TÍTULO: ESTABELECIMENTO DE METODOLOGIA DE COLETA E PREPARO DE AMOSTRAS DE
FEZES PARA IDENTIFICAÇÃO DE ROTAVÍRUS
CATEGORIA: CONCLUÍDO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: BIOMEDICINA
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
AUTOR(ES): LETICIA APARECIDA ALVES MOREIRA
ORIENTADOR(ES): MARIA CLARA DUARTE FREGOLENTE ALVES
COLABORADOR(ES): EDUARDA DE OLIVEIRA BARBOSA, GABRIELLE YURI KURODA, MÁRCIA
MARIA TSURUTA
1. Resumo
Os rotavírus representam a causa mais comum de diarreia grave na infância
em todo o mundo. Em geral, o quadro clínico clássico se caracteriza pelo início
abrupto com vômitos e febre alta, sobrevindo diarreia profusa. Instala-se com
frequência a desidratação do tipo isotônica, não raro daí decorrendo o óbito. Estimase que até os cinco anos todas as crianças terão, pelo menos, um episódio de
infecção, e que uma em cada 300 infectadas pode morrer em consequência das
complicações. São eliminados em alta quantidade nas fezes e transmitidos via fecaloral, por água ou alimentos, objetos contaminados e por contato de pessoa-apessoa. Os rotavírus pertencem à família Reoviridae e são classificados em grupos,
subgrupos e sorotipos. A partícula viral completa apresenta 100nm de diâmetro,
morfologia esférica, simetria icosaédrica, sem envelope lipídico e contém um
genoma de 11 segmentos de RNA dupla fita (RNAds). O genoma de RNA que
codifica proteínas estruturais e não estruturais é envolvido por triplo capsídeo
proteico. O objetivo deste projeto foi estabelecer a metodologia de coleta e preparo
de amostras de fezes, além de extração de dsRNA e eletroforese em gel de
poliacrilamida (EGPA), para identificação de rotavírus e seus genótipos no Núcleo de
Pesquisa em Neurociência (NUPEN) da Universidade Cidade de São Paulo
(UNICID). Para a implantação da técnica foram utilizadas 78 amostras de fezes de
animais dos biotérios existentes no NUPEN. A partir de cada amostra de fezes,
foram preparadas suspensões a 10% em tampão fosfato salina (PBS).
.
2. Introdução
Atualmente a diarreia tem se tornado a segunda causa de internações de
crianças, geralmente com idades inferior a cinco anos, e os rotavírus têm sido
reconhecidos como a sua principal causa no mundo todo. Eles ocasionam diarreia
grave e pode também levar a vômitos, dor abdominal, febre e desidratação severa,
pois se replicam nos enterócitos do intestino delgado, causando danos extensos nas
microvilosidades e resultando em má absorção e perda de fluidos e eletrólitos. A
transmissão ocorre principalmente por via fecal-oral, diretamente de pessoa para
pessoa, ou indiretamente, através de fômites contaminados (WHO, 2014).
Os rotavírus pertencem à família Reoviridae, e seu genoma é constituído por
11 segmentos de RNAds, onde cada segmento codifica para pelo menos uma
proteína, sendo seis estruturais (VP) e cinco não-estruturais (NSP) (GREENBERG &
ESTES, 2009).
Apresentam-se como partículas esféricas de simetria icosaédrica, não
envelopadas, com 100nm de diâmetro e três camadas proteicas concêntricas. A
camada mais interna - core viral- é constituída por quatro proteínas, que têm a elas
associadas uma proteína que constitui o capsídeo intermediário. Essa proteína,
denominada VP6 é o antígeno responsável pela classificação dos rotavírus em sete
grupos (A - G) e quatro subgrupos (I, II, não-I e não- II I+II) sendo bastante
imunogênica e induzindo a formação de anticorpos diferentes conforme a espécie de
rotavírus (BRICKS, 2005).
A classificação dos rotavírus é complexa e tem sofrido mudanças
relativamente constantes. Atualmente as cinco espécies de rotavírus (A, B, C, D, E)
são definidas em função da VP6 (ICTV). A espécie Rotavírus A é a mais
frequentemente encontrada em todas as espécies animais e é a única a ser
classificada também em subgrupos e sorotipos (FAUQUET et al., 2005; MUNFORD,
CARUZO & RACZ, 2008). Também é na espécie A de Rotavírus que estão
determinados os genogrupos, que correspondem a conjuntos de cepas cujas
sequências de nucleotídeos de regiões específicas de um segmento genômico
apresentam alta similaridade entre si (TAVARES, 2008), como os genogrupos Walike e DS-1-like. Esses genogrupos contêm cepas que infectam, tipicamente,
humanos.
A camada mais externa do core viral contém as proteínas estruturais VP7
(proteína G) e VP4 (proteína P) que são considerados importantes para a imunidade
protetora. Os genótipos G1P[8], G2P[4], G3P[8] e G4P[8] são considerados os mais
comuns em rotavírus de humanos (SANTOS & HOSHINO, 2005; GREENBERG &
ESTES, 2009). O sorotipo G9, tido até recentemente como emergente, tem sido
descrito em rotavírus de humanos em muitos países (STEELE et al., 2002;
FISCHER et al., 2003), inclusive no Brasil, (CARMONA et al., 2006; MONTENEGRO
et al., 2007) onde há também relatos de diferentes associações entre os genótipos G
e P, como G1P[4], G2P[8], G2P[6] ou G3P[4] (CARDOSO et al., 2000; ROSA e
SILVA, CARVALHO & GOUVEA, 2002; MUNFORD et al., 2007; MARTINI et al.,
2008).
Em 2006, a Vacina Oral Rotavírus Humano (VORH) foi incluída no Programa
Nacional de Vacinação. Para tanto, uma vacina atenuada de genótipo G1P[8] é
utilizada (CORREIA et al., 2010) e como consequência verifica-se um acentuado
declínio no número de casos de gastroenterite e/ou de hospitalizações ou
mortalidade associadas a essa enfermidade, principalmente entre crianças entre 1 a
4 anos de idade (GURGEL et al., 2009).
Após o estabelecimento da vacinação, alguns grupos de pesquisa vêm
realizando trabalhos com o objetivo de analisar a prevalência e a frequência da
circulação de genótipos de rotavírus em crianças menores de cinco anos de idade.
Embora a semelhança entre os trabalhos seja visivelmente constatada, os
resultados obtidos apresentaram suas diferenças. Os genótipos mais detectados
foram o G1P[8], durante 2004 e 2005 em São Paulo-SP (MORILLO et al., 2009) e
em 2010 na Argentina (DEGIUSEPPE et al., 2013); e o G2P[4] no ano de 2007 em
São Paulo – SP e em Juiz de fora – MG, durante 2011 (ASSIS et al., 2013).
3. Objetivo
Estabelecer a metodologia de coleta e preparo de amostras de fezes no
Núcleo de Pesquisa em Neurociência (Nupen) para identificação de rotavírus.
4. Metodologia
Para a implantação da técnica foram utilizadas amostras de fezes de
animais dos biotérios existentes no NUPEN. Amostras de rotavírus de símio (SA-11)
obtidos a partir de cultura celular foram utilizadas como controle positivo nas
reações.
A partir das amostras de fezes, foram preparadas suspensões a 10% em
tampão fosfato salina (PBS) 0,01 M pH 7,4, após centrifugação a 2.000 rpm por 10
minutos. As amostras de fezes e suspensões foram armazenadas a 4°C durante
todo o período do estudo. A extração do dsRNA viral foi feita por fenol-clorofórmio
segundo Herring e colaboradores (1982) com modificações e desenvolvida por outra
aluna. Após a finalização da extração do dsRNA viral, os extratos foram então
aplicados em um gel de poliacrilamida a 7,5% (HERRING et al., 1982). Para a
visualização do dsRNA de rotavírus foi realizada a técnica de Eletroforese em Gel de
Poliacrilamida (EGPA) (Laemmli et al., 1970), seguida de coloração por prata. A
impregnação do gel por prata foi feita segundo Sammons e colaboradores (1981).
5. Desenvolvimento
a. Preparo das amostras
Todas as 78 amostras utilizadas nesse projeto, foram coletadas dos
animais dos biotérios do NUPEN. As amostras foram preparadas da seguinte
maneira: inicialmente as amostras foram numeradas e então diluídas a 10%, sendo
aproximadamente 0,4 g de amostra fecal em 4mL de tampão fosfato salina (PBS)
0,01 M pH 7,4. Para o preparo das suspensões o material foi homogeneizado em
agitador de tubos Vórtex, e em seguida, centrifugado a 2.000 rpm durante 10
minutos. O sobrenadante (SN) foi coletado e o precipitado descartado. Para a
implantação das técnicas complementares de extração do dsRNA e visualização em
gel de poliacrilamida, todas as amostras foram utilizadas, sendo realizadas quatro
corridas eletroforéticas. Como controle positivo nas reações foi utilizado uma
amostra de rotavírus de símio (SA-11), obtidos a partir de cultura celular.
b. Extração de RNAds
Para a extração de RNAds, o próximo passo foi aliquotar 500 µl do SN em
micro tubos e adicionar 50 µl de SDS 10%. Depois, os tubos foram incubados em
banho-maria à 37°C por 30 minutos, e adicionados 500 µl de fenol-clorofórmio
(bidestilado, saturado com água, pH ~ 4,0). Durante 2 minutos, os tubos foram
agitados em Vórtex, e durante 5 minutos, centrifugados a 10.000 rpm à 4°C. Após
esses processos, a fase aquosa (superior) foi transferida para o micro tubo com
pipeta automática, evitando-se a interface. Foram acrescentados 50 µl de cloreto de
sódio (NaCl) 20%, 1ml de etanol gelado e após serem misturados novamente, foram
armazenados na vertical, à -20°C por 18 horas. Concluído este período, as amostras
foram centrifugadas a 12.800 rpm durante 10 minutos à 4°C, e em seguida foi
desprezado todo o SN, vertendo os tubos rapidamente. Os tubos abertos foram
emborcados sobre papel e, após sua secagem, foram acrescentados 20 µl de
Mistura Dissociante (MD) e deixados em banho-maria à 56°C durante 15 minutos.
Para o preparo do gel de poliacrilamida, o método descrito por Laemmli (Nature,
227:680, 1970) foi usado com pequenas modificações. A sensibilidade desta
metodologia detecta a quantidade mínima de 300 a 400pg de RNA (Sammons et al.,
1981).
6. Resultados
A partir das 78 amostras coletadas, as etapas de preparo, extração e corrida
eletroforética foram realizadas com sucesso, porém na etapa de visualização 18
amostras resultaram inconclusivas. As outras 60 amostras mostraram-se negativas
(Tabela 1).
Tabela 1: Número total de amostras coletadas, animal doador e os
resultados obtidos com a EGPA.
Animal
Resultados
Total
Negativo
Inconclusivo
Rato
34
18
52
Pombo
26
0
26
Total
60
18
78
Dezoito amostras de fezes de rato, após corrida eletroforética, não
apresentaram segmentos. Porém, como não houve visualização do controle positivo,
o resultado foi caracterizado como inconclusivo. Estas amostras devem ter a
extração repetida para confirmação do resultado.
Na figura 1 e 2 encontram-se a visualização em gel de poliacrilamida,
apresentando os segmentos dos dsRNA viral utilizado como controle positivo e os
perfis eletroforéticos das demais amostras analisadas.
C+
1 2
3
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Figura 1 – Gel de poliacrilamida após coloração com prata. C+: controle positivo;
Colunas de 1 a 18: amostras negativas (Z10 à Z20, Z28, Z36 à Z41).
C+
1 2
3
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Figura 2 - Gel de poliacrilamida após coloração com prata. C+: controle
positivo; Colunas de 1 a 18: amostras negativas (Z21 à Z27, Z29 à Z34).
7. Considerações Finais
O preparo das soluções utilizadas foi realizado de acordo com os protocolos
das técnicas e com a supervisão do técnico responsável pelo laboratório. As coletas
foram realizadas também com supervisão e não apresentaram dificuldades já que os
animais estavam presentes nas gaiolas no momento da coleta.
As etapas de coleta e preparo das amostras também não apresentaram
dificuldade para serem concluídas. Estas etapas são iniciais para a realização de
todo o processo de visualização de dsRNA viral. Portanto, para a avaliação da
efetividade das etapas, é necessário desenvolver as demais. Estas foram realizadas
por outros membros do laboratório e mostraram-se efetivas, como pode ser
observado pelos resultados obtidos. Todas as etapas foram essenciais para o
aprendizado e proporcionaram o aperfeiçoamento das técnicas.
A técnica de coleta e preparo de amostras fecais foi estabelecida no NUPEN
com sucesso e pode ser utilizada em outros projetos que venham a ser
desenvolvidos, seguindo as normas de biossegurança estabelecidas.
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