Detecção por
imunocitoquímica de
VEGF no pénis do rato
Cristina Resende
Diana Cruz
T6
Objectivo
 Mapear a localização preferencial do VEGF
(vascular endothelial growth factor) no pénis
do rato
Insere-se num projecto de investigação do que tem como objectivo
mapear e comparar a localização do factor de crescimento no
pénis em diversos grupos de risco.
Histologia do pénis
Componentes principais:
 Uretra
 3 corpos cilíndricos de
tecido eréctil
 2 Corpos cavernosos Fig. 1: Corte transversal de pénis humano
na parte dorsal
 Corpo esponjoso –
anteriormente; a
revestir a uretra
Os corpos cavernosos são
envolvidos por uma camada
resistente de tecido conjuntivo
denso - a túnica albugínea.
Fig. 2: Corte transversal de pénis humano
(maior ampliação)
O tecido eréctil que compõe
os corpos cavernosos e o
corpo esponjoso tem uma
grande
quantidade
de
espaços
cavernosos
separados por trabéculas de
fibras de tecido conjuntivo
e células musculares lisas.
Fisiologia da erecção (I)
Óxido nítrico – Essencial ao fenómeno de erecção
• Molécula sinalizadora parácrina
• Sintetizado a partir do aminoácido arginina
• Difunde-se directamente através da membrana plasmática
das células alvo
• Molécula extremamente instável, com um tempo de semivida curto (alguns segundos)
Fisiologia da erecção (II)
Fig. 3 Papel do óxido nítrico no relaxamento do músculo liso
Epidemiologia da disfunção
eréctil
 estudos epidemiológicos demonstram uma
associação entre o envelhecimento e a disfunção
eréctil
declínio da actividade sexual e da função eréctil
com o envelhecimento
Estima-se que a percentagem de homens sem disfunção
eréctil diminui de 60 para 33% entre os 40 e 70 anos de
idade.
principal causa
da disfunção eréctil
relacionada com a idade
doença
aterosclerótica
das artérias
penianas
Disfunção eréctil não é necessariamente
uma consequência inevitável da idade
associada a patologias concomitantes
Factores de risco vascular como hipertensão,
hipercolesterolemia, tabaco e diabetes  associados a
maior probabilidade de disfunção eréctil
Outros factores de risco:
 declínio da produção hormonal, nomeadamente de
androgénios
 Factores psicológicos
 Efeitos laterais de fármacos utilizados na terapêutica
de patologias concomitantes
Importância do estudo
 Última década  grande preocupação nesta área
Crescimento populacional
Aumento da esperança média de vida
Acréscimo importante na prevalência de diversas
patologias, incluindo a disfunção eréctil
Compreensão mais aprofundada dos mecanismos
fisiopatológicos da disfunção eréctil com vista à
orientação de novas linhas terapêuticas
Alterações estruturais e ultrastruturais nos
componentes fibroelásticos das:
trabéculas penianas,
músculo liso cavernoso
endotélio
inadequada expansão sinusoidal
rigidez do pénis erecto
Farmacologia para melhorar a
erecção peniana
Viagra
Medicamentos de acção periférica de
actuação predominantemente vasoactiva
como os inibidores da fosfodiesterase tipo
5
Angiogénese terapêutica
Disfunção endotelial
1 dos factores
responsáveis pela
disfunção eréctil
Traduz-se em:
 desordens do fluxo arterial
 relaxamento do músculo liso
cavernoso
 disfunção venooclusiva
Alvo farmacológico válido
na prevenção da disfunção
eréctil
 Neovascularização cavernosa é controlada
por factores de crescimento angiogénicos
que promovem a proliferação e migração de
células endoteliais e musculares lisas
VEGF um dos factores mais
importantes, que ainda estimula a
produção de óxido nítrico
VEGF
 Família de proteínas que actuam sobre células endoteliais,
estimulando a angiogénese
 Parente
distante do factor de crescimento derivado de
plaquetas (PDGF)
 Compreende 5 membros: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D
e factor de crescimento da placenta (codificados por genes
distintos)
 Produzido em vários tipos de células vasculares (endoteliais,
musculares lisas e fibroblastos)
A administração intracavernosa de VEGF em
modelo animal estimula a expressão da síntase
de óxido nítrico endotelial, sendo a presença
deste necessária para a angiogénese
regeneração de células endoteliais
delineando as trabéculas cavernosas
Melhoramento da erecção peniana
(numa situação de oclusão arterial aguda)
Utilização de modelos animais
 O estudo da expressão de VEGF no animal experimental
parece fundamental na regulação destes mecanismos
 Possibilidade de manipulação biológica, química e
genética, simulando nestes animais os factores de risco
para a disfunção eréctil, o que permite o seu estudo in
vivo
 Extrapolações têm que ser cuidadosas
Imunocitoquímica
Produto da reacção
Anticorpo secundário
conjugado com uma enzima
Anticorpo primário
Célula com antigénio
Protocolo Imunocitoquímica:
1º Dia
Desparafinar em xilol e hidratar em etanol e água
Inibir a peroxidase endógena à temperatura ambiente (TA).
Recuperação antigénica em tampão de citrato
Enxugar lâminas e isolar cortes com Dako pen.
Adicionar tampão de incubação (5% NGS em PBS)
Adicionar Anticorpo primário (1/100) “overnight” a 4ºC
Protocolo Imunocitoquímica:
2º Dia
Adicionar Ab secundário (1/100) a TA
Adicionar complexo Avidina-Biotina (ABC) a TA.
Preparar DAB a 30% H202 e adicionar aos cortes.
Parar reacção com H2O e corar com hematoxilina
Desidratar e montar com Entellan
Resultados
Fig. 4 Corte de pénis de rato (AT= 40x)
Fig. 5 Corte de pénis de rato (AT= 40x)
Fig. 6 Corte de pénis de rato (AT= 40x)
Fig. 7 Corte de pénis de rato – corpo cavernoso (AT= 200x)
Discussão dos resultados
 Os
corpos cavernosos apresentam marcação
preferencial no tecido conjuntivo (sem definição
específica). Este tecido apresenta as condições
necessárias para a formação de vasos.
 O
tecido muscular liso não apresenta marcação
acentuada
 O endotélio apresenta alguma marcação.
 Uretra com marcação, mas no lúmen  contaminação
(deficiência de lavagem)
Perspectivas futuras
 Estudos experimentais
 Fisiopatologia da erecção
 Mecanismos de actuação terapêutica
Agradecimentos
 Dr. Pedro Vendeira
 Dr. Jorge Ferreira
 Dra. Delminda Neves
 Serviço de Biologia Celular e Molecular
Bibliografia








Williams and Warwick; GRAY’S ANATOMY; 38º Edição; Churchill Livingstone, 1995
Alberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts and Watson, Garland Publishing, Inc. "Molecular Biology of
the Cell." - 4th ed., New York, 2002.
G.M. Cooper, AMS Press,. "The Cell. A Molecular approach."- 3th ed. U.S.A 2004.
Kinsey A, Pomeroy W, Martin C: Sexual behavior in the human Male. Philadelphia: W. B.
Saunders Co., 1948
Feldman H, Goldstein I, Hatzichristou D, et al: Impotence and its medical and phychosocial
correlates: results of the Massachusetts Male Aging Study. J Urol 151: 54, 1994
Siroky M, Azadzoi K: Vasculogenic erectile dysfunction: newer therapeutic strategies. J Urol
170: S24, 2003
Penson D, Rajfer J, Gonzalez-Cadavid N: Androgen dependence of neuronal nitric oxide
synthase content in the rat penis. Endothelium 3: S86, 1995
Liu X, Lin C, Graziottin T, et al: Vascular endothelial growth factor promotes proliferation and
migration of cavernous smooth muscle cells. J Urol 166: 354, 2001
Murohara T, Asahara T, Silver M, et al: Nitric oxide synthase modulates angiogenesis in
response to tissue ischemia, J Clin Invest 101: 2567, 1998

http://astro.temple.edu/~sodicm/labs/index.htm

http://www.vh.org/adult/provider/anatomy/MicroscopicAnatomy/MicroscopicAnatomy.html