UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Avaliação das Propriedades Farmacológicas dos
Extratos Brutos de duas Variedades da Capsicum chinense
Jacq.
Autor(a): Ana Paula Ferreira Leal
Orientadora: Dra Susana Elisa Moreno
Co-orientadora: Dra Ana Lúcia Alves de Arruda
Campo Grande
Mato Grosso do Sul
Abril – 2012
UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Avaliação das Propriedades Farmacológicas dos
Extratos Brutos de duas Variedades da Capsicum chinense
Jacq.
Autor(a): Ana Paula Ferreira Leal
Orientadora: Dra Susana Elisa Moreno
Co-orientadora: Ana Lúcia Alves de Arruda
“Dissertação apresentada, como parte
das exigências para obtenção do titulo
de MESTRE EM BIOTECNOLOGIA,
no Programa de Pós- Graduação em
Biotecnologia da Universidade Católica
Dom Bosco - Área de concentração:
Biotecnologia Aplicada à Saúde”
Campo Grande
Mato Grosso do Sul
Abril – 2012
MISSÃO SALESIANA DE MATO GROSSO
UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Avaliação das Propriedades Farmacológicas dos
Extratos Brutos de duas Variedades da Capsicum chinense
Jacq.
Autor(a): Ana Paula Ferreira Leal
Orientadora: Dra Susana Elisa Moreno
Co-orientadora:Dra Ana Lúcia Alves de Arruda
TITULAÇÃO: Mestre em Biotecnologia - Área de concentração:
Biotecnologia Aplicada à Saúde
APROVADA em 26 de Abril de 2012
________________________________
Prof Dr Pedro Roosevelt Torres Romão
_________________________________
Profª Dra Carina Elisei de Oliveira
_________________________________
Profª Dra Susana Elisa Moreno
(Orientadora)
Quem vive para o que der e vier, sabe que semeando a boa
semente, ainda que seja pela umidade das lágrimas, um dia verá
nascerem às plantas. Pode mesmo acontecer que os outros não
valorizem o quanto custou esse trabalho. Não faz mal: Você se
comprometeu pelo ideal do bem. Não importa também se, nesse
esforço, tropeçou e caiu, pois é aos que tombam na luta que se costuma
chamar de heróis. Apenas o que se lhes pede é o testemunho da
PERSEVERANÇA
(Autor desconhecido)
Dedico este trabalho,
Primeiramente a Deus, pois sem Ele, nada seria possível.
Aos meus pais, Mary Elaine Ferreira Leal e Osvaldo de Menezes Leal que
sempre me apoiou nos estudos, me ajudando em todos os momentos.
A minha irmã e a toda minha família pelo incentivo e pela ajuda durante toda a
caminhada.
AGRADECIMENTOS
Principalmente a Deus, meu melhor amigo que está sempre presente em todos
os momentos.
A toda minha família, principalmente meus pais, por todo amor, carinho,
conselhos, apoio financeiro, me ajudando nessa caminhada.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da UCDB, em especial a
Jane e ao Fernando pelas inúmeras ajudas.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, da UCDB,
pelos valiosos ensinamentos.
À Professora Dra Susana Elisa Moreno pela confiança depositada em mim
desde a monografia, abrindo as portas do seu laboratório, pela honra de ser sua
orientanda, pela sua amizade e pelos ensinamentos.
A Professora Doutora Ana Lúcia Alves de Arruda pelos ensinamentos, pela Coorientação e pela grande ajuda nos experimentos.
À equipe do laboratório Farmacologia e Mutagênse, Brunna Mary Okubo,
Danieli Fernanda Buccini, Frederico Nakasone Ferreira, Gleicieli Libório e Vinícios
Cabistany sem a ajuda deles a realização deste trabalho seria impossível;
A equipe do biotério, em especial ao Lucas de ousa Moreira, Andrew Souza
Vaveiro, Leonardo Nascimento e Bruna Dias Panhan pelos animais cedidos.
A todos os técnicos da Bio-saúde (Regilene Fátima de Oliveira, Generosa
Maria Salles de Oliveira, André Dias Silva, Rosa Maria e ao Sr Roberto) pela
colaboração constante.
A uma grande amiga que ajudou muito em todos os aspectos Bruna Araujo de
Sousa, que a nossa amizade dure muitos anos.
Ao Professor e Pesquisador da EMBRAPA CENARGEN Dr Thales Lima Rocha
pelas ótimas idéias, incentivos e pela grande ajuda.
A Professora Dra Fátima de Sá pela oportunidade de realizar parte dos
experimentos em seu laboratório de biotecnologia da EMBRAPA CENARGEN.
Às minhas amigas Cristiane Almiron, Carolina Bellodi, Bianca Bellodi, Mirian
Silveria, Laís Genoud, Elis Hernandes, Talita Sadakane, Henrique Nunes e Tarcila
Sandin pelo apoio, ajuda e horas de descontração.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho; MUITO OBRIGADA.
BIOGRAFIA DA AUTORA
ANA PAULA FERREIRA LEAL, filha de Osvaldo de Menezes Leal e Mary
Elaine Ferreira Leal, nasceu em Campo Grande, Mato Grosso do Sul, no dia 09 de
novembro de 1985.
Cursou Ciências Biológicas (Licenciatura e Bacharelado) na Universidade
Católica Dom Bosco, participando de projetos de Iniciação Científica, concluindo o
curso de graduação no ano de 2009.
Em Fevereiro de 2010, iniciou o Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia, em nível de Mestrado, área de concentração Biotecnologia Aplicada à
Saúde, na Universidade Católica Dom Bosco (UCDB), Campo Grande/MS,
realizando estudos farmacológicos de extrato de plantas medicinais, orientada pela
Dra Susana Elisa Moreno.
No dia 26 de Abril de 2012 submeteu-se à banca para Defesa da Dissertação.
SUMÁRIO
Páginas
Lista de Figuras
X
Lista de abreviaturas e siglas
XI
Resumo
XII
1. Introdução
01
1.1 Plantas Medicinais
01
1.2 As Pimentas
02
1.2.1 Capsicum chinense
03
1.3 Nematóides
06
2. Objetivos
09
2.1 Objetivos específicos
09
Artigo 1: Investigação das propriedades farmacológicas dos extratos
10
brutos de duas variedades da Capsicum chinense Jacq.
Introdução
11
Material e Métodos
12
Resultados
15
Discussão
27
Conclusão
31
Referencias
32
Artigo 2: Avaliação da inativação ou morte de juvenis nematóides da
37
espécie Meloidogynes incognita expostos aos extratos de Capsicum
chinense Jacq.
Introdução
37
Material e Métodos
39
Resultados
40
Discussão
44
Conclusão
46
Referencias
46
3. Considerações Finais
49
4. Referencias
50
LISTA DE FIGURAS
Páginas
Figura 1: Variedades da Capsicum chinense. (A) pimenta biquinho, (B)
pimenta bode amarela, (C) pimenta bode vermelha.
04
Figura 2: Estrutura Química da Capsaicina (A), Dihidrocapsaicina (B) e
Nordihidrocapsaicina (C).
05
Figura 3: Ciclo Biológico dos Nematóides formadores de galhas em
raízes.
07
Figura 4: Nematóides em forma de galhas (A), parasita nematóide via
microscópico óptico (B).
07
Figura 5: Obtenção dos extratos hexânicos (EH) e etanólicos (EE) do
material vegetal de Capsicum chinense (variedade biquinho e bode).
13
Figura 6: Avaliação do efeito dos extratos brutos da Capsicum chinense
variedade biquinho sobre a migração de neutrófilos para a cavidade
peritoneal de camundongos.
16
Figura 7: Avaliação do efeito dos extratos brutos da Capsicum chinense
variedade Bode sobre a migração de neutrófilos para a cavidade de
camundongos.
17
Figura 8: Avaliação do efeito antiinflamatório dos extratos brutos da
Capsicum chinense da variedade biquinho sobre o teste de edema de
pata induzido por carragenina em camundongos.
19
Figura 9: Avaliação do efeito antiinflamatório dos extratos brutos da
Capsicum chinense da variedade Bode sobre o teste de edema de pata
induzido por carragenina em camundongos.
21
Figura 10: Avaliação do efeito antinociceptivo dos extratos brutos da
Capsicum chinense da variedade bode por meio do teste de contorções
abdominais em camundongos.
22
Figura 11: Avaliação do efeito antinociceptivo dos extratos brutos da
Capsicum chinense da variedade Biquinho por meio do teste de
contorções abdominais em camundongos.
23
Figura 12: Avaliação do efeito antinociceptivo dos extratos brutos da
Capsicum chinense da variedade Biquinho por meio do teste de
lambidas induzidas por formalina em camundongos.
24
Figura 13: Avaliação do efeito antinociceptivo dos extratos brutos da
Capsicum chinense da variedade Bode por meio do teste de lambidas
25
induzidas por formalina em camundongos.
Figura 14: Avaliação da atividade hemolítica dos extratos brutos da
Capsicum chinense variedade Biquinho sobre eritrócitos humanos.
26
Figura 15: Avaliação da atividade hemolítica dos extratos brutos da
Capsicum chinense variedade Bode sobre eritrócitos humanos.
27
Figura 16: Análise e Reanálise da inativação ou morte de juvenis
nematóides expostos ao extrato bruto da Capsicum chinense variedade
Biquinho.
41
Figura 17: Análise e Reanálise da inativação ou morte de juvenis
nematóides expostos ao extrato bruto aquecido da Capsicum chinense
variedade Biquinho.
42
Figura 18: Análise e Reanálise da inativação ou morte de juvenis
nematóides expostos ao extrato bruto da Capsicum chinense variedade
Bode.
42
Figura 19: Análise e Reanálise da inativação ou morte de juvenis
nematóides expostos ao extrato bruto da Capsicum chinense variedade
Bode.
43
LISTA DE ABREVIATURAS
AAS – Ácido acetilsalicílico
IFN – α interferon Alfa
IFN – β Interferon Beta
i.p – intraperitoneal
Kg – Kilogramas
LPS – Lipopolissacarídeo
mL - Mililitros
mg – Miligramas
Milli-Q – Água ultrapura
NaOCl – Hipocloreto de Sódio
ηm - Nanômetro
rpm – Rotações por minuto
s.c. – Subcutâneo
s.p. – Subplantar
TG – Tioglicolato
TNF α – Fator de Necrose Tumoral Alfa
TRPV1 – Potencial Receptor transitório vanilóide 1
µL – Microlitros
RESUMO
As pimentas conquistaram o mundo e o comércio das especiarias com seu
colorido, ardor e beleza. As pimentas e pimentões são representados pelo gênero
Capsicum, que compreende cerca de 20-25 espécies, pertencentes à família
Solanaceae. Este gênero produz metabólitos secundários, dentre eles os
capsaicinóides. A capsaicina é o mais importante capsaicinóide, responsável pela
característica das pimentas, a pungência. Suas propriedades farmacológicas já
encontradas são antiinflamatória, analgésica, ação mucolítica e termogênica. Diante
do exposto, o objetivo do presente estudo foi avaliar as propriedades farmacológicas
dos extratos brutos de duas variedades da Capsicum chinense Jacq (pimenta
biquinho e bode). Os extratos brutos dos frutos das pimentas bode e biquinho foram
obtidos pelo método de extração por maceração a frio até o esgotamento por
hexano e etanol, e concentrados em evaporador rotatório, obtendo-se os respectivos
extratos. As metodologias aplicadas para a avaliação das propriedades
farmacológicas dos extratos brutos foram a avaliação da atividade antiinflamatória
pelo teste de migração de neutrófilos pela cavidade peritoneal em camundongos e
pelo teste edema de pata induzido por carragenina 1%. O potencial analgésico foi
avaliado pelo teste de contorções abdominais induzidos por ácido acético 0,8% e
pelo teste de lambidas induzida por formalina em camundongos. A avaliação da
citotoxicidade foi realizada pela atividade hemolítica in vitro em eritrócitos humanos.
A investigação da inativação ou morte de juvenis nematóides foi avaliada pelo
método de exposição in vitro dos nematóides Meloidogynes a diferentes
concentrações do extrato bruto. Os resultados demonstraram que os extratos
hexânicos das variedades bode e biquinho apresentaram atividade anti-inflamatória
nos modelos de migração de neutrófilos e edema de pata em camundongos,
atividade antinociceptiva avaliada pelo modelo de contorções abdominais e não
apresentaram hemólise nas concentrações utilizadas quando comparadas ao grupo
salina. O extrato etanólico apresentou atividade anti-inflamatória pelo modelo de
migração de neutrófilos e edema de pata somente na variedade bode, sendo que a
variedade biquinho apresentou atividade antinociceptiva pelos modelos de
contorções e teste de formalina em camundongos somente nas concentrações 15mg
e 5mg, respectivamente, e ambas as variedades apresentaram atividade hemolítica
similar ao controle salina na concentração de 1mg. Na avaliação dos juvenis
nematóides Meloidogynes expostos aos extratos etanólicos das variedades
apresentaram paralisia em todas as concentrações das duas variedades, mesmo
quando expostos aos extratos aquecidos. Desse modo, concluímos que as
variedades apresentam diferenças em seus potenciais farmacológicos, sendo que o
extrato hexânico o que mais apresentou atividade farmacológica. Sugerimos testes
mais aprofundados para descobrirmos as substâncias que apresentam tais
atividades.
Palavras-chave: Capsicum chinense, anti-inflamatório, antinociceptivo, nematóides.
1 INTRODUÇÃO
1.1
Plantas Medicinais
Os vegetais participam da vida humana desde seus primórdios, como fonte de
alimentos, habitação, materiais de vestuários, utilidades domésticas, como defesas e
ataque e como meio de restauração da saúde (SIMÕES et al. 2001). Entretanto, a
indústria farmacêutica faz utilização deste material muito recentemente, sendo que
até meados do século XX, as plantas medicinais e seus derivados constituíam a
base da terapêutica medicamentosa (CALIXTO 2000). Portanto, estudos com
plantas medicinais são desenvolvidos em função de informações terapêuticas
obtidas a partir da medicina popular, às quais em trabalhos multidisciplinares,
envolvendo conhecimento químico, atividade biológica e controle tecnológico de
qualidade da substância de origem vegetal e de seus extratos, são importantes para
a consolidação da fitoterapia como prática segura e eficaz (LOPES 2003).
Em geral, a escolha de uma determinada planta medicinal é feita através da
abordagem etnofarmacológica, que consiste na exploração científica dos agentes
biologicamente ativos, empregados ou observados pelo homem, permitindo a
formulação de hipóteses quanto às atividades farmacológicas e às substâncias
ativas responsáveis pelas ações terapêuticas (SIMÕES et al. 2001). Esta
abordagem está relacionada aos estudos etnobotânicos aplicados a plantas
medicinais para a exploração científica de agentes biologicamente ativos. (MACIEL
et al. 2002)
O Brasil, detentor da maior floresta tropical equatorial e tropical úmida do
planeta, constituído de uma grandeza de seu litoral e de sua flora, não pode abdicar
de sua vocação para os produtos naturais (PINTO et al. 2002). Seu Território possui
cinco principais biomas: Floresta Amazônica, Cerrado, Floresta Atlântica, Pantanal e
Caatinga, sendo, portanto, uma rica fonte de produtos terapêuticos (CALIXTO 2000).
O Brasil apresenta a maior diversidade vegetal do mundo, já que um total entre
350.000 a 550.000, 55 mil espécies encontram-se catalogadas no país, despertando
assim interesse em comunidades científicas para a realização de estudos,
conservações e utilizações destes recursos (SIMÕES 2001; SOUZA et al. 2006;
1
OMENA 2007). Portanto, em função dessa diversidade de espécies, o país se torna
um grande fornecedor de material botânico para o mercado farmacêutico.
As
análises
farmacológicas
e
químicas
de
plantas
medicinais
vêm
proporcionando um grande avanço científico, na obtenção de novos componentes
com propriedades terapêuticas (VIEGAS 2006), visto que cerca de 30% das drogas
disponíveis no mercado são de produtos naturais ou derivados deles (CALIXTO
2005). A descoberta de novos compostos tem estado em permanente evolução,
devido às novas técnicas que permitem o isolamento e a determinação dos
compostos químicos. Portanto, as plantas medicinais formam um elo entre as
comunidades tradicional e cientifica, compartilhando informações e interesses para o
desenvolvimento e aprimoramento das políticas de saúde (CALIXTO 2000). O
estudo destas plantas permite o crescimento do conhecimento cientifico, validando o
uso medicinal para a população (BONTEMPO 2007).
Embora esses estudos estejam em permanente evolução e tem crescido muito
nos últimos tempos, são poucos
os estudos
avaliando as propriedades
farmacológicas das pimentas, apesar de serem empregadas como recursos
medicinais nas medicinas indiana, chinesa, egípcia, mesopotâmica, entre outras,
devido às características de pungência (ardida) combatendo o excesso de
mucosidades, eliminando toxinas e tonificando a energia vital (BONTEMPO 2007).
1.2
As Pimentas
O nome Pimenta vem da forma latina pigmentum, passando para o espanhol
pimienta, apresentando significados de “matéria corante” e depois “especiaria
aromática,” respectivamente (BONTEMPO 2007). Esta especiaria era cultivada pelas
tribos indígenas brasileiras durante a época do descobrimento do Brasil e duram até
os dias de hoje. Entretanto, relatos históricos afirmam que foram os escravos que
trouxeram as pimentas da África para o Brasil, porém já eram utilizadas pelos
nativos como moedas na troca por ferramentas, antes da chegada dos
colonizadores (REIFSCHNEIDER 2000).
As pimentas conquistaram o mundo e o comércio das especiarias com seu
colorido, ardor e beleza. No Brasil são produzidas dezenas de variedades,
2
movimentando aproximadamente R$ 80 milhões por ano para a economia do país.
As pimentas vermelhas respondem pelo terceiro lugar em produção e consumo de
hortaliças para o tempero brasileiro, deixando a sua frente o alho e a cebola
(REIFSCHNEIDER 2000).
As pimentas e os pimentões são classificados em Reino Plantae, Divisão
Magnoliophyta, Classe Magnoliopsida, e apresenta duas Ordens importantes: a
Ordem Solanales da Família Solanaceae e do Gênero Capsicum, e a Ordem
Piperales da Família Piperaceae e do Gênero Piper, (BOSLAND e VOTAVA 1999
apud KUMAR et al. 2011).
O gênero Piper, da família Piperacea, é representado pela pimenta-do-reino no
Brasil, apresentando várias maturações dos grãos dando origem a pimenta-verde,
pimenta-preta e pimenta-branca, e seu principal princípio ativo é a piperina
(BONTEMPO 2007).
Este gênero é encontrado principalmente nas regiões Sudeste, Sul e Centrooeste, (PERUCKA et al. 2007). O gênero Capsicum compreende cerca de 20-25
espécies, pertencentes à família Solanacea, representado pelas pimentas e
pimentões. São classificadas em espécies domesticadas, semi-domesticadas e
silvestres (REIFSCHENEIDER 2000). No momento, o Brasil cultiva pimentas de
espécies domesticadas: C. annuum (jalapeño), C. baccatum (dedo-de-moça), C.
frutescens (malagueta) e C. chinense (pimenta-de-cheiro,biquinho, bode, cumari-doPará). No entanto, as primeiras consumidas eram originárias de plantas selvagens,
classificando as pimentas em uma das plantas mais antigas cultivadas das Américas
(BONTEMPO 2007).
1.2.1 Capsicum chinense
O nome Capsicum chinense foi conferido pelo físico holandês Kikolaus Von
Jacquinomist, ao considerar esta espécie originária da China, embora nesta época já
se soubesse que todas as espécies de Capsicum eram originárias do hemisfério
ocidental (BOSLAND e VOTAVA 1999 apud KUMAR et al. 2011).
A descrição botânica da espécie Capsicum chinense segundo SMITH e
HEISER (1957) apud LORENZI et al. 2008 é Capsicum sinense Jacques (sinônimo
de C. chinense). São plantas com 45 a 76 cm de altura, folhas ovadas, largas,
3
macias ou rugosas, de tonalidade verde claro a escuro. As flores aparecem de 3 a 5
por nó e os frutos variam de 1,0 a 12,0 cm de comprimento, com formas variáveis e
de cores salmão, laranja, amarela, vermelha ou marrom. É a mais brasileira das
pimentas domesticadas, encontrada em grande diversidade na bacia Amazônica e
no Pará, apresentando diferentes cultivares ou variedades (REIFSCHNEIDER
2000). As variedades da Capsicum chinense se diferenciam pelo tamanho, cor,
forma das folhas, flores, os frutos e a intensidade da atividade picante. Entretanto,
os frutos são a parte mais variável entre as cultivares ou variedades, com
numerosas sementes presas a placenta central, local do principio ativo picante
(LORENZI et al. 2008).
Algumas variedades da espécie Capsicum chinense são a pimenta biquinho
(Figura 1a), que apresenta pungência doce e com aroma forte e é utilizada em
saladas, conservas. A outra variedade, a pimenta bode (Figura 1b e c), ao contrário,
é de pungência forte, usada em condimentos no preparo de carnes, arroz, feijão,
pamonha salgada e biscoitos e principalmente em conservas. Essa apresenta duas
variedades, pimenta bode amarela e vermelha, ambas maduras, utilizadas em
conservas (REIFSCHNEIDER 2000).
(a)
(b)
(c)
FIGURA 1: (a) Variedade pimenta Biquinho; (b) Variedade pimenta bode amarela; (c) Variedade
pimenta bode vermelha.
FONTE:(a)http://movimento-natureza.blogspot.com/;
(b)http://gastronomiamineiracomcheffsilva.blogspot.com/20101001archive.html
As espécies do gênero Capsicum apresentam em sua composição, metabólitos
secundários, destacando os capsaicinóides, responsável pela ação picante das
pimentas. Além destes, as pimentas apresentam também os carotenóides, ácido
ascórbico, vitaminas C, vitamina E, vitaminas do complexo B e compostos fenólicos
(REIFSCHNEIDER 2000), ácidos graxos, alfa caroteno, violaxantina, flavonóides,
dentre outros (LORENZI et al. 2008). Entretanto, dos 14 capsaicinóides existentes, a
4
capsaicina (Figura 2-A) é a principal, sendo encontrada em maior quantidade nas
pimentas, encontrando também as dihidrocapsaicina e nordihidrocapsaicina (Figura
2 B e C) (SIMÕES et al. 2001). A capsaicina, dependendo da concentração do
principio ativo, estimula termos receptores das mucosas e da pele. Apresentam
também atividades farmacológicas,
como a ação mucolítica,
termogênica,
analgésica, antiinflamatória (PERUCKA et al. 2007).
FIGURA 2: Estrutura Química da Capsaicina (A), Dihidrocapsaicina (B) e Nordihidrocapsaicina (C).
FONTE: LUO et al. 2011.
Quanto a sua atividade anti-inflamatória, estudos revelam que a capsaicina
exibe propriedades antiinflamatórias inibindo o desenvolvimento da inflamação
induzido por carragenina no modelo de edema de pata em camundongos e também
no modelo de artrite em ratos. Entretanto, pesquisas revelam que a liberação de
mediadores pró-inflamatórios se associa com a propriedade antiinflamatória da
5
capsaicina (KIM et al. 2003). Recentemente, estudos in vitro demonstraram a
indução da apoptose em algumas linhagens de células de câncer humano,
desempenhando um papel na progressão do câncer e na morte celular apoptótica
(LI et al. 2001; LUO et al. 2011).
1.3
Nematóides
Os fitonemaótides (Figura 4b) apresentam o corpo alongado, afinando-se as
extremidades, apresentando comprimento de 0,5mm na fase juvenil e pode chegar a
4mm na fase adulta. São pertencentes à família Tylenchidae, e os gêneros mais
destacantes são os Meloidogynes e Heterodera, formadores de galhas e cistos em
raízes, respectivamente (BRASS et al. 2008). O gênero Meloidogynes apresenta um
ciclo biológico (Figura 3) desenvolvendo-se por meio de ovos depositados pelas
fêmeas adultas em uma substância gelatinosa chamada ooteca, por onde se
eclodem as larvas. As larvas passam por quatro estágios de desenvolvimento: o
primeiro (J1) ocorre ainda dentro do ovo quando essas trocam de pele pela primeira
vez (ecdises); o segundo estágio (J2) é a eclosão dos ovos, permitindo a penetração
em raízes; o terceiro (J3) inicia-se após a segunda troca de pele (ecdises) e o
crescimento das galhas nas raízes; após a terceira ecdise, a larva entra em seu
quarto estágio (J4). No final do ultimo estágio, as fêmeas desenvolvem seus órgãos
de reprodução e os machos abandonam as raízes e se espalham pelo solo para
fecundar as fêmeas. As fêmeas já fecundadas depositam seus ovos em ootecas que
podem fixar-se fora das raízes (SHARMA et al. 2000).
6
FIGURA 3: Ciclo Biológico dos Nematóides formadores de Galhas em raízes.
FONTE:Adaptado de COURTESIA V. BREWSTER
Os principais alvos do gênero Meloidogynes são as plantações de hortaliças,
em especial tomateiros, cafeicultura, algodoeiro, e soja (CHARCHAR 1997), que ao
se alojarem em raízes de plantações, formam galhas de tamanho e número variado
(Figura 4a). As deformações resultam em hipertrofia das células afetadas pela saliva
do parasita, que ao penetrá-las introduzem uma secreção esofagiana, iniciando a
hipertrofia celular e hiperplasia no periciclo, dando origem as células gigantes, que
são a fonte nutritiva para as larvas (BRASS et al. 2008).
(a)
(b)
FIGURA 4: (a) Nematóides em galhas no mamoeiro; (b) Visualização de nematóides na fase larval J2
em microscópio óptico na objetiva de 40 vezes; Meloidogynes spp.
FONTE: http://eeskm47.blogspot.com/2011_01_01_archive.html
7
A economia do Brasil é bastante afetada em decorrência aos danos causados
pelo gênero Meloidogynes, devido ao vasto círculo de plantas hospedeiras, incluindo
plantas
monocotiledôneas,
dicotiledôneas,
plantas
herbáceas
e
lenhosas,
expandindo para mais de 2000 espécies de plantas hospedeiras. Nas regiões do
Cerrado as plantações sofrem grandes perdas na época do verão, quando as
temperaturas se elevam, com o aumento concomitante das infestações no solo
(CHARHCAR 1997).
O controle desses parasitas é realizado por meio de produtos nematicidas e
rotação de culturas. A rotação de cultura é realizada com plantas não hospedeiras
ou más hospedeiras, sendo este de alto custo de espaço utilizado podendo onerar
os custos das produções. O nematicida mais utilizado é o brometo de metila,
apresentando um desequilíbrio biológico, deixando resíduos nos vegetais, seu uso
foi restrito ou parcialmente proibido devido aos impactos negativos causados ao
meio ambiente e ao ser humano (FERRIS et al. 1999; SHARMA et al. 2000; NICO et
al. 2004). Dessa forma, várias alternativas estão sendo avaliadas para o
desenvolvimento de opções ecologicamente sustentáveis no combate aos
fitonematoides (CHARCHAR et al. 2005). Uma das alternativas são extratos de
várias partes de plantas, visto que, apresentam vantagens, como a possibilidade de
gerar novos compostos que patógenos não são capazes de inativar, são menos
concentrados e, portanto, menos tóxicos, e biodegradáveis. (FERRIS et al. 1999).
Estudos com plantas pertencentes à família Solanaceae demonstram que são
naturalmente tolerantes a alguns fitopatógenos (MORASSUTTI et al. 2002). Por
exemplo, extratos de folhas de berinjela apresentam peptídeos de defesa com alta
atividade nematicida contra Meloidogynes incognita (ALMEIDA 2007), e também
clones de batata-doce são altamente resistentes a Meloidogynes incógnita
(MORASSUTTI et al. 2002).
Apesar de espécies do gênero Capsicum apresentar efeitos farmacológicos,
estudos com as variedades da Capsicum chinense na investigação farmacológica
ainda são escassos,
podendo ser um alvo importante na descoberta de novos
compostos fitoterápicos.
8
2 OBJETIVOS
O presente estudo teve como objetivo geral avaliar as propriedades
farmacológicas dos extratos brutos de duas variedades da Capsicum chinense Jacq
– pimenta biquinho e pimenta bode.
2.1
1.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a atividade anti-inflamatória dos extratos brutos das variedades
da Capsicum chinense Jacq. por meio da avaliação da migração de neutrófilos para
a cavidade peritoneal de camundongos.
2.
Avaliar a atividade anti-inflamatória dos extratos brutos das variedades
da Capsicum chinense Jacq. pelo modelo de edema de pata em camundongos
induzida por carragenina.
3.
Avaliar a atividade antinociceptiva dos extratos brutos das variedades
da Capsicum chinense Jacq. pelo modelo de contorções abdominais e teste de
formalina em camundongos.
4.
Avaliar a citotoxicidade dos extratos brutos das variedades da
Capsicum chinense Jacq. por meio da atividade hemolítica em eritrócitos humanos.
5.
Avaliar a inativação ou morte de juvenis nematóides Meloidogynes
incognita expostos aos extratos brutos das variedades da Capsicum chinense Jacq.
in vitro.
9
Artigo 1: INVESTIGAÇÃO DAS PROPRIEDADES
FARMACOLÓGICAS DOS EXTRATOS BRUTOS DE DUAS
VARIEDADES DA Capsicum chinense Jacq.
RESUMO: Capsicum chinense é uma espécie de pimenta encontrada em regiões
Sul, Sudeste e Centro-oeste do Brasil. Entretanto, esta espécie apresenta diferentes
cultivares, e sua composição é composta por metabólitos secundários, como o
alcalóide capsaicina, um capsaicinóide responsável pelo sabor pungente da
pimenta. O objetivo deste estudo foi investigar as propriedades farmacológicas dos
extratos brutos de duas variedades da Capsicum chinense (pimenta biquinho e
bode). Os extratos dos frutos das variedades foram obtidos pelo método de extração
utilizando solventes hexano e etanol, e após concentrados foram roto evaporados a
60°. Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss (n=5), machos e fêmeas. As
metodologias empregadas para a avaliação das atividades antiinflamatórias foram
migração de neutrófilos para cavidade peritoneal de camundongos e edema de pata
induzido por carragenina 1%, com o pré-tratamento com os extratos (1, 5, 15mg s.c).
A avaliação antinociceptiva foi realizada pelo teste de contorções abdominais
induzidas por ácido acético (0,8%) e lambidas de pata induzidas por formalina
(2,5%). O teste citotóxico foi realizado pelo método de atividade hemolítica em
eritrócitos humanos in vitro expostos aos extratos (1, 3, 5mg). Os resultados
demonstraram que os extratos hexânicos, das duas variedades, e o etanólico da
variedade bode apresentaram ação antiinflamatória pelo modelo de peritonite.
Resultados semelhantes foram observados no método de edema de pata, onde o
extrato hexânico da variedade biquinho reduziu o edema, e os extratos hexânicos e
etanólicos da pimenta bode. A avaliação antinociceptiva pelo teste de contorções
abdominais mostrou que o extrato hexânico da variedade bode reduziu as
contorções em todas as concentrações e a variedade biquinho reduziu as
contorções nas maiores concentrações dos dois extratos. O teste de lambidas
induzidos por formalina demonstrou que o extrato etanólico da pimenta biquinho foi
capaz de reduzir as lambidas na concentração de 5mg na fase tardia, mas o extrato
etanólico da pimenta bode não foi capaz de reduzir em nenhuma das concentrações.
A avaliação com eritrócitos humanos mostraram que os extratos hexânicos da
variedade bode e biquinho não apresentaram hemólise, similar ao grupo salina, e os
extratos etanólicos apresentaram valores maiores que o grupo salina, mas não
apresentaram hemólise quando comparados ao grupo Triton. Com base nesses
resultados concluímos que os extratos de ambas as variedades apresentam
substâncias com propriedades farmacológicas, sendo necessária uma avaliação dos
compostos para melhor esclarecimento das atividades.
Palavras-chave: Capsicum chinense, anti-inflamatório, antinocicepção.
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INTRODUÇÃO
O gênero Capsicum, pertencente à família Solanaceae, é representado por
cinco espécies de pimentas domesticadas utilizadas pelo homem: Capsicum
annuum L., Capsicum baccatum L., Capsicum chinense Jacq., Capsicum frutescens
L. e Capsicum pubescens (CARVALHO et al. 2004). A espécie Capsicum chinense é
representada por pimentas encontradas fartamente em regiões Sudeste, Sul e
Centro-oeste (PERUCKA et al. 2007), no entanto há pouca disponibilidade de
informações científicas sobre sua morfologia e outros caracteres relacionados à
farmacologia.
Dentro de cada espécie existem numerosos tipos de variedades ou cultivares.
A espécie Capsicum chinense possui cultivares morfologicamente distintas no
tamanho, cor e forma dos frutos e folhas, bem como na intensidade da atividade
picante. Os frutos de cada cultivares são as partes mais variáveis, todos com
numerosas sementes presas a placenta, que contém o princípio ativo picante, a
capsaicina (LORENZI et al. 2008). Pimenta de cheiro, pimenta biquinho, cumari-doPará, murupi, bode vermelha e amarela, são nomes populares de algumas
variedades de Capsicum chinense (REIFSCHNEIDER 2000).
As pimentas foram os primeiros temperos utilizados pelos índios com a função
de dar cor e aroma aos alimentos, além do emprego na conservação dos alimentos,
protegendo-os de fungos e bactérias (REIFSCHNEIDER 2000). São descritas como
um alimento funcional, ou seja, alimentos que proporcionam benefícios para a
saúde, inclusive na prevenção ou tratamentos de doenças (SURH 1999). De acordo
com ANJO (2004), as pimentas vermelhas apresentam propriedades antioxidantes,
antiinflamatórias, antimutagênicas. Dentre os estudos já realizados com este gênero,
a espécie Capsicum frutescens utilizada popularmente como condimento para
preparo de alimentos também apresenta atividade com fins farmacêuticos, como
vasodilatadora e também na agricultura como repelente e bioinseticidas (OGA
2008).
Espécies Capsicum baccatum L. e Capsicum frutescens L. são fontes de
agentes antioxidantes naturais em alimentos como demonstrado por COSTA e
colaboradores (2009). Ensaios com ratos revelaram que a espécie C.annuum L. é
provida de efeito hipocolesterolêmico e hipotrigliceridêmico quando acrescentada a
11
uma dieta hiperlipídica, porém sem efeitos tóxicos específicos e alterações
histológicas em órgãos isolados (KWON et al. 2003).
O gênero Capsicum também é fonte de vitaminas C, de carotenóides, de
vitamina E e das vitaminas do complexo B, bem como os compostos fenólicos e o
ácido ascórbico (REIFSCHNEIDER 2000). Esses compostos respondem por muitas
de suas ações farmacológicas.
Dentre os principais componentes das pimentas estão os capsaicinóides,
compostos fenólicos responsáveis pelo sabor pungente ou picante, variando a
concentração entre as espécies e cultivares da mesma espécie (CARVALHO 2004;
PERUCKA et al. 2007).
O capsaicinóide considerado de maior relevância no gênero Capsicum é a
capsaicina,
embora
outros
capsaicinóides
já
foram
relatados,
como
a
dihidrocapsaicina, nordihidrocapsaicina e homodihidrocapsaicina (BONTEMPO
2007).
Estudos revelam que a capsaicina apresenta atividades antihiperlipidêmica,
propriedades antiinflamatórias, antioxidantes e são efetivos no tratamento da dor
associada com artrite, cistite e neuropatia diabética (SURH et al. 2002).
Fisiologicamente, a capsaicina reduz a vasodilatação e também a transmissão de
impulsos dolorosos da periferia para o sistema nervoso central. A capsaicina é
também capaz de inibir a inflamação na pata de camundongos induzida por
carragenina e também na artrite em ratos, demonstrando possuir atividades
analgésicas e antiinflamatórias (KIM et al. 2003).
Diante destas informações, o presente estudo teve como objetivo investigar as
propriedades farmacológicas dos extratos brutos de duas variedades de pimenta da
Capsicum chinense Jacq. (pimenta biquinho e bode vermelha).
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta e Preparação dos extratos brutos de Capsicum chinense
Os frutos das duas variedades (biquinho e bode) foram adquiridos no Mercado
Municipal de Campo Grande – MS e as exsicatas depositadas no Herbário da
12
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul com o número de registro 29236 e
33633, respectivamente.
Aproximadamente 2 kg dos frutos foram lavados e secos em estufa com
circulação de ar, e submetidos a extração por maceração a frio até o esgotamento
por hexano e etanol, e concentrados em evaporador rotatório, obtendo-se os
respectivos extratos (Figura 5).
FIGURA 5: Obtenção dos extratos hexânicos (EH) e etanólicos (EE) do material vegetal de Capsicum
chinense (variedade biquinho e bode).
Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss, machos e fêmeas, pesando
aproximadamente 20-25g. Os animais foram provenientes do Biotério da
Universidade Católica Dom Bosco, mantidos sob condições de temperatura (2325°C) e o ciclo claro/escuro controlados, com livre acesso a ração e água. Todas as
fases dos experimentos e procedimentos foram realizadas de acordo com as normas
internacionais de ética em pesquisa com animais, com o protocolo número 004/11.
Avaliação antiinflamatória – Migração de neutrófilos
O efeito antiinflamatório foi realizado por meio do teste de migração de
neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos, de acordo com Moreno e
colaboradores (2006).
13
Para tanto os animais (Swiss n=5) foram pré-tratados com os extratos brutos
hexânicos e etanólicos em diferentes doses (1, 5 e 15mg s.c) e posteriormente
submetidos ao estímulo flogístico (Tioglicolato 4% i.p.) após 15 minutos do
tratamento. O grupo controle negativo foi tratado com Salina 0,9% (i.p.). Após 6
horas do estímulo os animais foram eutanasiados e a migração de neutrófilos para a
cavidade peritoneal foi avaliada por meio da coleta do exsudato com Salina/EDTA
(5%). A contagem total foi realizada em contador automático de células Hematologia
Analyser (Sysmex Corporation, Japan) e o resultado expresso em n° células X
106/mL. Foram realizados esfregaços para a contagem diferencial das células. Estas
foram coradas com Panótico rápido (Diff Quik) e analisadas em microscópio óptico
por meio da objetiva de imersão (1000 vezes).
Avaliação Antiinflamatória - Edema de Pata
O modelo de edema de pata induzido por carragenina 1% foi realizado de
acordo com a metodologia descrita por LEVY (1969) em camundongos Swiss (n=5),
pré-tratados com os extratos brutos hexânicos e etanólicos das duas variedades de
Capsicum chinense em diferentes doses (1,5 e 15mg s.c). Como controle do
experimento foi usada a Dexametasona 0,4mg/kg (s.c.). O controle positivo somente
carragenina 1% (50µL s.p.). As patas que receberam o estímulo foram avaliadas por
meio da mensuração da espessura no aparelho Pletismômetro (INSIGHT) em
diferentes intervalos de tempo (zero, 15, 30, 120, 240 minutos).
Após a última mensuração, os animais foram eutanasiados e as patas foram
coletadas e congeladas em ultrafreezer para futuras análises.
Avaliação da Atividade Analgésica
Teste de Contorções abdominais induzidos por ácido acético
A avaliação do potencial efeito analgésico foi realizada por meio do teste de
contorções abdominais de acordo com a metodologia descrita por KOSTER e
colaboradores (1959). Os animais (Swiss n=5) foram pré-tratados com os extratos
brutos hexânicos e etanólicos em diferentes doses (1, 5 e 15mg s.c) 15 minutos
antes do estímulo da dor com ácido acético 0,8% (10mL/kg i.p.). O grupo controle
recebeu ácido acetil salicílico (AAS - 100mg/kg). Os animais foram observados
durante 30 minutos após o estímulo, analisando o número de contorções.
14
Teste de Formalina
O teste de formalina avalia a atividade analgésica de acordo com o número
de lambidas/ou mordidas na pata. Os camundongos Swiss (n=5) foram pré-tratados
com os extratos brutos hexânicos e etanólicos das variedades de Capsicum
chinense, em diferentes doses (1, 5 e 15mg s.c), 15 minutos antes do estímulo com
Formalina 2,5% (30µL s.p.). Os controles receberam Ácido acetil salicílico (AAS –
100mg/kg). Os animais foram avaliados em duas fases: 1°fase nos primeiros 5
minutos, fazendo uma pausa de 10 minutos e a 2° fase os 15 minutos restante
observando o número de lambidas e/ou mordidas na pata injetada (HUNSKAAR e
HOLE 1987).
Avaliação da Citotoxicidade
Atividade Hemolítica
O ensaio para determinar a atividade hemolítica foi de acordo com Park e
colaboradores (2004), realizado na EMBRAPA CENARGEM de Brasília no
laboratório de Biotecnologia. Foram utilizados eritrócitos humanos do tipo sanguíneo
O negativo. Os eritrócitos foram coletados, lavados com salina 0,9% e centrifugados
a 1500 rpm por 5 min (20°C), separando assim o plasma. Para o experimento foi
utilizado sangue a 8%, distribuídos em poços de placa de 96 poços, adicionando os
extratos hexânicos e etanólicos em diferentes doses (1, 3 e 5mg). Os extratos foram
diluídos em Salina 0,9% e centrifugados, utilizando-se somente a parte solúvel dos
extratos. Os controles receberam Triton X-100 (5µL diluídos em 95µL de água MiliQ) e Salina 0,9%, todos os grupos foram realizados em triplicata. A leitura foi
realizada em espectrofotômetro (leitor de ELISA), em um comprimento de onda de
540nm.
RESULTADOS
1.
Avaliação da Atividade Antiinflamatória
15
Efeito dos extratos brutos das variedades de C. chinense sobre a
migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos
Os extratos hexânicos concentram os compostos apolares, como os ácidos
graxos e lipídios. Assim, nossos resultados demonstraram que o extrato bruto
hexânico da pimenta biquinho em todas as doses (1, 5 e 15mg) foi capaz de reduzir
a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos, quando
comparados ao controle não tratado. A migração observada nos grupos tratados
com o extrato hêxano da pimenta biquinho foi similar aquela observada em animais
que receberam salina intraperitonealmente. Por outro lado, o extrato etanólico da
mesma pimenta, que concentra substâncias polares, foi capaz de inibir a migração
de neutrófilos somente na concentração de 15mg (Figura 6). Os dados sugerem que
o extrato hexânico possui importante ação antiinflamatória e que esse efeito parece
ser mais potente em relação ao extrato etanólico.
N° de neutrófilos (x10 6)
7
6
5
4
3
2
1
*
*
*
0
TG. Sal.
1
*
*
5
15
Hexânico
1
5
15 (mg)
Etanólico
Pimenta Biquinho
FIGURA 6: Avaliação do efeito dos extratos brutos da Capsicum chinense variedade Biquinho
sobre a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos. O efeito
antiinflamatório dos extratos brutos da pimenta biquinho foi avaliado em camundongos Swiss (n=5)
submetidos ao pré-tratamento com diferentes doses dos extratos brutos hexânico e etanólico
(1/5/15mg, s.c) 15 minutos antes do estimulo inflamatório (Tioglicolato 4%, 500µL i.p). Os controles
negativos receberam salina 0,9% (200µL i.p). Após 6 horas os animais foram eutanasiados e
realizada a contagem total e diferencial das células. Os resultados estão expressos em número de
neutrófilos X 106 (media ±EPM) * p<0,05 quando comparado ao grupo tratado com tioglicolato 4%. Foi
utilizado o programa Graphpad prism 5.
16
Quando avaliamos o efeito antiinflamatório da variedade bode da C. chinense,
observamos que tanto o extrato hexânico quanto o extrato etanólico em todas as
doses utilizadas (1, 5 e 15mg) foram capazes de inibir a migração de neutrófilos para
a cavidade peritoneal de camundongos, quando comparado ao grupo não tratado.
Entretanto não foram observadas diferenças estatísticas entre os extratos etanólicos
e hexânicos, assim como entre as diferentes doses (Figura 7). Esses dados
sugerem o efeito antiinflamatório dos extratos hexânico e etanólico da variedade
Bode da C. chinense. Diante das diferenças observadas na atividade antiinflamatória
das variedades Biquinho e Bode da C. chinense, podemos sugerir a existência de
diferenças qualitativas e/ou quantitativas na composição química das variedades da
Capsicum chinense.
N° de neutrófilos (x106)
7
6
5
4
*
3
*
*
2
1
*
0
TG. Sal.
1
5
15
Hexânico
*
*
1
5
*
15 (mg)
Etanólico
Pimenta Bode
FIGURA 7: Avaliação do efeito dos extratos brutos da Capsicum chinense variedade Bode
sobre a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos. O efeito
antiinflamatório dos extratos brutos da pimenta bode foi avaliado em camundongos Swiss (n=5)
submetidos ao pré-tratamento com diferentes doses dos extratos brutos hexânico e etanólico
(1/5/15mg, s.c) 15 minutos antes do estimulo inflamatório (Tioglicolato 4%, 500µL i.p). Os controles
negativos receberam salina 0,9% (200µL i.p). Após 6 horas os animais foram eutanasiados e
realizada a contagem total e diferencial das células. Os resultados estão expressos em número de
neutrófilos X 106 (media ±EPM) * p<0,05 quando comparado ao grupo tratado com tioglicolato 4%. Foi
utilizado o programa Graphpad prism 5.
17
Efeito dos extratos brutos das variedades de C. chinense sobre o edema
de Pata em camundongos
Objetivando avaliar o efeito sobre os extratos das variedades Biquinho e Bode
da Capsicum chinense sobre os fenômenos vasculares da inflamação, foram
conduzidos os ensaios de edema de pata em camundongos. A concentração de
5mg dos extratos foi eleita por apresentar em experimentos anteriores uma
marcante ação antiinflamatória.
Nossos dados demonstraram que o extrato hexânico da variedade biquinho foi
capaz de reduzir o edema de modo similar ao tratamento com dexametasona na 2°
hora após o tratamento. Esse efeito não foi mais obervado na 4° hora (Figura 8,
painel A). Similar ao observado com a migração de neutrófilos, o extrato etanólico da
variedade biquinho, não foi capaz de reduzir o edema de pata quando comparado ao
grupo não tratado (Figura 8, painel B). Quando comparamos os dois extratos, não
houve diferença estatística (p<0,05) entre o extrato hexânico e etanólico da
variedade biquinho no pico do efeito antiedematogênico (120min).
Esses resultados corroboram os dados apresentados anteriormente. Nossos
resultados sugerem que apenas o extrato hexânico é provido de significativa ação
antiinflamatória.
18
A
0.25
s a lin a + c a r r a g e n in a
D e xa m e ta s o n a
E dem a (m l)
B iq u in h o He xa n o 5 m g
0.20
0.15
0
30
60
90
120
150
180
210
240
T e mp o (min u to s )
B
0 .2 5
S a lin a /C a r r a g e n in a
E dem a (m l)
D e xa m e ta s o n a
B iq u in h o e ta n o l 5 m g
0 .2 0
0 .1 5
0
30
60
90
120
150
180
210
240
T e mp o (min u to s )
FIGURA 8: Avaliação do efeito antiinflamatório dos extratos brutos da Capsicum chinense da
variedade Biquinho sobre o teste de edema de pata induzido por carragenina em
camundongos. O efeito do edema inflamatório dos extratos brutos da pimenta biquinho foi avaliado
em camundongos Swiss (n=5) submetidos ao pré-tratamento com diferentes doses dos extratos
brutos hexânicos (A) e etanólicos (B) (1, 5 e 15mg s.c) 15 minutos antes do estimulo do edema
(Carragenina 1%, 50µL s.p.). O controle negativo recebeu dexametasona 0,4mg/kg (100µL s.c.), 30
minutos antes do estímulo. Os animais foram avaliados pela mensuração das patas em diferentes
tempos (zero, 15, 30, 120, 240 minutos) utilizando o aparelho Pletismômetro de pata (EFF 304
INSIGHT). Os resultados estão expressos em volume (mL) pelo tempo de tratamento (media ±EPM) *
p<0,05 quando comparado ao grupo tratado com carragenina.
19
Quando avaliamos o efeito dos extratos hexânicos e etanólicos da variedade
Bode da C. chinense, observamos que similar a variedade biquinho, o extrato
hexânico foi capaz de inibir a atividade edematogênica da carragenina, com efeito
estatisticamente significativo na 2° hora, quando comparado ao grupo não tratado. A
intensidade da inibição foi similar aquela observada com a dexametasona (Figura 9,
painel A). De modo similar, os animais tratados com o extrato etanólico
apresentaram redução no edema estatisticamente significativa na 2° hora, quando
comparado ao grupo não tratado (Figura 9, painel B).
Similar ao observado com a variedade Bode, quando comparamos os dois
extratos, não houve diferença estatística (p<0,05) entre o extrato hexânico e
etanólico da variedade biquinho no pico do efeito antiedematogênico (120min).
Também não foram observadas diferenças estatisticamente significativas (p<0,05)
entre a atividade antiedematogênica das duas variedades de C. chinense.
20
A
0.25
Salina+Carragenina
Edema (ml)
Dexametasona
Bode hexano
0.20
0.15
0
30
60
90
120 150 180 210 240
Tempo (minutos)
B
0.25
Salina+Carragenina
Edema (ml)
Dexametasona
Bode etanol 5mg
0.20
0.15
0
30
60
90
120 150 180 210 240
Tempo (minutos)
FIGURA 9: Avaliação do efeito antiinflamatório dos extratos brutos da Capsicum chinense da
variedade Bode sobre o teste de edema de pata induzido por carragenina em camundongos. O
efeito do edema inflamatório dos extratos brutos da pimenta bode foi avaliado em camundongos
Swiss (n=5) submetidos ao pré-tratamento com diferentes doses dos extratos brutos hexânicos (A) e
etanólicos (B) (1, 5 e 15mg s.c) 15 minutos antes do estimulo do edema (Carragenina 1%, 50µL s.p.).
O controle negativo recebeu dexametasona 0,4mg/kg (100µL s.c.), 30 minutos antes do estímulo. Os
animais foram avaliados pela mensuração das patas em diferentes tempos (zero, 15, 30, 120, 240
minutos) utilizando o aparelho Pletismômetro de pata (EFF 304 INSIGHT). Os resultados estão
expressos em volume (mL) pelo tempo de tratamento (media ±EPM) * p<0,05 quando comparado ao
grupo tratado com carragenina.
21
Avaliação da Ação Analgésica
Efeito dos extratos brutos das variedades C. chinense sobre o número de
contorções abdominais induzidos por ácido acético em camundongos.
Substâncias químicas injetadas por via intraperitoneal induzem contorções
abdominais devido à sensibilização de nociceptores por prostaglandinas. Este teste
é útil para avaliar a analgesia moderada produzidas por compostos antiinflamatórios
(FERREIRA e VANE 1974). O teste de contorções abdominais demonstrou que o
extrato hexânico da variedade Bode da C. chinense foi capaz de reduzir o número
de contorções abdominais acumuladas em todas as doses administradas. A
magnitude da inibição foi a mesma em todas as doses, porem maior que aquela
observada nos animais tratados com AAS, sugerindo a marcante ação analgésica
desse extrato (Figura 10, painel A). Por outro lado, o extrato etanólico não foi capaz
de inibir as contorções abdominais nas doses utilizadas, indicando a ausência de
efeito analgésico (Figura 10, painel B).
B
100
100
80
60
*
40
20
#
*
0
ác. acético
AAS
1
#
*
5
Pimenta Bode
#
*
15 (mg)
N° de contorções abdominais
N° de contorções abdominais
A
80
60
*
40
20
0
ác. acético
AAS
1
5
15
Pimenta Bode
FIGURA 10: Avaliação do efeito antinociceptivo dos extratos brutos da Capsicum chinense da
variedade Bode por meio do teste de contorções abdominais em camundongos. O efeito
antinociceptivo dos extratos brutos da pimenta bode foi avaliado em camundongos Swiss (n=5)
submetidos ao pré-tratamento com diferentes doses dos extratos brutos hexânicos (A) e etanólicos
(B) (1, 5 e 15mg s.c) 15 minutos antes do estimulo da dor (ácido acético 0,8%, i.p.). O controle
negativo recebeu AAS 100mg/kg (100µL s.c.). Os animais foram avaliados pelo número de
contorções realizado durante 30 minutos após estímulo. Os resultados estão expressos em número
de contorções abdominais em diferentes tratamentos (media ±EPM) * p<0,05 quando comparados ao
grupo tratado com ácido acético 0,8%.
22
De modo similar ao observado com a variedade Bode, o extrato da pimenta
Biquinho é provido de ação analgésica (Figura 11, painel A). Entretanto, esse efeito
foi verificado apenas nas doses de 1mg e 15mg quando comparado ao grupo não
tratado. A ação analgésica foi similar aquela observada com AAS e de magnitude
menor quando comparado ao extrato hexânico da pimenta Bode. Por outro lado, o
extrato etanólico foi capaz de inibir as contorções abdominais apenas nas doses de
15mg (Figura 11, painel B). Esse efeito foi maior que aquele observado com o
tratamento com o AAS.
B
100
80
60
*
*
40
*
20
0
ác. acético
AAS
1
5
15 (mg)
Pimenta Biquinho
N° de contorções abdominais
N° de contorções abdominais
A
120
100
#
80
#
60
*
40
*#
20
0
ác. acético
AAS
1
5
15
Pimenta Biquinho
FIGURA 11: Avaliação do efeito antinociceptivo dos extratos brutos da Capsicum chinense da
variedade Biquinho por meio do teste de contorções abdominais em camundongos. O efeito
antinociceptivo dos extratos brutos da pimenta biquinho foi avaliado em camundongos Swiss (n=5)
submetidos ao pré-tratamento com diferentes doses dos extratos brutos hexânicos (A) e etanólico (B)
(1/5/15mg, s.c) 15 minutos antes do estimulo da dor (ácido acético 0,8%, i.p.). O controle negativo
recebeu AAS 100mg/kg (100µL s.c.). Os animais foram avaliados pelo número de contorções
realizado durante 30 minutos após estímulo. Os resultados estão expressos em número de
contorções abdominais em diferentes tratamentos (media ±EPM) * p<0,05 quando comparados ao
grupo tratado com ácido acético 0,8%.
Efeito dos extratos brutos das variedades de C. chinense sobre o teste de
formalina na pata de camundongos.
O teste de formalina é um modelo validado para avaliação de nocicepção e é
sensível para diversas classes de drogas analgésicas. Dois períodos distintos da
atividade de lamber podem ser identificados, uma fase precoce durando os primeiros
5 minutos e uma fase tardia com duração de 20 a 30 minutos após a injeção de
formalina. Foi demonstrado que as duas fases no teste de formalina podem ter
23
diferentes mecanismos nociceptivos. Sugere-se que a fase inicial é devido a um
efeito direto sobre nociceptores e que as prostaglandinas não desempenham um
papel importante durante esta fase. A fase tardia parece ser uma resposta
inflamatória, com dor inflamatória que pode ser inibida por drogas antiinflamatórias.
Apenas drogas analgésicas de ação central são efetivas na inibição da fase da
nocicepção (HUNSKAAR 1987).
A figura 12 representa a avaliação do efeito analgésico do extrato etanólico da
variedade biquinho da C. chinense. Nossos resultados demonstram que nenhuma
das concentrações usadas foi capaz de reduzir a nocicepção na fase 1, sugerindo a
ausência de efeitos analgésicos centrais do extrato. Entretanto na fase 2, o extrato
etanólico apenas na dose de 5mg foi capaz de reduzir a resposta nociceptiva
deflagrada pela formalina, quando comparado ao grupo tratado com AAS.
Número de Lambidas
140
120
Fase 1
Fase 2
#
100
80
60
40
*
*
20
0
Formol
AAS
1mg
5mg
15mg
Pimenta Biquinho
FIGURA 12: Avaliação do efeito antinociceptivo dos extratos brutos da Capsicum chinense da
variedade Biquinho por meio do teste de Lambidas induzidas por formalina em camundongos.
O efeito antinociceptivo do extrato bruto da pimenta biquinho foi avaliado em camundongos Swiss
(n=5) submetidos ao pré-tratamento com diferentes doses do extrato bruto etanólico (1/5/15mg, s.c)
15 minutos antes do estimulo da dor (Formalina 2,5%, s.p.). O controle negativo recebeu AAS
100mg/kg (100µL s.c.). Os animais foram avaliados pelo número de lambidas em duas fases, 1°fase
durante os 5 primeiros minutos (pausa de 10 minutos), 2° fase observa-se durante 15 minutos, em um
total de 30 minutos após estímulo. Os resultados estão expressos em número de lambidas em
diferentes tratamentos (media ±EPM) * p<0,05 quando comparados ao grupo tratado com formalina
2,5%.
24
A avaliação do efeito analgésico do extrato etanólico da variedade bode da C.
chinense (Figura 13) demonstrou que esse extrato nas doses avaliadas não foi
capaz de reduzir a resposta nociceptiva nas fases 1 e 2 induzidas pela formalina.
Número de Lambidas
140
120
Fase 1
Fase 2
#
100
80
60
40
*
20
0
Formol
AAS
1mg
5mg
15mg
Pimenta Bode
FIGURA 13: Avaliação do efeito antinociceptivo dos extratos brutos da Capsicum chinense da
variedade Bode por meio do teste de Lambidas induzidas por formalina em camundongos. O
efeito antinociceptivo do extrato bruto da pimenta bode foi avaliado em camundongos Swiss (n=5)
submetidos ao pré-tratamento com diferentes doses do extrato bruto etanólico (1/5/15mg, s.c) 15
minutos antes do estimulo da dor (Formalina 2,5%, s.p.). O controle negativo recebeu AAS 100mg/kg
(100µL s.c.). Os animais foram avaliados pelo número de lambidas em duas fases, 1°fase durante os
5 primeiros minutos (pausa de 10 minutos), 2° fase observa-se durante 15 minutos, em um total de 30
minutos após estímulo. Os resultados estão expressos em número de lambidas em diferentes
tratamentos (media ±EPM) * p<0,05 quando comparados ao grupo tratado com formalina 2,5%.
Avaliação da atividade hemolítica dos extratos brutos das variedades de
C. chinense em eritrócitos humanos.
Objetivando a avaliação da atividade citotóxica inicial, foram realizados os
ensaios de atividade hemolítica. Na figura 14 estão representados os resultados
obtidos com os extratos hexânico e etanólico da variedade biquinho da C. chinense.
Nossos resultados demonstraram que o extrato hexânico nas doses de 1, 3 e 5mg e
o extrato etanólico na dose de 1mg apresentaram atividade hemolítica similar ao
grupo incubado com salina. O extrato etanólico nas doses de 3 e 5mg induziram
hemólise estatisticamente maior que o grupo salina, mas inferior aquela observada
com o controle positivo incubado com Triton-X.
25
140
Hemólise (%)
120
100
80
*#
60
40
*
20
0
*
Triton Sal.
*
1
*#
*
*
3
5
Hexânico
1
3
5 (mg)
Etanólico
Pimenta Biquinho
FIGURA 14: Avaliação da atividade hemolítica dos extratos brutos da Capsicum chinense
variedade Biquinho sobre eritrócitos humanos. O efeito da atividade hemolítica dos extratos
brutos da pimenta biquinho foi avaliado em eritrócitos humanos. Em placa de 96 poços, foram
adicionados 100µL de cada extrato (hexânico e etanólico) em diferentes doses (1/3/5mg). O controle
negativo foi Salina 0,9% (100 µL) e o controle positivo foi Triton X-100 (5µL diluídos em 95µL de água
Milli-Q). A análise foi realizada em espectrometria na absorbância de 540nm. Os resultados estão
expressos em porcentagem de hemólise (media ±EPM) #*p<0,05 quando comparados aos grupos
controles salina 0,9% e Triton X-100.
Os extratos da figura 15 não apresentaram efeitos hemolíticos sobre as
hemácias em todas as concentrações (1, 3 e 5mg) quando comparados ao controle
positivo (Triton), mas quando comparados ao controle negativo (Salina), as
concentrações 3mg e 5mg do extrato etanólico mostram-se hemolíticas.
26
140
Hemólise (%)
120
100
80
*#
60
*#
40
20
*
0
Triton Sal.
*
1
*
*
3
5
Hexânico
*
1
3
5 (mg)
Etanólico
Pimenta Bode
FIGURA 15: Avaliação da atividade hemolítica dos extratos brutos da Capsicum chinense
variedade Bode sobre eritrócitos humanos. O efeito da atividade hemolítica dos extratos brutos da
pimenta bode foi avaliado em eritrócitos humanos. Em placa de 96 poços, foram adicionados 100µL
de cada extrato (hexânico e etanólico) em diferentes doses (1/3/5mg). O controle negativo foi Salina
0,9% (100 µL) e o controle positivo foi Triton X-100 (5µL diluídos em 95µL de água Milli-Q). A análise
foi realizada em espectrometria na absorbância de 540nm. Os resultados estão expressos em
porcentagem de hemólise (media ±EPM) #*p<0,05 quando comparados aos grupos controles salina
0,9% e Triton X-100.
DISCUSSÃO
Os seres humanos há muitas gerações têm usado plantas empregadas como
especiarias na alimentação e no tratamento de diversas doenças, sendo que
estudos já realizados demonstraram a variedade de plantas e seus constituintes com
propriedades farmacológicas (SIMÔES 2001). As plantas medicinais apresentam
uma ampla diversidade de constituintes denominados de metabólitos primários e
secundários. Os metabólitos secundários mais presentes nas plantas são terpenos,
glicosídeos, alcalóides, dentre outros, apresentando diferentes atividades biológicas.
(RATES 2001; SIMÕES 2001), nesse contexto, as pimentas produzem metabólitos
secundários característicos de cada espécie.
O grupo de pimentas é classificado em dois gêneros dentro do Reino Plantae,
o gênero Piper e o gênero Capsicum, as quais apresentam como princípio ativo o
alcalóide piperina e capsaicina, respectivamente. O Gênero Piper, da família
Piperaceae, é representado pela pimenta-do-reino, apresentando modificações nos
grãos. (BONTEMPO 2007). A piperina é funcionalmente semelhante a capsaicina.
27
Estudos revelam que a piperina apresenta alguns efeitos biológicos, como
antitireoidiano, antidepressivo e antitumoral (PRADEEP et al. 2002; SRINIVASAN
2007; SUNILA et al. 2004). Ensaios in vitro demonstram que a piperina apresenta
potencial efeito antioxidante e anti-apoptótico. Assim a piperina é capaz de inibir a
geração de espécies reativas de oxigênio, com importante papel no controle do
estresse oxidativo. Mostrou também um grande potencial anti-apoptótico em células
do baço, reduzindo o índice de apoptose inibindo a ação da caspase-3 mantendo os
níveis de Bcl-2, proteína associada a integridade da membrana mitocondrial
(PATHAK et al. 2007). Outros estudos revelam que a piperina quando administrada
no choque séptico, induzido por LPS foi capaz de aumentar a taxa de sobrevida dos
animais experimentais, provavelmente devido à ação imunomoduladora, visto que a
produção dos mediadores inflamatórios como o TNF-α, IFN-α e IFN-β foi inibida pela
piperina (BAE et al. 2010).
O gênero Capsicum, pertencente à família Solanaceae. Estudos utilizando
extratos etanólicos e metanólicos de plantas dessa família demonstram que esses
apresentam atividades analgésicas e antiinflamatórias (JIMOH et al. 2011). A família
Solanaceae compreende muitas espécies empregadas na alimentação, e são
produtoras de substâncias de uso farmacêutico, como atropina e hiosciamina,
isoladas de Atropa belladoma L. e Hyocyamus niger L. (AGRA 2000).
Pesquisas
recentes
com
pimentas
do
gênero
Capsicum
evidenciam
propriedades as farmacológicas de algumas espécies, por exemplo, o extrato
etanólico e butanólico da C. baccatum mostrou-se provido de ação antiinflamatória
no modelo de pleurisia induzida por carragenina e efeito antioxidante pelo método
DPPH (ZIMMER et al. 2012). Outro estudo com extrato metanólico da espécie C.
annuum revelou que o tratamento oral reduziu a inflamação alérgica das vias aéreas
em camundongos, diminuindo também as espécies reativas de oxigênio (JANG et al.
2011). Os dados encontrados na literatura corroboram nossos resultados quanto a
avaliação da atividade anti-inflamatória de duas variedades de pimenta Capsicum
chinense, as quais foram capazes de inibir a migração de neutrófilos para a
cavidade peritoneal e o edema de pata em camundongos.
Similar ao encontrado em nossos estudos, onde ambas as variedades
apresentaram atividade antinociceptiva, estudos com o extrato metanólico das folhas
da Capsicum frutescens demonstrou inibição dose dependente das contorções
28
abdominais induzidas por ácido acético e ausência do efeito no teste de placa
quente, indicando que a ação antinociceptiva do extrato não ocorre participação de
mecanismos centrais, e sim por mecanismos anti-inflamatórios (PIRES et al. 2004).
Esses efeitos são similares aos apresentados em nosso trabalho, onde a C.
chinense, nas variedades Bode e Biquinho, apresentaram ação antiinflamatória e
antinociceptiva. Entretanto o perfil dessas ações farmacológicas tenham sido distinto
entre as duas variedades, sugerindo diferenças qualitativas e quantitativas na
composição química desses frutos.
Os frutos são as partes mais variáveis entre as espécies e cultivares do gênero
Capsicum, com diferenças na forma, cor, e grau de pungência (LORENZI et al.
2008). KAPPEL e colaboradores (2008) avaliaram frutos maduros e imaturos quanto
à presença de compostos fenólicos em pimentas do gênero C. baccatum, e
demonstraram que a quantidade de fenóis varia de acordo com o estágio de
maturação, sugerindo mudanças fisiológicas e bioquímicas, entretanto ambas
formas de maturação da pimenta apresentaram atividade antioxidante. Também foi
demonstrado que a atividade antioxidante de frutos da espécie Capsicum annuum
foi variável de acordo com o grau de pungência das pimentas, onde o teor maior de
vitamina E e β-caroteno foi encontrado em frutos mais doces em relação aos
picantes (PERUCKA et al. 2007). As pimentas Bode e Biquinho usadas em nosso
estudo apresentam diferenças na pungência, onde a pimenta biquinho é de
pungência doce e com aroma forte, já a pimenta bode, ao contrário, é de pungência
forte e aroma forte (REIFSCHNEIDER 2000). Apesar dessas diferenças, ambas
mostraram atividade antiinflamatória e analgésica semelhantes, quando comparados
os efeitos dos extratos com mesmo solvente de extração.
Na placenta dos frutos estão presentes os capsaicinóides, grupo de
substâncias responsáveis pela pungência das pimentas e grande parte dos efeitos
farmacológicos (REIFSCHNEIDER 2000). Dentro do grupo dos capsaicinóides
podemos destacar a capsaicina, a dihidrocapsaicina e a nordihidrocapsaicina
(SIMÕES et al. 2001).
O capsaicinóide mais utilizado para o alívio da dor é a capsaicina. Estudos
revelam que pacientes com osteoartrite tratados por via oral ou tópico, com
capsaicina demonstraram redução na inflamação e na analgesia da dor de artrite
reumatóide (FRAENKEL et al. 2004). A capsaicina interage com receptores
29
nociceptivos ou receptores vanilóides, o mais estudado é o TRPV1, canal presente
na membrana plasmática e encontrado em neurônios sensíveis ao calor (LUO et al.
2011).
A extração de compostos ativos de plantas depende do tipo de solvente
utilizado, por exemplo, o hexano sendo um solvente apolar remove lipídeos,
carotenóides e clorofila, enquanto o metanol e etanol, como solventes polares
extraem açucares, ácidos orgânicos e fenóis de baixo peso molecular. O acetato de
etila e éter dietílico extraem fenóis de baixo peso molecular, enquanto a acetona
extrai fenóis poliméricos. Assim os capsaicinóides por serem fenóis são
majoritariamente extraídos com uso de solventes polares (MOURE et al. 2001).
Entretanto COSTA e colaboradores (2009) realizaram a quantificação dos
capsaicinóides em extratos e frações das espécies C. frutescens (malagueta), C.
annuum var. annuum (pimentão magali), C. baccatun var. praetermissum (cumari),
demonstrando amplas variações nas concentrações desses capsaicinóides. Os
extratos brutos e as frações hexânicas da C. frutescens e da C. baccatun
apresentaram menor concentração de capsaicinóides, sendo que a fração
clorofórmica da C. baccatun apresentou a maior concentração entre as frações e
extratos testados. Esses dados sugerem as diferenças entre os capsaicnoides.
Visto que os extratos hexânicos da variedade Bode e Biquinho foram mais
efetivos no controle da inflamação e da dor em relação aos extratos etanólicos,
podemos sugerir que outros compostos além dos capsaicinóides são responsáveis
pelos efeitos observados. Com base nesses dados, podemos sugerir que em nossos
extratos hexânicos estejam presente outros compostos além dos capsaicinóides
presentes. Nesse contexto SHINTAKU e colaboradores (2012) demonstraram a
existência de outro grupo, os capsinóides, com principal representante o composto
capsiato, encontrado em pimentas vermelhas não pungentes como a Capsicum
annuun. Similar a capsaicina, o capsiato é capaz de aumentar o metabolismo por
estimulação do sistema nervoso simpático, além de ser provido de ação
antiinflamatória, porém por mecanismo ainda não esclarecido. Foi demonstrado que
o capsiato também é capaz de estimular receptores vanilóides (TRPV1), o qual
também é alvo da capsaicina e responsável por seus efeitos analgésicos e
antiinflamatórios (ALTIER et al. 2004).
30
Os medicamentos derivados de plantas apresentam uma boa aceitação da
população, mesmo presente na indústria farmacêutica apenas uma parcela dos
produtos derivados de plantas medicinais. Estudos comprovando a eficácia e os
aspectos toxicológicos garantindo a qualidade desses produtos ainda são escassos
(RATES 2001). Qualquer substância pode ser considerada tóxica, dependendo das
condições de exposição, da quantidade administrada ou absorvida, o tempo e a
freqüência e também as vias de administração. Essas características determinam o
potencial toxicológico de uma determinada substância (VALENTE et al. 2009).
Estudos revelam que extratos da pimenta malagueta (C. frutescens) não apresentou
toxicidade frente aos testes em hemácias suínas e ao teste de presença de botão de
hemácias (CARBONERA 2010), podendo correlacionar aos nossos resultados de
toxicidade em hemácias humanas. Nossos extratos apresentaram atividade
hemolítica menor quando comparados ao controle Triton-X, revelando resultado
similar quando comparados ao controle salina. Sugerimos que outros testes de
citotoxicidade sejam realizados para comprovarmos a não toxicidade das pimentas.
Embora a importância dos princípios ativos de pimentas esteja bem
documentado na literatura e seja alvo para o delineamento de novas drogas,
estudos avaliando a composição química das diferentes variedades de pimentas
dentro de uma mesma espécie ainda são escassos e podem revelar a existência de
novos compostos com potencial aplicação terapêutica.
CONCLUSÕES
Com base nos dados, podemos concluir que os extratos das variedades (bode
e biquinho) da Capsicum chinense Jacq. revelaram atividades analgésicas e antiinflamatórias similares, não apresentando toxicidade em eritrócitos, sendo
necessários estudos mais aprofundados para a verificação dos compostos
existentes em ambos os extratos das variedades.
31
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36
Artigo 2: AVALIAÇÃO DA INATIVAÇÃO OU MORTE DE JUVENIS
NEMATÓIDES DA ESPÉCIE Meloidogynes incognita EXPOSTOS
AOS EXTRATOS DE Capsicum chinense Jacq
RESUMO: Culturas agrícolas são atacadas por pragas, doenças e parasitas
causando grandes perdas nas plantações. Dentre os parasitas, o mais importante
são os nematóides do gênero Meloidogynes, conhecidos também como nematóides
de galhas. Entretanto, os danos causados por esse parasita impedem o
desenvolvimento da planta, pois forma galhas nas raízes, local nutritivo dos
parasitas. O combate aos fitonematoides é realizado com produtos químicos e
nematicidas, mas estes foram proibidos devido aos danos causados ao meio
ambiente e ao homem. Diante disso, várias alternativas vêm sendo estudadas,
inclusive extratos de plantas como forma de bioinseticidas. A Capsicum chinense é
representada por pimentas, e são fontes de substâncias produzidas por metabólitos
secundários, dentre eles a capsaicina. O objetivo deste estudo foi avaliar a
inativação ou morte de juvenis nematóides da espécie Meloidogynes incógnita
expostos aos extratos de duas variedades de Capsicum chinense. Os extratos dos
frutos das variedades foram obtidos pelo método de extração utilizando o solvente
etanol, e após concentrados foram roto evaporados a 60°. As concentrações foram
diluídas em água Milli-Q e centrifugadas para a obtenção da parte solúvel do extrato.
Foram extraídos ovos de nematóides das raízes de Tomateiro, e armazenados em
água destilada até que os ovos eclodam. Os nematóides jovens foram expostos a
diferentes concentrações (250µg, 350 µg, 400 µg, 500 µg, 1mg) dos extratos
etanólicos das variedades da Capsicum chinense, e analisados em câmara de
Neubauer após 48 horas de exposição. Os resultados demonstraram que os extratos
etanólicos, em todas as concentrações, das duas variedades (biquinho e bode)
paralisaram/inativaram os juvenis nematóides sugerindo que os extratos apresentam
ação nematostática, devido aos nematóides voltarem à mobilidade após a reanálise.
Conclui-se que as variedades da Capsicum chinense apresentam substâncias
nematostáticas, sugerindo uma alternativa no combate desse parasita.
Palavras-chave: Capsicum chinense, Meloidogynes incógnita, nematostático.
INTRODUÇÃO
As culturas agrícolas de interesse comercial sofrem grandes perdas causadas
por diferentes fitopatógenos. Estimativas atuais mostram que as perdas chegam a
14%, mesmo com a utilização dos sistemas de proteção disponíveis. (ALMEIDA,
2007).
Os parasitas mais importantes em plantações, sendo responsáveis por grandes
perdas em culturas agrícolas em todo mundo (KIEWNICK, 2006), são os nematóides
do gênero Meloidogynes spp, conhecidos também como nematóides de galhas
37
(CHARCHAR et al. 2005). Estes são parasitas de aproximadamente 2000 espécies,
se hospedando em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, plantas herbáceas e
lenhosas. As plantas nativas do Cerrado são hospedeiras das inúmeras espécies de
Meloidogynes.
As manifestações com os nematóides são comuns em solos do
cerrado do Centro-Oeste do Brasil, causando prejuízos de até 100% na
produtividade das plantações (Charchar e Moita, 1997). Esses parasitas causam
danos às plantas hospedeiras ao formarem as galhas nas raízes. A saliva do
parasita, ao penetrar as raízes, introduz uma secreção esofagiana, causando a
hipertrofia das células e a hiperplasia no periciclo, originando as células gigantes,
fonte nutritiva dos nematodos (BRASS, et al., 2008).
Uma das formas mais utilizadas no controle destes parasitas é o uso de
nematicidas sintéticos, na qual estes foram proibidos totalmente ou somente uso
restrito devido aos impactos negativos causados ao homem e ao meio ambiente
(NICO, et al., 2004). Entretanto, várias alternativas ecologicamente sustentáveis são,
atualmente, avaliadas em todo mundo para combater ou controlar os fitonematóides.
Uma das alternativas são extratos de diferentes espécies e diversas partes de
plantas como matéria prima para a produção de nematicidas naturais (Ferris et al.
1999).
O Gênero Capsicum pertence à Família Solanacea e é representada por
pimentas e pimentões. As pimentas são especiarias originadas da América,
cultivadas em todo mundo atualmente. No entanto, o gênero Capsicum é
representado por cinco espécies domesticadas: Capsicum annuum L., Capsicum
baccatum L., Capsicum chinense Jacq., Capsicum frutescens L. e Capsicum
pubescens (CARVALHO et al. 2004).
A espécie Capsicum chinense Jacq. é bastante encontrada nas regiões do
Sudeste, Sul e Centro-oeste. Entretanto existem poucas informações cientificas
sobre seus componentes e suas atividades. Estas produzem metabólitos
secundários, dentre eles os capsaicinóides, principal substância contida nas
pimentas desta espécie, cuja concentração é variável entre as espécies e as
variedades de uma mesma espécie (PERUCKA, et al., 2007). O mais estudado dos
capsaicinóides é a capsaicina, presente nas sementes e membranas dos frutos das
pimentas, responsável pelo sabor picante (BONTEMPO 2007). Este composto
38
possui propriedades farmacológicas como a ação mucolítica, termogênica,
antiinflamatória e analgésica (PERUCKA, et al., 2007).
Algumas plantas utilizam como defesa de inimigos, pragas e insetos a
produção de metabólitos secundários. A quantidade produzida depende das
condições de cultivo da planta, tipo de espécie e suas variedades, e a temperatura,
podendo ser relacionado ao potencial de perigo e toxicidade aos usuários.
Entretanto, produtos naturais apresentam uma rica fonte de compostos a serem
explorados
na
seleção
de
novos
defensivos
agrícolas.
Suas
principais
características são a baixa toxicidade para humanos, com baixo impacto ambiental e
baixa quantidade de resíduos em alimentos (LOVATTO et al. 2004).
Desse modo, o objetivo do presente estudo foi avaliar a inativação ou morte de
juvenis nematóides da espécie Meloidogynes incognita expostos aos extratos brutos
das variedades de Capsicum chinense Jacq. como forma alternativa de nematicidas.
MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Preparo dos extratos brutos etanólicos
Os frutos das duas variedades (biquinho e bode) foram adquiridos no Mercado
Municipal de Campo Grande – MS e as exsicatas depositadas no Herbário da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul com o número de registro 29236 e
33633, respectivamente.
Aproximadamente 2 kg dos frutos foram lavados e secos em estufa com
circulação de ar, macerados e submetidos a extração por maceração a frio até o
esgotamento por etanol, e concentrados em evaporador rotatório, obtendo-se os
respectivos extratos. Assim, os extratos foram distribuídos em diferentes
concentrações (250µg, 350µg, 400µg, 500µg, 1mg), e diluídos com água ultra-pura e
centrifugados (13000 rpm/5min) para a separação das fases. A fase solúvel foi
separada para a realização do teste.
O preparo dos extratos foi realizado no Laboratório de Farmacologia e
Mutagênse da Universidade Católica Dom Bosco em Campo Grande-MS.
2.2 Avaliação dos extratos brutos sobre juvenis nematóides “in vitro”
39
A metodologia aplicada foi de acordo com CHARCHAR e colaboradores
(2006), realizada na EMBRAPA CENARGEM de Brasília-DF no laboratório de
Biotecnologia.
Os nematóides utilizados foram Meloidogynes incognita, extraídos de raízes de
Tomates TSW-10. As raízes com presença de galhas foram coletadas, cortadas em
pedaços e trituradas em liquidificador juntamente com uma solução hipoclorito 0,5%
(NaOCl). Os extratos de raízes foram filtrados em peneiras, e estas deixadas em
vasilhas com água destilada para a eclosão dos ovos de nematóides. Estes são
contados em câmara de Neubawer para estabelecer um número de nematóides
antes do teste.
Os
nematóides
foram
colocados
em
tubos
eppendorfs
(1,5mL),
aproximadamente 60 (50µL), juntamente com diferentes concentrações (250µg,
350µg, 400µg, 500µg, 1mg) da parte solúvel dos extratos brutos etanólicos da
pimenta bode e da pimenta biquinho. O volume foi completado para 1mL com água
ultra-pura, sendo deixados em temperatura ambiente por 48 horas para a avaliação
dos nematóides. Os nematóides vivem a uma temperatura ótima entre 10° - 30°C.
A análise dos nematóides foi realizada em câmara de Neubauer, observando
a paralisação/inativação ou a mobilidade dos mesmos. Após esta análise foi feita a
reanálise das amostras com nematóides paralisados/inativados, centrifugando-os a
3000rpm/5min, descartando o sobrenadante e adicionando 1mL de água ultra-pura e
deixando-os por mais 48 horas em temperatura ambiente. Após a segunda análise
dos nematóides, se esses voltassem a mover-se, o extrato é considerado com ação
nematostática, nos casos onde os nematóides permanecerem paralisados na
segunda avaliação o extrato é considerado nematicida.
Os resultados foram calculados de acordo com a fórmula:
n° paralisados X n° total colocado
n° total contados (móveis e paralisados)
RESULTADOS
. Na figura 16, os juvenis nematóides foram expostos a parte solúvel dos
extratos da variedade biquinho, em diferentes concentrações (250/350/400/500ug e
40
1mg). O painel A representa a análise realizada por 48 horas de exposição aos
extratos. O extrato da variedade biquinho apresentou resultados significativos de
paralisação dos nematóides quando comparados ao controle com água ultra-pura.
No painel B está representada a segunda análise das amostras, onde observamos
que os nematóides apresentaram mobilidade em todas as concentrações indicando
que o extrato da variedade biquinho tem propriedades nematostática.
B
A
70
*
60
*
*
*
*
50
40
30
20
10
0
Água
250
350
400
500 (ug) 1mg
Pimenta Biquinho
Móveis
Paralisados
Número de nematóides
Número de nematóides
70
60
Móveis
Paralisados
50
40
30
20
#
10
#
#
#
#
0
Água
250
350
400
500(ug) 1mg
Pimenta Biquinho
FIGURA 16: Análise e Reanálise da inativação ou morte de juvenis nematóides expostos ao
extrato bruto da Capsicum chinense variedade Biquinho. A análise (A) dos juvenis nematóides
como inativados ou mortos ocorreu após serem expostos a diferentes concentrações
(250/350/400/500ug e 1mg) da parte solúvel do extrato bruto etanólico da pimenta biquinho, sendo
avaliados após 48 horas de exposição, contendo aproximadamente 60 nematóides. A reanálise (B)
dos nematóides foi realizado após a leitura e observado nematóides paralisados nas amostras. Esta
avaliação foi realizada centrifugando os tubos eppendorfs (3000 rpm por 5 minutos) e descartando o
sobrenadante e adicionando ao pellet áqua ultra-pura, armazenando novamente por 48 horas. Os
nematóides foram avaliados em câmara de Neubauer em microscópio óptico na objetiva de 40 vezes,
classificando-os em paralisados/inativados ou móveis. Os resultados estão expressos em número de
nematóides paralisados ou móveis (média ±EPM) *p<0,05 quando comparados ao grupo controle
tratado com água ultra-pura.
Objetivando avaliar a termoestabilidade do extrato da variedade biquinho da C.
chinense, esse foi aquecido overnight (50°) e as diferentes concentrações
(250/350/400/500ug e 1mg) empregadas nos ensaios. Na figura 17, painel A, similar
ao descrito anteriormente, observa-se que os nematóides expostos aos extratos
aquecidos apresentam-se paralisados, com resultados significativos em todas as
concentrações avaliadas quando comparados ao controle (água ultra-pura). A
reanálise destas amostras (painel B) mostrou que os nematóides expostos ao
extrato aquecido apresentaram-se móveis na segunda avaliação. Os resultados
sugerem que não houve alterações químicas e nas ações do extrato induzidas pelo
calor.
41
B
A
70
*
60
*
*
*
*
50
N ú m e ro d e n e m a tóid es
N ú m e ro d e n e m a tóid es
70
M ó ve is
P a ra lis a d o s
40
30
20
10
60
M ó ve is
50
P a ra lis a d o s
40
30
20
10
#
#
0
#
#
#
0
Água
250
350
400
5 0 0 (u g ) 1 mg (5 0 °)
Água
250
P im e n ta B iq u in h o
350
400
5 0 0 (u g ) 1 mg (5 0 °)
P im e n ta B iq u in h o
FIGURA 17: Análise e Reanálise da inativação ou morte de juvenis nematóides expostos ao
extrato bruto aquecido da Capsicum chinense variedade Biquinho. A análise (A) dos juvenis
nematóides como inativados ou mortos ocorreu após serem expostos a diferentes concentrações
(250/350/400/500ug e 1mg) da parte solúvel do extrato bruto etanólico da pimenta biquinho, mantidos
overnight a 50°C, sendo avaliados após 48 horas de exposição, contendo aproximadamente 60
nematóides. A reanálise (B) dos nematóides foi realizado após a leitura e observado nematóides
paralisados nas amostras. Esta avaliação foi realizada centrifugando os tubos eppendorfs (3000 rpm
por 5 minutos) e descartando o sobrenadante e adicionando ao pellet áqua ultra-pura, armazenando
novamente por 48 horas. Os nematóides foram avaliados em câmara de Neubawer em microscópio
óptico na objetiva de 40 vezes, classificando-os em paralisados/inativados ou móveis. Os resultados
estão expressos em número de nematóides paralisados ou móveis (média ±EPM) *p<0,05 quando
comparados ao grupo controle tratado com água ultra-pura
B
A
70
*
60
*
*
*
*
50
M ó ve is
P a ra lis a d o s
40
30
20
10
0
Água
250
350
400
5 0 0 (u g )
P im enta B ode
1mg
N úm ero de nem atóides
N úm ero de nem atóides
70
60
M ó ve is
50
P a ra lis a d o s
40
30
20
10
0
Água
250
350
400
5 0 0 (u g ) 1 m g
P im enta B ode
FIGURA 18: Análise e Reanálise da inativação ou morte de juvenis nematóides expostos ao
extrato bruto da Capsicum chinense variedade Bode. A análise (A) dos juvenis nematóides como
inativados ou mortos ocorreu após serem expostos a diferentes concentrações (250/350/400/500ug e
1mg) da parte solúvel do extrato bruto etanólico da pimenta bode, sendo avaliados após 48 horas de
exposição, contendo aproximadamente 60 nematóides. A reanálise (B) dos nematóides expostos a
parte solúvel do extrato bruto da pimenta bode em diferentes concentrações (250/350/400/500ug e
1mg) foi realizado após a leitura e observado nematóides paralisados nas amostras. Esta avaliação
foi realizada centrifugando os tubos eppendorfs (3000 rpm por 5 minutos) e descartando o
sobrenadante e adicionando ao pellet áqua ultra-pura, armazenando novamente por 48 horas. Os
nematóides foram avaliados em câmara de Neubawer em microscópio óptico na objetiva de 40 vezes,
classificando-os em paralisados/inativados ou móveis. Os resultados estão expressos em número de
nematóides paralisados ou móveis (média ±EPM) *p<0,05 quando comparados ao grupo controle
tratado com água ultra-pura.
42
Na figura 18 (A e B) os nematóides foram expostos a parte solúvel do extrato
da variedade bode da
Capsicum chinense,
em diferentes concentrações
(250/350/400/500ug e 1mg). A análise (painel A) dos Meloidogynes expostos ao
extrato evidenciou a paralisação em todas as concentrações, sendo significativo
quando comparados ao controle com água ultra-pura. No painel B, foi realizada a
reanálise das amostras, onde observamos também efeito nematostático em todas as
concentrações do extrato da variedade bode, visto que os nematóides apresentaram
mobilidade no momento da avaliação. Porém houve diferença quanto a magnitude
do efeito nematostático, visto que nas concentrações de 1mg o extrato da variedade
bode foi capaz de manter um maior numero de nematóides paralisados.
B
A
70
*
60
*
*
*
*
M ó ve is
50
P a ra lis a d o s
40
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N úm ero de nem atóides
N úm ero de nem atóides
70
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M ó ve is
50
P a ra lis a d o s
*
40
30
20
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0
Água
250
350
400
5 0 0 (u g ) 1 mg
P im e n ta B o d e
(5 0 °C )
0
Água
250
350
400
5 0 0 (u g ) 1 m g
(5 0 °C )
P im enta B ode
FIGURA 19: Análise e Reanálise da inativação ou morte de juvenis nematóides expostos ao
extrato bruto da Capsicum chinense variedade Bode. A análise (A) dos juvenis nematóides como
inativados ou mortos ocorreu após serem expostos a diferentes concentrações (250/350/400/500ug e
1mg) da parte solúvel do extrato bruto etanólico da pimenta bode, mantidos overnight a 50°C, sendo
avaliados após 48 horas de exposição, contendo aproximadamente 60 nematóides. A reanálise (B)
dos nematóides expostos a parte solúvel do extrato bruto da pimenta bode em diferentes
concentrações (250/350/400/500ug e 1mg) mantidas overnight a 50°C, foi realizado após a leitura e
observado nematóides paralisados nas amostras. Esta avaliação foi realizada centrifugando os tubos
eppendorfs (3000 rpm por 5 minutos) e descartando o sobrenadante e adicionando ao pellet áqua
ultra-pura, armazenando novamente por 48 horas. Os nematóides foram avaliados em câmara de
Neubawer em microscópio óptico na objetiva de 40 vezes, classificando-os em paralisados/inativados
ou móveis. Os resultados estão expressos em número de nematóides paralisados ou móveis (média
±EPM) *p<0,05 quando comparados ao grupo controle tratado com água ultra-pura.
Na figura 19 a avaliação (painel A) dos nematóides expostos ao extrato da
pimenta bode aquecido overnight a 50°, apresentou resultados de paralisação em
todas as concentrações utilizadas, mostrando-se significativo quando comparado ao
controle com água ultra-pura. A reanálise (painel B) dos nematóides apresentou
parasitas móveis, demonstrando assim que o extrato manteve efeito nematostático
sobre os nematóides em todas as concentrações do extrato da pimenta bode,
observando que na maior concentração (1mg) alguns nematóides permaneceram
paralisados, similar ao observado com o extrato não aquecido.
43
DISCUSSÃO
O controle dos nematóides com o uso de nematicidas químicos é uma das
primeiras formas de controle, mas estes apresentam impactos negativos causados
ao homem e ao meio ambiente (Nico 2004). Atualmente várias opções são avaliadas
para o desenvolvimento de alternativas ecologicamente sustentáveis para o controle
dos fitonematoides, dentre elas o controle biológico com o uso de plantas
antagônicas, extratos de diferentes espécies de plantas medicinais, rotação de
culturas e cultivares resistentes (CHARCHAR et al. 2005).
Com isso, uma alternativa para o combate dos fitonematóides são as pimentas
devido as suas características. O gênero Capsicum, é representado por pimentas e
pimentões encontrados em várias regiões do Brasil, principalmente no Centro-Oeste.
Este gênero produz metabólitos secundários, dentre eles, o mais conhecido grupo
dos capsaicinóides (LORENZI et al. 2008) podendo ser usados na defesa de plantas
contra pragas, insetos e doenças.
Estudos revelam que uma das alternativas no combate de nematóides é o
porta-enxerto resistentes, um método efetivo para plantas parasitadas por
nematóides. Estudos de porta-enxertos de diferentes acessos de Capsicum spp, e
cultivares foram testados quanto à resistência a M. incógnita e M. javanica. Os
resultados deste estudo revelaram que acessos de C. frutescens são altamente
resistentes a espécies de Meloidogynes. As diferentes espécies de Capsicum
referenciadas neste estudo (C. chacoense, Charleston quente e C. annuum)
apresentaram maior resistência ao Meloidogyne incógnita apresentando quantidades
pequenas de galhas nas raízes (OKA 2004). Entretanto, alternativas para
nematicidas são necessários, entre elas, a resistência da planta hospedeira,
fornecendo eficácia, economia e ambientalmente o controle de nematóides. Outros
estudos isolaram genes de plantas resistentes ao parasita. Os genes isolados da
Capsicum annuum, mostraram-se altamente específicos e outros foram eficazes
contra uma variedade de espécies de Meloidogynes. O gênero Capsicum, pertence
a família Solanaceae, a qual estudos revelam resistência aos fitonematoides,
geralmente associada à hipersensibilidade. (DJIAN-CAPORALINO 1999).
PEGARD e colaboradores (2005) revelaram em seus estudos que as diferentes
espécies de Meloidogynes apresentaram penetrações diferenciadas nas raízes. Os
dados demonstraram que pimentas originadas no México (Criollo de morelos)
44
apresentam dois tipos de resistência a Meloidogynes, uma é suprimindo a
penetração dos juvenis e a outra é o desenvolvimento de blocos após a penetração.
Outras pesquisas realizadas com cultivares de Capsicum chinense apresentaram
resistência a Meloidogynes arenaria com pouca presença de ovos nas galhas. Já a
espécie de M. javanica, não foi patogênica a qualquer cultivar de Capsicum
chinense, apresentando nenhuma escoriação de galhas nas raízes (THIES et al.
2001).
Portanto, pesquisas revelam que diferentes espécies de pimentas apresentam
resistências aos parasitas Meloidogynes quando expostos as suas raízes. Sugere-se
que componentes existentes nas plantas de pimentas do gênero Capsicum, repelem
nematóides de várias formas. Nossos resultados demonstraram que os nematóides
quando expostos in vitro ao extrato dos frutos das variedades de pimentas da
espécie Capsicum chinense paralisaram seus movimentos, inativando-os, sugerindo
que os extratos inibem as funções fisiológicas dos nematóides, podendo levá-los a
morte, sem causar danos às plantações, sendo necessários estudos mais
avançados para denominação dos compostos com atividades nematostáticas ou
nematicidas.
Desse modo, ainda são escassas pesquisas com pimentas no combate aos
fitonematóides. Assim, estudos com plantas pertencentes à outra família
(Magnoliaceae) apresentaram atividade nematicida contra os nematóides das
espécies P. redivivus e B. xylophilus após exposição de 48 horas. As plantas
referidas neste estudo foram Magnolia grandiflora e Michelia hedyosperma, sendo o
primeiro relatório com plantas desta família relacionadas a nematicidas. Os
resultados com efeitos nematicidas dependem da parte da planta extraída, podendo
existir diferentes componentes químicos em toda a planta (HONG et al. 2007).
Entretanto, BEGUM e colaboradores (2011) demonstraram que o isolamento de
substâncias da casca, folhas e frutos da planta Cordia latifolia deram origem a dois
novos componentes com propriedades nematicidas (ácido cordinóico e cordicilínico)
contra Meloidogynes incógnita.
Atualmente, outros estudos estão sendo realizadas com extratos de plantas no
combate de nematóides de outras espécies. Por exemplo, o extrato aquoso da
planta Caryocar brasiliense que se revelou eficiente na atividade anti-helmíntico em
estudos com nematóides em intestinos de ovelhas (NOGUEIRA et al. 2012).
45
CONCLUSÃO
Nossos dados sugerem que os nematóides da espécie Meloidogynes incognita
apresentam paralisia de seus movimentos quando expostos aos extratos etanólicos
das duas variedades da Capsicum chinense Jacq. (Pimenta Biquinho e Bode),
concluindo que as variedades de pimentas apresentam atividade nematostática
sobre os Meloidogynes incognita.
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48
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A perspectiva do presente estudo é avaliar a citotoxicidade dos extratos sobre
as células animais, a atividade mutagênica, e para ampliar as propriedades
farmacológicas realizar testes com células tumorais e atividades antioxidantes.
Assim, realizar o fracionamento dos extratos brutos e se possível a quantificação
dos compostos capsaicinóides.
49
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