REGENERAÇÃO DO FEIJÃO-DE-CORDA
VIA EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA: PROGRESSOS E PROBLEMAS
Francisco A.P. Campos
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
Universidade Federal do Ceará
Via
de Regeneração
Organogênese direta
Organogênese direta
Organogênese direta
Organogênese direta
Organogênese direta
Organogênese indireta
Organogênese direta
Embriogênese somática
indireta
Embriogênese somática
indireta
Embriogênese somática
indireta
Embriogênese somática
indireta
Explante
Regulador de
Crescimento
Freqüência
de
Regeneração
Baixa
Baixa
Muthukumat et al. 1995)
Pelegrineschi (1997
BA
TDZ
BA
BA e Cinetina
Alta
Baixa
Baixa
Baixa
Choi et al. (2003)
Van Lê et al. (2002)
Brar et al. (1999)
Anand et al (2001)
BA
Baixa
Popelka et al. (2006)
Referência
Folhas primárias
Cotilédones e eixo
embrionários de sementes
imaturas
Embriões imaturos
Nó cotiledonar
Nó cotiledonar
Cotilédones de sementes
imaturas
Eixo embrionário de
sementes maduras
Folhas primárias
2,4,5-T
Citocininas (BA,
CIN, Zeatina
2,4-D
Baixa
Kulothungan (1995)
Protoplastos de
cotilédones imaturos
Folhas primárias
2,4-D, NAA e BA
Baixa
Li et al. (1995)
2,4-D
Baixa
Anand et al. (2000)
Folhas primárias
2,4-D
Ramakrhishnan et al. (2006)
Estabelecimento de um sistema de cultura in vitro para o feijão-de-corda (Popelka et al. Plant Cell
Rep (2006) 25: 304–312). A Variação fenotípica em sementes de feijão-de-corda; B Explante cotiledonar
de uma semente madura Após remoção dos ápices radicular e caulinar; C Formação de calos não
embriogênicos em meio contendo picloram; D Inibição do crescimento dos ápices caulinares pela
putrescina; E Efeito do TDZ na morfologia de partes aéreas; F Indução da formação de múltiplas partes
aéreas em meio de cultura contendo BA; G Plantas enxertadas in vitro através do uso de anel de silicone:
H-I Plantas aclimatadas
Regeneração de plantas de feijão-de-corda a partir de embriões somáticos induzidos em
suspensões celulares (Ramakrishnan et al. Plant Cell Rep 2005, 24: 449–461)
2,4-D
Kin mg/L
0,0
0,1
0,5
2,5
7,5
37,5
mg/L
0,0
0,1
0,5
Efeitos de 2,4-D e cinetina na indução de calos embriogênicos friáveis a partir de eixos embrionários
do feijão-de-corda.
Suspensão celular embriogênica do feijão-de-corda
A
B
Análise histológica da histo-diferenciação de embriões somáticos no feijão-de-corda (A e B) e na cenoura (C e D)
A
B
C
D
Análise histológica da embriogênese zigótica no feijão-de-corda. Embriões com 1 (A), 2 (B), 4 (C) e 5 (D) dias após
a antese.
Análise histológica da indução de embriogênese somática em folhas primárias do feijão-de-corda. 1. Controle; 2. Explante
foliar após 24 horas de incubação em meio de indução(sais MS, vitaminas B5, 3% sacarose, 150 mg/L hidrolisado de
caseína, 100 mg/L L-Glutamina e 1,5 mg/L de 2,4-D); 3. Detalhe da região em volta do feixe vascular. Legendas: ead epiderme adaxial; eab – epiderme abaxial; pp – parênquima paliçadiço; pe – parênquima esponjoso; f – floema; x –
xilema.
Análise histológica da indução de embriogênese somática em folhas primárias do feijão-de-corda. 1 e 2. Explantes foliar após
3 dias de incubação em meio de indução; 3. Explante após 3 dias de incubação em meio de indução; 4 e 5. Detalhe das
massas celulares formadas em volta dos feixes vasculares mostrados em 3.
1
2
Análise histológica da indução de embriogênese somática em folhas primárias do feijão-de-corda. 1. Explantes foliares
após 15 dias de incubação em meio de indução; 2. Detalhe das massas pro-embriogênicas presentes em suspensões
celulares.
Expressão do gene uidA em massas pro-embriogênicas do feijão-de-corda
Mapa de referência bi-dimensional das proteínas de suspensões celulares embriogênicas
do feijão-de-corda
Resultados obtidos TABELA
por Peptide
Mass Fingerprinting dos “spots” selecionados do gel
DOS RESULTADOS DE PMF (2ª RIO) JULHO-2005
2D Suspensões Celulares Embriogênicas.
SUSPENÇÃO CELULAR de Vigna unguiculata
Spot
name
Best matching
1. Chain B, Complex Porcine Pancreatic
MWM TrypsinSOYBEAN TRYPSIN Inhibitor, Orthorhombic
Crystal Form
SC1 1. Class 1 Chitinase
SC2 1. Pathogenesis related protein
SC3 1. putative FPP syntase
SC4 1. NADH ubiquinone oxidoreductase subunit 5
SC5 1. vicilin
1. RUBISCO small subunit 1/4 chloroplat
SC6 2. Phosphoenolpyruvate carboxylase housekeeping
isozyme
SC7 1. AGAMOUS-like MADS-box transcription factor
SC8 1. putative AdoMet syntase 3
1. RUBISCO small subunit
SC9
2. KAP-2
SC10 1. photosystem 2 subunit H
SC11 1. TnpD
SC12 1. MAP kinase phosphatase
1. phosphoenolpyruvate carboxylase
SC13 2. endochitinase 1A
3. endochitinase 1B
1. formate-tetrahydrofolate ligase
SC14
2. ribosomal protein L23
Number
Mowse
of
score matched
peptides
%
Sequence
coverage
MW/pI of
the best
match
MW/pI
6
49%
18.9/4.87
20.1
80
78
27
35
27
6
6
3
5
5
25%
44%
27%
36%
33%
32.6/5.7
16.3/4.7
15.8/6.58
20.5/8.78
26.8/7.16
31.6/5.4
15.6/4.8
47.1/5.5
27.3/5.6
20.1/5.9
O24634
AAL26863
42
24
6
6
46%
28%
19.6/8.7
44.4/7.9
17.2/6.2
AAM76208
CAJ01704
BAA00450
AAL87544
AAP39896
AAM45961
AAK29384
CAA96509
Q06012
Q06013
BAA77217
AAN04892
32
39
36
29
40
32
61
33
30
30
46
31
5
6
5
9
3
4
9
4
3
3
7
4
40%
22%
36%
20%
54%
62%
59%
Taxonomy
Access
number
Glycine max
1AVW_B
69
Vigna unguiculata
Vigna unguiculata
Taraxacum japonicum
Zea mays
Theobroma mammosum
AAG233965
T11670
BAB20822
AAA31953
AAF13464
Frutillaria agrestis
Phaseolus vulgaris
Ginko biloba
Hordeum vulgare s.vulgare
Pyrus pyrifolia var. culta
Phaseolus vulgaris
Heteroscyphus balneti
Hordeum vulgare
Lycopersicon esculentum
Flaveria pringlei
Arachis hypogea
Arachis hypogea
Lithospermum erithrohizon
Vigna angularis
25.3/8.9
42.7/5.5
20.5/9.04
77.28/5.7
3.48/8.15
10.37/8.89
19.79/6.31
10.25/4.4
58% 82%
4.69/7.98
82%
4.66/7.98
26.01/8.99
52% 54%
10.9/11.04
15.7/6.7
14.7/6.1
14.4/5.4
11.4/4.1
23.2/6.6
66.1/4.9
31.6/5.2
24.0/4.5
Espectros de massas dos peptídeos trípticos de SC1
Espectros de massas dos peptídeos trípticos de SC2
MW EZM SC
94
EZM
Dias após a antese
2 6 8 10 12 14 16
MW
94
67
43
30
SC
67
43
30
20,1
2
6 8 10 12 14 16
20,1
14,4
14,4
(A)
MW r
94
67
43
30
c
(B)
f
r
c
f
MW c
e
c
e
94
67
43
30
20,1
20,1
14,4
14,4
(C)
(D)
Detecção em suspensões celulares embriogênicas e diferentes tecidos do feijão-de-corda de proteínas
que reagem com anticorpos preparados contra o peptídeo sintético HSKGDAPPNEDELK, derivado da
sequência de aminoácidos predita para a PR-10 de feijão-de-corda.
4
7
66
29
24
20
14
pH 4
MW
67
43
30
20,1
14,4
7
É possível demonstrar a expressão dos genes que codificam para a PR-10 e para
a quitinase que foram identificadas em suspensões celulares embriogênicas do
feijão-de-corda?
PR-10-F CAT ATG GCC GTT TTC ACA TTC GAG
PR-10-R GGA TCC TCA AGC ATT GGC CAA AAG GTA
QUI-F CAT ATG GCA GTG TGG AAG CCA AGC G
QUI-R GGA TCC TCA GAC GAT GGG ATG GAG ATT AA
PR-10
QUI
ACT
Análise da expressão em suspensões celulares embriogênicas de feijão-decorda, dos genes que codificam para as proteínas PR-10 (A) e quitinase (B) por
RT-PCR.
Seqüência de nucleotídeos de um cDNA que codifica a PR-10 que é acumulada em
suspensões celulares embriogênicas do feijão-de-corda.
PERSPECTIVAS FUTURAS