A Expressão de Colágeno VI durante
o desenvolvimento do coração de
Zebrafish (Danio rerio)
Aluno: Deivid Augusto da Silva
Orientador: Gregory Thomas Kitten
Laboratório do Desenvolvimento e Matriz Extracelular
ICB – UFMG
Dezembro - 2005
Estrutura
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Importância do Zebrafish como modelo
Colágeno VI
Desenvolvimento do coração
Resultados
Discussão
Vantagens do Zebrafish como
modelo
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Ovos transparentes
Fertilização externa
Desenvolvimento rápido
Alta fecundidade
Pequeno tamanho – Não necessita de um
sistema circulatório eficiente para desenvolver-se
Capacidade de expressar mutações induzidas
Ovos transparentes e pequeno
tamanho
(http://pharyngula.org/images/larvae.jpg)
Estágios do desenvolvimento
embrionário
Fotos do
desenvolvimento
Animação do
desenvolvimento
Domínios da molécula de colágeno VI
N1
C1 C2
1(VI)
N1
C1 C2
2(VI)
3(VI)
N9
0
aa
300
N5
600
900
N1
1200
1500
C1 C2 C3 C4
1800
2100
2400
C5
2700
300
CHU et al., 1990
Colágeno tipo VI: das cadeias  à microfibrila
3
Monômero
2
1
Dímero
Colágeno tipo VI
Tetrâmero
Microfibrila
Aspectos do
desenvolvimento cardíaco
Especificação de cada tipo celular: 16 hpf
Endocárdicas X miocárdicas
Atriais
X ventriculares
Migração celular e formação do tubo cardíaco na
linha mediana
Remodelamento do tubo cardíaco com a
formação do coração funcional
(Satainier D.Y., 2001)  Especificação das células precursoras
 Formação de grupos laterais
o células ventriculares
o células atrias
o células do miocárdio
o células do endocárdio
 As células endocárdicas migram mais medialmente que
as miocárdicas
 Forma-se uma estrutura em forma de funil com 22 hpf
 Coração tubular com 24 hpf – batimentos cardíacos
 Looping com 36 hpf
Formação cardíaca
 Os precursores ventriculares estão
marcados em verde e as atriais em
vermelho
 As células ventriculares migram
medialmente em relação às células
atriais
 A fusão ocorre primeiramente na
região posterior
 Na seqüência, há a fusão na área
anterior, formando um alo central.
Coração tubular com 24 hpf
(Glickman e Yelon, 2002)
Formação dos Coxins
endocárdicos
De 1 a 2% dos nativivos apresentam alguma doença
cardíaca congênita (HCD)
Algumas das malformações cardíacas são devidas à
problemas na formação dos coxins
 Alterações na expressão de colágeno VI são associadas à
malformações
Processo extensivamente estudado em outros modelos,
mas o zebrafish apresenta vantagens, como a expressão de
mutações induzidas
Fornece um sistema simplificado da função gênica
 A-B As células endocárdicas no
canal AV são cúbicas, enquanto
as restantes são pavimentosas
 C-D Expressam Dm-grasp,
molécula de adesão superficial
da superfamília das Igs.
(Beis et al., 2005)
Com 55 hpf, as células cúbicas
continuam expressando Z01, molécula
associada a tight junctions, marcadora
de tecido epitelial.
 Com 60 hpf, há diminuição na
expressão de Z01, indicando a
ocorrência de transformação epitéliomesenquimal
Durante esse processo, observa-se a
migração das células endocárdicas
pela ECM em direção aos miocárdicos
Com 7 dpf, as valvas estão
completamente formadas
No coração adulto, observa-se a
presença de 4 válvulas na valva
atrioventricular
(Beis et al., 2005)
Resultados
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Limitações:
•
•

Dificuldade em obter cortes que contenham o coração
e que estejam em uma boa orientação
O microscópio confocal ter ficado estragado durante
quase todo o semestre
Forte marcação em uma área externa ao
coração parecendo ser Hatching gland contidas
no pericárdio
Colágeno VI – 48 hpf - Aumento 40 X
A
C
A: Marcação para
colágeno VI
B: Morfologia
C: Controle
D: Imagem sobreposta
de A em B
B
D
Colágeno VI – 48hpf - Aumento 63 X
A
C
A: Marcação para
colágeno VI
B: Morfologia
C: Controle
D: Imagem sobreposta
de A em B
B
D
Imunofluorescência do coração
inteiro – Col. VI – 75 hpf
Discussão

Forte marcação em uma área externa ao coração
parecendo ser Hatching gland contidas no pericárdio

Por quê no coração inteiro houve marcação ???

Necessidade de testar outros anticorpos

Aprimorar técnicas de dissecação
Perspectivas
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

Boas perspectivas, uma vez que em outros modelos
já existem trabalhos semelhantes
Entender a marcação de hatching gland
Quando houver padronização das técnicas, fazer
imunofluorescência e whole mount para outros
colágenos.
Perspectivas
e objetivos
(Kolker S. J., 2000)
Agradecimentos
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À Deus, pela saúde e perseverança
Aos meus pais e familiares
À Cristiane, pelo carinho e amor incondicionais
Ao Greg, pelos ensinamentos e paciência de um verdadeiro mestre
Ao pessoal do laboratório, em especial a Elisandra e a Lorenza
À Cleida, pela oportunidade e exemplo de organização
Aos fornecedores de ovos de Zebrafish
Aos colegas do PAD pelos momentos vividos
E ao povo brasileiro, pelo financiamento.
Obrigado pela Atenção!