1
Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
ANA LIDIA VIEIRA GOMES QUERUBINO
DETECÇÃO DE CARBOIDRATOS DE SUPERFÍCIE EM MELANOMA APÓS
TERAPIA FOTODINÂMICA
São José dos Campos, SP
2014
2
ANA LIDIA VIEIRA GOMES QUERUBINO
DETECÇÃO DE CARBOIDRATOS DE SUPERFÍCIE EM MELANOMA APÓS
TERAPIA FOTODINÂMICA
Dissertação
de
Mestrado
apresentada
Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas, como complementação dos créditos
necessários para obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Cristina Pacheco
Soares
Co-orientador: Prof. Dr. Newton Soares da
Silva
São José dos Campos, SP
2014
ANA LIDIA VIElRA GOMES QUERUBINO
"DETECÇÃO DE CARBOIDRATOS
DE SUPERFÍCIE EM MELANOMA APÓS TERAPIA
FOTODINÂMICA."
Dissertação
aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências
Biológicas, do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, do Instituto de Pesquisa e
Desenvolvimento
da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte
banca examinadora:
Prof", Dra. NÁDIA MARIA RODRIGUES DE CAMPOS VELHO (U
Prof". Dra. CRISTINA PACHECO SOARES (UNIVAP)~dJ,.L:,L~.-!--JIb~~~~J..I(.6,~_
Prof. Dr. NEWTON
SOARES DA SILVA (UNIV AP) __
Prof". Dra. RITCHELLI RICCI (UNIFESP)-=~~~~~~::
Prof". Dra. Sandra Maria Fonseca da Costa
Diretor do IP&D - UniVap
São José dos Campos, 28 de fevereiro de 2014.
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4
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pelo seu eterno amor e misericórdia que me guiou
até aqui e me proporcionou mais uma vitória.
Agradeço ao meu pai Francisco pelas longas conversas filosóficas, elas me
ajudaram muito, também pelo seu cuidado e amor.
Agradeço a minha mãe Vicentina (in memória) que mesmo não sabendo ler nem
escrever uma palavra era uma mulher sábia, ah mamãe! Que saudade!
Agradeço ao meu maravilhoso esposo, super companheiro André que sempre me
apoiou e não me deixou desistir dos meus sonhos.
Agradeço aos meus filhos por estarem sempre presentes me apoiando e ajudando
cada um a sua maneira.
Aos colegas de laboratório pelas conversas e pelas deliciosas comidinhas que ali
sempre apareciam. Em especial a Regiane e Lívia, formamos um bom trio!
Agradeço a minha querida orientadora Cristina e co-orientador Newton, sempre
estiveram do meu lado em todos os momentos difíceis que passei ao longo dessa
jornada, sem vocês jamais estaria escrevendo estas palavras, vocês, são presente
de Deus em minha vida.
Agradeço imensamente a Universidade do Vale do Paraíba pela bolsa de estudos a
mim concedida.
Finalmente a todos os amigos e colegas, obrigada!
5
“Nosso medo mais profundo não é que sejamos inadequados. Nosso medo mais
profundo é que sejamos poderosos demais. É nossa sabedoria, não nossa
ignorância, o que mais nos apavora. Perguntamo-nos: 'Quem sou eu para ser
brilhante, belo, talentoso, fabuloso? Na verdade, por que você não seria? Você é um
filho de Deus. Seu medo não serve ao mundo. Não há nada de iluminado em se
diminuir para que outras pessoas não se sintam inseguras perto de você. Nascemos
para expressar a glória de Deus que há em nós. Ela não está em apenas alguns de
nós; está em todas as pessoas. E quando deixamos que essa nossa luz brilhe,
inconscientemente permitimos que outras pessoas façam o mesmo. Quando nos
libertamos de nosso medo, nossa presença automaticamente liberta as outras
pessoas.”
Nelson Mandela (2014)
6
RESUMO
O melanoma é um câncer que se origina nas células produtoras de pigmento da pele
(melanócitos). O melanoma pode ter início como um pequeno tumor cutâneo
pigmentado sobre a pele normal, frequentemente em áreas expostas ao sol
constantemente como rosto, pescoço, braços e mãos, mas quase metade dos casos
ocorre a partir dessas regiões do corpo já com maior pigmentação. A presença de
carboidratos na superfície de células de melanoma, linhagem B16-F10 está
relacionada a capacidade de colonização metastática. Os carboidratos expressos
estão envolvidos assim na proliferação e desenvolvimento de metástases à distância
em diversas localizações anatômicas. O conhecimento dos componentes de
superfície da célula tumoral a tempos são considerados nos tratamento
convencionais, na terapia fotodinâmica entretanto as lectinas têm sido exploradas na
conjugação com fotossensibilizantes, com o objetivo de potencializar a interiorização
dos mesmos pela célula tumoral. Numa grande variedade de tumores sólidos,
biópsias de câncer humano e cultura de células malignas os níveis de 78 kDa
glucose-regulated protein (GRP78) estão elevados e correlacionam-se com
malignidade e metástase e resistência a tratamentos com drogas. Os objetivos deste
trabalho foram Avaliar a influência da terapia fotodinâmica (TFD) na expressão de
carboidratos de superficie em células tumorais através da utilização de lectinas
Concanavalina A (ConA) e Aglutinina de Gérmen de trigo (WGA), também avaliar a
presença da proteína de choque térmico GRP78 em células de melanoma e o
quanto a mesma está correlacionada com a proteção da célula tumoral e metástase.
Os resultados indicam que a TFD não esta interferindo na atividade do reticulo
endoplasmático, mas devido a alterações na expressão de carboidratos interfere na
alteração da atividade do complexo de Golgi. Os fotossensibilizantes, ALA e
Photosan interferem nos açúcares D- Manose, D- Glicose e N- acetil glicosinamina
presentes na superfície das células, enquanto Photosan e AlPcS4 mantém a
atividade da GRP78.
Palavras- Chave: Câncer. Melanoma. Terapia Fotodinâmica.
7
ABSTRACT
Melanoma is a cancer that originates in the pigment producing cells of the skin
(melanocytes ) . Melanoma may begin as a small pigmented skin tumors on normal
skin , often on sun-exposed areas constantly as face, neck , arms and hands , but
almost half of the cases occur from these body regions have greater pigmentation.
The presence of carbohydrates on the surface of melanoma cells B16 –F10 strain is
related to the ability of metastatic colonization. The cast carbohydrates are so
involved in the proliferation and development of distant metastases in different
anatomical locations . Knowledge of the surface components of the tumor cell to time
are considered in conventional treatment, photodynamic therapy however lectins
have been explored in conjunction with photosensitizers with the aim of enhancing
the internalization of the same tumor cell. In a variety of solid tumors biopsies of
human cancer and malignant cell culture levels of 78 kDa glucose –regulated protein
( GRP78 ) is elevated and correlates with malignancy and metastasis , and
resistance to drug treatments . The objectives of this study were to evaluate the
influence of photodynamic therapy (PDT ) in the surface carbohydrate expression in
tumor cells through the use of lectins Concanavalin A ( ConA ) and wheat germ
agglutinin ( WGA ) also evaluate the presence of protein heat shock GRP78 in
melanoma cells and how the same is correlated with protection and metastasis of
tumor cells . The results indicate that PDT is not interfering in the endoplasmic
reticulum activity but due to changes in carbohydrate expression interferes with the
change in the Golgi complex activity. The photosensitizer , ALA and Photosan
interfere with the sugars D-mannose , D- glucose and N-acetyl glicosinamina present
on the cell surface , while Photosan AlPcS4 and keeps the activity of GRP78.
Key-Words: Cancer. Melanoma.Photodynamic Therapy.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Desenvolvimento de melanoma em nevo já existente...............................12
Figura 2: Mecanismo das metástases em melanoma...............................................13
Figura 3:Tipos de melanomas benignos e malignos.................................................
............................................................................................................................. 144
Figura 4: Níveis de Clark comparado ao índice de Breslow......................................17
Figura 5: Diagrama de Jablonski simplificado para o processo de fotossensibilização
....................................................................................................................................22
Figura 6: Rota simplificada da biossíntese do Neu5A...............................................25
Figura 7: Expressão de carboidratos da célula B16-F10 antes da TFD................... 32
Figura 8: Mudança da expressão indireta do carboidrato da superfície celular após
TFD............................................................................................................................ 33
Figura 9: Marcação das células tumorais com lectina ConA.....................................33
Figura 10: Células tumorais submetidas a TFD com ALA.........................................34
Figura 11: Células tumorais tratadas com Photosan e lectina ConA........................34
Figura 12: Células tumorais tratadas com TFD com Photosan e a lectina
WG.............................................................................................................................35
Figura 13: Células tumorais tratadas com TFD, AlP4 e marcadas com lectina
ConA...........................................................................................................................35
Figura 14: Células tumorais tratadas com TFD, AlP4 e lectina
WGA.......................................................................................................................... 36
Figura 15: Marcação das células tumorais com GRP78...........................................36
Figura16: Marcação das células tumorais com GRP78............................................37
Figura17: Células tumorais tratadas com TFD e ALA e marcadas GRP78..............37
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Índice de Breslow ..................................................................................... 17
Tabela 2: Superfície celular alterações em carboidratos em diferentes tipos de
câncer, onde pode-se obeservar o as mudanças nas células após histologia
(H).............................................................................................................................. 19
10
LISTA DE ABREVIATURAS
OMS: Organização Mundial de Saúde
INCA: Instituto Nacional do Câncer.
UV: Raio ultravioleta
UVA: Raio ultravioleta A
UVB: Raio ultravioleta B
ConA: Concanavalina A
WGA: Aglutinina de Gérmen de trigo
GRP78: 78 kDa glucose-regulated protein
BiP: binding protein
ALA: 5-aminolevulínico
ALPS4: Alumínio Ftalocianina Tetrasulfonada
PBS: Tampão fosfato-salina
DGuiL: Dioclea guianensis
CFL: Cratylia floribunda
OsO4: Tetróxido de Ósmio
11
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO .............................................................................................. 12
1.1 Melanoma ..................................................................................................... 12
1.1.2 Radiação UV e Melanoma ........................................................................... 15
1.1.3 Diagnóstico do Melanoma .......................................................................... 16
1.1.4 Tratamento ................................................................................................... 18
1.1.5 Carboidratos de Superfície Celular e Melanoma ...................................... 18
1.2 Terapia Fotodinâmica ................................................................................. 20
1.3 Lectinas ........................................................................................................ 22
1.3.1 Lectinas e TFD ............................................................................................. 25
1.4 Chaperonas.................................................................................................. 26
1.5 Proteína de Choque Térmico GRP78 ......................................................... 26
2
OBJETIVOS .................................................................................................. 28
3
METODOLOGIA ........................................................................................... 29
3.1 Indução do Tumor e TDF ............................................................................ 29
3.1.2 Processamento de Amostras ..................................................................... 29
3.1.3 Marcação Fluorescente com as Lectinas ConA e WGA........................... 30
3.1.4 Imunomarcação para GRP78...................................................................... 30
4
RESULTADOS .............................................................................................. 32
5
DISCUSSÃO ................................................................................................. 38
6
CONCLUSÃO ............................................................................................... 40
REFERÊNCIAS ............................................................................................. 41
REFERÊNCIAS CONSULTADAS ................................................................ 43
12
1
INTRODUÇÃO
A seguir serão apresentados os contextos que acercam a pesquisa.
1.1 Melanoma
O melanoma é um câncer que se origina nas células produtoras de pigmento da
pele (melanócitos). O melanoma pode ter início como um pequeno tumor cutâneo
pigmentado sobre a pele normal, frequentemente em áreas expostas ao sol
constantemente como rosto, pescoço, braços e mãos, quase metade dos casos
ocorre a partir dessas regiões do corpo já com maior pigmentação, como visto na
figura 1 (AKISKAL et al., 2010).
Figura 1: Desenvolvimento de melanoma em nevo já existente.
Fonte: Dermatologia.Net (2014).
Ao contrário de outras formas de câncer de pele, o melanoma é uma das formas
mais agressivas de câncer, pois é extremamente metastático e migra rapidamente
para partes distantes do corpo, onde continua a crescer e destruir tecidos, figura 2.
O melanoma cutâneo apresenta disseminação por via linfática muito precocemente
na sua evolução, e linfonodos regionais são o sítio mais comum de metástases. A
13
excisão cirúrgica destes linfonodos é o único meio efetivo para alcançar controle da
doença e cura, embora a presença de metástases piore em muito a sobrevida dos
pacientes. Quanto menos o melanoma crescer na pele, maior a possibilidade de
cura (AKISKAL et al., 2010).
Figura 2: Mecanismo das metástases em melanoma.
Fonte: Patologia Melanoma (2011).
Considerado o mais agressivos dos tumores, o melanoma está entre os maiores
causadores de morte nos países industrializados, este tipo de tumor vem
aumentando significativamente no mundo nas últimas décadas. Segundo a
Organização Mundial de Saúde (OMS) estima-se que ocorram 132 mil novos casos
deste tumor por ano no país. Nos Estados Unidos é considerada a doença que mais
cresce em ambos os sexos. No Brasil, de acordo com o Instituto Nacional do Câncer
(INCA) estima-se que 5.920 novos casos por ano, sendo 2.950 em homens e 2.970
em mulheres sendo que a maior parte destes casos acontece na região sul do país
onde há predominância de peles muito claras como apresentado na figura 3
(CARVALHO, 2010; OLIVEIRA; GLAUSS; PALMA, 2011).
14
Figura 3: Tipos de melanomas benignos e malignos.
Fonte: Universidade Federal de Goiás (2014).
No Brasil, as estimativas para o ano de 2012 serão válidas também para o ano
de 2013, apontam a ocorrência de aproximadamente 5.920 casos novos de câncer,
incluindo os casos de não melanoma, reforçando a magnitude do problema do
câncer no país. Sem os casos de câncer de pele não melanoma, estima-se um total
de 385 mil casos novos. Os tipos mais incidentes são os cânceres de pele não
melanoma, próstata, pulmão, cólon e reto e estômago para o sexo masculino; e os
15
cânceres de pele não melanoma, mama, colo do útero, cólon e reto e glândula
tireóide para o sexo feminino (INSTITUTO NACIONAL DO CANCER, 2011).
O prognóstico do melanoma pode ser considerado bom se detectado nos
estádios iniciais. Nos últimos anos, houve uma grande melhora na sobrevida dos
pacientes com esse tipo de câncer, principalmente devido à detecção precoce do
mesmo. Nos países desenvolvidos, a sobrevida média estimada em cinco anos é de
73%, enquanto que, para os países em desenvolvimento, a sobrevida média é de
56%. A média mundial estimada é de 69% (INSTITUTO NACIONAL DO CANCER,
2011).
1.1.2 Radiação UV e Melanoma
A radiação ultravioleta está fortemente associada à ocorrência de câncer de pele.
Segundo Oliveira, Glauss e Palma (2011), a maior parte dos raios ultravioleta (UV)
que chega a superfície da Terra é o Ultravioleta A (UVA), porém em decorrência da
destruição da camada de ozônio, os raios ultravioleta B (UVB) tem elevado sua
incidência sobre a terra.
A intensidade da radiação solar tem uma variável em função de fatores como
localização geográfica (latitude), hora do dia, estação do ano e condição climática,
entre outros (INSTITUTO NACIONAL DO CANCER, 2011). Os raios UVA não são
dependentes da camada de ozônio e podem provocar casos de câncer de pele em
indivíduos que se expõem a eles regularmente, por espaço de tempo prolongado,
em horários de elevada incidência e ao longo de vários anos (OLIVEIRA; GLAUSS;
PALMA, 2011).
A pele, por sua vez, protege o resto do corpo contra a ação dos raios solares,
uma fonte de radiação ultravioleta que pode lesar as células. A exposição excessiva,
ainda que de curta duração, produz queimaduras solares. Com a exposição
prolongada à luz solar, a camada superior da pele (epiderme) torna-se mais espessa
e as células cutâneas produtoras de pigmento melanina (melanócitos) aumentam a
produção do mesmo, o qual provê à pele a sua cor. A melanina, uma substância
protetora natural, absorve a energia dos raios ultravioleta e impede que eles
penetrem mais profundamente nos tecidos. A sensibilidade à luz solar varia de
acordo com cada grupo étnico, a exposição prévia e a cor da pele, mas todo mundo
16
é vulnerável em certo grau. Como os indivíduos de pele escura possuem mais
melanina, eles possuem uma maior resistência aos efeitos nocivos do sol, como
queimaduras, envelhecimento prematuro da pele e câncer de pele (AKISKAL et al.,
2010).
Uma informação extremamente importante sobre a exposição ao sol e o
melanoma é que a exposição cumulativa e excessiva nos primeiros 10 a 20 anos de
vida pode aumentar muito o risco de desenvolvimento de câncer de pele, mostrando
ser a infância uma fase muito vulnerável aos efeitos nocivos do Sol.
Após o
período da infância o que pode desencadear o melanoma são as exposições ao sol
em praias, piscinas e até mesmo os trabalhadores rurais ou aqueles que trabalham
sob o sol diariamente. (INSTITUTO NACIONAL DO CANCER, 2011).
1.1.3 Diagnóstico do Melanoma
O índice de Breslow e Clark avalia a profundidade do tumor em milímetros
(atualmente é o principal fator usado para estadiamento do melanoma cutâneo e
base indispensável para o tratamento), e o nível de Clark, que descreve a invasão
neoplásica em cinco níveis em relação às camadas da pele como pode se observar (
tabela1) e (figura 4) (BRASIL, 2013).
O controle local do melanoma exige excisão ampla da lesão até a fáscia e uma
margem de pele normal entre 0,5 2 cm de diâmetro em torno da lesão, que será
determinada de acordo com o índice de Breslow. Melanomas de até 1mm de
espessura podem ser ressecados com margem oncológica de 1cm, enquanto que os
mais espessos (Breslow acima de 1mm) requerem margem de 2cm. Melanomas
com Breslow acima de 4mm têm alto risco de recorrência local e metástase (10 a
20%), mesmo seguindo-se este padrão nas ressecções, (CHIBA et al., 2011).
17
Tabela 1: Índice de Breslow.
Nível
Profundidade do tumor
Nível l
o tumor envolve somente a epiderme
Nível ll
o tumor envolve a epiderme e parte da derme papilar
Nível lll
o tumor preenche a derme papilar
Nível
Lv
o tumor envolve a derme reticular
Nível V
o tumor invade as camadas de gordura da pele a
hipoderme.
Fonte: Adaptado do INSTITUTO NACIONAL DO CANCER (2011).
Figura 4: Níveis de Clark comparado ao índice de Breslow.
Fonte: Patologia Especial 2010.2 (2013).
18
1.1. 4 Tratamento
Se o melanoma for diagnosticado no início pode ser curado por meio de
intervenção cirúrgica com quase 80% de sucesso, entretanto, em casos de
metástase as terapias existentes não são tão eficientes (BALDEA; FILIP, 2012).
O mais indicado nos casos de melanoma é a cirurgia para retirada total do
tumor e, nos casos mais avançados, a lifadenoctomia parcial ou total. A radioterapia
ou quimioterapia também podem ser utilizadas no tratamento, mas apenas nos
casos menos avançados. Quando há metástase, o melanoma geralmente é
incurável, sendo o tratamento paliativo voltado para aliviar os sintomas e melhorar a
qualidade de sobrevida dos pacientes (INSTITUTO NACIONAL DO CANCER, 2011).
1.1. 5 Carboidratos de Superfície Celular e Melanoma
Os carboidratos, que são exclusivamente encontrados na monocamada
externa de membranas plasmáticas, interagem ora com proteínas (glicoproteínas),
ora com lípides (glicolípideos), formando uma estrutura denominada glicocálice. O
glicocálice desempenha inúmeras funções e elas refletem, na verdade, funções
desempenhadas por seus componentes. Por exemplo, a inibição do crescimento
celular por contato depende de glicoproteínas do glicocálice. Se tais proteínas forem
perdidas ou modificadas, como acontece em alguns tumores malignos, mesmo o
glicocálice ainda existindo, esta função será comprometida. O glicocálice é
importante na adesão e reconhecimento celular, na determinação de grupos
sanguíneos, entre outras funções (FÁTIMA; BAPTISTELLA; PILLI, 2005).
Muitas das proteínas e dos lipídeos presentes na membrana celular
presentam-se como conjugados de carboidratos, denominando-se glicoproteínas e
glicolipídeos, respectivamente. As glicoproteínas, em especial, são fundamentais em
muitos processos biológicos incluindo fertilização, ativação do sistema imune,
replicação viral, crescimento e renovação celular e inflamação, entre outros
(KONRAD et al., 2011).
Recentemente uma revisão da participação e importância dos carboidratos
em alguns tipos de câncer como melanoma, câncer de fígado e de ovário,
19
destacando a importância de estudos sobre a influência dos tratamentos anticâncer
na expressão de carboidratos de superfície como apresentado na tabela abaixo
(CHRISTIANSEN et al., 2013).
Tabela 2: Superfície celular alterações em carboidratos em diferentes tipos de câncer, onde
pode-se obeservar o as mudanças nas células após histologia (H).
Fonte: adaptado de Christiansen et al. (2013).
Segundo Christiansen et al. (2013) a expressão excessiva de carboidratos
está associada com estados patológicos incluindo câncer, decorrente da transcrição
20
desregulada de enzimas envolvidas na glicosilação, que irão refletir em alterações
estruturais de N e O-glicanos, tais como sialização, fucosilação, grau de ramificação
e a expressão específica de glicosiltransferases para cada tipo de câncer.
A presença de carboidratos na superfície de células de melanoma, linhagem
B16-F10 está relacionada a capacidade de colonização metastática (NICOLSON;
IRIMURA, 1984). Muitos autores consideram que a transformação em malignidade
dos melanócitos esteja associada a modificações de carboidratos de superfície). Os
carboidratos expressos estão envolvidos assim na proliferação e desenvolvimento
de metástases à distância em diversas localizações anatômicas, (GORELIK,, 1994).
1.2 Terapia Fotodinâmica
Historicamente, o uso da luz e de fotossensibilizantes em seres humanos data
do Egito antigo onde, há 4.000 anos, tratava-se vitiligo combinando-se a ingestão de
plantas e a exposição à luz solar. O sucesso do tratamento era resultado de uma
reação fotoquímica, mediada por psoralenos presentes em determinadas plantas
(SILVA; SANTOS; RICCI JUNIOR, 2009). Estudos sistemáticos das reações de fotos
sensibilização foram iniciados apenas no final do século XIX por Oscar Raab (1900)
que investigou o efeito dos corantes eosina e acridina, ambos fotossensibilizantes,
sobre uma cultura de paramécios (protozoários), percebendo que, em presença de
luz, os microrganismos eram inativados (SILVA; SANTOS; RICCI JUNIOR, 2009).
Em 1903, Tappeiner empregou uma solução de eosina e luz para tratar câncer de
pele e observou uma redução no tamanho do tumor (OLEINICK; EVANS, 1998).
Meyer-Betz (1912) estudou o efeito fotossensibilizante sistêmico de porfirinas
em humanos, injetando no próprio corpo hematoporfirina. A subsequente exposição
de algumas partes do seu braço à luz visível produziu forte reação de eritema solar,
indicando que a hematoporfirina possui efeito fotossensibilizante.
Anos mais tarde,
em 1950, Schwartz descobriu que o efeito colateral observado por Meyer-Betz não
era devido à hematoporfirina, eliminada rapidamente do organismo e sim, devido a
uma mistura de derivados diméricos e oligoméricos facilmente formados durante a
purificação do composto (OLEINICK; EVANS, 1998). Em 1925, Policard avaliou a
fototoxicidade de porfirinas em tecido canceroso após injeção e acúmulo do
fotossensibilizante no tecido. Em 1960, Lipson empregou, pela primeira vez, uma
21
combinação de derivados de hematoporfirina e luz para tratar câncer de mama
(SILVA; SANTOS; RICCI JUNIOR, 2009). Em 1976, iniciaram-se os primeiros
estudos clínicos em pacientes com câncer de bexiga tratados com hematoporfirina
injetável e levando a TFD, como uma possível ferramenta promissora para o
tratamento moderno do câncer (SILVA; SANTOS; RICCI JUNIOR, 2009).
A
Terapia
Fotodinâmica
envolve
a
ativação
de
uma
substância
fotossensibilizadora, a qual acumula - se preferencialmente em células tumorais, a
exposição à luz visível, com comprimento de onda específico, resultando na ativação
do fotossensibilizador. Na presença de oxigênio no tecido o fotossensibilizante
ativado favorece a produção de espécies reativas de oxigênio, os quais exercem
efeitos citotóxicos nas organelas celulares e membranas resultando em morte
(VISONA et al., 2000).
A interação da luz com o fotossensibilizante torna-o excitado passando de seu
estado fundamental (S0) ao estado tripleto (T1). Neste segundo estado, sua meia
vida é de pouquíssimos milésimos de segundos, durante o qual é capaz de uma
rápida energização do oxigênio dissolvido, que é ativado para seu primeiro estado
eletrônico excitado. Este estado energético (1O2) também é de vida curta, embora
muito reativo. Típicas moléculas orgânicas sensibilizadoras são convertidas a estado
singleto (S1) de vida muito curta na absorção do fóton. O estado excitado singlete
(S1) de bons fotossensibilizadores, passa eficientemente pelo cruzamento intersistemas para atingir o estado tripleto como é mostrado na figura 5 (SILVA;
SANTOS; RICCI JUNIOR, 2009).
22
Figura 5: Diagrama de Jablonski simplificado para o processo de fotossensibilização.
Fonte: Adaptado de Sotomayor et al. (2008).
O corante no estado fundamental (S0) é excitado ao primeiro estado singleto
(S1), podendo fluorescer e retornar ao estado fundamental, ou realizar um
cruzamento intersistemas para o estado tripleto de mais baixa energia. A reação
deste com o oxigênio molecular, inicia o processo de produção dos EROs.
O processo Tipo I, mais comum nos tecidos biológicos, envolve o sequestro
de um elétron de um substrato redutor, resultando na forma semi oxidativa do
substrato e forma semirreduzida do fotossensibilizador. Frequentemente, o radical
do substrato resultante pode reagir com o oxigênio, formando produtos oxidativos
em alguns casos esses são peróxidos, os quais podem iniciar processos em cadeia.
Alguns sensibilizadores semirreduzidos reagem com o oxigênio no estado
fundamental para regenerar o sensibilizador para o estado fundamental e produzir
superóxido. Corantes semirreduzidos podem também interagir para retornar ao
estado fundamental e produzir peróxido de hidrogênio (SILVA; SANTOS; RICCI
JUNIOR, 2009).
1.3 Lectinas
23
A moderna era da lectnologia teve início no começo dos anos 1960 com duas
grandes descobertas por Peter C. Nowell (1960) que estabeleceu que a lectina de
Phaseolus vulgaris conhecida como fitohemaglutinina (PHA), é mitogênica, pois
possui a capacidade de estimular linfócitos a entrar em mitose, assim como a lectina
de
ConA
também
apresentava
a
mesma
característica
mitogênica,
diferentemente de PHA essa atividade podia ser inibida por
mas
pequenas
concentrações de monossacarídeos, por exemplo a manose; A segunda descoberta
foi feita por Joseph C. Aub (1963, 1965) que estabeleceu que a aglutinina de gérmen
de trigo (WGA) tinha habilidade de aglutinar preferencialmente células malignas.
Tais investigações propuseram evidências iniciais que alterações nos açúcares de
superfície celular são associadas com o desenvolvimento de vários tipos de câncer e
levam a suposição que a alta suscetibilidade a aglutinação por lectinas era uma
propriedade compartilhada por quase todas as células malignas (MELO JUNIOR et
al., 2004).
Lectinas representam um grupo estruturalmente heterogêneo de proteínas, de
origem não imune, que apresentam propriedades em comum de se unir a
carboidratos com alta especificidade (OLIVEIRA et al., 1990). Elas são amplamente
distribuídas na natureza, podendo ser encontradas em animais, plantas e
microrganismos. Nos animais e microrganismos elas podem servir para mediar o
reconhecimento biológico de diversos eventos relacionados à comunicação celular,
desenvolvimento, defesa, metástase tumoral, inflamação, etc. (OLIVEIRA et al.,
1990). Apesar de sua abundância em muitas plantas, as lectinas de plantas ainda
não possuem sua verdadeira função fisiológica claramente definida. Entre algumas
funções propostas para lectinas de plantas estão incluídas: armazenamento ou
transporte de carboidratos em sementes, inibição do crescimento de fungos
(SHARON; LIS, 1990) ou atividade inseticida (MELO JUNIOR et al., 2004). Entre as
lectinas
mais
estudadas
estão as
de
plantas,
principalmente da família
Leguminosae. Lectinas dessa família representam um grupo de proteínas
semelhantes estruturalmente, porém com diferentes especificidades a carboidratos.
A subtribo Diocleinae (família Leguminosae) compreende 13 principais gêneros,
24
sendo que algumas lectinas têm sido isoladas de plantas que pertencem a alguns
destes gêneros: Canavalia, Cratylia e Dioclea (OLIVEIRA et al., 1990).
A Concanavalina A (ConA), obtida das sementes de Canavalia ensiformis
(Família Leguminosae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae), foi a primeira lectina a
ser isolada e sequenciada tendo sua estrutura tridimensional determinada por
cristalografia de raio-x. ConA é uma lectina D-glicose/D-manose específica e seu
monômero contém 237 resíduos de aminoácidos. Muitos estudos bioquímicos,
biofísicos e estruturais fizeram desta proteína a lectina de planta melhor
caracterizada (OLIVEIRA et al., 1990; ZANETI, 2007). Esta lectina tem sido muito
estudada e caracterizada quanto a sua estrutura e efeitos biológicos sobre diferentes
sistemas. A partir do isolamento de ConA, várias outras lectinas com propriedades
físicas e químicas similares tem sido purificadas e parcialmente caracterizadas de
outras espécies da subtribo Diocleinae, como as lectinas de Canavalia brasiliensis,
ConBr (CAVADA, 1980), Canavalia bonariensis, (OLIVEIRA et al., 1990; ZANETI,
2007), Cratylia floribunda, CFL (OLIVEIRA et al., 1990), Dioclea guianensis, DGuiL
(VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004), Dioclea violacea, DVioL (MOREIRA et al.,
1998), entre outras. Várias evidências têm demonstrado que apesar de terem alta
homologia, ConA e outras lectinas apresentam grandes e importantes variações nas
atividades biológicas (ZANETI, 2007).
Independentemente de a lectina ser ou não uma glicoproteína, existe na
estrutura da molécula proteica um sítio de ligação ao carboidrato, denominado de
“domínio de reconhecimento de carboidrato”,
que desempenha papel de
reconhecimento e de direcionamento do carboidrato para o qual a molécula tem
afinidade. Cada subunidade polipeptídica possui, caracteristicamente, ao menos um
destes sítios (ZANETI, 2007). Em fabáceas, conforme Spilatro et al.(1996), das
quatro cadeias polipeptídicas que se ligam ao carboidrato, três são altamente
conservadas e apenas uma determina a especificidade ao carboidrato. Em
Phaseolus vulgaris L., por exemplo, a lectina PHA é específica para N-acetil-Dgalactosamina, além de um complexo sacarídeo.
No gérmen de trigo, a lectina
WGA, apesar de ser dimérica, possui quatro sítios para ligação a carboidratos. Os
inibidores da mesma são N-acetil-D-glicosamina e seus derivados oligossacarídeos
e quitina, além de ácido siálico.
25
Dentre os carboidratos presentes nos glicoconjugados de membrana
destacam-se os ácidos siálicos, uma família de carboidratos complexos de nove
carbonos, normalmente ligados a outros carboidratos por meio de ligações
α
-
cetosídicas, que ocorrem na natureza em cerca de 50 tipos. A presença de
glicolipideos e glicoproteínas é de suma importância para o reconhecimento e
adesão celular. A biossíntese destes glicoconjugados tem inicio no citosol,
envolvendo várias enzimas, que através da fosforilação e defosforilação dos
carboidratos, o produto final para o núcleo, onde por hidrolise da citidina trifosfato
(CTP), ocorre à formação de um complexo CMP-ácido siálico. Este complexo então
é enviado ao complexo de Golgi, onde atuará como doador de glicosídeo para a
formação de cadeias de oligossacarídeos de glicoproteínas e glicolipídeos, por ação
de enzimas denominadas sialiltransferases 9,10 (Figura 6). Assim, glicoproteínas ou
glicolipídeos sialilados são secretados ou entregues à membrana plasmática da
célula (FÁTIMA; BATISTELLA; PILLI, 2005).
Figura 6: Rota simplificada da biossíntese do Neu5Ac.
Fonte: (FÁTIMA; BATISTELLA; PILLI, 2005).
1.3.1 Lectinas e TFD
26
A utilização de lectinas para rastrear alterações nos componentes de
superfície da célula pode ser muito útil, pois através das mesmas complexadas com
radioisótopos, fluoresceína ou biotina pode-se rastrear os carboidratos expressos
nessas células. O conhecimento dos componentes de superfície da célula tumoral a
tempos são considerados nos tratamento convencionais, na terapia fotodinâmica
entretanto as lectinas têm sido exploradas na conjugação com fotossensibilizantes,
com o objetivo de potencializar a interiorização dos mesmos pela célula tumoral
(NOJIMOTO et al., 1987).
1.4 Chaperonas
Ao longo da evolução, as células desenvolveram mecanismos bastante
eficientes para evitar que erros na transmissão da informação genética se
propaguem na replicação, na transcrição e na tradução. Ainda assim, com todo esse
cuidado de assegurar que a seqüência de aminoácidos esteja correta, ainda é
possível que uma proteína não consiga estar apta a desempenhar suas funções por
erro no enovelamento. Na verdade, uma quantidade significativa de proteínas
precisa de ajuda para atingir a configuração terciária correta (NASCIMENTO, 2012).
Essa ajuda é fornecida por uma família de proteínas que, além de auxiliar o
enovelamento proteico, encaminha a proteína à destruição, caso não seja possível
atingir a configuração correta essas proteínas são chamadas de chaperonas e
constituem uma família de muitas proteínas diferentes com função semelhante: elas
usam energia da hidrólise de ATP para desenovelar proteínas, possibilitando novo
enovelamento, dessa vez na forma correta ou no lugar correto (NASCIMENTO,
2012).
1.5 Proteína de Choque Térmico GRP78
Proteínas de choque térmico é o nome genérico dado a um grupo de
proteínas altamente conservadas que aumenta rapidamente sua concentração em
resposta a exposição das células a estresses ambientais, as mesma pertencem à
27
classe das chaperonas que são definidas como proteínas celulares que mediam o
enovelamento correto de outras proteínas e também podem exercer a função de se
associarem com macromoléculas, evitando uma associação com proteínas ainda
não corretamente enoveladas. Além disso, mesmo em relação às proteínas
induzidas por choque térmico (HSPs) existem diferenças entre os grupos
sintetizados durante distintos tratamentos (ARAP, 2003).
A proteína de choque térmico GRP78 (78 kDa glucose-regulated protein),
também conhecida como BiP (binding protein), pertence à família das chaperonas
HSP70 e foi descrita pela primeira vez em 1983 por Hass e classificada como
proteína de ligação de imunoglobulinas. Sua presença foi demonstrada no retículo
endoplasmático de vários tipos celulares e mais tarde em membranas de células
malignas (ARAP, 2003).
Ensaios de super expressão em culturas de células e estudos de
fragmentação de DNA evidenciaram que a GRP78 está envolvida com a proteção
celular contra apoptose. Numa grande variedade de tumores sólidos, biópsias de
câncer humano e cultura de células malignas os níveis de GRP78 estão elevados e
correlacionam-se com malignidade e metástase e resistência a tratamentos com
drogas (ARAP, 2003).
28
2
OBJETIVOS
- Avaliar a influência da terapia fotodinâmica (TFD) na expressão indireta de
carboidratos de superficie em células tumorais através da utilização de lectinas.
- Avaliar a presença da proteína de choque térmico GRP78 em células de
melanoma e o quanto a mesma está correlacionada com a proteção da célula
tumoral e metástase.
29
3 METODOLOGIA
Este trabalho é a continuação de um trabalho realizado pela Msc Carolina
Genúncio da Cunha Menezes Costa que gentilmente nos cedeu os tumores já
tratados com os fotossesibilizantes e PDT.
3.1 Indução do Tumor e TFD
A indução do tumor foi realizado pela McS. Carolina Genuncio da Cunha
Menezes
Costa, utilizando camundongos do tipo suíço, com idade entre 6-8
semanas, divididos em quatro grupos. Estes foram inoculados na região da escapula
via subcutânea, com 1x106 células B16F10 ressuspensas em 30 μl de PBS. Após o
tumor ter atingido de 1,5-2 cm (aproximadamente um mês e meio) iniciou-se o
tratamento. A terapia foi avaliada da seguinte forma:
Grupo Controle (n=3): Animais utilizados como controle e que não foram
submetidos a nenhum tipo de tratamento.
Grupo Photosan (n=3) : Animais submetidos a sessões de TFD com laser
Kondortech (λ 670nm potência de 10Jcm-2) e fotossensibilizante Photosan3®.
Grupo AlPCS4 (n=3): Animais submetidos a sessões de TFD com laser Kondortech
(λ 670nm potência de 10Jcm-2) e fotossensibilizante AlPCS4.
Grupo ALA (n=3): Animais submetidos a sessões de TFD com laser Kondortech (λ
670nm potência de 10Jcm-2) e fotossensibilizante ALA.
3.1.2 Processamento de Amostras
Ao final do tratamento os animais foram eutanasiados, os tumores foram
extraídos e medidos e fixados com 4% de Paraformaldeído e 2,5% de glutaraldeído,
em tampão fosfato 0,1 M. Após fixação as células foram removidas e centrifugada
(3000 rpm por 10 minutos) em eppendorf lavando-as por 3 vezes e preparado para
microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de fluorescência.
30
Pós-fixação - Adicionou-se 200 ml de Tetróxido de Ósmio (OsO4) da solução
estoque a 2% (diluído em tampão fosfato 1:1) e deixados por rigorosos 30 minutos.
Passado este tempo lavou-se 3 vezes com PBS.
Desidratação - A desidratação consiste na passagem das amostras por uma
série de concentrações crescentes de acetona ou etanol até atingir 100% Incubouse as amostras nas diferentes concentrações de acetona:
Acetona 50% incubada por 10 minutos
Acetona 70% incubada por 10 minutos
Acetona 90% incubada por 10 minutos
Acetona 100% incubada 3 vezes por 10 minutos.
Infiltração - Preparou-se um tubo eppendorf uma mistura acetona - epon 1:1,
transferiu-se a mistura para o pellet. Deixou-se overnight, no dia seguinte retirou-se
a mistura e adicionou epon puro na mesma quantidade.
Inclusão - No final do dia seguinte ( 24horas) removeu-se o material para a
forma e epon puro foi adicionado. Permaneceu na estufa por 48 horas para
polimerização da resina e a formação do bloco.
Ultramicrotomia - O bloco com material foi cortado em cortes semi finos (200
e 300 nm) em ultramicrótomo (Ultracut UCT, Leica) e coletados com pincel e
colocados em lâminas de vidro.
3.1.3 Marcação Fluorescente com as Lectinas Con-A e WGA
A seguir os cortes foram submetidos a tratamento com NaOH 10% e etanol
por 20 minutos, para remoção do epon, ao termino deste período as laminas foram
lavadas com etanol 70%. Para remoção da fluorescência do glutaraldeido as
amostras foram incubadas com boroidreto de sódio por 20 minutos e lavadas com
PBS duas vezes. As amostras foram então incubadas com as lectinas
Concanavalina A-TRITC (ConA) ou Aglutinina de Gérmen de trigo-TRITC (WGA) por
30 minutos, lavadas com PBS por duas vezes e analisadas ao microscópio Leica
Axiovert DMLB
3.1.4 Imunomarcação para GRP78
31
As amostras após remoção da resina epon foram incubadas com PBS-BSA
0,1% por 30 minutos, com anti-GRP78 por 1 hora. Ao termino deste período as
amostras foram incubadas com anticorpo secundário anti-mouse conjugado com
peroxidase por 1 hora, após este período as amostras foram reveladas com água
oxigenada a 1%, lavadas com PBS e analisadas ao microscópio Leica Axiovert
DMLB.
32
4
RESULTADOS
A análise das fotomicrografias revelou alteração na expressão indireta de
açúcares glicose, manose e resíduos de N- acetil glicosamina na superfície das
células tumorais após tratamento fotodinâmico com ALA, Photosan e Alps4 e
mudança do carboidrato nas superfícies das células após tratamento com a terapia
fotodinâmica e os fotossensibilizantes como observado na figura 7 e 8.
Figura 7: Expressão de carboidratos da célula B16-F10 antes da TFD.
Fonte: A autora.
Não observa-se mudança da expressão indireta dos carboidratos de
superfície celular.
33
Figura 8: Mudança da expressão indireta do carboidrato da superfície celular após TFD.
Fonte: A autora.
Após a TFD acredita-se que o complexo de golgi sofre alteração, sendo este
a organela responsável pela expressão de alguns carboidratos acredita-se que o
fotossensibilizante juntamente com o a TFD está interferindo diretamente nesta
organela.
Figura 9: Marcação das células tumorais com lectina ConA..
B
A
Fonte: a autora.
34
Células tumorais submetidas a TFD com ALA foram incubadas com a lectina
ConA, é possível verificar que após TFD com a superfície celular apresenta a
marcação de resíduos de manose e glicose (a) e (b) Controle não sofreu tratamento
com lectina
Figura 10: Células tumorais submetidas a TFD com ALA.
B
A
Fonte: a autora.
A marcação com WGA permitiu verificar que resíduos de N-acetil-glicosamina
ocorre somente nas hemácias presentes nos vasos sanguíneos no tumor (a) e em
(b) controle as células tumorais não sofreram tratamento com as lectinas.
Figura 11: Células tumorais tratadas com Photosan e lectina ConA.
A
B
Fonte: a autora.
35
A TFD com o tratamento com Photosan e a lectina ConA. Pode-se constatar
uma suave redução da marcação de resíduos de D-manose e D-glicose (a) em (b)
observa-se o controle que não sofreu tratamento com a lectina.
Figura 12: Células tumorais tratadas com TFD com Photosan e a lectina WG.
B
A
Fonte: a autora.
A TFD com o tratamento com Photosan e a lectina WGA não houve marcação
evidenciando que não há marcação de ácido siálico (a) em (b) controle sem
tratamento algum.
Figura 13: Células tumorais tratadas com TFD, AlP4 e marcadas com lectina ConA.
A
B
Fonte: a autora.
36
Em (a) o controle que não sofreu tratamento com as lectina, em (b) não
observa-se fluorescência.
Figura 14: Células tumorais tratadas com TFD, AlP4, e lectina WGA.
A
B
Fonte: a autora.
Em (a) controle sem tratamento e em (b) taratada com lectina WGA, também
não apresenta fluorescência.
As células tumorais submetidas a TFD com diferentes fotossensibilizantes,
marcadas com anti-GRP-78, demonstrou a presença desta proteínas nos grupos
Photosan e AlPcS4, como apresentado nas figuras 9a e 9b.
Figura 15: Marcação das células tumorais com GRP78.
A
B
Fonte: a autora.
Após remoção da resina epon as amostras submetidas a TFD com AlPc4 em
(a) controle, não houve marcação com GRP78. È em (b) possível detectar a
presença de GRP78 no grupo de células após o tratamento.
37
Figura16: Marcação das células tumorais com GRP78.
B
A
Fonte: a autora.
Após remoção da resina epon as amostras submetidas a TFD com Photosan
foram incubadas com anticorpo anti-GRP78 e reveladas com anticorpo secundário
marcado com peroxidase. Em (a) controle que não foi arcado com GRP78.
É
possível detectar a presença de GRP78 em após o tratamento em (b).
Figura17: Células tumorais tratadas com TFD e ALA e marcadas GRP78.
B
A
Fonte: a autora.
Em (a) controle e em (b) marcação com GRP78, a expressão de GRP78 é
bem visível.
38
5
DISCUSSÃO
Desde a sua introdução até cerca de duas décadas, TFD tem se tornado
progressivamente uma técnica estabelecida para o tratamento de cânceres e, mais
recentemente, outras doenças (PLATZER et al., 2002). Três mecanismos que levam
a destruição tumoral primária in vivo têm sido propostos: a foto inativação direta da
célula tumoral, a destruição vascular e a ativação do sistema imunológico
(MACHADO, 2000).
Entender os mecanismos envolvidos na TFD e alterações acarretadas nos
diferentes tipos de cânceres é de suma importância para correta prescrição e
sucesso no tratamento fotodinâmico, com esta finalidade este trabalho analisou a
influência do uso do PDT associado com fotossensibilizantes em células tumorais
B16-F10, já que o tratamento com TFD em cânceres não melanoma já é um
protocolo estabelecido (ZEZELL, 1987).
Sendo o melanoma um dos tipos de câncer que mais acomete pessoas em
todo o mundo, torna-se importante a busca por novas terapias que apresentem
sucesso no tratamento/eliminação de células tumorais. A utilização da linhagem
celular B16-F10 nos permitiu avaliar a presença de açúcares na superfície das
células, já que a expressão de determinados grupos de carboidratos estão
envolvidos com a capacidade de metástase, comprometendo outros tecidos. Além
disso após TFD com diferentes fotossensibilizantes, as células apresentam
diferentes carboidratos de superfície e vias de resposta como visto no trabalho de
(FÁTIMA; BAPTISTELLA; PILLI, 2005).
Segundo Christiansen et al. (2013) os carboidratos expressos em melanomas,
principalmente aqueles envolvidos na sinalização, estão envolvidos na regulação do
processo metastásico. Assim os resultados obtidos demonstram que no caso dos
fotossensibilizantes ALA e Photosan ocorre alteração da superfície das células
tumorais submetidas à TFD, sendo possível verificar a presença de resíduos de Dmanose e D-glicose após uso da lectina ConA-TRITC e ausência de Naceltilglicosamina/ácido siálico, envolvidos no processo de metástase.
A expressão de carboidratos na superfície celular envolve a participação do
reticulo endoplasmático e do complexo de Golgi, sendo estas duas organelas alvo
da TFD, é possível inferir que alteração na expressão de proteínas especificas
39
destes compartimentos favorecem a compreensão e o delineamento das vias
moleculares envolvidas no sucesso da PDT, como mostrado neste trabalho
corroborando com os resultados de (FÁTIMA; BAPTISTELLA; PILLI, 2005).
Costa (2013) descreve a presença estável de GRP78 em melanoma após
marcação com anti-GRP78, revelada com anticorpo secundário marcado com FITC
e essa condição também foi observada neste trabalho, corroborando com os
resultados de Costa.
Segundo Lee (2001) a presença de GRP78 esta associada à malignidade,
progressão tumoral, metástase e resistência a drogas. A utilização de anticorpo
secundário marcado com peroxidase, revelou a presença desta proteína nos
tratamentos com Photosan e AlPcS4, confirmando o envolvimento desta proteína em
uma possível resistência das células ao tratamento como demonstrado por
Christiansen et al. (2013). Ao mesmo tempo os resultados indicam que a TFD não
está interferindo na atividade do reticulo endoplasmático, mas devido a alterações
na expressão de carboidratos interfere na alteração da atividade do complexo de
Golgi.
As células B16 - F10 , assim como as células normais , expressam epítopos α
– galactosil, mas ao realizar o tratamento com os fotossnsibilizantes ALA e Photosan
e TFD
pode-se notar que houve mudança do carboidrato na superfície celular,
enquanto Photosan e AlPcS4 mantém a atividade da GRP78 corroborando com os
resultados de (ARAP, 2003).
40
6
CONCLUSÃO
Conclui-se que:
- Os fotossensibilizantes, ALA e Photosan interferem nos açúcares de superfície,
enquanto Photosan e AlPcS4 mantem a atividade da GRP78.
- Sugere-se que o tratamento com TFD não está interferindo na atividade do reticulo
endoplasmático, mas devido a alterações na expressão de carboidratos interfere na
da atividade do complexo de Golgi e consequentemente há mudança do carboidrato
expresso na superfície celular.
Dessa forma sugere-se que mais estudos sejam realizados nesta área para
que os eventos que ocorrem no Complexo de Golgi após TFD com os
fotossensibilizantes ALA, Photosan e AlPcS4 sejam elucidados e assim podendo-se
entender como ocorrem as mudanças e expressão indireta de carboidratos na
superfície celular com a técnica de reação em cadeia da polimerase quantitativo em
tempo real (RT-PCR).
41
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