testemunha suscetível Santa Clara. Padrão heterozigoto resistente (Sw5/Sw-5+) foi observado nos genótipos BPX339G-045-01 e BPX362C-18-01, confirmando o
mecanismo de herança do marcador do tipo co-dominante (Figura 1). A codominância neste
caso refere-se a amplificação das duas cópias dos fragmentos pelos 2 primers (Sw-421-1 e
Sw-421-2), o que permite discriminar em uma mesma geração, plantas resistentes
heterozigotas. Na população BPX 385E-pl#15, das 16 plantas que foram avaliadas, seis (37,5
%) apresentaram bandas para o genótipo resistente, outras três (18,8%) apresentaram bandas
para genótipo suscetível. Duas bandas foram observadas em sete (43,8%) das plantas
avaliadas (Figura 2). A população BPX 385E-pl#23 teve 24 plantas avaliadas, das quais
apenas uma (4,2%) foi resistente heterozigota e as outras 23 (95,8%) foram suscetíveis (Figura
2 e 3). Na população BPX 385E-pl#08, 11 plantas avaliadas foram resistentes homozigotas.
Em outras três não foi observado padrão de banda por não ter ocorrido anelamento do primer
com a seqüência específica, possivelmente pela degradação ou oxidação do DNA durante a
extração e amplificação (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Nas populações BPX 385Epl#28 e BPX 385E-pl#04 apenas uma das seis plantas que foram avaliadas foi resistente
(Figura 3). A grande importância do marcador Sw-421 não se situa apenas na segurança e
facilidade da identificação de materiais homozigotos resistentes, mas também na possibilidade
da piramidização de genes de resistência ao vira-cabeça. A piramidização seria factível com o
desenvolvimento de marcadores ligados a outros alelos de resistência, como por exemplo,
oriundos da cultivar Rey de los Tempranos.
REFERÊNCIAS
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em
análises genéticas. 3ª ed. Brasília: EMBRAPA-CENERGEN, 1998. 220p.
JULIATTI, F.C.; MALUF, W.R. Controle genético da resistência do tomateiro a um isolado de
tospovirus (TSVW) – Análise de plantas individuais. Fitopatologia Brasileira, v.20, n.1, 1995.
STEVENS, M.R. et al. A linkage map of the tomato spotted wilt virus resistance gene Sw-5 using
near isogenic lines and an interspecific cross. Acta Horticulturae, v.431, p.385-392, 1996.
STEVENS, M.R. et al. Mapping the Sw-5 locus for tomato spotted wilt virus resistance in tomatoes
using RAPD and RFLP analyses. Theoretical and Applied Genetics, v.90, p.451-456, 1995.
L
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3
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R
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S
S
R
S
R
S
H
S
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Figura 1 – Padrão eletroforético de fragmentos de DNA amplificados para o marcador Sw-421 em plantas de linhagens de
tomateiro. L – Marcador Ladder; 1 – Stevens; 2 – BPX339G-004; 3 – BPX339G-045-01; 4 – BPX339F-050-01; 5 – BPX339G065-01; 6 – TOM 585; 7 – TOM 584; 8 – Santa Clara; 9 – BPX339E-050-02; 10 – BPX339F-06; 11 – BPX339F-07; 12 –
BPX339E-O65-02; 13 – BPX363C-18-01; 14 – BPX363C-04-02; 15 – BPX362C-18-01. R: Resistente; H: Heterozigoto; S:
Suscetível.
1
2
S
3 4
5
6
7
8
H R H R S R
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
H R S H R H R H H S
S S
S S
S
S
S
S
S S
S
S
S
Figura 2 – Padrão eletroforético de fragmentos de DNA amplificados para o marcador Sw-421 em plantas de populações de
tomateiro. 1 - BPX 385Epl#15-01; 2 - BPX 385Epl#15-02;3 - BPX 385Epl#15-03; 4 - BPX 385Epl#15-04; 5 - BPX 385Epl#15-05; 6
- BPX 385Epl#15-06; 7 - BPX 385Epl#15-07; 8 - BPX 385Epl#15-08; 9 - BPX 385Epl#15-09; 10 - BPX 385Epl#15-10; 11 - BPX
385Epl#15-11; 12 - BPX 385Epl#15-12; 13 - BPX 385Epl#15-13; 14 - BPX 385Epl#15-14; 15 - BPX 385Epl#15-15; 16 - BPX
385Epl#15-16; 17 - BPX 385Epl#23-01; 18 - BPX 385Epl#23-02; 19 - BPX 385Epl#23-03; 20 - BPX 385Epl#23-04; 21 - BPX
385Epl#23-05; 22 - BPX 385Epl#23-06; 23 - BPX 385Epl#23-07; 24 - BPX 385Epl#23-08; 25 - BPX 385Epl#23-09; 26 - BPX
385Epl#23-10; 27 - BPX 385Epl#23-11; 28 - BPX 385Epl#23-12; 29 - BPX 385Epl#23-13; 30 - BPX 385Epl#23-14. Em que: R –
Resistente; H – Heterozigoto e S – Suscetível.
1
S
2 3
4
5 6
S S H S
7
S S
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9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
S S
S
R
R R R R R
R
R R R
R S
S
S S
S R
Figura 3 – Padrão eletroforético de fragmentos de DNA amplificados para o marcador Sw-421 em plantas de populações de
tomateiro. 1 - BPX 385Epl#23-15; 2 - BPX 385Epl#23-16;3 - BPX 385Epl#23-17; 4 - BPX 385Epl#23-18; 5 - BPX 385Epl#23-19; 6
- BPX 385Epl#23-20; 7 - BPX 385Epl#23-21; 8 - BPX 385Epl#23-22; 9 - BPX 385Epl#23-23; 10 - BPX 385Epl#23-24; 11 - BPX
385Epl#08-01; 12 - BPX 385Epl#08-02; 13 - BPX 385Epl#08-03; 14 - BPX 385Epl#08-04; 15 - BPX 385Epl#08-05; 16 - BPX
385Epl#08-06; 17 - BPX 385Epl#08-07; 18 - BPX 385Epl#08-08; 19 - BPX 385Epl#08-09; 20 - BPX 385Epl#08-10; 21 - BPX
385Epl#08-11; 22 - BPX 385Epl#08-12; 23 - BPX 385Epl#08-13; 24 - BPX 385Epl#08-14; 25 - BPX 385Epl#28-01; 26 - BPX
385Epl#28-02; 27 - BPX 385Epl#28-03; 28 - BPX 385Epl#28-04; 29 - BPX 385Epl#04-01; 30 - BPX 385Epl#04-02. R: Resistente;
H: Heterozigoto; S: Suscetível.