1
Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Avaliação de aditivos químicos e microbianos como inibidores da
síntese de etanol em silagens de cana-de-açúcar (Saccharum
officinarum L.)
Daniel de Paula Sousa
Tese apresentada para obtenção do título de
Doutor em Agronomia. Área de concentração:
Ciência Animal e Pastagens
Piracicaba
2006
Daniel de Paula Sousa
Zootecnista
Avaliação de aditivos químicos e microbianos como inibidores da síntese de
etanol em silagens de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.)
Orientador:
Prof. Dr. WILSON ROBERTO SOARES
MATTOS
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor
em Agronomia. Área de concentração: Ciência
Animal e Pastagens
Piracicaba
2006
Da d o s I n t e r n a c i o n a i s d e Ca t a l o g a ção n a Pu b l i c a ção ( CI P)
DI VI SÃO DE BI BL I OT ECA E DOCUMENT AÇÃO - ESAL Q/ USP
Sousa, Daniel de Paula
Avaliação de aditivos químicos e microbianos como inibidores da síntese de etanol em
silagens de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) / Daniel de Paula Sousa. - Piracicaba, 2006.
142 p. : il.
Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2006.
Bibliografia.
1. Ácido orgânico 2. Cana-de-açúcar 3. Eletroforese em gel 4. Etanol 5. Lactobacillus
6. Leveduras 7. Silagem 8. Uréia I. Título
CDD 636.08552
“Pe r mi t i d a a c óp i a t o t a l
o u p a r c i a l d e s t e d o c u me n t o ,
f ont e – O a ut or ”
de s de que c i t a da a
3
"Quem quer fazer alguma coisa encontra, sempre, um meio, quem não
quer fazer nada encontra, sempre, uma desculpa". (Anônimo)
A
meu avô Bento R. de Paula;
meus pais, Cleonaldo R. de Sousa e Maria Cristina;
minhas queridas irmãs Denise, Débora e Danusa;
meus cunhados Vinícius, Marcelo e Bruno;
Dedico
A uma grande mulher, pessoa forte e determinada, porém doce e
carinhosa que esteve comigo grande parte do doutorado.
Ofereço
4
AGRADECIMENTOS
À USP/ESALQ, por meio do Departamento de Zootecnia, pela oportunidade da
realização do doutorado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES pela
concessão da bolsa de estudos.
Ao Prof. Dr. Wilson Mattos pela orientação na realização desse trabalho, pela amizade
e por todo auxiliou no meu desenvolvimento profissional.
Aos Professores Luiz Gustavo Nussio, Luiz Coutinho e Marcio Lambais por toda
ajuda, ensinamentos e valiosas contribuições em todas as fases desse trabalho.
Ao Prof. Thomas Pauly por todo apoio e amizade em tão pouco tempo de convívio.
Aos demais professores do Departamento
ensinamentos, exemplo e amizade.
de
Zootecnia
da
ESALQ,
pelos
À empresa: Lallemand, pelo apoio financeiro.
Ao casal Laudi Cunha Leite e Meiby de Paula pela preciosa amizade, por dividirem
comigo todas as dificuldades e estarem sempre prontos a ajudar quando preciso.
Aos seniores Rodrigo Goulart, Patrick Shmidt, Lucas José Mari, José Leonardo
Ribeiro, Maity Zoppolato, Mateus Castilho Santos, Oscar Queiroz pelo exemplo de
profissionalismo e dedicação.
À todos os estagiários que passaram pelo departamento nesses últimos quatro anos
Aos amigos da república Viola quebrada, Marconi e Cesar. Que possamos manter
para sempre essa amizade e esse companherismo.
Às amigas da república Pitt boas, amigas de longa data, grande familia que me acolheu
desde que cheguei em Piracicaba.
À Universidade de Agricultura da Suécia pela oportunidade de trabalho no
desenvolvimento de pesquisas e pelo aprendizado pessoal.
À Carla Bittar por toda ajuda na realização das análises laboratorias. Pelo exemplo de
profissionalismo e competência.
Aos funcionários do Departamento de Zootecnia: Carlos César e Tânia pelo apoio nas
atividades realizadas durante a pós-graduação.
À Andrea Baggio Amaral por todo incentivo e amizade.
A todos, que direta ou indiretamente, auxiliaram na realização desse trabalho.
Agradeço
5
SUMÁRIO
RESUMO...........................................................................................................................8
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................13
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .........................................................................................15
2.1 Cana-de-açúcar.........................................................................................................15
2.2 Silagem de cana-de-açúcar.......................................................................................16
2.3 Microflora epífita e fermentação das silagens ...........................................................18
2.4 Uréia..........................................................................................................................21
2.5 Lactobacillus buchneri ...............................................................................................24
2.6 Associações de microrganismos ...............................................................................27
Referências .....................................................................................................................29
3
DINÂMICA
DA
FERMENTAÇÃO,
DAS
PERDAS
DE
MATÉRIA
SECA,
DESENVOLVIMENTO DA MICROFLORA EPÍFITA E ATIVIDADE DA ÁLCOOL
DESIDROGENASE EM SILAGENS DE CANA-DE-AÇÚCAR..................................35
Resumo ...........................................................................................................................35
Abstract ...........................................................................................................................36
3.1 Introdução .................................................................................................................37
3.2 Material e métodos....................................................................................................39
3.2.1 Local do experimento .............................................................................................39
3.2.2 Silos laboratoriais e confecção da silagem.............................................................39
3.2.3 Enchimento dos silos..............................................................................................39
3.2.4 Avaliação das perdas e amostragem das silagens ................................................40
3.2.5 Equações para estimar perdas...............................................................................41
3.2.6 Análises químico-bromatológicas ...........................................................................42
3.2.7 Determinação da atividade da álcool desidrogenase ADH.....................................43
3.2.8 Caracterização da microflora epífita.......................................................................44
3.2.9 Análise estatística ..................................................................................................44
3.3 Resultados e Discussão ............................................................................................45
3.4 Conclusões................................................................................................................60
Referências .....................................................................................................................60
6
4
EFEITO
DE
ADITIVOS
QUIMICO
E
MICROBIANOS
NA
DINÂMICA
DA
FERMENTAÇÃO E NO CONTROLE DA PRODUÇÃO DE ETANOL EM SILAGENS
DE CANA-DE-AÇÚCAR............................................................................................65
Resumo ...........................................................................................................................65
Abstract ...........................................................................................................................66
4.1 Introdução .................................................................................................................67
4.2 Material e métodos....................................................................................................69
4.2.1 Local do experimento .............................................................................................69
4.2.2 Silos laboratoriais e confecção da silagem.............................................................70
4.2.3 Tratamentos e aplicação dos aditivos ....................................................................70
4.2.4 Enchimento dos silos..............................................................................................71
4.2.5 Avaliação das perdas e amostragem das silagens ................................................71
4.2.6 Equações para estimar perdas...............................................................................72
4.2.7 Análises químico-bromatológicas ...........................................................................73
4.2.8 Determinação da atividade da álcool desidrogenase .............................................74
4.2.9 Caracterização da microflora epífita.......................................................................75
4.2.10.1 Extração de DNA...............................................................................................76
4.2.10.2 Amplificação do DNA.........................................................................................77
4.2.10.3 Análise dos Amplicons do rDNA 16s .................................................................77
4.2.10.4 Análise da Diversidade Genética ......................................................................78
4.2.11 Análise estatística ................................................................................................78
4.3 Resultados ................................................................................................................78
4.3.1 Apresentação geral dos dados...............................................................................79
4.3.2 Desdobramento de interações ...............................................................................81
4.3.3 Teor de matéria seca e cinzas ...............................................................................82
4.3.4 Teores de FDN e DVIVMS .....................................................................................83
4.3.5 Teores de proteína bruta, carboidratos solúveis e pH ............................................84
4.3.6 Produção de efluentes............................................................................................85
4.3.7 Produção de gases e perdas totais de MS.............................................................86
4.3.8 Teor de etanol e ácido acético ...............................................................................87
4.3.9 Teores de ácido lático e as relações ácido lático:C2 e C3:C2................................88
7
4.3.10 Atividade enzimática da ADH ...............................................................................89
4.3.11 Contagem do número de bacterias láticas e de leveduras...................................92
4.3.12 Diversidade genética ............................................................................................94
4.3.13 Coeficientes de correlação .................................................................................100
4.4 Discussão................................................................................................................101
4.4.1 Compósição químico-bromatológica inicial da cana-de-açúcar............................101
4.4.2 Teor de matéria seca (MS) e matéria mineral (CZ) ..............................................102
4.4.3 Teores de FDN, carboidratos solúveis (CS) e DVIVMS .......................................105
4.4.4 Produção de efluentes, gases e perdas totais de MS ..........................................115
4.4.5 Teores de PB e pH ...............................................................................................119
4.4.6 Teores de etanol e ácido orgânicos .....................................................................120
4.4.7 Atividade da Álcool desidrogenase (ADH)............................................................131
4.4.8 Contagem do número de Bactérias láticas (LAB) e Leveduras (LEV)..................134
4.4.9 Diversidade Genética ...........................................................................................136
4.5 Conclusões..............................................................................................................138
Referências ...................................................................................................................139
8
RESUMO
Avaliação de aditivos químico e microbianos como inibidores da síntese de etanol
em silagens de cana-de-açúcar (saccharum officinarum l.)
O trabalho teve por objetivo avaliar fatores associados à ensilagem da cana-deaçúcar, com destaque para a aplicação de aditivos químicos e microbianos sobre a
dinâmica fermentativa, composição bromatológica, atividade da álcool desidrogenase e
desenvolvimento e diversidade da micloflora em silagens de cana-de-açúcar. No ensaio
conduzido durante 110 dias o delineamento experimental adotado foi o inteiramente ao
acaso, com 4 tratamentos, 2 repetições, e seis épocas de abertura (1, 3, 7, 15, 35, 110
dias). Os tratamentos foram: uréia 1% MV e os inoculantes microbianos Lactobacillus
buchneri (3,65x105 ufc/g da MV) e a combinação de bactérias Pedioccocus pentosassus
e Lactobacillus buchneri (1x106 ufc/g MV). As maiores variações na composição
bromatológica e perdas de MS, das silagens controle ocorreram dos 7 aos 15 dias,
estabilizando após esse período. As regressões ajustadas para perdas de MS e
carboidratos solúveis foram bem similares e de forma contrária ao acúmulo de FDN. As
perdas por gases alcançaram valores de 28,27%, de carboidratos solúveis em apenas
2,98% e FDN em torno de 67,77% da MS. Os aumentos nos teores de etanol e perda na
digestibilidade nas silagens controle se extenderam até o 35º dia, com valores máximos
de etanol de 12,23%. Foi possível relacionar etanol com a digestibilidade mostrando que
cada 1% de aumento nos teores de etanol, 2 unidades de digestibilidade foram
perdidas. Os aditivos uréia e o aditivo Lactobacillus buchneri mais Pediococcus foram
eficazes em diminuir a produção de etanol (2,75 e 1,30 vs 8,27% no tratamento
controle), em diminuir perdas de MS em 47 e 60%, e de carboidratos soluveis em 22 e
56% em relação à silagem controle, respectivamente. As silagens aditivadas com uréia
obtiveram maiores valores de pH e maiores valores de ácido lático em relação às
silagen controle. As silagens aditivadas com L. buchneri apenas foram as de maiores
produções de etanol, acima da silagem controle (11.53 vs 8.27%), além de grandes
perdas de matéria seca e baixa digestibilidade pelo acúmulo de FDN, comparáveis às
silagens controle. A diferença entre aditivos na composição químico-bromatológica e
perdas ocorreu após 7 dias de fermentação. Os dados apresentados pelos aditivos uréia
e L. buchneri mais Pediococcus foram ajustados em curvas simples, através de modelos
lineares, para descrever e predizer as variações durante a ensilagem. Os tratamentos
controle e a aditivação com L. buchneri apenas, pelas altas taxas fermentativas,
observaram melhor ajuste dos dados em polinômios de segundo e terceiro grau. Apesar
dos altos teores de ácido acético em todas as silagens, principalmente nas silagens
aditivadas com a combinação de bactérias, não foram verificadas efeitos deste sobre a
população de leveduras. Os teores obtidos de ácido lático e ácido propiônico e a relação
entre esses ácidos e o ácido acético, durante a fermentação, conseguiu explicar parte
do sucesso dos tratamentos uréia e L. buchneri mais Pediococcus na redução da
atividade da enzima álcool desidrogenase e na producão de etanol. A análise de
grupamentos hieráquicos mostrou que os aditivos alteraram a diversidade bacteriana
durante a ensilagem.
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, Uréia, L. buchneri, Pediococcus, Etanol, Carboidratos
solúveis, Ácidos orgânicos, Leveduras, ADH, DGGE.
9
ABSTRACT
Chemical and microbial additives for the inhibition of ethanol
synthesis in sugarcane silage
The present trial aimed to study the ensiling associated factors of sugarcane
focusing on chemical and microbial additives on fermentation, chemical composition,
enzymatic activity of alcohol dehydrogenase and the microflora development and
diversity in sugarcane silages. A complete randomized design was set to a 110-d trial
with 4 treatments, two replications within 6 opening dates (1, 3, 7, 15, 35, 110-d).
Treatments were described as follows: urea 1% (wet basis), Lactobacillus buchneri
(3.65x105 cfu/g of forage), a combination of Pediococus pentosassus and Lactobacillus
buchneri (1x106). Major variation observed on the chemical composition and the DM
losses in sugarcane silages without additives took place from the day 7 through the day
15. Losses of DM and soluble carbohydrates showed similar trend and in opposition to
the NDF increase. Gases losses averaged 28.27%, while the soluble carbohydrates and
NDF contents reached respectively, 2.98% and 67.77% when fermentation was
stabilized. Conversely, ethanol and the digestibility were changed across the storage
period up to the day 35, with ethanol content increasing to 12.23%. 1% of ethanol
increase was associated with 2 percentage units of digestibility decrease. Both urea and
the combination of microorganisms were effective in decrease the ethanol content (2.75,
1.30 vs 8.27% - without additives), decrease DM losses (47 and 60%) and reduce
soluble carbohydrates losses (22 and 56%) when compared to the control treatment. The
urea treated silages showed higher pH and lactic acid values. The L. buchneri treatment
led to higher ethanol content (11.23 vs 8.27%) compared to the control, resulting in low
DM recovery rate, higher losses and decreased digestibility as well as the silages without
additives. The major changes on the chemical composition were noticed after the day 7
of fermentation. For the addition of urea and the combination of microorganisms L.
buchneri and Pediococcus the variation was better described by linear equations
whereas quadratic and cubic effects were more suitable for fitting the data from the
control and the L. buchneri added silages. Even tough all silages has shown high acetic
acid contents, mainly the combination of lactic bacteria, no significant effects were
observed upon the yeast counts. However, the levels of lactic acid and propionic acid
and the ratio of both over the acetic acid content were related to the decrease on the
activity of the alcohol dehydrogenase enzyme and, furthermore, on the ethanol content
of the silages. The cluster analysis based on molecular evaluation demonstrated a
change promoted over the bacterial population mediated by the additives applied during
the ensiling of sugarcane.
Key words: Sugar cane, urea, L. buchneri, Pediococus, ethanol, soluble carbohydrates,
organic acids, yeasts, ADH, DGGE.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Relação entre os teores de etanol e a digestibilidade de silagens de cana-deaçúcar.............................................................................................................49
Figura 2 – Variação nos teores de FDN, carboidratos solúveis e perdas por gases
durante a ensilagem da cana-de-açúcar......................................................51
Figura 3 – Valores de pH e contagens de LAB e LEV (Log ufc g-1), durante a
fermentação................................................................................................58
Figura 4 – DGGE de amplicons de bactérias de silagens de cana-de-açúcar ................95
Figura 5 - Diagrama representando as bandas de rDNA do domínio bactérias de
comunidade das sialgens de cana-de-açúcar, com diferentes aditivos,
detectadas por DGGE.................................................................................96
Figura 6 – Agrupamento hierárquico de amplicons de rDNA 16S de Bactéria de silagens
de cana-de-açúcar aditivadas com uréia ou L. buchneri em combinação ou
não com Pediococcus, detectadas por DGGE ..............................................99
Figura 7 – Efeitos dos diferentes aditivos nos teores de MS durante a ensilagem de
cana-de-açúcar com diferentes aditivos ....................................................104
Figura 8 – Relação entre os teores de FDN e teores de MS.........................................110
Figura 9 – Relação entre os teores de FDN, CS e a DVIVMS ......................................115
Figura 10 – Teores de ácido propiônico durante a silagens de cana-de-açúcar ...........122
Figura 11 - Teores de ácido lático durante a silagens de cana-de-açúcar ....................128
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição químico-bromatológica da cana-de-açúcar ...............................45
Tabela 2 - Composição bromatológica, perdas de MS, ácidos orgânicos e atividade
enzimática da ADH em silagem de cana-de-açúcar ....................................46
Tabela 3 – Composição químico-bromatológica da cana-de-açúcar, nos tratamentos,
antes da ensilagem.....................................................................................79
Tabela 4 - Estatística descritiva das variáveis avaliadas.................................................80
Tabela 5 - Estatística descritiva das variáveis avaliadas.................................................80
Tabela 6 – Valores médios da composição químico-bromatológica, parametros
fermentativos e perdas assoaciadas a ensilagem da cana-de-açucar nas
3 primeiras datas de abertura ................................................................81
Tabela 7 - Desdobramento de interações para as variáveis MS e Cinzas ......................82
Tabela 8 - Desdobramento de interações para as variáveis FDN e DVIVMS .................83
Tabela 9 - Desdobramento de interações para as variáveis proteína bruta e pH............85
Tabela 10 - Desdobramento de interações para a variável produção de efluentes.........86
Tabela 11 - Desdobramento de interações para as variáveis perdas de MS e gases.....87
Tabela 12- Desdobramento de interações para as variáveis etanol e ácido acético.......88
Tabela 13 - Desdobramento de interações para as variáveis ácido lático e as relações
ácido lático:ácido acético e C3:C2 ..............................................................89
Tabela 14- Desdobramento de interações para a variável atividade enzimática da ADH
(nmol min-1 g-1 PB) .......................................................................................91
Tabela 15 - Desdobramento de interações para as variáveis LAB e LEV (Log ufc/g MV)
.....................................................................................................................93
Tabela 16 – Coeficientes de correlação (r) entre as variáveis relacionadas a composição
químico bromatológica e às perdas em silagens de cana-de-açúcar ........101
Tabela 17 - Equações de regressão do acúmulo de FDN durante o tempo de ensilagem
para os diferentes aditivos .........................................................................107
12
LISTA DE ABREVIATURAS
ADH – enzima álcool desidrogenase
C2 – ácido ácético
C3 – ácido propiônico
CS – carboidratos solúveis
DGGE – Eletroforese em gel com gradiente desnaturante
DVIVMS – digestibilidade verdadeira in vitro da matéria seca
FDN – fibra insolúvel em detergente neutro
FDA – fibra insolúvel em detergente ácido
LAB – Bactérias láticas
L. buchneri – Lactobacillus buchneri
LEV - Leveduras
Log - logaritimo
Pediococcus – Pediococcus pentosaceus
MS – matéria seca
PB – proteína bruta
pH – potencial hidrogeniônico
UFC – unidade formadora de colônia
13
1 INTRODUÇÃO
A exploração pecuária brasileira depende da utilização adequada das condições
inerentes à produção de biomassa vegetal, na forma de pastagens nativas ou
cultivadas, com o entendimento correto das inter-relações entre o clima, solo, planta e
animais.
A produção sazonal das pastagens propicia o desenvolvimento de tecnologias,
corroborada com pesquisas, na busca constante pelo aumento dos índices produtivos
de maneira viável, sem prejuízos ao meio ambiente, condição única para o
desenvolvimento sustentável.
A utilização da cana-de-açúcar fresca na alimentação de bovinos, submetida a
cortes diários, na época seca do ano, período de escassez de alimento, é tradicional e
de amplo conhecimento dos pecuaristas. Esta tecnologia tem como vantagens, a alta
produtividade de massa verde (80 a 120 t/ha), o baixo custo por unidade de matéria
seca (MS), a manutenção do valor nutritivo até seis meses após a maturação e o
período de colheita.
No entanto, um dos principais fatores que norteiam a tomada de decisão pelo uso
da cana-de-açúcar é o problema logístico decorrente da colheita diária da forragem,
problema este intensificado em propriedades com grandes rebanhos. Além disso,
situações em que a cana é utilizada como forragem durante o ano todo incluem
dificuldades de colheita em dias chuvosos e perda do valor nutritivo durante o período
de verão. Há, ainda, a necessidade da rápida utilização de canaviais, seja para a
liberação de áreas de cultivo para outro tipo de cultura em caso de queda nos preços do
açúcar e álcool, ou de áreas que acidentalmente foram queimadas ou que sofreram
geadas. Dessa maneira abre-se espaço para a utilização da cana-de-açúcar na forma
de silagem.
Embora possa representar uma solução operacional, por todas as razões
comentadas, as silagens produzidas exclusivamente de cana-de-açúcar são de baixa
qualidade, com conseqüente redução no consumo voluntário e desempenho animal
insatisfatório.
14
Por apresentar grandes quantidades de carboidratos solúveis a cana-de-açúcar é
altamente susceptível ao ataque de leveduras. Dentro do ambiente anaeróbico do silo,
as leveduras são capazes de gerar perdas significativas em função da fermentação
alcoólica.
Tendo em vista o cenário que envolve o uso da cana-de-açúcar ensilada, o meio
acadêmico vem pesquisando inúmeros aditivos capazes de controlar a população de
leveduras, diminuindo, assim, as perdas decorrentes dos processos fermentativos.
Em alguns ensaios foi observado melhora na dinâmica fermentativa de silagens de
cana-de-açúcar inoculadas com L. buchneri, o que resultou em menores teores de
etanol e menores perdas totais.
Ao avaliar animais recebendo silagens de cana-de-açúcar com aditivos químicos e
bacterianos também se constatou que o tratamento uréia 1% proporcionou resultados
satisfatórios e promissores.
Diante desse contexto o uso de aditivos químicos ou microbianos na ensilagem de
cana-de-açúcar pode melhorar as condições de fermentação e resultar em produto de
qualidade média a alta e consequentemente maior desempenho animal.
Este trabalho tem por objetivos estudar os efeitos de aditivos químicos e
microbianos na dinâmica fermentativa, na atividade da enzima ligada a síntese de etanol
e na população epífita durante a ensilagem da cana-de-açúcar.
15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Cana-de-açúcar
A tradição no cultivo da cana-de-açúcar é uma das características que a tornam
elegível para adoção nos sistemas de produção animal. Na década de 40 cerca de 37%
das propriedades rurais produtoras de leite utilizavam a cana-de-açúcar como fonte de
volumoso (JARDIM, 1949 apud MATTOS, 2003). Atualmente a cultura da cana-deaçúcar está presente em uma área de 5,495 milhões de hectares, o que representa uma
produção de 423 milhões de toneladas.
Dentre os aspectos a serem considerados para o uso da planta, deve ser
destacada a alta produção por hectare. Schmidt et al. (2004) determinaram índices de
produção da variedade IAC 87-3184 em 183,5 t MV/ha, ou 59,3 t MS/ha.
Nussio e Schmidt (2005) ressaltam o baixo custo por tonelada de matéria seca
como ponto atrativo no uso da cana-de-açúcar na produção animal. Atualmente o custo
por tonelada de matéria seca é de aproximadamente R$ 200, 00, considerando a planta
colhida com teor de 30% MS.
Segundo Silva (1993), a manutenção do valor nutritivo por grande período de
tempo e a época de maturação coincidindo com a época de escassez de forragem são
aspectos vantajosos à utilização da cana-de-açúcar.
Ainda que apresente inúmeras vantagens, a cana-de-açúcar tem limitações do
ponto de vista nutricional (SHIMIDT; NUSSIO, 2005) e quanto à operacionalização da
colheita diária (JUNQUEIRA, 2006).
A deficiência de proteína encontrada na cana-de-açúcar foi primeiramente relatada
por Nicolau Athanassof (1917 apud MATTOS, 2003) quando este observou que o
fornecimento exclusivo da planta ao animal como única fonte de alimento poderia
acarretar na morte do mesmo, por falta de substâncias azotadas. Boin e Tedeschi
(1993) reportaram que além da deficiência de proteína, baixos teores de minerais,
principalmente enxofre e fósforo, podem culminar em baixa utilização da energia
digerida.
16
Junqueira (2006) relata a importância da disciplina e os problemas advindos do
corte diário da plantação. A necessidade diária de máquinas e pessoal para atender as
demandas de confinamentos industriais e grandes rebanhos tornam a prática do corte
diário algo complexo e pouco prático. Além dos problemas operacionais envolvendo a
colheita diária, esta gera a necessidade de um plantio escalonado, caso contrário, seria
impossível utilizar todos os talhões quando a cana-de-açúcar apresentasse seu maior
acúmulo de nutrientes. Quando utilizada fora do período de safra, a cana-de-açúcar não
apresenta seu maior valor nutritivo, pois, ainda, contém um baixo teor de sacarose
(MATSUOCA; HOFFMANN, 1993). O plantio escalonado também leva a diferentes
épocas de tratos culturais nos talhões, e disso deriva uma série de novas demandas e
cuidados.
Tendo em vista os problemas relacionados ao corte escalonado e à colheita fora
de época, associado às possibilidades de queimas de canavial ou excedentes de
produção, a ensilagem de cana-de-açúcar e a demanda por informações tornam-se
cada vez mais freqüentes.
2.2 Silagem de cana-de-açúcar
A cana-de-açúcar vem sendo adotada nos sistemas de produção como uma
estratégia de alimentação no período de escassez de pasto. O interesse pela planta é
resultado de inúmeras vantagens associadas ao alto potencial de produção de matéria
seca, maior produção de NDT por hectare quando comparado às forragens tradicionais
como milho e sorgo e baixo custo por tonelada de matéria seca.
A escolha pelo uso da planta ensilada e não in natura, como tradicionalmente é
feito, decorre das inúmeras vantagens operacionais e do aumento da flexibilidade do
sistema de produção. O uso da planta na forma ensilada permite o corte em curto
espaço de tempo, o aproveitamento da forragem quando esta atinge seu máximo valor
nutritivo, o manejo facilitado do canavial, além de permitir o uso da cana em caso de
incêndios acidentais ou excedentes de produção (PEDROSO, 2003).
Entretanto, vários trabalhos têm evidenciado que a cana-de-açúcar ensilada sem o
uso de aditivos, devido ao intenso processo de fermentação alcoólica, não é um
17
alimento que resultará em bom desempenho animal. Trabalhos realizados por Preston
et al. (1976), mostraram que a ensilagem da cana-de-açúcar por 49 dias apresentou teor
alcoólico de 5,49% na MS, e redução de aproximadamente 30% no conteúdo total dos
açúcares e da sacarose em relação à cana fresca (44,4 e 40,7 para 31,1 e 27,5% da
MS, respectivamente).
Kung Jr. e Stanley (1982), avaliaram o efeito do estágio de maturação da cana-deaçúcar no valor nutritivo das silagens. A cana ensilada a partir dos 6, 12 e 24 meses
teve valores de digestibilidades de 54,9; 55,0 e 50,0 % e consumo de matéria seca de
9,31; 6,12 e 6,35 g MS kg-1 peso vivo, respectivamente. Os autores atribuíram o
decréscimo nos valores tanto de digestibilidade como de consumo de MS às
concentrações de ácido acético (1,5; 1,88 e 1,40 % MS) e de etanol (7,50; 15,45 e 17,52
% MS).
Em estudos posteriores sobre a fermentação de cana-de-açúcar em silos
experimentais, Alli e Backer (1982), observaram aumento no teor de fibra em detergente
ácido (FDA) de 29,9 para 43,1% na MS e perda de aproximadamente 5% da MS, em
relação à cana fresca. Os autores ressaltaram que o teor de etanol nas silagens (8,86%
da MS), correspondeu à perda pela fermentação, de aproximadamente 50% da
sacarose presente na cana fresca.
Schmidt et al. (2004) trabalhando com ensilagem de cana-de-açúcar em silos
laboratoriais de 20 L, providos de válvula para escape de gases, quantificaram perdas
de matéria seca em silagens não aditivadas da ordem de 36,5% da matéria seca.
Junqueira (2006) estudando o efeito de aditivos químicos e bacteriano sobre as
perdas na conservação da silagem de cana-de-açúcar verificou o aumento de perdas
gasosas em silagens não aditivadas em comparação com silagens com 2% de uréia MV
e L. buchneri (22,19% MS vs 14,50% MS e 14,97% MS). A recuperação de matéria seca
da silagem controle foi de 77,26% enquanto os tratamentos com 2% de uréia e L.
buchneri apresentaram recuperação de 84,87% e 82,47%, respectivamente. Ambos os
tratamentos foram capazes de diminuir o teor de etanol na silagem em relação ao
tratamento controle (2,59% MS e 2,96% MS vs 5,75% MS).
18
Poucos trabalhos, entretanto, são encontrados na literatura quando se pretende
verificar o impacto da ensilagem da cana-de-açúcar sobre os valores de desempenho
animal. Alvarez et al. (1977), relataram que o ganho de peso médio diário de animais
alimentados com silagem de cana acrescida de uréia e aditivo rico em amido, apesar de
maior em relação à silagem de cana sem aditivo, foi menor do que a cana desintegrada
fornecida diariamente.
Do mesmo modo, Alcântara et al. (1989) observaram perda no valor nutritivo da
silagem de cana-de-açúcar com redução no consumo voluntário (7,1 para 5,7% do Peso
metabólico) e na digestibilidade “in vivo” da MS (66,4 para 55,3%), quando fornecida a
ovinos machos, em relação à cana fresca.
2.3 Microflora epífita e fermentação das silagens
Os microrganismos naturalmente presentes nas plantas forrageiras chamadas
microflora epífita, são responsáveis pela fermentação das silagens, afetando, também, a
suas estabilidade aeróbica e a eficiência dos inoculantes contendo microrganismos
exógenos. O número de cepas de microrganismos epífitas é variável, sendo afetado
pelo tipo de forragem, pelo estádio de maturidade das plantas, pelo clima, por tratos
agronômicos dispensados na condução da cultura, pelo corte e condicionamento da
forrageira (LIN et al., 1992), bem como pela ocorrência de incêndio prévio, no caso da
cana-de-açúcar (BERNARDES et al., 2002).
Geralmente, os microrganismos presentes em maior número nas plantas
forrageiras são as enterobactérias, as leveduras e os fungos, que competem com os
lactobacilos pelos açúcares solúveis (BOLSEN et al., 1992) durante a etapa fermentativa
do silo. Embora bactérias indesejáveis, como enterobactérias e clostrídeos possam
respressentar importante fonte de perdas qualitativas e riscos toxicológicos em silagens
de baixa fermentação, seu desenvolvimento é inibido em condições de baixo pH
(BRAVO-MARTINS, 2004), o que reduz a importância prática desses microrganismos na
ensilagem da cana-de-açúcar, que se caracteriza por apresentar teor adequado de MS e
rápido abaixamento do pH, a níveis considerados adequados.
19
Estudando a dinâmica fermentativa da silagem de cana-de-açúcar, Pedroso et al.
(2005) verificaram valor de pH próximo a 4,0 no segundo dia após a ensilagem, sendo
esse valor reduzido em menor intensidade nos dias subsequentes, a valores próximos a
3,5. Mesmo após a abertura do silo, o pH das silagens de cana permaneceu baixo,
limitando o crescimento bacteriano no painel do silo. Baliero Neto et al. (2005)
observaram valores de pH próximos a 5,0, para silagens de cana expostas ao ar por
nove dias.
Embora valores de pH possam ser usados como indicadores diretos de qualidade
fermentativa para a maioria das silagens de gramíneas anuais e perenes, a cana-deaçúcar mostra-se como uma exceção, em função do desenvolvimento prejudicial de
leveduras epifítas. Leveduras são microrganismos heterotróficos, eucariontes e
unicelulares, abundantes no solo, na vegetação e na água. Aproximadamente 25
espécies de leveduras que colonizam as silagens foram listadas por Jonsson (1989)
citado por McDonald et al. (1991), em dois grandes grupos fisiológicos: leveduras com
alta capacidade fermentativa, que obtém energia de açúcares em anaerobiose; e
leveduras com alta capacidade respiratória, que utilizam principalmente ácido lático,
além de outros ácidos orgânicos, sob aerobiose. Por serem resistentes em meio ácido,
algumas cepas conseguem se manter em pH abaixo de 2, sendo que a grande maioria
se desenvolve em pH variando de 3,0 a 8,0 (McDonald et al., 1991). Além disso, são
menos sensíveis que as bactérias à falta de umidade, crescendo em níveis inferiores a
0,9 de atividade de água.
Em termos energéticos, a respiração é o processo metabólico mais favorável às
leveduras, pela maior obtenção de energia, incorrendo em queda na taxa de consumo
de açúcar do meio, quando comparada à fermentação (chamado de efeito Pasteur).
Entretanto, concentrações de glicose do meio acima de 2 g L-1 ocasionam depressão
catabólica das enzimas respiratórias das leveduras, fazendo com que a fermentação
seja a principal via de degradação de açúcar, mesmo em condições aeróbicas
(CHAPMAN e BARTLEY, 1968). Esse mecanismo é chamado de efeito Crabtree, em
que o aumento na atividade das enzimas glicolíticas e das enzimas descarboxilase
pirúvica e desidrogenase alcóolica, leva ao desaparecimento das mitocôndrias
20
citosólicas em concentrações de glicose acima de 9 g L-1, favorecendo a fermentação e
à sintese de etanol.
Os novos estudos de génetica têm mostrado as enormes vantagens das
leveduras sobre os demais microrganismos pela síntese de etanol. Segundo Piskur et al
(2006), Sabe-se que durante a fermentação, as leveduras reciclam o NADH + H+ através
da conversão do acetaldeído a etanol. Se o oxigênio é subsequentemente disponível, o
acúmulo de etanol é reconvertido a acetaldeído. A conversão do aldeído a etanol é
catalizado pelo álcool desidrogenase (ADH), que em princípio pode catalizar a reação
em uma das duas direções. Dessa forma, através do estudo de Thomson et al. (2005),
utilizando Sacharomyces cerevisae, foi verificado que a atividade citoplamática da ADH
é codificada por dois genes. Assim, existem duas enzimas álcool desidrogenase
distintas, ADH1 e ADH2, uma envolvida na síntese e a outra, no consumo de etanol
levando-o a acetaldeído novamente. A ADH1 é expressa comumentemente, enquanto
que ADH2 só é expressa quando a concentração de açúcares diminui. A enzima ADH1
tem elevado Km para o etanol, consistente com o fato do etanol de ser o produto da
reação, enquanto que o Km da ADH2 para o etanol é dez vezes menor, condizente com
o fato do etanol ser o substrato desta enzima.
No estudo realizado o autor usou várias combinações e comparações de análises
genéticas sequenciais e reconstruiu o gene da antiga enzima ADH progenitora. Além
disso, regenerou novas formas de genes ADH, que representaram antigos
intermediários, caracterizando os parâmetros cinéticos e especificidade de substrato
dessas enzimas. A interpretação dos resultados mostrou que a duplicação dos genes da
ADH está predominantemente envolvida na geração e não no consumo de etanol, sendo
essa, uma vantagem da levedura sobre os demais microrganismos. A produção de
etanol proveu a levedura, vantagens sobre outros competidores, por ser o etanol tóxico
a maioria dos outros microrganismos, apesar de poder ser consumido por esta,
posteriormente.
Na ensilagem da cana-de-açúcar ocorre extensa atividade de leveduras, que
podem estar presentes na ordem de 1x106 unidades formadoras de colônias (UFC) por
grama de forragem, e convertem os carboidratos solúveis da forragem a etanol, dióxido
de carbono e água. Essa reação pode levar a perdas excessivas de MS, a baixos teores
21
de ácido lático e acético e aumento no teor de FDA das silagens (ALLI et al., 1983),
contribuindo ainda com a deterioração aeróbica dessas silagens (DHIEHUIS et al.,
1999).
Vale ressaltar que são poucos os trabalhos como os de González e Mc Leod
(1976), Alli et al. (1983) e Bernardes et al. (2002), que determinaram o efeito de aditvos
sobre a contagem de leveduras em silagens de cana-de-açúcar, e mais raros os que
procuraram caracterizar a população epífita da cana, como López et al. (1988) e Bravo
Martins (2004), o que dificulta o entendimento sobre a produção e metabolização de
ácidos orgânicos e compostos voláteis durante a ensilagem.
A reação bioquímica da produção de etanol, catalisada pela via fermentativa de
leveduras, pode ser descrita da seguinte forma (McDONALD et al., 1991):
Glicose + 2 ADP + 2 Pi = 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O
Talvez a produção de etanol e a consequente redução no valor nutritivo da
silagem de cana, seja a principal dificuldade apresentada por essa tecnologia e o maior
desafio
da
pesquisa,
na
busca
por
processos
específicos
que
controlem
adequadamente a população e a atividade de leveduras, sem prejuízos da qualidade da
silagem e do desempenho de animais.
2.4 Uréia
A utilização de aditivos nitrogenados foi inicialmente proposto em silagens de
cana-de-açúcar, a partir de resultados de experimentos pioneiros com silagens de milho
que avaliaram solução de amônia no controle do desenvolvimento de leveduras (BRITT
et al., 1975). No caso da cana-de-açúcar, o uso destes aditivos trouxe como vantagens
a melhoria na composição química das silagens, por ser a cana pobre em proteína.
Resultados promissores foram observados nos trabalhos da década de 70,
conduzidos por Preston et al. (1976) e Alvarez e Preston (1976), testando combinações
de amônia aquosa e uréia com melaço. Ambas soluções apresentaram efeito positivo
sobre a preservação das silagens e queda na produção de etanol. O uso da amônia
22
proporcionou efeito mais pronunciado, provavelmente em decorrência do menor
consumo de açúcares solúveis durante o processo de ensilagem.
Várias são as especulações a respeito da ação dos aditivos nitrogenados em
silagens de cana-de-açúcar. Primeiramente deve ser destacado o melhor balanço
nutricional do substrato para o desenvolvimento da flora bacteriana nas silagens
aditivadas. Como a cana-de-açúcar é desbalanceada em termos de energia e proteína,
as bactérias láticas podem ter seu crescimento inibido, diminuindo a competição por
substrato com as leveduras, favorecendo a produção de etanol. As leveduras, apesar de
presentes em menor número, têm seu crescimento favorecido à medida que o meio
torna-se impróprio ao desenvolvimento dos demais microrganismos.
O trabalho desenvolvido por Keady e O’kiely (1998) em que os autores usaram
120 a 168 kg.ha-1 de nitrogênio em campos de gramíneas a serem ensilados,
obtiveram, além da maior produção e aumento do teor protéico da massa (15,9% para
16,8% na MS), silagens com menores teores de etanol (10%).
Outra influência do nitrogênio em silagens de cana-de-açúcar seria através da
ação fungicida sobre as leveduras. Britt e Huber (1975) estudaram a adição de uréia e
amônia nas doses de 0 a 1% na matéria seca sobre a população de leveduras em
silagens de milho grão. A ação do nitrogênio retardou o aparecimento de leveduras nos
primeiros 20 dias de ensilagem (3 x 103 ufc g-1 de MS) em relação a silagem controle (39
x 103 ufc g-1 de MS), com concomitante aumento no teor de ácido lático das silagens.
Uma terceira hipótese está na ação do nitrogênio no desvio na rota metabólica da
síntese de etanol. Segundo Bruinenberg et al. (1983), algumas leveduras como a S.
cerevisae não possui transhidrogenases ou a isocitrato desidrogenase para gerar
NADPH, agente redutor utilizado no crescimento, tendo que obter esse composto
através da rota das hexoses monofosfato. O maior número e aumento de massa pelo
aumento do teor de nitrogênio do meio, fazem com que haja um desvio na rota de
síntese de etanol, para a maior síntese de NADPH e consequenemente para maior
síntése de aminoácidos e peptídeos, reduzindo a síntese de etanol.
A interferência do nitrogênio sobre o padrão de fermentação foi estudada por Alli
et al (1983), pela adição de 16,9 kg NH3 t-1 MS às silagens de cana-de-açúcar. A partir
desse estudo houve constatação pelos autores, na redução na população inicial de
23
leveduras e fungos, menor produção de etanol, redução nas perdas de MS em 67,5% e
de carboidratos solúveis em 47%, aumento no teor de ácido láctico e redução no teor de
FDA, em relação à silagem controle. Devido à presença de ácido butírico na silagem
aditivada, os autores sugeriam o uso de menores doses de amônia a serem aplicadas.
Segundo Nussio e Schmidt (2005), atualmente inúmeros trabalhos vêm sendo
realizados para avaliar o efeito da uréia como aditivo em silagem de cana-de-açúcar
(PEDROSO, 2003; SCHMIDT et al., 2004; SIQUEIRA et al., 2004). Os autores
verificaram resultados interessantes quando as doses de uréia estavam entre 0,5% e
1% da MV.
Pedroso (2003) avaliou o efeito de aditivos químicos na estabilidade aeróbia de
silagens de cana-de-açúcar. Os aditivos utilizados continham diferentes concentrações
de hidróxido de sódio e uréia (0,5, 1,0 e 1,5%) da MV. Os resultados mostraram que a
menor concentração de uréia levou a uma redução na estabilidade aeróbia em 25%
quando comparada ao controle (48h vs 65h), a maior concentração resultou em
acréscimo de 22% na estabilidade (79h vs 65h). Segundo o autor esses dados
evidenciam o aumento do poder inibidor do desenvolvimento de leveduras, com o
aumento da dose de uréia.
Roth et al. (2005) trabalhando com diferentes concentrações de uréia (0,5; 1,0 e
2,0% na MV) constataram que o aumento de 1% de uréia representa uma elevação de
9,7 unidades percentuais no teor de proteína bruta. Utilizando equações matemáticas os
autores verificaram que a maior digestibilidade estava associada à adição de 1,37% de
uréia, e que o efeito do aditivo sobre a menor recuperação de hemicelulose, ocorreu
com a adição de 1,3% de uréia na MV.
Junqueira (2006) trabalhando com novilhas recebendo silagens de cana-deaçúcar aditivadas com diferentes concentrações de uréia (1,0, 1,5 e 2,0% na MV) e L.
buchneri, não observou diferença entre os tratamentos quanto ao consumo de matéria
seca (kg/d), a conversão alimentar (kg MS/kg GPD) ou taxa de ganho diário de peso
vivo. O consumo de matéria seca variou de 7,73 kg no tratamento com uréia (1,5% MV)
até 8,76 kg no tratamento com L. buchneri. A conversão alimentar variou de 8,15 para o
tratamento uréia 1,0% MV até 9,17 para o tratamento contendo L.buchneri. A taxa de
24
ganho de peso variou de 0,98 kg para o tratamento uréia 1,0% até 1,05 kg para o
tratamento contendo o L. buchneri.
2.5 Lactobacillus buchneri
O uso de aditivos microbianos, a partir de bactérias homoláticas, pode acelerar a
queda do pH, reduzir o pH final, aumentar a concentração de ácido lático, diminuir a
produção de efluentes e a perda de matéria seca no silo, melhorando o desempenho
dos animais (McDONALD et al., 1991).
Entretanto, no caso da silagem de cana-de-açúcar os resultados obtidos foram
insatisfatórios. Andrade et al. (2000), trabalhando com silagens de cana-de-açúcar
tratadas com 0,5% de uréia, 4 doses de rolão de milho (0, 40, 80 e 120 kg / tonelada de
cana picada) e com ou sem aditivo biológico (Silobac®), relataram altos teores de etanol
nas silagens aditivadas com o Silobac®, chegando a 10,6% nas silagens acrescidas com
120 kg de rolão de milho. Na silagem controle o teor de etanol foi de apenas 0,56%.
Pedroso et al. (2003) observaram, em relação à silagem controle, redução na
recuperação de MS (de 80,9 para 77,7%) e acentuada elevação na produção de etanol
(de 3,06 para 9,81% da MS), com a inoculação de bactérias homoláticas (Lactobacillus
plantarum) em silagens de cana.
Segundo Ribeiro et al. (2005) a inabilidade de bactérias ácido láticas
homofermentativas em promover estabilidade aeróbia despertou o interesse da
pesquisa pelo uso de bactérias heteroláticas capazes de produzir ácidos com efeito
antifúngico e ao mesmo tempo estáveis em meio aeróbio. O L. buchneri se tornou uma
opção como aditivo, pois além de produzir ácido acético, que é comprovadamente um
agente antifúngico (DANNER, 2002), não produz etanol, graças à ausência da enzima
acetaldeído desidrogenasse. A incapacidade de síntese de etanol pelo L. buchneri é
extremamente desejável, já que muitas bactérias heteroláticas produzem álcool quando
fermentam glicose e frutose até gliceraldeído 3 fosfato e acetilfosfato pela via 6fosfogluconato.
O uso destas bactérias como aditivos para silagens está baseado em estudos em
que se buscou melhorar a estabilidade aeróbica de silagens de milho, trigo e cevada
25
(RANJIT; KUNG, 2000; TAYLOR et al., 2002, ADESOGAN, et al., 2003). A estabilidade
aeróbica é o tempo após abertura do silo em que a temperatura da silagem permanece
até no máximo 2ºC acima da temperatura ambiente (KUNG Jr. et al., 1998). A perda da
estabilidade aeróbica reflete a presença de microrganismos oportunistas, como as
leveduras assimiladoras de ácido lático, Sacharomyces, Candidas, Cryptococcus e
Pichia e, em menor grau, fungos e bactérias assimiladoras de ácido acético e lático.
Esses microrganismos consomem tanto os ácidos orgânicos produzidos durante o
período de ensilagem quanto os açúcares remanescentes, provocando a deterioração e
diminuição do valor nutritivo da silagem, (WOOLFORD, 1990).
Neste caso, em vários estudos realizados por Muck (1996); Driehuis et al. (1999);
Ranit e Kung (2000), a bactéria heterolática Lactobacillus buchneri mostrou-se
altamente eficiente em aumentar a estabilidade aeróbica das silagens, devido à
produção de ácido acético. Apesar do tipo de fermentação realizado por bactérias
heteroláticas ser considerado desvantajoso em relação à fermentação realizada por
bactérias homoláticas, devido a maiores perdas de MS, o alto potencial antimicótico do
ácido acético mostra-se altamente eficiente no controle do crescimento de leveduras
(RANJIT e KUNG, 2000).
O efeito do ácido acético e propiônico em inibir o crescimento das leveduras foi
observado no trabalho realizado por Moon (1993), com culturas in vitro. A partir do
estudo de sinergismo entre os compostos o mesmo autor verificou que altas
concentrações de ácido lático e baixas concentrações de ácido acético aumentaram
dramaticamente o crescimento das leveduras. Além disso, a mistura do ácido acético e
propiônico (concentração acima de 10 mM) foi, dentre as misturas estudadas, a mais
eficiente em reduzir a taxa de crescimento das leveduras (50% de inibição).
Como no caso da cana-de-açúcar busca-se diminuir o desenvolvimento de
leveduras durante o período fermentativo da massa, o uso destes ácidos ou dos aditivos
microbianos que aumentem os teores tanto de ácido acético quanto de propiônico é uma
possibilidade para diminuir a síntese de etanol e melhorar o valor nutritivo da silagem de
cana.
Oude Elferink et al. (2001) demonstraram a habilidade do L. buchneri em transformar
ácido lático em 1,2-propanodiol e ácido acético. Segundo Siqueira et al. (2005) é
26
importante lembrar que a redução de ácido lático representa uma diminuição do
substrato potencialmente fermentescível por determinadas cepas de leveduras.
Inúmeros trabalhos comprovaram os bons resultados obtidos com L. buchneri
antes dessa bactéria ser estudada como aditivo em silagens de cana-de-açúcar
(NISHIRO et al,. 2003, ADESOGAN et al,. 2003,. DRIEHUIS et al,. 1999, WEINBERG et
al,. 2002).
Ranjit e Kung Jr (2000) avaliaram os efeitos de inoculantes microbianos,
homoláticos e heteroláticos, e ácido propiônico sobre a fermentação e a estabilidade
aeróbia de silagens de milho. Os autores concluíram que a adição de 1x106 ufc g-1 de L.
buchneri na forragem representou em aumento de estabilidade acima de 873,5 horas
em relação ao tratamento controle. O mesmo tratamento apresentou maior teor de
carboidratos residuais, maior concentração dos ácidos acético e lático, e pH similar ao
do tratamento com ácido propiônico depois de 3 dias de exposição das silagens ao ar.
Kung Jr et al. (2003) estudando o efeito do L. buchneri na produção de leite de
vacas alimentadas com silagem de alfafa observaram que os animais recebendo
silagem tratada com a bactéria produziram mais leite do que os animais que receberam
silagem sem aditivos, 40,7 kg/dia e 39,9 kg/dia respectivamente.
Segundo Siqueira et al. (2005) a retomada das pesquisas com silagem de cana-deaçúcar nos anos 2000 baseia-se em uma maior preocupação com o manejo pósabertura do silo. Dentro deste contexto, aditivos como L. buchneri tomam papel
importante e cada vez mais freqüente nas pesquisas nacionais (NUSSIO; SCHMIDT,
2004).
O valor nutritivo de silagem de cana-de-açúcar inoculada com L. buchneri foi
avaliado por Siqueira et al. (2005). Os autores concluíram haver maior teor de
carboidratos não fibrosos e maior digestibilidade da matéria seca em silagens aditivadas
com L. buchneri em comparação as silagens tratadas com a associação de bactérias
(“P.acidipropionici” + “L.plantarum”), uréia ou benzoato de sódio.
Pedroso (2003) avaliando o efeito de aditivos bacterianos, como L. pantarum e L.
buchneri, e químicos, benzoato de sódio, sorbato de potássio e uréia, concluiu que o L.
buchneri é um dos mais promissores aditivos, pois diminuiu a produção de etanol na
silagem e aumentou a estabilidade aeróbia. A silagem aditivada com a bactéria demorou
27
78 horas para perder a estabilidade, o que corresponde a um aumento de 63% em
relação à silagem controle, não aditivada. O teor de etanol encontrado na silagem com
L. buchneri foi de 1,9% da MS enquanto na silagem controle esse teor chegou a 4,05 %
da MS.
Toledo Filho et al. (2004) concluíram que o uso de L. buchneri foi capaz de
aumentar a estabilidade aeróbia de rações, ainda que esse aumento não tenha sido
verificado na silagem exclusivamente. A ração contendo silagem de cana-de-açúcar
sem aditivo e concentrado, apresentou estabilidade aeróbia de 1 dia, enquanto a ração
contendo a silagem aditivada com a bactéria (5x104 ufc/g) apresentou estabilidade 4
vezes maior.
Pedroso (2003) avaliando o desempenho de novilhas recebendo silagem de canade-açúcar queimada observou um aumento nos índices de desempenho dos animais
quando estes recebiam silagem tratada com L. buchneri. A melhor conversão alimentar
apresentada pelos animais recebendo a silagem aditivada (7,73 kg MS/kg GPD) em
comparação com os animais recebendo a silagem controle (9,37 kg MS/kg GPD) é
resultado de um consumo similar, associados a um ganho de peso diário 32% maior
para os animais comendo a silagem preservada com a bactéria.
2.6 Associações de microrganismos
Ribeiro et al. (2005) reportaram a importância da associação entre inoculantes para
elaboração de aditivos. Segundo os autores o aumento no interesse envolvendo grupos
distintos de microrganismos pauta-se na melhoria dos processos fermentativos, papel
desempenhado pelas bactérias homofermentativas, e no aumento da estabilidade
aeróbia
verificada
pelo
incremento
de
ácidos
produzidos
por
bactérias
heterofermentativas. Dessa forma, busca-se através do uso da combinação de bactérias
homo e heteroláticas aumentar as taxas de abaixamento do pH, reduzir o pH final,
concomitantemente com aumentos nos teores de ácido acético, aumentando a
estabilidade aeróbica do material pelo controle do desenvolvimento de leveduras
(NISHINO et al., 2003; DRIEHUIS et al., 2001).
28
Driehuis et al. (2001), em tres experimentos estudando o efeito do uso de
bacterias homo e heteroláticas em combinação ou não, em silagens de gramíneas,
verificaram em um dos ensaios, menores perdas de carboidratos solúveis e menores
perdas de MS em relação à silagem controle. Os autores concluíram que parte das
vantagens da inoculação conjunta com bactérias homoláticas foi frear um pouco a
atividade do L .buchneri, verificado pela maior relação ácido lático:acético, reduzindo as
perdas de MS.
Adesogan e Salawu (2004), trabalhando com silagens de trigo e 2 variedades de
cevada em combinação ou não, observaram grande variaçao nos resultados de perdas
de carboidratos solúveis e acúmulos de FDN, relacionados a este aditivo. Os resultados
mostraram valores semelhantes e um pouco maiores nos teores de carboidratos
solúveis pela aditivação com a combinação de bactérias muitas vezes não
representando diferenças estatísticas.
Filya
(2003)
combinando
L.
buchneri
com
bactérias
ácido
láticas
homofermentativas constatou que houve um aumento significativo de ácido acético em
silagens contendo L. buchneri e L. buchneri associado com L. plantarum quando
comparado às silagens controle, não aditivadas, e inoculadas exclusivamente com L.
plantarum. A combinação entre os diferentes tipos de bactérias propiciou a diminuição
do pH, do nitrogênio amoniacal e das perdas fermentativas.
Filya et al. (2004) observaram melhoras na estabilidade aeróbia e redução na
produção de CO2 quando associaram bactérias homofermentativas (L. plantarum) com
bactérias
heterofermentativas
produtoras
de
ácido
acético
e
propiônico
(P.
acidipropionici).
As melhorias em estabilidade aeróbia e a diminuição da população de leveduras
observadas por Driehuis et al. (1999) são atribuídas ao aumento na concentração dos
ácidos propiônico e acético, que apresentam efeito antifúngico e sinergístico (MOON,
1983), além do 1-propanol (DANNER et al, 2002). A combinação de bactérias homo e
heterolática ainda não havia sido testadas em silagens de cana-de-açúcar não se tendo
idéia do processo fermentativo advindo do uso deste aditivo.
29
Referências
ADESOGAN, A.T.; SALAWU, M.B.; ROSS, A.B.;DAVIES, D.R.; BROOKS, A.E. Effect of
Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fermentum, Leuconostoc mesenteriodes inoculants,
or chemical additive on the fermentation, aerobic stability, and nutritive value of crimped
wheat grains. Journal of Dairy Science, Lancaster, v. 86, p.1789-1796, 2003.
ALLI, I.; FAIRBAIRN, R.; BAKER, B. E.; GARCIA, G. The effects of ammonia on the
fermentation of chopped sugarcane. Animal Feed Science and Technology,
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35
3 DINÂMICA DA FERMENTAÇÃO, DAS PERDAS DE MATÉRIA SECA,
DESENVOLVIMENTO DA MICROFLORA EPÍFITA E ATIVIDADE DA ÁLCOOL
DESIDROGENASE EM SILAGENS DE CANA-DE-AÇÚCAR
Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar a dinâmica fermentativa, composição
bromatológica, atividade enzimática da álcool desidrogenase e desenvolvimento da
micloflora em silagens de cana-de-açúcar. No ensaio conduzido durante 110 dias foram
utilizados silos experimentais contendo sistema de drenagem e válvulas para escape de
gás permitindo assim a mensuração de perdas de efluente e gases, além da perda total
de matéria seca. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente ao acaso, com
seis épocas de abertura e 2 repetições (1, 3, 7, 15, 35, 110 dias). As maiores variações
na composição bromatológica da cana-de-açúcar e perdas de MS ocorreram dos 7 aos
15 dias de ensilagem, estabilizando após esse período. Pelas altas taxas de perdas
entre o 7º e o 15º, polinômios de terceiro grau melhor se ajustaram para predizer as
variações durante a fermentação da ensilagem da cana-de-açúcar. As regressões
ajustadas para os parâmetros perdas de MS e carboidratos solúveis foram bem
similares e de forma contrária ao acúmulo de FDN. As perdas por gases atingiram
valores médios de 28,27%, de carboidratos solúveis em apenas 2,98% e FDN em torno
de 67,77% da MS. De forma contrária, os aumentos nos teores de etanol e perda na
digestibilidade se extenderam até o 35º, com valor máximo de etanol em torno de
12,23%. Pela alta correlação entre o teor de etanol e digestibilidade (r2= 0,98) foi
possível relacionar essas duas variáves, mostrando que para cada 1% de aumento nos
teores de etanol, 2 unidades de digestibilidade foram perdidas. Apesar dos altos teores
de ácido acetico e os baixos valores de pH observados a partir do 3º dia de ensilagem,
não foram verificados efeitos destes sobre a populacao de leveduras e sobre a atividade
da enzima álcool desidrogenase, apresentando altos valores na última data de
ensilagem. Os valores de ácido lático e propiônico foram baixos, o que evidência a
fermentação predominantemente alcoólica e a grande dificuldade de inibição das
leveduras.
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, Etanol, Ácidos orgânicos, Leveduras, ADH.
36
Abstract
FERMENTATION, DRY MATTER LOSSES, EPIPHYTIC DEVELOPMENT AND
ALCOHOL DEHYDROGENASE ACTIVITY IN SUGARCANE SILAGE
The present trial aimed to study the ensiling associated factors of sugarcane
(Saccharum officinarum L.) focusing on fermentation, chemical composition, enzymatic
activity of alcohol dehydrogenase and the microflora development in sugarcane silages.
A 110-d trial was performed using lab silos provided with effluent drainage system and a
valve to allow the escaping of gases and the overall DM losses measurement. A
complete randomized design was set two replications within 6 opening dates (1, 3, 7, 15,
35, 110-d). Major variation observed on the chemical composition and the DM losses in
sugarcane silages took place from the day 7 through the day 15. Cubic equations were
best fitted to predict the high DM losses during the fermentation. Losses of DM and
soluble carbohydrates showed similar trend and in opposition to the NDF increase.
Gases losses reached averaged 28.27%, while the soluble carbohydrates and NDF
contents were respectively, 2.98% and 67.77% when fermentation was stabilized.
Conversely, ethanol and the digestibility were changed across the storage period up to
the day 35, with ethanol content increasing to 12.23%. Due to the correlation between
ethanol and digestibility (r2 = 0,98) each 1% of ethanol increase was associated with 2
percentage units of digestibility decrease. Even tough all silages has shown high acetic
acid contents, and low pH in 3th day, no significant effects were observed upon the yeast
counts and alcohol dehydrogenase activity, presenting high values at the last opening
silos date. Levels of lactic acid and propionic acid were low showing predominantly
alcohol fermentation and how difficult is to inhibit yeats.
Key words: Sugar cane, urea, ethanol, organic acids, yeasts, ADH.
37
3.1 Introdução
A utilização da cana-de-açúcar fresca na alimentação de bovinos, submetida a
cortes diários, na época seca do ano, é tradicional e de amplo conhecimento dos
pecuaristas. Esta tecnologia tem como vantagens, a alta produtividade de massa verde
(80 a 120 t/ha), o baixo custo por unidade de matéria seca (MS), a manutenção do valor
nutritivo até seis meses após a maturação e o período de colheita coincidente com o
período de escassez de forragem nas pastagens (SILVA, 1993).
Atualmente, no entanto, tem-se realizado a ensilagem desta planta forrageira, por
problemas logísticos e operacionais, na suplementação de rebanhos numerosos, para
melhorar a eficiência na colheita e facilidade no manejo de canaviais, ou ainda evitar a
perda da forragem na ocorrência de fogo e geadas.
Embora possa representar uma solução operacional, as silagens produzidas
exclusivamente de cana-de-açúcar levam a fermentação alcóolica, com perdas
acentuadas no valor nutritivo e de matéria seca propiciando baixo consumo voluntário e
desempenho animal insatisfatório.
Vários trabalhos têm evidenciado que a cana-de-açúcar ensilada sem o uso de
aditivos, devido ao intenso processo de fermentação alcóolica, leva a perda do valor
nutritivo, com grande redução no conteúdo total de açúcares. Trabalhos pioneiros
realizados por Preston et al. (1976), mostraram que a ensilagem da cana-de-açúcar por
49 dias apresentou teor alcóolico de 5,49% na MS, e redução de aproximadamente 30%
no conteúdo total dos açúcares e da sacarose em relação à cana fresca (44,4 e 40,7
para 31,1 e 27,5% da MS, respectivamente).
Kung Jr. e Stanley (1982), avaliaram o efeito do estágio de maturação da canade-açúcar no valor nutritivo das silagens. A cana ensilada a partir dos 6, 12 e 24 meses
apresentou valores de digestibilidades de 54,9; 55,0 e 50,0 % e consumo de matéria
seca de 9,31; 6,12 e 6,35 g MS/kg peso vivo, respectivamente. Os autores atribuíram o
decréscimo nos valores tanto de digestibilidade como de consumo de MS às
concentrações de ácido acético (1,5; 1,88 e 1,40 % MS) e de etanol (7,50; 15,45 e 17,52
% MS).
38
Em estudos posteriores sobre a fermentação de cana-de-açúcar em silos
experimentais, Alli et al. (1983), observaram aumento no teor de fibra em detergente
ácido (FDA) de 29,9 para 43,1% na MS e perda de aproximadamente 5% da MS, em
relação à cana fresca. Os autores ressaltaram que o teor de etanol nas silagens (8,86%
da MS), correspondeu à perda pela fermentação de aproximadamente 50% da sacarose
presente na cana fresca.
Atualmente o tema silagem cana-de-açúcar voltou a se tornar destaque no
cenário agropecuário, por todos as vantagens logísticas e operacionais associadas, bem
como pelos grandes avanços no controle dos teores de etanol, associado ao uso de
aditivos tanto químicos quanto microbianos (QUEIROZ, 2006). Segundo Shmidt (2006),
observa-se em média 11 trabalhos publicados do ano de 2003 a 2005, buscando o
controle da fermentação alcoólica em silagens de cana-de-açúcar.
No entanto, segundo Pedroso et al. (2005), ainda são poucos trabalhos de
pesquisa realizados no Brasil, que forneceram dados dos processos fermentativos e as
perdas inerentes em silagens de cana-de-açúcar. Trabalhos recentes como os de Coan
et al. (2002) e Molina et al. (2002), mostraram as reduções nos teores de MS com o
aumento no período de fermentação. Andrade et al. (2001) e Bernardes et al., (2002)
evidenciaram os teores de etanol em torno de 7,0% nestas silagens e sua relação com a
queda na digestibilidade. Junqueira (2006), verificou a queda nos teores de carboidratos
solúveis com o avanço nos dias após a ensilagem e Pedroso et al. (2005) caracterizou
as perdas e o desenvolvimento da microflora epifítica nas silagens de cana-de-açúcar.
O objetivo deste estudo foi fornecer um conjunto mais abrangente de informações
sobre as mudanças que ocorrem com a cana-de-açúcar durante a ensilagem, estudando
a dinâmica da fermentação associada às perdas na ensilagem e a variação no valor
nutritivo em relação ao material original. Além disso, buscou-se caracterizar o
desenvolvimento de bactérias láticas e leveduras, assim como a atividade da enzima
álcool desidrogenase catalizadora da síntese de etanol.
39
3.2 Material e métodos
3.2.1 Local do experimento
O experimento foi realizado no Departamento de Zootecnia da USP/ESALQ, em
Piracicaba-SP, com início em 03 de novembro de 2004.
3.2.2 Silos laboratoriais e confecção da silagem
As silagens foram confeccionadas com cana-de-açúcar da variedade RB72454, colhida manualmente com 12 meses de crescimento. O valor do grau brix da
forrageira foi determinado através de um refratômetro de campo (marca TOKYO®,
modelo 032) indicando valor médio de 23,4°. A cana foi colhida manualmente e picada,
sem a retirada da palha, através de uma picadora de forragens modelo estacionário,
regulada para corte com tamanho de partícula médio de 10 mm.
Para a produção dos silos experimentais (unidades experimentais), foram
utilizados 12 baldes de plástico de 20 litros (minisilos), com tampas próprias para
vedação e adaptadas com válvulas tipo Bunsen, para que fosse possível o escape de
gases e a avaliação das perdas gasosas durante o tempo de estocagem. No fundo de
cada balde foram colocados dois quilos de areia seca e uma tela fina de plástico, com a
finalidade de serem avaliados quantitativamente os efluentes.
3.2.3 Enchimento dos silos
O cálculo para estabelecer o peso total da forragem foi determinado tendo como
objetivo atingir a densidade de 550 kg/m3. Dentro deste contexto, camadas sucessivas
com 10 cm de espessura foram compactadas com os pés até o peso final do balde
atingir aproximadamente 12 kg de forragem.
Após o enchimento, os minisilos foram fechados e vedados com fita plástica autoadesiva, para impedimento da entrada de ar. Os silos foram então pesados e
armazenados em local coberto.
40
Durante o enchimento dos silos amostras foram retiradas para determinação do
teor de matéria seca da forragem e para produção do extrato aquoso (KUNG JR, 2000).
3.2.4 Avaliação das perdas e amostragem das silagens
Os silos laboratoriais foram abertos aos 1, 3, 7, 15, 35 e 110 dias após a
ensilagem. Os baldes foram avaliados quanto as perdas de matéria seca total, perdas
gasosas e perdas por efluentes. O peso dos baldes e de seus componentes individuais
foram medidos previamente, desta forma possibilitando os cálculos de perdas.
Na abertura foram anotados os pesos dos baldes com e sem a forragem. O
conjunto (silo laboratorial) sem a forragem foi constituído pela tampa, o próprio balde e o
sistema de drenagem a tela e a areia. A diferença de peso entre o conjunto vazio antes
do enchimento, e a medida do mesmo conjunto vazio após a abertura, permitiu estimar
o calculo de perdas por efluente.
A perda gasosa pode ser quantificada pela diferença entre a quantidade de matéria
seca da forragem no fechamento do silo, e a quantidade de matéria seca existente no
balde na época da abertura.
As perdas totais de matéria seca resultam da diferença entre a quantidade de
matéria seca da forragem ensilada no fechamento do silo, e a quantidade de matéria
seca na forragem recuperada, descontando-se desta a perda por efluente. De uma
maneira simplificada, pode ser equacionar a perda total de MS como a soma das perdas
por gás e efluente.
41
3.2.5 Equações para estimar perdas
Perda gasosa (%MS), eq. (1).
⎧ (MSis − MSfs ) ⎫
PG = ⎨
⎬ × 100
MSis
⎩
⎭
(1)
em que:
PG= perda gasosa;
MSis= Matéria seca inicial descontada a tara seca= (Peso do balde após enchimento – peso
do conjunto vazio (sem a forragem) antes do enchimento) x teor de MS da forragem no
fechamento;
MSfs= Matéria seca final descontada a tara seca= (Peso do balde cheio antes da abertura peso do conjunto vazio (sem a forragem) antes do enchimento) x teor de MS da forragem na
abertura.
Perda por efluente (kg/t), eq (2).
PE =
Pef × 1000
MVi
(2)
em que:
PE= perda por efluente;
Pef= peso de efluente= (Peso do conjunto vazio antes da abertura – peso do conjunto vazio
antes do enchimento);
MVi= quantidade de massa verde da forragem ensilada.
42
Perda total de matéria seca (%MS), eq. (3)
⎧ (MSis − MSfu ) ⎫
PMS = ⎨
⎬ × 100
MSis
⎩
⎭
(3)
em que:
PMS= perda total de matéria seca;
MSis=Matéria seca inicial descontada a tara seca= (Peso final do balde após enchimento –
peso do conjunto vazio (sem a forragem) antes do enchimento) x teor de MS da forragem no
fechamento;
MSfu= Matéria seca final descontada a tara úmida= (Peso do balde cheio antes da abertura
- peso do conjunto vazio (sem a forragem) na abertura) x teor de MS da forragem na
abertura.
3.2.6 Análises químico-bromatológicas
As amostras secas de silagem foram moídas contra peneira de malha de 1 mm e
posteriormente analisadas para:
Matéria seca em estufa a 105°C por 24 horas.
Matéria mineral obtida pela incineração das amostras em mufla a 600°C por 3
horas.
Os teores de fibra em detergente neutro (FDN) e a digestibilidade verdadeira “in
vitro” da matéria seca (DVIVMS) (CAMPOS et al., 2005)
Os teores de proteína bruta (PB) segundo AOAC (1990)
O teor de PB para o tratamento com uréia foi determinado pelo método macro
Kjeldahl (AOAC, 1990), em amostras úmidas de silagem que haviam sido mantidas
congeladas (-5°C).
Os teores de etanol, carboidratos solúveis (CS), ácido graxos voláteis (AGVs) e
ácido lático foram determinados em extratos aquosos das amostras de silagem, obtidos
segundo método descrito por Kung, Jr. (1996). Para isso 25 g de amostra úmida foram
processados com 225 mL de água destilada, em liquidificador, durante um minuto. Em
seguida, o material foi filtrado em papel de filtro Whatman® 54, acidificado com H2SO4 a
50% e centrifugado (5000 x g) por 15 min, sendo o extrato líquido armazenado em
43
congelador (-5 °C) até o momento das análises. O pH foi determinado nos extratos,
antes da filtragem, através de um potenciômetro digital, modelo DM 20® (Digimed
Analítica, São Paulo). O teor de etanol foi obtido por leitura direta em autoanalisador
bioquímico YSI 2700 Select (Biochemistry Analyser, Yellow, Spring,), contendo
membrana enzimática específica para esse analito. As determinações dos teores de CS
foram realizadas pelo método colorimétrico de Dubois et al. (1956), diluindo os extratos
aquosos das amostras de silagem na proporção de 1 mL de extrato para 20 mL de água
destilada. Os teores de ácido lático foram determinados por cromatografia líquida de alta
performance (HPLC), utilizando coluna de troca catiônica (Polyspher OA HY 51272;
Merck, Amsterdam). A fase móvel consistiu de H2SO4 (0,004 mol L-1), a uma taxa de 0,6
mL min-1 a 40°C.
3.2.7 Determinação da atividade da álcool desidrogenase ADH
Para a obtenção dos extratos enzimáticos brutos, primeiramente as amostras
foram homogeneizadas por maceração em graal, adicionados 5 mL de extrator e
centrifugados a 30.000g por 10 minutos a 4ºC. O extrator foi constituído de tampão
fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,5 (4,82 mL), MgCl2 6 H2O, 0,5 M (100 μL), EDTA 0,1 M e
dihidro teitrol (DTT) 1,0 M (10 μL), Fenil metil sulfonil fluoride (PMSF) 0,4 M (10 μL) e
Polivinil polipirrolidona (PVPP) (100 mg). Os extratos obtidos foram armazenados a –
20ºC.
Para o ensaio com a ADH utilizou-se protocolo estabelecido por Maitra e Lobo
(1969). Foram adicionados 40 μL do extrato enzimático em 0,9 mL do meio de reação
composto de tampão Tris-HCl 50 mM pH 8,9 e DTT 2 mM, 20 μL de NAD+ 37,5 mM e 40
μL de etanol, incubando-se a mistura durante 15 minutos a 30ºC. O NADH+H+ produzido
foi determinado em espectrofotômetro a 340 nm e a unidade de atividade enzimática
definida como 1 nmol de substrato convertido por minuto por mg de proteína a 30ºC.
A determinação da proteína procedeu-se pelo método de Bradford (Lowry et al.
1951), nos mesmos extratos brutos utilizados no ensaio enzimático. As alíquotas para
determinação, foram de 300 μL do extrato, e 1 mL do reagente Comassie, constituído de
0,01% de Comassie Blue G-250, 8,5% de ácido fosfórico e 4,7% de etanol. Depois de
44
homogeneizadas as alíquotas em vortex a leitura foi feita em espectrofotômetro a 595
nm, sendo os valores expressos com base na curva padrão obtida a partir de diferentes
concentrações de soro-albumina bovina.
3.2.8 Caracterização da microflora epífita
Amostras da cana-de-açúcar obtidas antes da ensilagem, e das silagens nos dias
de abertura dos silos experimentais foram utilizadas para contagem de bactérias láticas
e leveduras presente na forragem.
O isolamento e a contagem dos microrganismos foram realizados através do
“plaqueamento” em meio seletivo, segundo método descrito por Lin et al. (1992).
Amostras das forragens (25 g) foram pesadas em recipientes esterilizados contendo 250
mL de tampão fosfato de potássio dibásico 0,7 mM (pH, 7,0) e homogenizadas por 60s.
Diluições em série (x 10) foram realizadas com a solução tampão. Os microrganismos
foram isolados posteriormente com o uso dos respectivos meios de cultura seletivos
(SEALE et al., 1986), como segue:
Bactérias produtoras de ácido lático: Rogosa SL agar (Difco Laboratories, Detroit,
MI) foi utilizado para contagem dos grupos contendo Lactobacilos, Pediococos e
Leuconostocs. As contagens foram realizadas após incubação das placas por dois dias
a 35 °C.
Leveduras: Malt agar (Difco) com adição de ampicilina (200 μg/mL) e tetraciclina
(200 μg/mL) para inibição do crescimento de bactérias. A contagem foi realizada após
dois dias de incubação a 25 °C.
3.2.9 Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com duas
repetições. O modelo proposto foi analisado pelo PROC GLM do programa SAS (SAS,
1999) e as comparações das médias obtidas nas datas de abertura foram realizadas
utilizando-se o método dos quadrados mínimos (LSMEANS). Foram declaradas
significativas as diferenças entre médias a partir de p<0,05.
45
3.3 Resultados e Discussão
As análises químico bromatológicas da cana-de-açúcar, utilizada na preparação
das silagens apresentaram valores de matéria seca semelhantes à maioria dos
trabalhos apresentados na literatura (AROEIRA, et al., 1992; CARVALHO, 1992;
MIRANDA et al., 1999; RODRIGUES; BARBOSA, 1999; PEREIRA et al., 2001;
AZEVEDO et al., 2003; FERNANDES et al., 2003; Tabela 1). Os teores de carboidratos
solúveis foram próximos e acima dos encontrados por Pedroso et al. (2003) e Bernardes
et al. (2002) de 17,8 e 24%, porém bem inferiores aos observados por Alli et al. (1982) e
Campos et al. (2001) de 52 e 46,9%, respectivamente. Os teores de FDN encontrados
foram próximos aos encontrados por Azevêdo et al. (2003) e Fernandes et al. (2003),
que avaliaram 15 variedades industriais com 16 meses (48,8 e 48,5%). Os teores de PB
da cana estão próximos aos encontrados por Coan et al. (2002), Molina et al. (2002),
Pedroso et al., (2003) e Freitas et al., (2006), na média 2% na matéria seca. Os valores
de DVIVMS da cana-de-açúcar utilizada estiveram próximos aos limites estabelecidos
por Rodrigues (2001), de 58 a 69% ao estudar dezoito variedades e de Campos et al
(2006), de 60,9%. No entanto, os valores de DVIVMS estão abaixo dos valores obtidos
por Freitas et al., (2006), de 77,5% na MS.
Tabela 1 - Composição químico-bromatológica da cana-de-açúcar
Variável
Cana-de-açúcar
MS (%)
31,06
DVIVMS (%)
CZ(%MS)
63.63
1,66
PB(%MS)
2,83
FDN(%MS)
48,69
CS(%MS)
21,69
Na tabela 2 são apresentados os valores médios das variáveis nas datas de
abertura dos silos. Pela análise dos dados verifica-se que os acúmulos de FDN e perdas
de Carboidratos solúveis e por gases ocorreram principalmente entre o 7º e 15º dia de
46
fermentação. Os maiores teores de etanol e menores teores de digestibilidade, no
entanto, foram alcançados até o 35º dia.
Tabela 2 - Composição bromatológica, perdas de MS, ácidos orgânicos e atividade
enzimática da ADH em silagem de cana-de-açúcar
Parâmetros1
Dias após ensilagem
7
15
A
30,41
23,29B
MS (%)
1
31,92A
3
30,64A
35
24,42B
110
22,51B
MM (% MS)
1,82C
1,58C
1,74C
2,23B
2,32AB
PB (% MS)
2,41A
2,43A
2,70A
3,21A
FDN (% MS)
48,65C
47,05C
51,70B
CS (% MS)
21,37B
26,50A
DVIVMS (% MS)
67,83A
Gases (% MS)
-2,54C
-1
Efluentes g t MV
RMS (% MS)
7,10
C
101,81
Etanol (% MS)
0,18
D
C
EPM
27,20
0,40
2,55A
2,04
0,12
3,55A
3,51A
2,97
0,24
66,59A
68,62A
68,12A
58,46
1,27
12,87C
4,07D
2,38D
2,51D
11,62
1,78
67,96A
65,45A
58,78B
51,47C
50,42C
60,32
2,77
3,25B
4,42B
27,99A
25,64A
31,22A
15,00
1,56
A
A
A
27,53
2,43
C
82,75
1,47
4,49
0,67
1,17A
0,69
0,09
10,45
A
Média
C
95,72
1,34
B
D
B
28,98
B
92,74
B
0,97
D
B
42,03
68,86
3,93
C
37,40
71,42
39,20
C
65,95
A
B
C
12,23
B
A
8,27
B
Ác.lático (% MS)
0,00
0,13
Ác.Latico mmol L-1
0,00C
4,47B
11,73B
25,49B
57,75A
39,49B
23,15
26,36
C2 (% MS)
3,41C
4,03BC
4,35B
5,26A
4,77AB
5,55A
4,56
0,18
C2 mmol L-1
172,48C
203,69BC
219,94B
265,77A
241,24AB
280,58A
230,62
36,80
C3 (% MS)
0,12B
0,18AB
0,20AB
0,25A
0,23AB
0,23AB
0,20
0,04
C3 mmol L-1
4,52B
7,00AB
7,90AB
9,65A
8,97AB
8,72AB
7,79
14,74
Ac. Lático:C2
0,000C
0,032B
0,085B
0,144B
0,361A
0,211AB
0,03
C3:C2
LAB Log Ufc g
-1
LEV Log Ufc g
-1
PH
ADH
nmol g-1 PB min-1
A
8,50
A
7,78
A
4,11
A
19,53A
0,03
A
6,49
B
6,18
B
3,73
B
97,39B
0,35
0,04
8,12
6,97
A
A
AB
3,16
C
117,11B
0,76
0,04
5,60
C
6,70
3,09
A
B
CD
137,07B
1,72
0,04
3,35
D
6,23
2,99
A
B
D
156,37B
0,151
0,05
A
0,04
0,005
2,05
E
5,69
0,12
5,85
B
6,62
0,48
D
3,34
0,11
0,03
2,94
211,88A
123,22
25,97
1
RMS – Recuperação total de matéria seca; C2 – ácido acético; C3 – ácido propiônico; LAB – Contagem
de bactérias láticas; LEV-Contagem de leveduras; ADH-atividade da álcool desidrogenase.
Letras diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (p<0,05).
Várias conclusões podem ser feitas baseadas nos resultados apresentados pelas
silagens de cana-de-açúcar. Primeiramente, esses resultados nos mostram que o
decréscimo acentuado no teor de carboidratos solúveis em função do tempo de
ensilagem, ocorre de maneira inversa ao observado para perdas de gases e produção
de etanol. Segundo McDonald et al. (1991), a síntese de etanol pelos microrganismos
47
indesejáveis, principalmente leveduras, é feita com base na utilização dos carboidratos,
gerando, para cada 1 mol de glicose consumida, 2 moles de CO2, responsável pelo
aumento nas perdas gasosas e conseqüentemente, pelo aumento em perdas totais de
matéria seca.
Segundo, pela análise de tendência temporal, é observado que o consumo de
carboidratos solúveis e acúmulo de FDN não está em sincronia com a síntese de etanol
e a digestibilidade in vitro da MS. Várias hipóteses podem ser formuladas para explicar
esse efeito: 1) o baixo número de repetições utilizadas no experimento (n=2). Esse fato
faz com que, no caso de variáveis com altos coeficientes de variação (peculiar a análise
por espectrofotometria, no caso dos teores de CS), não permitiu a obtenção de maior
exatidão, que caracterizasse melhor essas silagens no início da fermentação; 2) os
carboidratos solúveis das silagens podem ter sido inicialmente metabolizados a outros
compostos, mais estáveis que o etanol, como outros álcoois e aldeídos, não
constituindo, assim, perda de MS, embora sejam observadas reduções na fração CS.
Interessante observar nas silagens deste estudo, que os valores de CS
consumidos não foram suficientes para atingir os valores de massa de etanol acumulado
aos 35 dias de fermentação. Para efeito de cálculo, utilizou mesmas suposições feitas
por Pedroso (2003). Assim, pela análise da composição químico-bromatológica da cana
supõe que para cada 100 g de MS de forragem ensilada, existiam 21,73 g de CS antes
da ensilagem. Aos 35 dias de fermentação, foram consumidos 18,99 g de CS e
produzidos 12,23 g etanol. Considerando-se que para cada mol de hexose fermentada
(180 g mol-1), são produzidos 2 moles de etanol (46 g mol-1), poderia ser obtidos, no
máximo 9,7% de etanol na matéria seca e não 12,23% como observado. Isso
demonstra, em parte as falhas e alta variabilidade em se determinar o real teor de
carboidratos solúveis e etanol nas silagens de cana-de-açúcar.
As diferenças nos métodos de obtenção das amostras para a análise de
carboidratos solúveis podem ser umas das explicações as falhas observadas e a grande
diferença entre os ensaios com cana-de-açúcar. Em alguns ensaios, a determinação do
teor de carboidratos solúveis é feita utilizando a amostra seca, moída em peneira de
1mm e em outros, se utiliza o extrato aquoso para a análise (AOAC, 1990). Seria
interessante talvez, fazerem estudos para se determinar qual dos métodos se obtém
48
valores mais reais, podendo ser aceito como padrão a ser utilizado nos trabalhos com
silagens.
Por fim, os dados dos teores de etanol, no presente estudo, nos indicam que a
fermentação alcoólica nas silagens de cana-de-açúcar se estenderam por vários dias,
levando a grandes perdas em digestibilidade (Figura 1). Esse processo ocorreu
diferentemente de outras forrageiras, que atingem maiores teores de ácido lático em
curtos intervalos de tempo, inibindo o desenvolvimento microbiano e as reações
fermentativas na massa (McDONALD, et al., 1991). Pela relação entre os teores de
etanol e digestibilidade, verifica-se que até próximo a 10% de etanol na MS, para cada
incremento em etanol houve perdas em torno de duas unidades da digestibilidade.
Alli e Backer (1982) e Pedroso et al., (2005), estudando, do mesmo modo a
dinâmica da fermentação em silagens de cana-de-açúcar, observaram aumentos na
concentração de etanol durante a ensilagem, atingindo valores máximos, em apenas 15
dias de ensilagem.
No caso das silagens produzidas por Alli e Backer (1982), a exaustão nos teores
de carboidratos solúveis (apenas 1% na MS), foram responsáveis pela parada no
incremento em etanol das silagens. No caso de Pedroso et al. (2005), como os teores
de CS e etanol continuaram variando dos 15 ao 45 dias, apesar de não serem
estatísticamente significativas as diferenças, pode ter ocorrido continuidade na
fermentação alcoólica, assemelhando-se a situação do presente trabalho.
49
Figura 1 - Relação entre os teores de etanol e a digestibilidade de silagens de cana-de-açúcar
Os resultados referentes ao teor de MS das silagens (Tabela 2) revelaram valores
comumente encontrados na literatura e são diferentes entre si em função do tempo de
fermentação. A média dos teores observados, após a estabilização nas perdas, foi de
23,40%. Queiroz (2006) analisando diferentes aditivos em silagens de cana-de-açúcar
obteve após 120 dias de fermentação valores tambem em torno de 23%. Pedroso
(2003), trabalhando com o mesmo tipo forragem obteve 26,6% de MS, enquanto Freitas
et al. (2006) observaram valores bem inferiores, de 21,40% MS.
Como comentado anteriormente, o estudo da tendência temporal da fermentação
das silagens de cana-de-açúcar mostra perda de materia seca, apenas durante os
primeiros 15 dias de fermentação. A partir desse ponto, a silagem se manteve estável,
sendo constante os valores até os 110 dias de ensilagem (Tabela 2).
Os resultados apresentados por Alli et al. (1983) e Pedroso et al. (2005), apesar
de terem evidenciado produções de etanol apenas até o 15º dia, de forma contraria,
50
observaram perdas de MS até próximo aos 45 dias, sendo em torno de 15 e 30%,
respectivamente. As perdas de matéria seca, neste trabalho, foram em torno de 27%,
próximos aos valores observados por Freitas et al. (2006) e Queiroz (2006), de 25 e
26%, respectivamente.
Os teores de matéria mineral foram acrescidos até os 35 dias de fermentação
atingindo valores médios de 2,55% na MS (Tabela 2). Pedroso et al. (2005),
demonstraram existir um aumento no teor de matéria mineral em função do tempo de
fermentação da silagem, que tendeu a se estabilizar (4,01%), em apenas 15 dias de
estocagem. As diferenças de concentração de matéria mineral foram relacionadas às
perdas gasosas resultantes de fermentações levando ao aumento na concentração dos
minerais pela diluição da matéria seca da forragem. Os valores obtidos foram bem
inferiores aos valores encontrados na literatura, como os de Kung, Jr. e Stanley (1982)
de 7,37% MS, em silagens de cana-de-açúcar colhida com um ano de crescimento
vegetativo.
Os valores de FDN encontrados nas silagens foram altos em relação à maioria
dos trabalhos na literatura (ALLI E BACKER, 1982 e COAN et al., 2002), porém próximo
a trabalhos recentes de Pedroso et al. (2003) e Freitas et al. (2006), em torno de 65%.
Da mesma forma ao que foi observado por Junqueira (2006), houve um aumento
progressivo do teor de FDN das silagens de cana-de-açúcar à medida que o tempo de
fermentação se prolongou, resultando na diminuição do teor de carboidratos solúveis,
transformados em gases e água durante a fermentação.
No presente ensaio, apesar de não ser observado sincronia entre os teores de
carboidratos solúveis e de etanol, houve alta similaridade no ajuste dos dados para as
variáveis perdas de MS e CS e, de forma contrária ao acúmulo de FDN, em função do
tempo de fermentação. A tendência de variação nas concentrações de CS evidenciou
comportamento oposto ao da concentração de FDN, com consumo intenso até o 15º
fermentação, e desaparecimento de 86% do total, no inicio da ensilagem (Figura 2).
51
Figura 2 – Variação nos teores de FDN, carboidratos solúveis e perdas por gases durante a ensilagem da
cana-de-açúcar
Interessante observar pelas curvas ajustadas, que dos 7 aos 15 dias de
fermentação observaram altas taxas e perdas de CS, MS e acúmulos de FDN. As
silagens apresentaram em torno de 12% de perdas de MS na forma de gases, e destes
em torno de 9% como CS, levando ao acúmulo aproximado de 7% de FDN. Além disso,
nesse período observam-se taxas próximas a 1,7% de perdas de MS por dia na forma
de gases, sendo 1,3% por dia em carboidratos solúveis, levando a 1,2% por dia de
acúmulo de FDN. Esses valores são considerados altos, indicando perdas próximas a
20 kg por dia de MS e de 13 kg de carboidratos solúveis por tonelada de cana, caso não
se controle a fermentação alcoólica.
Alli et al. (1983) observaram diminuição dos teores de carboidratos solúveis em
silagens de cana-de-açúcar em função do tempo, sendo que a planta original continha
34,2% da MS, e após 55 dias decresceu para 1,27% da MS. As perdas de carboidratos
solúveis nesse estudo foram maiores do que no presente ensaio, com perdas de CS a
uma taxa de 2,25% do 2º ao 7º dia. Pedroso et al. (2005), apresentou valores de taxas
52
nas perdas de CS e MS semelhantes ao do presente trabalho, em torno de 1% do 7º ao
15º dia.
As perdas de CS observadas foram próximas às relatadas por Alli e Backer
(1982), Alli et al. (1983) e Freitas et al. (2006) de 93, 96, 89%, sendo esses valores bem
superiores aos obtidos por Pedroso et al. (2004), de 61%.
Apesar de aumentos numéricos, não foi significativo o acúmulo nos teores de
proteína bruta, durante a fermentação. Isso se deve, em parte, aos baixos valores de PB
da cana-de-açúcar e o baixo número de repetições, não permitindo que essa relação
fosse melhor melhor comparada.
Diferentemente de Pedroso et al. (2004), não houve diminuição na concentração
de proteína bruta até o 3º dia após o fechamento do silo. Segundo o autor, essas perdas
inicias podem ser creditadas à perda de amônia produzida pela ação proteolíticas das
enzimas das células da forragem, além da ação de enterobacterias e clostridiuns, que
atuam enquanto o pH da silagem não é suficientemente baixo para a inibição do
processo catalítico. Como o pH da silagem (Tabela 2), atingiu valores inferiores a 4,0 no
3º dia de fermentação, a proteólise foi interrompida e as proteínas da silagem tiveram
aumento em concentração devido principalmente à perda de carboidratos solúveis (CS)
na forma de CO2 e água, pelo metabolismo das leveduras (McDONALD et al., 1991).
Os valores de pH foram abaixo dos comumente encontrados na literatura, em
média 3,0, tornando estável após 35 dias de fermentação. Os valores obtidos neste
estudo mostram que o pH não é o fator limitante em silagens de cana-de-açúcar, no
entanto, nao pode ser usado como medida de qualidade, uma vez que essa variável não
esteve associada à redução nas perdas de MS. Os trabalhos publicados têm mostrado
valores de pH variando de 3,2 a 3,8 (KUNG JR.; STANLEY, 1982; ANDRADE et al.,
2001; PEDROSO et al., 2004; FREITAS et al., 2006; QUEIROZ, 2006).
Do mesmo modo que Pedroso et al. (2005), ao avaliar a dinâmica fermentativa
em silagens de cana-de-açúcar foram verificados valores de pH abaixo de 4,0 no
terceiro dia de ensilagem. Apesar dos valores de pH abaixo de 4,2 serem considerados
adequados para manutenção e controle de perdas, na grande maioria das silagens
(McDONALD et al., 1991), não houve controle de leveduras.
53
As perdas por gases foram altas e próximas aos valores encontrados por Queiroz
(2006), em torno de 30%. Os valores obtidos são superiores aos relatados por Pedroso
et al., (2003) e Junqueira (2006) de 15 e 22%, e bem divergentes aos valores obtidos
por Alli et al. (1983), de 6,63% na MS. As grandes variações entre experimentos em
relação às perdas de matéria seca e gases se devem, em parte, a grande dificuldade de
serem determinadas de forma precisa os teores de MS. No caso deste experimento e
em vários outros, com exceção de Alli et a., (1983), a determinação de matéria seca foi
feita por secagem em estufa. Neste caso, as perdas por volatização dos ácidos graxos e
do etanol, não foram levados em consideração (McDONALD 1991). Assim, os teores de
matéria seca podem ter erros de até 20% o que justifica em parte as diferenças entre
experimentos, e a grande amplitude de valores alcançada neste estudo. Outros pontos
que interferem na perda por gases é o teor de matéria seca original da forragem, o
material a ser ensilado, e o tipo de fermentação predominante. Como nos estudos
citados há grandes diferenças entre as variedades e a idade da cana utilizada, o teor de
MS original e o teor de etanol obtido nas silagens, grandes diferenças são também
esperadas nas perdas por gases.
Existem poucos dados sobre perda de efluentes em silagens de cana. Os dados
apresentados foram bem altos aos evidenciados por Pedroso et at., (2003), de 15,1 kg
ton-1 de MV. Esses valores são alcançados em função da perda de matéria seca, e da
produção de água metabólica chegando a reduzir o nível de matéria seca da silagem em
até 22%, como verificado nas silagens deste estudo (McDONALD et al., 1991). O teor
de matéria seca é o fator mais importante ao se considerar na produção de efluentes.
Segundo Miller & Clifton (1965), que desenvolveram equações relacionando teor de MS
e perdas por efluentes, as perdas são bem pequenas em forragens com altos teores de
MS. Nas silagens de cana-de-açúcar, as perdas de MS por efluentes (considerando 5%
de MS no efluente, valor hipotético), foram de 0,64% de MS, valor inferior ao
determinado pela regressão de Miller & Clifton (1965), em torno de 1,5%.
Caso aceitemos como verdadeiros os valores de matéria seca obtidos nas
silagens, pode-se calcular a quantidade de água metabólica produzida levando em
consideração a perda de matéria seca e a produção de efluentes. Para cada quilograma
de cana-de-açúcar ensilada foram encontrados após 15 dias, 219,7 gramas de MS e
54
680,3 g de água. Considerando-se 5% de MS no efluente (valor hipotético), resultaria
em uma silagem com 25,37% de matéria seca. Levando-se em conta que o teor real de
matéria seca da silagem foi de 22,51%, houve geração de 28,6 g de água para cada kg,
ou 28,6 kg por tonelada de forragem ensilada.
Pode-se assim concluir que do total de perdas de MS até 15 dias (31,26%),
28,28% foram devido às perdas por gases, 0,47% foram pela geração de água
metabólica e 0,64 pela lixiviação de efluentes. A diferença em 1,87% necessária para
totalizar o valor de 31,26% nas perdas totais de MS pode ser atribuída aos pequenos
erros inerentes às variações das amostras e aos desvios causados pelos valores
hipotéticos assumidos (Pedroso et al., 2005).
A participação dos ácidos orgânicos nas silagens foi mensurada e está
apresentada na Tabela 2. Houve incremento no teor de ácido lático em função do tempo
de abertura até os 35 dias, com posterior queda até os 110 dias de fermentação. A
diminuição no teor de ácido lático na última data de abertura dos silos está
provavelmente associada à utilização deste como substrato pelos microrganismos, à
medida que diminuem as reservas de CS (KROONEMAN et al, 2002).
As concentrações de ácido lático em silagens de cana-de-açúcar têm grande
variação entre os trabalhos publicados. Alli e Backer (1982) verificaram teores de ácido
lático variando entre 1,66% MS e 1,93% MS, Alcântara obteve 1,52% MS e Andrade et
al. (2001) e Freitas et al. (2002), em torno de 4,3. Kung Jr e Stanley (1982) trabalhando
com a ensilagem de cana-de-açúcar colhida em diferentes períodos de desenvolvimento
vegetativo observaram teores de ácido lático variando entre 5,65 a 2,82% MS, sendo
que o menor valor foi acompanhado pelo maior teor de etanol. A fermentação
predominantemente alcoólica faz com que não se obtenha em qualquer uma das datas
de abertura deste experimento, valores próximos aos determinados por Moon (1983),
em torno de 400 mmol L-1, que promove redução de 50% no crescimento das espécies
de leveduras estudadas.
Neste experimento, as concentrações de ácido acético das silagens (Tabela 2),
foram altas e superiores aos valores observados em silagens de cana por Freitas et al.
2006, de 2,6 a 4,5% e por Andrade et al. 2001, em que todos os tratamentos obtiveram
variação de 0,9 a 2,2%. Os valores de ácido acético das silagens foram, do mesmo
55
modo, superiores à valores observados por Ranjit & Kung Jr. (2000) de 3,6% e próximas
aos valores encontrados por Nishino (2003), de 6,33%, utilizando, nos dois casos,
silagens de milho adicionadas de L. buchneri na grandeza de Log de 106 ufc/g MS.
Todos os valores de ácido acético observados pelas silagens, no presente
estudo, foram bem superiores aos valores mínimos de 200 mmol L-1, indicados para
redução em 50% no crescimento de leveduras (MOON, 1983), apesar dos altos teores
de etanol e perdas de MS. Esse fato nos faz concordar que talvez se exijam maiores
quantidades deste ácido, para a inibição da fermentação no caso da cana-de-açúcar.
Uma possível explicação se deve aos próprios mecanismos de controle do pH
intracelular pelas leveduras. Como em silagens de cana-de-açúcar existem altos
conteúdos de açúcares solúveis, pode haver rápidos acúmulos de energia pelas
leveduras e talvez controles bem mais precisos no uso desta energia na extrusão dos
ácidos orgânicos para fora da célula, controlando o pH intracelular, podendo talvez
garantir a permanência no ambiente (McDONALD et al., 1991).
Dentre os ácidos orgânicos analisados, apenas os teores de ácido propiônico
não apresentaram diferença nas datas de abertura das silagens. As concentrações de
ácido propiônico nas silagens estão dentro da faixa de 0 a 1% para serem classificadas
como silagens de boa qualidade, como citado por Mahanna (1993), no entanto, foram
bem inferiores aos valores observados por Freitas et al., 2006 de 0,7 a 1,9% na MS. O
propionato é um dos ácidos de cadeia curta de maior efeito sobre os microrganismos,
reduzindo o crescimento de leveduras em pequenas concentrações. Essa característica
se deve tanto pela ação a nível citoplasmático, pelo abaixamento do pH celular, como
através do impedindo do transporte de aminoácidos entre as membranas celulares
(FREESE et al., 1973). No entanto no presente ensaio, não foram obtidas
concentrações próximas a 10 mmol L-1 que Segundo Moon (1983), reduziria em 50% o
crescimento de algumas espécies de leveduras.
Poucos são os trabalhos encontrados na literatura que apresentam teores de
ácidos orgânicos em silagens de cana-de-açúcar, e não foram encontrados trabalhos
em que se fazem relações entre eles associado-os com valores de produção de gases e
perdas de MS durante a ensilagem da cana-de-açúcar.
56
Não há um consenso quanto a valores mínimos aceitáveis bem como, há grandes
diferenças entre experimentos, sem uma lógica comum entre os teores obtidos por
esses ácidos e possíveis predições nos teores de etanol. Em trabalhos recentes de
Freitas et al. (2006), observou-se maiores relações entre os ácidos, em torno de 1,23 e
0,42:1, para ácido lático:C2 e C3:C2, respectivamente, no entanto, os teores de etanol
(17,2 % da MS), foram bem mais altos do que os observadas no presente ensaio.
Queiroz (2006) obteve teores de ácido lático inferiores aos de Freitas et al. (2006), de
2,23, porém com valores de etanol bem menores e em torno de 7,91% da MS.
Schmidt (2006), estudando as diferenças entre variedades, tempos de colheitas
(12, 15 e 18 meses) e tempo de abertura de silagens de cana-de-açúcar (60 e 120 dias),
obteve os maiores valores de ácido lático e de ácido acético e na relação ácido lático:
acético nas plantas colhidas com 18 meses e aos 120 dias de abertura. No entanto,
essas silagens foram as que apresentaram os maiores teores de etanol, superior em
mais de 70% em relação às silagens feitas com cana mais jovem.
Essas disparidades apresentadas entre experimentos e a falta de qualquer
concordância entre teores dos ácidos orgânicos, suas relações e a influência na inibição
da síntese de etanol, nos mostra que pouco se conhece dos reais mecanismos
envolvidos no controle da produção de álcool. Devem ser buscados estudos que
integrem e modelem os valores dos ácidos orgânicos, com os teores de CS e de MS do
material original, bem como a variedade envolvida. Além disso, devem ser padronizadas
as técnicas de análise, para determinação de CS, a fim de que se diminuam os erros
intrínsecos e, melhores relações e compreensões do modelo possam ser feitos. Assim,
poderemos ter melhor compreensão de quais variáveis e qual a real importância de um
determinado parâmetro no controle das leveduras e na síntese de etanol.
As contagens do número de bactérias (LAB) e leveduras (LEV) são apresentadas
na tabela 2. Observa-se, entre o 1º e o 3º dia de ensilagem uma queda tanto nos valores
de LAB quanto de LEV, com posterior aumento até o sétimo dia de ensilagem, quando
novamente houve uma redução chegando, no caso das LAB a 2,05 Log ufc g-1, aos 110
dias de fermentação. No caso das LEV obteve-se em média 6,26 Log ufc g
-1
aos 15
dias de ensilagem, sem serem observadas diminuições posteriores nas contagens.
57
Os dados apresentados no presente ensaio são um pouco diferentes dos
observados por Pedroso et al. (2005) e por Alli et al. (1983). Nesses dois casos houve
um rápido incremento no número de bactérias láticas até o 3º dia, com valores máximos
próximos a 8 Log ufc g-1 e posterior queda até valores próximos a 3,5 Log ufc g-1 aos 45
e 21 dias de fermentação, respectivamente.
Diferentemente do que é geralmente observado em outros trabalhos, não houve
inibição acentuada no desenvolvimento de leveduras durante a fermentação. Pedroso et
al. (2005), avaliando a ensilagem da cana-de-açúcar, observou maior contagem de
leveduras até o 2º dia, declinando a partir desse ponto a valores baixos, próximos a 2
Log ufc g-1 aos 45 dias de fermentação.
Ali e Backer (1983), obteve, nos primeiros dias de fermentação, contagens de
leveduras próximas aos do presente ensaio. No entanto, da mesma forma que
observado por Pedroso et al. (2005), verificou decréscimos na população de leveduras,
com valores de 3,3 log ufc g-1 aos 21 dias de ensilagem. Bernardes et al. (2002), do
mesmo modo, obteve valores de 2,02 Log ufc g-1 aos 55 dias de fermentação.
Valores mais próximos ao deste experimento foram obtidos recentemente por
Freitas et al. (2006), trabalhando com diversos aditivos em silagens de cana-de-açúcar.
Os autores observaram aos 45 dias de ensilagem valores em torno de 5 a 6 Log ufc g-1.
Apesar das diferenças entre experimentos, observa-se que o tempo para inibição
do desenvolvimento de bactérias e de leveduras é bem extenso. Mesmo apresentando a
silagem de cana-de-açúcar pH abaixo de 4, já no 3º dia de fermentação, que
teoricamente garantiria a estabilidade da massa (McDONALD et al., 1991), verifica-se
que o número de bactérias láticas só estabilizou aos 35 dias de fermentação. Além
disso, no presente ensaio não foram observadas reduções acentuadas nas contagens
de LEV, estabilizando seus valores em patamares altos após 15 dias de ensilagem
(Figura 3).
Parece que no caso das silagens de cana-de-açúcar, a inibição do
desenvolvimento de microorganismos está mais relacionada à exaustão de substrato
(ROTZ E MUCK, 1994) e aos altos teores de etanol que se tornam, a partir de certo
ponto, tóxicos as próprias LEV (DRIEHUIS & WIKSELAAR, 2000; THOMSON et al.,
2005), do que aos valores de pH.
58
Figura 3 – Valores de pH e contagens de LAB e LEV (Log ufc g-1), durante a fermentação
Os resultados referentes à atividade enzimática do álcool desidrogenase das
silagens de cana-de-açúcar estão apresentados na Tabela 2. A análise mostrou
semelhança com valores obtidos na literatura, estando os dados de atividade da ADH na
faixa normalmente aceita em ensaios com leveduras (CASEY et al., 1984).
Houve diferenças entre as datas de datas de abertura, apresentando os maiores
valores aos 110 dias de ensilagem. Através desta análise buscou-se caracterizar em
que estágio da fermentação se apresentam as maiores sínteses de etanol e se há
relação entre o controle no desenvolvimento de leveduras com controle nos
mecanismos e rotas enzimáticas de síntese de álcool.
Esperava-se que os maiores valores de atividade da ADH fossem observados
entre o 7º e 35º dia, período de intensa síntese de etanol, com posterior decréscimo,
pelo próprio acúmulo deste composto, inibindo maiores atividades da enzima, o que não
59
ocorreu. Esse fato pode nos indicar que a fermentação alcoólica em silagens de canade-açúcar é bem extensa, não sendo verificado, controle da síntese de álcool, nem pelo
desenvolvimento de leveduras, e nem pelo controle da atividade de uma das enzimas
envolvidas na rota de síntese de etanol.
De maior importância para a redução na síntese de etanol, parece ser mesmo a
exaustão de substrato, impedindo que as leveduras continuem com os sistemas
enzimáticos em atividade, levando a maiores teores de álcool (ROTZ E MUCK, 1994).
Os dados só não deixam mais claro e evidente a incapacidade natural de controle
das leveduras e da síntese de etanol, devido às novas pesquisas nas áreas de genética.
Thomson et al. (2005), utilizando Sacharomyces cerevisae, verificou que a atividade
citoplamática da ADH é codificada por dois genes. Assim, existem duas enzimas álcool
desidrogenase distintas, ADH1 e ADH2, uma envolvida na síntese e a outra, no
consumo de etanol levando-o a acetaldeído novamente, respectivamente. A ADH1 é
expressa comumente, enquanto que ADH2 só é expressa quando a concentração de
açúcares diminui. A enzima ADH1 tem elevado Km para o etanol, consistente com o fato
do etanol de ser o produto da reação, enquanto que o Km da ADH2 para o etanol é dez
vezes menor, condizente com o fato do etanol ser o substrato desta enzima.
Como no presente estudo, os ensaios da ADH foram baseados na técnica,
proposta por Maitra e Lobo (1971), em que as determinações de atividade são obtidas
adicionando etanol como substrato e analisando a geração de NADH+, talvez os dados
não mostrem a real situação e atividade da ADH que ocorre no silo. Por essa técnica, a
análise da ADH foi feita pelo sentido inverso da reação e, como foi observado pelos
novos estudos de genética, talvez não se trate da mesma enzima envolvida na síntese
de etanol, mas sim na síntese do acetaldeído. Como existem diferenças entre as
enzimas ADH1 e ADH2 quanto a afinidade e as eficiências de síntese de etanol, talvez
isso, em parte, explique as maiores atividades da ADH, obtidas, neste experimento,
apenas no final da fermentação.
60
3.4 Conclusões
A ensilagem da cana-de-açúcar faz com que se tenha um produto final bem
diferente do material original. As drásticas perdas de carboidratos solúveis e acúmulos
de FDN sugerem que aditivos sejam usados, buscando o controle da fermentação.
As perdas de MS, carboidratos solúveis e acúmulos de FDN foram observados
em apenas 15 dias, com posterior estabilização nos valores. Um tanto discrepante, os
teores de etanol atingiram os maiores valores apenas aos 35 dias, não sendo similares
os modelos ajustados entre essa variável e os teores de carboidratos solúveis.
A relação obtida entre etanol e digestibilidade mostrou que para cada 1% de
aumento no teor de etanol, 2 unidades percentuais de digestibilidade são perdidas.
Não houve controle no desenvolvimento das leveduras e inibição na atividade da
enzima envolvida na etapa final de síntese de etanol, apesar dos altos teores de ácido
acético.
Os valores de ácido lático e propiônico foram baixos, o que evidência a
fermentação predominantemente alcoólica e a grande dificuldade de inibição das
leveduras.
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FERMENTAÇÃO E NO CONTROLE DA PRODUÇÃO DE ETANOL EM
SILAGENS DE CANA-DE-AÇÚCAR
Resumo
O experimento foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito de aditivos químicos
e inoculantes microbianos sobre a dinâmica fermentativa, composição bromatológica,
atividade enzimática da álcool desidrogenase e desenvolvimento da micloflora e sua
diversidade em silagens de cana-de-açúcar. No ensaio conduzido durante 110 dias
foram utilizados silos experimentais contendo sistema de drenagem e válvulas para
escape de gás permitindo, assim, a mensuração de perdas de efluente e gases, além da
perda total de matéria seca. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente
casualizado, com 4 tratamentos, 2 repetições por tratamento e seis épocas de abertura
(1, 3, 7, 15, 35, 110 dias). Os tratamentos impostos à forragem neste ensaio foram:
uréia 1% MV, na forma de fertilizante granulado contendo 45% de Nitrogênio (N), e os
inoculantes microbianos Lalsil cana®, contendo a bactéria heterolática Lactobacillus
buchneri (cepa NCIMB 40788) na razão de 3,65x105 ufc g-1 na massa verde (MV) e um
inoculante não comercial contendo a combinação de bactérias homolática Pedioccocus
pentosassus e Lactobacillus buchneri (1x106 ufc g-1 MV) fornecidos pela Lallemand Inc.
(Montreal, Quebec). Os aditivos uréia e principalmente a combinação de bactérias
Lactobacillus buchneri mais Pediococcus foram eficazes em diminuir a produção de
etanol (2,75 e 1,30 vs 8,27% no tratamento controle), em diminuir as perdas de matéria
seca em 47 e 60%, e de carboidratos solúveis em 22 e 56% em relação à silagem
controle, respectivamente. As silagens aditivadas com uréia obtiveram maiores valores
de pH e maiores valores de ácido lático em relação à silagem controle. As silagens
aditivadas com L. buchneri apenas foram, neste estudo, de maiores produções de
etanol, acima da silagem controle (11.53 vs 8.27%), tendo como conseqüência grandes
perdas de matéria seca e baixa digestibilidade, pelo acúmulo de FDN, comparáveis às
das silagens sem aditivo. As diferenças entre aditivos para composição químicobromatológica e perdas ocorreram após 7 dias de fermentação. Os dados apresentados
pelos aditivos uréia e a combinação de bactérias L. buchneri mais Pediococcus foram
ajustados em curvas simples, através de modelos lineares, para descrever e predizer as
variações durante a ensilagem. Os tratamentos controle e aditivado com L. buchneri
apenas, pelas altas taxas fermentativas, se ajustaram melhor em polinômios mais
complexos de segundo e terceiro. Apesar dos altos teores de ácido acético em todas as
silagens, principalmente nas silagens aditivadas com a combinação de bactérias homo e
heteroláticas, não foram verificados efeitos deste sobre a população de leveduras.
Entretanto, os teores obtidos de ácido lático e ácido propiônico e a relação entre esses
ácidos e o ácido acético, durante a fermentação, conseguiu explicar parte do sucesso
dos tratamentos uréia e L. buchneri mais Pediococcus na redução da atividade da
enzima álcool desidrogenase e na produção de etanol. A análise de grupamentos
hierárquicos
mostrou
que
os
aditivos
alteraram
a
diversidade bacteriana durante a ensilagem.
Palavra-chave: Uréia, L. buchneri, Pediococcus, Álcool desidrogenase, DGGE.
66
Abstract
CHEMICAL AND MICROBIAL ADDITIVE EFFECTS ON FERMENTATION AND
CONTROL OF ALCOHOL PRODUCTION IN SUGARCANE SILAGES
The present trial aimed to study chemical and microbial additive effects on
fermentation, chemical composition, enzymatic activity of alcohol dehydrogenase and the
microflora development and diversity in sugarcane silages. A 110-d trial was performed
using lab silos provided with effluent drainage system and a valve to allow the escaping
of gases and the overall DM losses measurement. A complete randomized design was
set with 4 treatments, two replications within 6 opening dates (1, 3, 7, 15, 35, 110-d).
Treatments were described as follows: urea 1% (wet basis), the microbial inoculant Lalsil cana (L buchneri NCIMB 40788, Lallemand®) 3.65x105 cfu g-1 of forage, a
combination of Pediococus pentosassus and Lactobacillus buchneri – Lallemand® (1x106
cfu g-1). Both urea and the combination of microorganisms L. buchneri and Pediococus
pentosassus were effective in decrease the ethanol content (2.75, 1.30 vs 8.27% without additives), decrease DM losses (47 and 60%) and reduce soluble carbohydrates
losses (22 and 56%) when compared to the control treatment. The urea treated silages
showed higher pH and lactic acid values. The L. buchneri treatment led to higher ethanol
content (11.23 vs 8.27%) compared to the control, resulting in low DM recovery rate,
higher losses and decreased digestibility as well as the silages without additives. The
major changes on the chemical composition were noticed after the day 7 of fermentation.
For the addition of urea and the combination of microorganisms the variation was better
described by linear equations whereas quadratic and cubic effects were more suitable for
fitting the data from the control and the L. buchneri added silages. Even tough all silages
has shown high acetic acid contents, mainly the combination of L. buchneri and
Pediococus, no significant effects were observed upon the yeast counts. However, the
levels of lactic acid and propionic acid and the ratio of both over the acetic acid content
were related to the decrease on the activity of the alcohol dehydrogenase enzyme and,
furthermore, on the ethanol content of the silages. The cluster analysis based on
molecular evaluation demonstrated a change promoted over the bacterial population
mediated by the additives applied during the ensiling of sugarcane.
Key words: Urea, L. buchneri, Pediococus, ethanol, alcohol dehydrogenase, DGGE.
67
4.1 Introdução
A utilização da cana-de-açúcar, colhida diariamente e fornecida fresca aos
animais, é tradicional e de amplo conhecimento dos pecuaristas, porém o manejo
industrial de canaviais exige que o corte dos talhões seja realizado de forma
concentrada, para aumentar a eficiência dos tratos culturais. Além disso, o corte diário
torna-se problemático em situações onde se deseja utilizar a cana como forragem
durante todo o ano, devido à dificuldade de colheita em dias de chuva e à perda no seu
valor nutritivo durante o verão. Canaviais que tenham sido submetidos à queima, ou que
tenham sofrido fortes geadas, também precisam ser utilizados rapidamente.
A ensilagem da cana-de-açúcar apresenta-se como soluções para esses
problemas, alem de representar vantagens pela melhoria na logística de arraçoamento
no caso de confinamentos com grande numero de animais, permitindo a colheita de
grandes áreas num curto espaço de tempo. No entanto, o alto teor de carboidratos
solúveis e a grande população de leveduras epífitas fazem com que silagens de canade-açúcar tenham intensa fermentação alcoólica convertendo esses carboidratos
solúveis a etanol, CO2 e água, causando perdas excessivas de matéria seca, reduções
de mais de 45% nos teores de carboidratos solúveis, aumentos nos componentes
fibrosos, redução no valor nutritivo com conseqüente baixo desempenho animal
esperado.
Teores de etanol na ordem de 7,8 a 17,5% têm sido relatados para a cana-deaçúcar ensilada sem o uso de aditivos (KUNG Jr.; STANLEY, 1982; ANDRADE et al.,
2001; PEDROSO, 2003; FREITAS et al., 2006). Apesar da alta demanda em
informações
sobre
a
ensilagem
da
cana-de-açúcar,
observa-se
reduzido
desenvolvimento científico em relação ao uso de aditivos para o controle da produção
de etanol.
Os primeiros testes com aditivos para o controle do desenvolvimento de
leveduras em silagens de cana foram baseados nos resultados promissores de
experimentos pioneiros que avaliaram o uso de aditivos nitrogenados (NH3 em solução),
em silagens de milho (BRITT et al., 1975). Assim, vários trabalhos têm avaliado o uso de
68
fontes nitrogenadas visando melhorar o padrão de fermentação e a conservação da
cana-de-açúcar na forma de silagem.
Alvarez & Preston (1976) testaram soluções contendo amônia aquosa e melaço,
em comparação com silagens contendo uréia, verificando que ambas as silagens
apresentaram redução nas perdas de açúcares solúveis e melhor preservação das
silagens. Alli et al. (1983) avaliaram silagens de cana-de-açúcar aditivadas com 16,9 kg
NH3/ton de MS, obtendo menores contagens na população de leveduras e mofos, menor
produção de etanol e conseqüente redução nas perdas de MS em 67% e de
carboidratos solúveis em 47%.
Trabalhos recentes como o de Pedroso (2003) observaram diminuição nas
perdas de materia seca em aproximadamente 50% nas silagens adicionadas de uréia
em relação às silagens sem aditivos, e Andrade et al. (2001), do mesmo modo,
obtiveram com a adição de uréia, silagens de cana-de-açúcar com 4,14% de etanol
apenas.
Outra forma sendo avaliada no controle da fermentação alcoólica é o uso de
aditivos microbianos como forma de alterar o padrão fermentativo das silagens. Nesse
contexto o uso de bactérias homoláticas, usualmente utilizadas não se mostrou
eficiente, por não controlar a produção de etanol e o desenvolvimento de leveduras
(PEDROSO, 2003). Inoculantes bacterianos contendo bactérias homoláticas são rápidos
e eficientes na produção de ácido lático, podendo aumentar a taxa de acidificação e
reduzir o pH final e a taxa de degradação protéica das silagens aditivadas (WEINBERG
& MUCK, 1996).
O objetivo inicial do uso dessas bactérias homofermentativas foi reduzir o risco de
clostridium em silagens de gramíneas, aumentando assim seu valor nutricional. Como
leveduras podem sobreviver em pH próximos ou inferiores a 2 (McDONALD et al.,
1991), a maior produção de ácido lático não foi eficiente em controlar as leveduras em
silagens de cana (PEDROSO, 2003; FREITAS et al., 2006).
Por outro lado, em estudos recentes, tem-se demonstrado que a adição de
inoculantes bacterianos contendo Lactobacillus buchneri, bactéria heterolática, melhora
a estabilidade aeróbica de varias forragens, por meio da redução no crescimento de
leveduras tanto durante a fase anaeróbica, quando da exposição ao ar (DRIEHUIS et
69
al., 2001, WEINBERG et al., 1999). Tem sido demonstrado que L. buchneri tem uma via
metabólica de degradação do ácido lático anaerobicamente, em que um mole de ácido
lático é convertido em meio mol de ácido acético e meio mol de 1,2-propanodiol e traços
de etanol (OUDE ELFERINK et al., 2001). O aumento da estabilidade aeróbica em
silagens aditivadas com L. buchneri e a melhoria na fermentação em silagens de canade-açúcar pelo controle de leveduras foram do mesmo modo, demonstrado em vários
estudos (KUNG JR. & RANJIT 2001, PEDROSO 2003), sendo atribuído exclusivamente
a ação do ácido acético (MOON, 1996), no entanto, os mecanismos inibitórios ainda não
são totalmente claros.
Atualmente busca-se o uso da combinação de bactérias homo e heteroláticas
com o intuito de aumentar as taxas de abaixamento do pH, redução do pH final,
concomitantemente com melhorias na estabilidade aeróbica do material pelo controle do
desenvolvimento de leveduras (NISHINO et al., 2003; DRIEHUIS et al., 2001). Essa
combinação de bactérias homo e heterolática ainda não foram testadas em silagens de
cana-de-açúcar não se tendo idéia do processo fermentativo advindo do uso deste
aditivo.
Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os efeitos de aditivos
microbianos como bactérias heterofermentativas em combinação ou não com bactérias
homofermentativas e o aditivo químico uréia, sobre as características fermentativas,
composição químico-bromatológica, atividade da enzima álcool desidrogenase e o
desenvolvimento e diversidade da microflora epifítica em silagens de cana-açúcar.
4.2 Material e métodos
4.2.1 Local do experimento
O experimento foi realizado no Departamento de Zootecnia da USP/ESALQ, em
Piracicaba-SP, com início em 03 de novembro de 2004.
70
4.2.2 Silos laboratoriais e confecção da silagem
As silagens foram confeccionadas com cana-de-açúcar da variedade RB72454, colhida manualmente com 12 meses de crescimento. O valor do grau brix da
forrageira foi determinado através de um refratômetro de campo (marca TOKYO®,
modelo 032) indicando valor médio de 23,4°. A cana foi colhida manualmente e picada,
sem a retirada da palha, através de uma picadora de forragens modelo estacionário,
regulada para corte com tamanho de partícula médio de 10 mm.
Para a produção dos silos experimentais (unidades experimentais) foram
utilizados 48 baldes de plástico de 20 litros (minisilos), com tampas próprias para
vedação e adaptadas com válvulas tipo Bunsen, para que fosse possível o escape de
gases e a avaliação das perdas gasosas durante o tempo de estocagem. No fundo de
cada balde foram colocados dois quilos de areia seca e uma tela fina de plástico, com a
finalidade de serem avaliados quantitativamente os efluentes.
4.2.3 Tratamentos e aplicação dos aditivos
Os tratamentos consistiram de um aditivo químico, e de dois aditivos microbianos.
O aditivo químico testado foi a uréia na forma de fertilizante granulado contendo 45% de
Nitrogênio (N), na concentração de 1% na materia verde. Os inoculantes microbianos
utilizados foram: Lalsil cana®, contendo a bactéria heterolática Lactobacillus buchneri
(cepa NCIMB 40788, Lallemand Inc. Montreal, Quebec) na razão de 3,65x105 ufc g-1
massa verde (MV), e um inoculante não comercial contendo a combinação de bactérias
homolática Pedioccocus pentosassus e Lactobacillus buchneri (1x106 ufc g-1 MV),
fornecidos pela Lallemand Inc. (Montreal, Quebec).
Os aditivos químicos e microbianos foram aplicados à cana-de-açúcar picada
antes do enchimento dos baldes, na forma de soluções aquosas, por meio de
pulverizadores manuais de 5 litros (Brudden®, Brudden Equipamentos Ltda), buscando
distribuição uniforme dos produtos na massa a ser ensilada. Todos os aditivos foram
aplicados utilizando razão calculada para 25 litros de solução por tonelada de forragem.
71
4.2.4 Enchimento dos silos
O cálculo para estabelecer o peso total da forragem foi determinado tendo como
objetivo atingir a densidade de 550 kg/m3. Dentro deste contexto, camadas sucessivas
com 10 cm de espessura foram compactadas com os pés até o peso final do balde
atingir aproximadamente 12 kg de forragem.
Após o enchimento, os minisilos foram fechados e vedados com fita plástica autoadesiva, para impedimento da entrada de ar. Os silos foram então pesados e
armazenados em local coberto.
Como prevenção a contaminação dos tratamentos com aditivos previamente
aplicados, algumas medidas foram adotadas, tais como: Uso de botas plásticas
descartáveis, desinfecção dos instrumentos com fogo e álcool 70% além da troca de
lonas plásticas e pulverizadores entre cada tratamento.
Durante o enchimento dos silos amostras foram retiradas para determinação do
teor de matéria seca da forragem e para elaboração de extrato aquoso (KUNG JR,
2000).
4.2.5 Avaliação das perdas e amostragem das silagens
Os silos laboratoriais foram abertos aos 1, 3, 7, 15, 35
e 110 dias após a
ensilagem. Os 4 tratamentos, contendo 12 baldes cada, foram avaliados quanto as
perdas de matéria seca total, perdas gasosas e perdas por efluente. O peso dos baldes
e de seus componentes individuais foram medidos previamente, desta forma
possibilitando os cálculos de perdas.
Na abertura foram anotados os pesos dos baldes com e sem a forragem. O
conjunto (silo laboratorial) sem a forragem é constituído pela tampa, o próprio balde e o
sistema de drenagem com o pano, a tela e areia. A diferença de peso entre o conjunto
vazio antes do enchimento, e a medida do mesmo conjunto vazio após a abertura,
permite estimar o calculo de perdas por efluente.
72
A perda gasosa pode ser quantificada pela diferença entre a quantidade de matéria
seca da forragem no fechamento do silo, e a quantidade de matéria seca existente no
balde na época da abertura.
As perdas totais de matéria seca resultam da diferença entre a quantidade de
matéria seca da forragem ensilada no fechamento do silo, e a quantidade de matéria
seca na forragem recuperada, descontando-se desta a perda por efluente. De uma
maneira simplificada, pode ser equacionar a perda total de MS como a soma das perdas
por gás e efluente.
4.2.6 Equações para estimar perdas
Perda gasosa (%MS), eq. (1).
⎧ (MSis − MSfs ) ⎫
PG = ⎨
⎬ × 100
MSis
⎭
⎩
(1)
em que:
PG= perda gasosa;
MSis= Matéria seca inicial descontada a tara seca= (Peso do balde após enchimento – peso
do conjunto vazio (sem a forragem) antes do enchimento) x teor de MS da forragem no
fechamento;
MSfs= Matéria seca final descontada a tara seca= (Peso do balde cheio antes da abertura peso do conjunto vazio (sem a forragem) antes do enchimento) x teor de MS da forragem na
abertura.
Perda por efluente (kg/t), eq (2).
PE =
Pef × 1000
MVi
(2)
em que:
PE= perda por efluente;
Pef= peso de efluente= (Peso do conjunto vazio antes da abertura – peso do conjunto vazio
antes do enchimento);
73
MVi= quantidade de massa verde da forragem ensilada.
Perda total de matéria seca (%MS), eq. (3)
⎧ (MSis − MSfu ) ⎫
PMS = ⎨
⎬ × 100
MSis
⎭
⎩
(3)
em que:
PMS= perda total de matéria seca;
MSis=Matéria seca inicial descontada a tara seca= (Peso final do balde após enchimento –
peso do conjunto vazio (sem a forragem) antes do enchimento) x teor de MS da forragem no
fechamento;
MSfu= Matéria seca final descontada a tara úmida= (Peso do balde cheio antes da abertura
- peso do conjunto vazio (sem a forragem) na abertura) x teor de MS da forragem na
abertura.
4.2.7 Análises químico-bromatológicas
As amostras secas de silagem foram moídas contra peneira de malha de 1 mm e
posteriormente analisadas para:
Matéria seca em estufa a 105°C por 24 horas.
Matéria mineral obtida pela incineração das amostras em mufla a 600°C por 3
horas.
Os teores de fibra em detergente neutro (FDN) e a digestibilidade verdadeira “in
vitro” da matéria seca (DVIVMS) (Campos et al., 2005).
Os teores de proteína bruta (PB) segundo AOAC (1990).
O teor de PB para o tratamento com uréia foi determinado pelo método macro
Kjeldahl (AOAC, 1990), em amostras úmidas de silagem que haviam sido mantidas
congeladas (-5°C).
Os teores de etanol, carboidratos solúveis (CS), ácido graxos voláteis (AGVs) e
ácido lático foram determinados em extratos aquosos das amostras de silagem, obtidos
segundo método descrito por Kung, Jr. (1996). Para isso 25 g de amostra úmida foram
processados com 225 mL de água destilada, em liquidificador, durante um minuto. Em
74
seguida, o material foi filtrado em papel de filtro Whatman® 54, acidificado com H2SO4 a
50% e centrifugado (5000 x g) por 15 min, sendo o extrato líquido armazenado em
congelador (-5 °C) até o momento das análises. O pH foi determinado nos extratos,
antes da filtragem, através de um potenciômetro digital, modelo DM 20® (Digimed
Analítica, São Paulo). O teor de etanol foi obtido por leitura direta em autoanalisador
bioquímico YSI 2700 Select (Biochemistry Analyser, Yellow, Spring,), contendo
membrana enzimática específica para esse analito. As determinações dos teores de CS
foram realizadas pelo método colorimétrico de Dubois et al. (1956), diluindo os extratos
aquosos das amostras de silagem na proporção de 1 mL de extrato para 20 mL de água
destilada. Os teores de ácido lático foram determinados por cromatografia líquida de alta
performance (HPLC), utilizando coluna de troca catiônica (Polyspher OA HY 51272;
Merck, Amsterdam). A fase móvel consistiu de H2SO4 (0,004 mol L-1), a uma taxa de 0,6
ml min-1 a 40°C.
4.2.8 Determinação da atividade da álcool desidrogenase
Para a obtenção dos extratos enzimáticos brutos, primeiramente as amostras
foram homogeneizadas por maceração em graal, adicionados 5 mL de extrator e
centrifugados a 30.000g por 10 minutos a 4ºC. O extrator foi constituído de tampão
fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,5 (4,82 mL), MgCl2 . 6 H2O, 0,5 M (100 μL), EDTA 0,1 M
e dihidro teitrol (DTT) 1,0 M (10 μL), Fenil metil sulfonil fluoride (PMSF) 0,4 M (10 μL) e
Polivinil polipirrolidona (PVPP) (100 mg). Os extratos obtidos foram armazenados a –
20ºC.
Para o ensaio com a ADH utilizou-se protocolo estabelecido por Maitra e Lobo
(1969). Foram adicionados 40 μL do extrato enzimático em 0,9 mL do meio de reação
composto de tampão Tris-HCl 50 mM pH 8,9 e DTT 2 mM, 20 μL de NAD+ 37,5 mM e 40
μL de etanol, incubando-se a mistura durante 15 minutos a 30ºC. O NADH+H+ produzido
foi determinado em espectrofotômetro a 340 nm e a unidade de atividade enzimática
definida como 1 nmol de substrato convertido por minuto por mg de proteína a 30ºC.
A determinação da proteína procedeu-se pelo método de Bradford (LOWRY et al.
1951), nos mesmos extratos brutos utilizados no ensaio enzimático. As alíquotas para
75
determinação, foram de 300 μL do extrato, e 1 mL do reagente Comassie, constituído de
0,01% de Comassie Blue G-250, 8,5% de ácido fosfórico e 4,7% de etanol. Depois de
homogeneizadas as alíquotas em vortex a leitura foi feita em espectrofotômetro a 595
nm, sendo os valores expressos com base na curva padrão obtida a partir de diferentes
concentrações de soro-albumina bovina.
4.2.9 Caracterização da microflora epífita
Amostras da cana-de-açúcar obtidas antes da ensilagem, e das silagens nos dias
de abertura dos silos experimentais foram utilizadas para contagem de bactérias láticas
e leveduras presente na forragem.
O isolamento e a contagem dos microrganismos foram realizados através do
“plaqueamento” em meio seletivo, segundo método descrito por Lin et al. (1992).
Amostras das forragens (25 g) foram pesadas em recipientes esterilizados contendo 250
mL de tampão fosfato de potássio dibásico 0,7 mM (pH, 7,0) e homogenizadas por 60 s.
Diluições em série (x 10) foram realizadas com a solução tampão. Os microrganismos
foram isolados posteriormente com o uso dos respectivos meios de cultura seletivos
(SEALE et al., 1986), como segue:
Bactérias produtoras de ácido lático: Rogosa SL agar (Difco Laboratories, Detroit,
MI) foi utilizado para contagem dos grupos contendo Lactobacilos, Pediococos e
Leuconostocs. As contagens foram realizadas após incubação das placas por dois dias
a 35 °C.
Leveduras: Malt agar (Difco) com adição de ampicilina (200 μg/mL) e tetraciclina
(200 μg/mL) para inibição do crescimento de bactérias. A contagem foi realizada após
dois dias de incubação a 25 °C.
76
4.2.10 Diversidade genética
4.2.10.1 Extração de DNA
Inicialmente 5 g de silagem foram adicionados a 100 mL de tampão fosfato de
potássio dibásico 0,7 mM (pH, 7,0) e sonicadas por 7 min utilizando Sonicator 3000®,
(Misonix incorporated, Farmingdale, New York). Posteriormente a solução da silagem foi
filtrada em gaze e centrifugada a 12000g por 15 minutos, descartado o sobrenadante e
resuspendido o pellet bacteriano em 1 mL de água. A solução foi então
armazenazenada em Freezer (-80 °C).
Para a extração do DNA, utilizou-se o kit Fast DNA Spin para bactéria (Bio101,
Vista, Califórnia). Em microtubos contendo granada finamente moída, foi adicionado 200
μL da solução da silagem e 1 mL de tampão CLS-TC. Estes tubos foram agitados
horizontalmente por 30 s a 4 m s-1, em um FP120 FastPrep Cell Disruptor (Bio101,
Vista, Califórnia). Em seguida centrifugou-se por 1 min a 14000g transferindo 600 μL do
sobrenadante para um tubo limpo. A essa solução adicionaram 600 μL de matriz de
ligação, e homogeneizaram os tubos durante 4 min. A solução foi, então, centrífugada
por 1 min a 14000g, descartado o sobrenadante e o pellet lavado com 500 μL de SEWS.
Novamente a solução foi centrífugada a 14000g, descartado o sobrenadante e o pellet
foi ressuspendido com 100 μL de DES e homogeneizado por 2 min. A solução foi
novamente centrifugada por 14000g e o DNA puro foi recolhido em tubo limpo e
armazenado a -20°C. Obteve-se a quantificação do DNA por densitometria, após
eletroforese em gel de agarose 1,5%-0,5xTBE (1xTBE: 44mM Tris-Borato, 1mM EDTA
pH 8,0), utilizando um densitômetro a laser FluorImager SI (Amersham Biosciences,
Piscataway, New Jersey) e o programa Fragment Analysis (Molecular Dynamics Ltd.,
Sunnyvale, Califórnia). Como padrão de tamanho e quantidade de DNA foi utilizado o
marcador de massa DNA Mass Ladder (Gibco, Invitrogen).
77
4.2.10.2 Amplificação do DNA
Para a amplificação de fragmentos específicos do rDNA 16S de bactéria utilizouse
o
seguinte
conjunto
de
iniciadores:
BA338fGC
(5’GCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGACTCCTACGGGAGGCA
GCAG 3’) e UN518r (ATTACCGCGGCTGCTGG 3’) (Ovreas et al., 1997). A amplificação
foi feita em solução contendo: 2,5 μL de tampão para PCR 10 X; 0,2 mM dNTP; 3,0 mM
MgCl2; 1U de Taq DNA polimerase recombinante (Gibco, Invitrogen); 10 ng de DNA
total; 5 pmol de cada primer; água Mili-Q esterelizada para um volume final de 25 μL. A
amplificação foi realizada em um termociclador Mastercycler Gradiente (Eppendorf AG,
Barkhausenweg, Hamburg), nas seguintes condições: 95°C por 5 min; 30 ciclos de 92°C
por 1 min; 55°C por 1 min e 72°C por 1 min; 72°C por 10 min. A quantificação dos
amplicons resultantes foi feita por densitometria, após eletroforese em gel de agarose
1,5%-0,5xTBE, utilizando um densitomêtro laser FluorImager (Amersham Biosciences,
Piscataway, New Jersey) e o programa Fragment Analysis (Molecular Dynamics Ltd.,
Sunnyvale, Califórnia). Como padrão de tamanho e quantidade de DNA foi utilizado o
marcador de massa DNA Mass Ladder (Gibco, Invitrogen).
4.2.10.3 Análise dos Amplicons do rDNA 16s
Os amplicons do rDNA 16S foram separados por eletroforese em gel de
poliacrilamida com gradiente desnaturante. Os géis de acrilamida:bisacrelamida (37,5: 1;
m:m) 8%, foram preparados com gradiente desnaturante variando de 15 a 55%, usando
duas soluções: uma solução desnaturante 100%, contendo 7 M uréia e 40% formamida
e uma solução 0% uréia e formamida (OVREAS et al., 1997). A eletroforese foi feita a 60
°C e 200V constantes, por 3h, em um sistema de eletroforese vertical DCode (BioRad),
utilizando solução tampão 0,5X TAE (10 mM tris-acetato, 0,5 mM EDTA pH 8,0). Após a
eletroforese, o gel foi fixado em uma solução 10% de ácido acético glacial por 15 min.
Em seguida, o gel foi lavado três vezes com água destilada, imerso em solução de
metanol 50% por 15 min, lavado 3 vezes com água destilada e imerso em solução de
SYBR-Green I (1:10000; v:v) (Molecular Probe, Eugene, Oregon) por 30 min. Após a
78
coloração, o gel foi lavado 3 vezes com água destilada e analisado por densitometria,
utilizando o densitômetro laser fluorImager SI (Amersham Biosciences, Piscataway, New
Jersey) e o programa Fragment Analysis (Molecular Dynamics Ltd., Sunnyvale,
Califórnia)
4.2.10.4 Análise da Diversidade Genética
A riqueza de espécies (SE) foi determinada pel número de amplicons presentes
em cada amostra. A similaridade entre as estruturas de comunidades de Bactérias foi
determinada com base na presença ou ausência das bandas detectadas no gel. A
análise de agrupamento hierárquico foi feita com o programa Systat 8.0, utilizando
matrizes de similaridade geradas pelo método de concordância simples (simple
matching), algoritmo de Wand e a distância euclidiana como unidade de medida.
4.2.11 Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com duas
repetições. O modelo proposto foi analisado pelo PROC GLM do programa SAS (SAS,
1999) e as comparações das médias obtidas nas datas de abertura foram realizadas
utilizando-se o método dos quadrados mínimos (LSMEANS). Foram declaradas
significativas as diferenças entre médias a partir de p<0,05.
Com o objetivo de identificar as relações funcionais entre as variáveis, recorreuse ao PROC CORR do programa SAS (SAS, 1998), com vistas à análise de correlação
simples.
4.3 Resultados
Neste item são apresentados os dados médios tabelados das variáveis e
interações estudadas, acompanhados de breve descrição dos principais efeitos
observados. O posicionamento dos dados, comparações e discussões estão
apresentados no item (4.4 Discussão).
79
4.3.1 Apresentação geral dos dados
A composição químico-bromatológica da cana-de-açúcar fresca, utilizada em
cada uma das silagens, para cada tratamento, está apresentada na tabela 3. Esses
dados representam a média de 2 repetições de cada tratamento e são apresentadas
apenas para uma visão geral e posicionamento iniciail dos dados que serão discutidos,
não sendo comparáveis entre si, em nível estatístico.
Tabela 3 – Composição químico-bromatológica da cana-de-açúcar, nos tratamentos,
antes da ensilagem
Tratamentos
MS
DVIVMS
CZ
PB
(%)
FDN
CS
(%MS)
Controle
31,06
63.63
1,66
2,83
48,69
21,69
Uréia
31,78
64.76
1,67
9,59
48,34
25,54
L. buchneri
30,58
65.23
1,61
3,09
47,89
26,96
L. buch+P.
27,80
65.52
1,74
2,86
50,08
25,94
30,31
64.78
1,67
5,17
48,75
25,03
Média
MS=Matéria Seca; DVIVMS=Digestibilidade verdadeira “in vitro” da matéria seca; CZ=Cinzas;
PB=Proteína bruta; FDN=Fibra em detergente neutro; CS=Carboidratos solúveis.
Medidas descritivas de cada variável podem ser observadas nas tabelas 4 e 5,
como média geral, coeficiente de variação e valores máximos e mínimos. Com excessão
para os teores de ácido propiônico, sem diferença entre adititivos, as demais variáveis
mostraram efeito significativo tanto para aditivos, quanto para os tempos de abertura, os
dois fatores que compõe cada um dos tratamentos.
Foram observadas interações significativas para todas as variáveis entre aditivos
nas datas de abertura. Para a maioria das variáveis houve diferenças entre aditivos
apenas após 15 dias de ensilagem, enquanto que para os teores de cinzas, ácido lático
e a relação ácido lático: acético, essas diferenças ocorreram previamente, a partir dos 7
dias de fermentação. Foram observadas diferenças entre os aditivos em todas as datas
de abertura para as variáveis proteína bruta, carboidratos solúveis e pH.
80
Tabela 4 - Estatística descritiva das variáveis avaliadas
Variável
Matéria Seca, %
Cinzas, %MS
FDN, %MS
PB, %MS
DVIVMS, %MS
CS, %MS
Média
Geral
28,40
2,01
55,60
5,40
62,21
12,70
CV
(%)
3,15
6,89
3,69
13,97
27,60
10,85
Mínimo
Máximo
22,60
1,41
45,02
2,06
49,32
1,86
33,36
2,87
69,90
17,13
69,67
26,95
1
Efeitos1
Interações AdxAb (Dias)
3
7
15
35
ns
ns
**
**
ns
*
*
*
ns
ns
**
**
Ad
Ab
1
ns
ns
ns
**
**
110
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
ns
ns
ns
**
**
**
**
**
*
**
**
**
**
**
**
*
**
**
Ad – Efeitos dos aditivos; Ab – Efeitos das datas de abertura
CV – Coeficiente de variação
*
(p<0,05); ** (p<0,01); ns – não significativo.
Tabela 5 - Estatística descritiva das variáveis avaliadas
Variável1
Efluentes kg t-1 MV
PMS, % da MS
Gases, % da MS
pH
Etanol, % da MS
Ác. Lático, % da MS
C2, % da MS
C3, % % da MS
Relação ác. Lático:C2
Relação C3:C2
LAB Log ufc/g-1 MV
LEV Log ufc g-1 MV
ADH Mmol min-1 g-1PB
1
Média
Geral
32,40
12,95
10,20
3,45
3,18
1,60
4,89
0,23
0,28
0,035
6,10
7,08
79,45
CV
(%)
10,48
3,40
32,76
2,16
20,59
25,81
7,95
33,74
24,42
32,48
5,58
7,23
44,57
Mínimo
Máximo
6,63
-4,36
-6,57
2,60
0,12
0,00
3,07
0,10
0,00
0,015
2,01
5,26
-33,58
46,36
35,63
32,25
4,61
12,57
7,03
9,63
0,89
1,14
0,111
9,26
8,96
255,81
Efeitos2
Ad
Ab
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
1
**
ns
ns
Interações AdxAb (Dias)
3
7
15
35
110
ns
ns
ns
**
**
ns
ns
**
**
**
ns
ns
**
**
**
**
**
**
**
**
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
**
**
**
**
**
**
**
ns
ns
*
**
**
ns
**
ns
**
*
**
**
ns
**
**
**
**
**
ns
ns
ns
ns
ns
ns
**
**
*
**
**
*
**
ns
ns
**
**
**
**
ns
*
**
*
*
*
ns
ns
**
**
*
*
*
*
**
**
PMS – perda total de matéria seca; C2 – ácido acético; C3 – ácido propiônico; Aw – atividade de água; CE – condutividade elétrica.
Ad – Efeitos dos aditivos; Ab – Efeitos das datas de abertura
CV – Coeficiente de variação
*
(p<0,05); ** (p<0,01); ns – não significativo.
2
80
81
4.3.2 Desdobramento de interações
Os desdobramentos de interações foram realizados para os efeitos das variáveis
que demonstraram significância na análise geral de variância, após a análise individual
do interesse técnico-biológico do desdobramento em questão.
Inicialmente, na tabela 6 são apresentados os valores médios das variáveis que,
nas três primeiras datas de abertura, não apresentaram efeitos da interação com os
aditivos testados. Como foram observadas diferenças nos teores de ácido lático e na
relação ácido lático:acético, a partir do 7º dia, os dados destas variáveis, nesta data,
foram desdobrados e apresentados na tabela 13. Os teores de cinzas, mesmo
apresentando interações entre aditivos no 7º dia, não foram desdobrados seus efeitos,
por não serem de grande interesse na discussão dos resultados.
Tabela 6 – Valores médios da composição químico-bromatológica, parametros
fermentativos e perdas assoaciadas a ensilagem da cana-de-açucar nas 3
primeiras datas de abertura
Matéria Seca, %
Cinzas, %MS
FDN, %MS
DVIVMS, %MS
PMS, % da MS
Gases, % da MS
Etanol, % da MS
C2, % da MS
Ác. Lático, % da MS
Relação ác. Lático:C2
1
31,11A
1,71B
47,14B
67,82
0,94A
0,08A
0,35A
3,62B
0,00B
0,00B
Dias de abertura
3
31,71A
1,64B
46,51B
67,96
1,79A
-0,78A
0,87AB
3,84B
0,15B
0,04B
7
30,05B
1,97A
51,35A
65,45
8,06B
5,02B
1,52B
4,57A
1,50A
0,25A
Médias seguidas de mesma letra na linha são estatísticamente semelhantes pelo teste T (p<0,05).
82
4.3.3 Teor de matéria seca e cinzas
O desdobramento das interações significativas para a variável teor de MS está
apresentado na tabela 7.
Tabela 7 - Desdobramento de interações para as variáveis MS e Cinzas
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
23,29C
31,33Aa
26,38Ba
32,28Aa
Dias de abertura
35
Matéria seca, %
24,42C
26,88Bb
25,34BCa
28,96Ab
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
2,23Ab
1,97Abb
2,06Ac
1,72Bb
Cinzas, % da MS
2,32Aab
2,31Aa
2,44Ab
1,99Bb
15
110
22,51C
24,24Bc
22,80BCb
26,86Ac
2,55ABa
2,30Ba
2,73Aa
2,36Ba
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula na coluna ou minúscula na linha, são estatísticamente
semelhantes pelo teste T (p<0,05).
Com excessão das silagens controle, todas as demais silagens diminuiram seus
teores de MS durante as três datas finais de abertura.
As silagens aditivadas com uréia e L. buchneri mais Pedioccocus apresentaram
queda nos teores de MS durante todas as três datas finais de abertura, porém, em
taxas diferentes, fazendo com que o tratamento L. buchneri mais Pedioccocus obtivesse
os maiores teores de MS aos 110 dias de ensilagem.
Não ocorreram perdas durante o 15º e 35º nas silagens aditivadas com L.
buchneri, porém as perdas entre o 35º e 110º dia, fizeram com que essas
apresentassem valores semelhantes às silagens controle no 110º dia.
As silagens controle foram as que apresentaram os menores valores de MS, no
15º e 35º dia de ensilagem e semelhantes ao do aditivo L. buchneri aos 110 dias.
Houve aumento em concentração nos teores de cinzas em todos os tratamentos,
nas três datas finais de abertura. O incremento em cinzas não foi proporcional à queda
nos teores de materia seca entre as datas finais de abertura, no entanto, os aditivos
uréia e L. buchneri mais Pediococcus por reduzir a perda de MS, como esperado,
tiveram menores teores de CZ.
83
4.3.4 Teores de FDN e DVIVMS
Os desdobramentos das interações para teor de FDN e digestibilidade estão
apresentados na tabela 8.
As silagens sem aditivos e as aditivadas com L. buchneri apenas nao monstraram
diferencas nas três datas finais de abertura para os teores de FDN, no entanto
obtiveram os maiores valores entre os tratamentos nestes tempos de abertura.
Tabela 8 - Desdobramento de interações para as variáveis FDN e DVIVMS
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
66,59A
59,06Bb
69,15A
49,07Cc
Dias de abertura
35
FDN, % da MS
68,62A
61,03Bab
67,18A
53,32Cb
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
58,78Ba
59,86Ba
65,16Aa
65,72Aa
DVIVMS, % da MS
51,47Cb
56,35Bab
50,85Cb
64,28Aa
15
110
68,12B
63,55ABa
66,56B
60,29Aa
50,42Bb
55,60Ab
50,20Bb
56,28Ab
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula na coluna ou minúscula na linha, são estatísticamente
semelhantes pelo teste T (p<0,05).
As silagens uréia e L. buchneri mais Pedioccocus apresentaram aumentos nos
teores de FDN nas três datas finais de abertura. Como houve grandes incrementos nos
teores de FDN entre o 7º e 15º dia de fermentação, no tratamento uréia, estas silagens
obtiveram maiores valores do que as silagens com L buchneri mais Pediococcus.
As silagens sem aditivos e aditivadas de uréia e L. buchneri apresentaram queda
na digestibilidade até o 35º dia. As silagens aditivadas com L. buchneri mais
Pediococcus mostraram queda na digestibilidade apenas entre o 35º e 110º dia, obtendo
os maiores valores entre as silagens durante a fermentação, no entanto semelhante as
silagens com uréia aos 110 dias de ensilagem.
84
4.3.5 Teores de proteína bruta, carboidratos solúveis e pH
Na tabela 9 estão apresentadas as interações significativas para as variáveis teor
de proteína bruta, teor de carboidratos solúveis e pH.
Conforme esperado, a adição de uréia elevou os teores de PB nas silagens
obtendo os maiores valores em todas as datas de abertura. As silagens aditivadas com
uréia tiveram aumentos significativos nos teores de proteína bruta até o 35º dia de
ensilagem. Não foram constatadas diferenças significativas entre os demais aditivos
para os teores de PB e, apesar de aumentos numéricos, não foram constatadas
diferenças entre as datas de abertura nestas silagens.
Foram constatadas diferenças entre os aditivos em todos os tempos de abertura
para a variável carboidratos solúveis refletindo em parte as estratégias e o modo de
ação dos aditivos no controle da queima destes compostos durante a ensilagem. As
silagens controle e a silagens aditivadas com uréia tiveram perdas iniciais grandes,
sendo essas até o 15º, na silagem controle, e até o 7º dia, na silagem com uréia,
respectivamente. Apesar das perdas iniciais elevadas a uréia foi eficiente, reduzindo,
nas datas finais de abertura, as perdas de carboidratos solúveis em relação às silagens
controle.
A silagens de cana-de-açúcar aditivadas com L. buchneri apenas tiveram suas
perdas de CS principalmente após 15 dias de ensilagem, sendo os valores semelhantes
a silagem controle aos 110 dias. As silagens com L. buchneri mais Pediococcus
apresentaram pequenas perdas sendo essas constantes a partir do 7º dia. Estas
silagens apresentaram os maiores valores de carboidratos solúveis em relação as
demais silagens a partir do 7º dia quando da ocorrência de grandes perdas nos demais
tratamentos.
Em todos os tempos de abertura, a aditivação com uréia fez com que essas
silagens possuissem pH mais elevado em relação as demais. A aditivação com a
combinação de bactérias L. buchneri mais Pediococcus foi eficiente em reduzir o pH,
proporcionando os menores valores a partir do 35º dia de ensilagem.
85
As silagens atingiram seus menores valores de pH em diferentes tempos, sendo
que as silagens L. buchneri mais Pediococcus foram as mais tardias, obtendo os
menores valores após 35 dias de fermentação. Nestas silagens, entre o 35º e 110º,
observou-se um aumento apenas numérico no pH. Nas silagens adicionadas de uréia, o
aumento do pH entre as duas datas finais de abertura foi significativo estatisticamente.
Tabela 9 - Desdobramento de interações para as variáveis proteína bruta e pH
Dias de abertura
7
15
Proteína bruta, % da MS
2,70B
3,21B
Abc
12,39
13,39Ab
B
2,49
3,10B
1
3
35
110
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn +
Ped
2,41B
9,32Ad
2,35B
2,43B
11,13Ac
2,55B
3,55B
15,83Aa
3,62B
3,51B
16,33Aa
3,66B
2,34B
2,41B
2,73B
2,95B
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn +
Ped
21,37b
23,37a
19,95a
26,50Aa
15,89Bb
15,31Bb
2,38Ce
6,35Bcd
5,20Bc
2,51BCe
4,34Bd
2,375Cd
19,17a
16,95Bab
19,29Aa
16,36Ab
13,61Acd
11,01Ad
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn +
Ped
4,11Ba
4,59Aa
4,04Ba
3,73Bb
4,41Ab
3,76Bb
3,16Dc
4,16Ac
3,39Cc
3,09Bcd
3,36Ae
2,92Cd
2,99Bd
3,43Ade
2,80Cd
2,94Bd
3,52Ad
2,85BCd
4,12Ba
3,66Bb
3,67Bb
2,81Cc
2,64Dd
2,73Ccd
2,57B
2,59B
Carboidratos solúveis, % da MS
12,87Cd
4,07Ce
Dc
7,51
7,07Bc
Bb
16,37
14,92Ab
pH
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula na coluna ou minúscula na linha, são estatísticamente
semelhantes pelo teste T (p<0,05).
4.3.6 Produção de efluentes
Os desdobramentos das interações para a variável produção de efluentes estão
apresentados na tabela 10. Não houve aumentos na produção de efluentes após 15 dias
de ensilagem, assim como não houve diferenças entre os aditivos nestas três datas
finais de abertura, de média 42,67 kg t-1 MV.
Os dados mostraram grandes diferenças entre os aditivos para a produção de
efluentes, nas datas iniciais de ensilagem. A silagem controle apresentou as menores
perdas de efluentes até o 3º dia, diferentemente das silagens aditivadas com L. buchneri
mais pediococcus com grandes perdas já no primeiro dia de ensilagem. No caso das
86
silagens aditivadas com uréia a produção de efluentes foi a uma taxa mais ou menos
constante entre as primeiras datas de abertura, enquanto que as silagens aditivadas
apenas com L. buchneri não apresentou produção de efluentes entre o 1º e o 3º dia de
ensilagem.
Tabela 10 - Desdobramento de interações para a variável produção de efluentes
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
1
7,10Cc
15,98Bc
17,47Bb
24,15A
Dias de abertura
3
10,45Cb
25,03Ab
17,2Bb
22,33AB
7
28,98BCa
33,11Ba
40,17Aa
23,45C
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula na coluna ou minúscula na linha, são estatísticamente
semelhantes pelo teste T (p<0,05).
4.3.7 Produção de gases e perdas totais de MS
Na tabela 9 estão apresentados os desdobramentos de interações para as
variáveis produção de gases e perda total de matéria seca (PMS) nos silos
experimentais.
A produção de gases e a PMS foram afetadadas pelos aditivos sendo os menores
valores obtidos pelas silagens aditivadas com L. buchneri mais Pediococcus. As
diferenças entre as datas de abertura para cada um dos aditivos são semelhantes aos
resultados apresentados pela queda nos teores de MS. Assim, percebe-se que no
tratamento controle houve uma perda considerável de MS e produção de gases entre o
7º e 15º dia, estabilizando a partir de então. Nas silagens aditivadas apenas com L.
buchneri, não foram observadas produções de gases e perdas de MS entre o 15º e o
35º dia de ensilagem. O tratamento ureia e L. buchneri mais Pediococcus tiveram
produções de gases e perdas de MS a partir do 7º dia se estendendo até a data final de
abertura, no entanto em taxas diferentes, apresentando valores finais diferentes em
perdas de MS e produção de gases.
87
Tabela 11 - Desdobramento de interações para as variáveis perdas de MS e gases
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
31,14C
6,95Ac
21,37Bb
2,50Ac
Dias de abertura
35
Perdas de MS, % da MS
28,58C
21,05Bb
25,54Cb
13,30Ab
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
27,99A
2,677Cc
17,67Bb
1,07Cc
Gases, % da MS
25,64A
17,42Bb
22,00Abb
9,32Cb
15
110
34,05B
29,41Ba
33,44Ba
20,34Aa
31,22A
25,88Aa
30,09Aa
16,51Ba
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula na coluna ou minúscula na linha, são estatísticamente
semelhantes pelo teste T (p<0,05).
4.3.8 Teor de etanol e ácido acético
Na tabela 12 apresentam-se os valores do desdobramento de interações dos
aditivos nas três datas finais de abertura para teor de etanol e ácido acético (% da MS).
Foram observadas grandes diferenças entre os aditivos para estas duas variáveis
nas três datas finais de abertura dos silos. A silagens aditivadas com uréia e
principalmente a silagem com a combinação de bactérias obtiveram os menores valores
de teores de etanol nas duas datas finais de abertura. Apresentando aumentos
expressivos entre 15º e o 35º nas silagens controle, e acima dos 35º nas silagens com
L. buchneri apenas, estas foram as de maiores teores de etanol. As silagens aditivadas
com uréia e as com L. buchneri mais pediococcus apresentaram aumentos nos teores
de etanol apenas até o 15º dia. Com excessão das silagens aditivadas apenas com L.
buchneri, todas as demais apresentaram queda no teores de etanol. No caso das
silagens sem aditivos essa queda ocorreu apenas após 35 dias, enquanto que nas
silagens uréia e nas silagens L.buchneri mais pediococcus essa queda iniciou-se a partir
do 15º dias de fermentação.
88
Tabela 12- Desdobramento de interações para as variáveis etanol e ácido acético
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
3,93Bc
6,31Aa
3,25Bb
2,84Ba
Dias de abertura
35
Etanol (% da MS)
12,23Aa
3,13Cb
8,44Ba
1,25Db
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
5,26Aab
4,55Bc
4,96Bb
4,45Bc
Ácido acético (% da MS)
4,77Cb
5,59Bb
5,32BCb
6,38Ab
15
110
8,27Bb
2,75Cb
11,53Aa
1,30Db
5,55Ca
6,97Ba
6,12Ca
9,26Aa
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula na coluna ou minúscula na linha, são estatísticamente
semelhantes pelo teste T (p<0,05).
Observam-se aumentos nos teores de ácido acético, nas três datas finais de
abertura dos silos, sendo caracteristicos de cada aditivo. As silagens aditivadas com L.
buchneri apenas mostraram aumentos apenas após 35 dias de ensilagem sendo esses
valores semelhantes à silagem controle aos 110 dias de fermentação. As silagens
aditivadas com uréia e as com L. buchneri mais Pediococus apresentaram aumentos
nos teores de ácido acético a partir do 15º dia, porém em diferentes amplitudes
principalmente, após 35 dias de ensilagem, fazendo com que a combinação de bacterias
obtivesse os maiores valores nas duas datas finais de abertura dos silos.
4.3.9 Teores de ácido lático e as relações ácido lático:C2 e C3:C2
As interações aditivos e datas de abertura que apresentaram efeito para as
variáveis ácido lático (% da MS) e a relação ácido lático:ácido acético e ácido
propiônico:ácido acético são apresentadas na tabela 13.
89
Tabela 13 - Desdobramento de interações para as variáveis ácido lático e as relações
ácido lático:ácido acético e C3:C2
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
0,35Cb
1,24ABd
1,13Bb
1,89Ac
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
0,085Cb
0,275ABc
0,235Bb
0,405Ac
Dias de abertura
15
35
Ácido lático (% da MS)
0,76Cb
1,72Da
Ac
2,67
6,23Aa
Bb
1,54
3,12Ca
Ab
2,81
5,10Ba
Relação ácido lático: C2
0,15Cb
0,36Da
Ab
0,58
1,12Aa
0,31Bb
0,56Ca
0,64Ab
0,80Ba
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
0,036
0,027b
0,035b
0,029c
Relação ácido C3: C2
0,037D
0,036B
Cbc
0,021
0,094Aa
Bb
0,037
0,048Ca
Ab
0,045
0,080Ba
7
110
1,17Bab
3,50Ab
1,80Bb
2,83Ab
0,21Bab
0,51Ab
0,30Bb
0,31Bc
0,031A
0,016Bd
0,030Ab
0,020Bc
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula na coluna ou minúscula na linha, são estatísticamente
semelhantes pelo teste T (p<0,05).
Todas as silagens apresentaram queda nos teores de ácido lático e nas relações
ácido lático:C2 e C3:C2, após 35 dias de ensilagem. O uso de aditivos antecipou a
produção de ácido lático nas silagens com aumentos expressivos a partir do 3º dia. As
silagen aditivadas com uréia e com a combinação de bactérias homo e heteroláticas,
foram as de maiores teores de lactato devido ao grande acúmulo deste composto entre
o 15º e 35º dia de ensilagem.
As silagens sem aditivos foram as que apresentaram os menores valores de
ácido lático e nas relações ácido lático:C2 e C3:C2, no 35º dia de fermentação. No
entanto, pela queda nos teores de ácido lático e/ou aumento nos teores de ácido acético
entre o 35º e 110º foram diminuídas as relações entre esses ácidos nas silagens
aditivadas fazendo com que fossem semelhantes ou inferiores às silagens controle aos
110 dias de fermentação.
4.3.10 Atividade enzimática da ADH
Os desdobramentos das interações significativas para a variável atividade
enzimática do álcool desidrogenase estão apresentadas na tabela 14.
90
Foram observadas diferenças nas atividades da ADH, em todos os tempos de
abertura e, com excessão das silagens aditivadas com L. buchneri mais pediococcus, as
demais apresentaram aumentos significativos (nmol min-1 g-1 PB) até os 110 dias de
fermentação.
As silagens aditivadas apenas com L. buchneri obtiveram valores de atividade da
ADH semelhantes as silagens sem aditivos em todos os tempos de abertura dos silos.
As silagens aditivadas com uréia apresentaram os menores valores do 3º ao 7º dia de
ensilagem, e semelhando às silagens L. buchneri mais Pediococcus do 7º ao 35º dia.
No 110º apenas as silagens aditivadas com L. buchneri mais Pediococcus foram as de
menores valores de atividade enzimática.
91
Tabela 14- Desdobramento de interações para a variável atividade enzimática da ADH (nmol min-1 g-1 PB)
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
1
19,30c
3,53c
-13,09c
-14,98b
3
97,95Ab
36,15Bbc
81,66Ab
52,06Aba
Dias de abertura
7
15
117,11Ab
137,07ABb
25,63Bbc
73,49Bb
ABb
81,87
179,24Aa
Aa
104,26
85,38Ba
35
156,37Aab
73,73Bb
119,20ABb
67,98Ba
110
211,88Aa
169,59Aa
176,13Aa
60,05Ba
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula na coluna ou minúscula na linha, são estatísticamente semelhantes pelo teste T (p<0,05).
91
92
4.3.11 Contagem do número de bacterias láticas e de leveduras
No caso das variáveis contagem do número bactérias láticas e leveduras, são
apresentadas todas as médias de cada aditivo em todas as datas de abertura, para que
fossem mais bem compreendidos, no tempo, os valores dessas duas variáveis (Tabela
15).
A aditivação com uréia promoveu aumento no número de bacterias láticas nos
primeiros dias de ensilagem sendo superior aos demais tratamentos até o 7º dia. As
silagens apresentaram queda no número de bacterias láticas entre o 1º e o 3º dia de
fermentação, sendo a adição de aditivos microbianos, eficiente em aumentar a
contagem de bactérias láticas no 3º e o 15º dia de abertura em relação às silagens
controle. Como era esperado houve um decréscimo no número de bactérias láticas a
partir do 7º dia, fazendo com que as silagens apresentassem pequenos valores aos 35 e
110 dias, sendo esses semelhantes entre os tratamentos.
Houve diferenças entre aditivos na contagem do número de leveduras a partir do
7º dia de ensilagem. As silagens aditivadas com uréia e as com L. buchneri mais
pediococcus foram as que apresentaram as maiores contagens até o 15º dia de
ensilagem. Apesar do maior valor numérico, ao 35º, no caso das silagens L. buchneri
mais pediococcus e ao 110º dia, no das silagens com uréia, estas foram semelhantes
aos demais tratamentos.
As silagens aditivadas com L. buchneri apenas obtiveram contagem de leveduras
inferior às silagens controle no 15º dia de abertura, sendo semelhante nas demais datas
a estas silagens.
93
Tabela 15 - Desdobramento de interações para as variáveis LAB e LEV (Log ufc/g MV)
Dias de abertura
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
Controle
Uréia 1%
L buchneri
L. buchn + Ped
1
3
8,50Aa
9,10Aa
7,80Bb
8,70Aa
6,49Cb
8,29Ab
7,11Bbc
7,23Bb
a
7,78
8,35a
7,47a
7,46ab
7
b
6,18
7,29b
6,70a
6,60b
15
LAB, Log ufc g-1 MV
8,12Ba
5,60Bc
Abab
8,82
5,84Bc
Aba
8,85
6,57Ac
9,19Aa
6,70Ab
35
110
3,35d
3,58d
3,84d
3,51c
2,05e
2,70e
2,09e
2,16d
LEV, Log ufc g-1 MV
6,97
6,70Bb
Aa
8,94
8,40Aa
Ba
6,82
5,65Cb
Aa
8,45
7,74Aa
6,23Bb
7,11Ab
5,65Bb
6,44ABb
5,85Bb
6,85ABb
6,53Ba
7,69Aa
Bab
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula na coluna ou minúscula na linha, são estatísticamente semelhantes pelo teste T (p<0,05).
93
94
4.3.12 Diversidade genética
A figura 4 mostra a separção dos amplicons do rDNA 16S de Bactéria,
respectivamente, por DGGE. Estes géis foram analisados por densitometria e foi
determinada, para cada amostra, a riquesa de espécies (SE), representada pelo número
total de diferentes bandas (genótipos).
Existe uma grande variação na distribuição das bandas de bactérias encontradas
entre as amostras mostrando grandes diferenças entre os aditivos e as datas de
abertura dos silos quanto a SE (Figura 5).
Em média cada amostra apresentou menos da metade das 81 bandas totais
observadas, sendo grandes as diferenças a partir do 7º dia de fermentação, em que
houve baixa similaridade de espécies entre todos os quatro tratamentos (Figura 6).
No primeiro dia de fermentação o tratamento com L. buchneri mais Pediococcus
obteve similaridade à flora epifítica encontrada na cana fresca. Neste primeiro dia
também, os tratamentos uréia e com L. buchneri apenas mostraram similaridade, no
entanto apresentando SE bem diferentes das silagens sem aditivos.
A maior similaridade entre as silagens ureia e com L. buchneri apenas ocorreu
também no sétimo dia, porém com grandes diferenças dos demais tratamentos. Nos
demais períodos de fermentação as silagens foram bem diferentes entre os tratamentos,
não podendo ser feitas mais relações entre eles.
95
Cana
1
3
Tratamento 1
7
15 35
110
1
3
Tratamento 2
7
15
35
110
1
3
Tratamentos 3
7
15
35
110
1
3
Tratamentos 4
7
15
35
110
Figura 4 – DGGE de amplicons de bactérias de silagens de cana-de-açúcar
95
96
Continua
B
Cana
1
3
Tratamento 1
7 15 35 110
1
3
Tratamento 2
7 15 35
110
1
3
Tratamentos 3
7 15 35
110
1
Tratamentos 4
3
7 15 35
110
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
Figura 5 - Diagrama representando as bandas de rDNA do domínio bactérias de comunidade das sialgens de cana-de-açúcar, com diferentes
aditivos, detectadas por DGGE. „: presença de banda, …: ausências de banda
96
97
Continuação
B
Cana
1
3
Tratamento 1
7 15 35 110
1
3
Tratamento 2
7 15 35
110
1
3
Tratamentos 3
7 15 35
110
1
Tratamentos 4
3
7 15 35
110
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
Figura 5 – Diagrama representando as bandas de rDNA do domínio bactérias de comunidade das sialgens de cana-de-açúcar, com diferentes
aditivos, detectadas por DGGE. „: presença de banda, …: ausências de banda
97
98
Conclusão
B
Cana
1
3
Tratamento 1
7
15 35
110
1
3
Tratamento 2
7 15 35
110
1
Tratamentos 3
3
7 15 35
110
1
Tratamentos 4
3
7 15 35
110
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
T%
43
43 36 47 23 49 40
25 33 36 37 41 37
42 31 48 52 28 38
26 19 36 44 41 52
Figura 5 – Diagrama representando as bandas de rDNA do domínio bactérias de comunidade das sialgens de cana-de-açúcar, com diferentes
aditivos, detectadas por DGGE. „: presença de banda, …: ausências de banda. T% = porcentagem de bandas presentes na amostra em relação
às 81 bandas encontradas.
98
99
Figura 6 – Agrupamento hierárquico de amplicons de rDNA 16S de Bactéria de silagens de cana-deaçúcar aditivadas com uréia ou L. buchneri em combinação ou não com Pediococcus,
detectadas por DGGE
100
4.3.13 Coeficientes de correlação
Foram analisadas as correlações entre as variáveis estudadas no 110º dia de
fermentação sendo apresentadas os valores na tabela 16. A produção de etanol obteve
altos valores de correlação positivos com as perdas de matéria seca e gases, e
negativos para carboidratos solúveis e digestibilidade, sendo um bom indicador do valor
nutritivo das silagens de cana-de-açúcar. A alta correlação entre todas as variáveis
relacionadas a perdas com os teores de FDN e CS nos permite concluir que a
fermentação quanto mais intensa, consumiu maiores quantidades de carboidratos
solúveis, levando ao maior acúmulo de FDN e etanol.
Entre os ácidos orgânicos, o ácido ácetico mostrou ser o de maior influência na
inibição da síntese de etanol e na diminuição das perdas ocorridas na silagem. Em
parte, esse efeito se deve as grandes diferenças nos teores de ácido ácetico entre os
tratamentos, bem como a obtenção dos maiores valores de ácido acético nas silagens
mais bem conservadas e de menores perdas.
Por outro lado, esse fato se deve em parte, pela grande diferença observada
entre tratamentos para ácido lático e propiônico, apenas no 35º dia de fermentação.
Como a correlação foi feita apenas para o último dia de abertura dos silos não foi
possível, neste caso, verificar a real importância destes na preservação e diminuição da
fermentação alcóolica nas silagens de cana-de-açúcar.
Também não foram observadas correlações entre todas as variáveis e as
atividades da ADH. Isso se deve em parte aos altos valores apresentados pela enzima,
no último dia de ensilagem e nas silagens aditivadas com uréia, apesar dos baixos
valores de etanol e menores perdas. Como esse tratamento foi eficiênte no controle das
perdas e na diminuição do teor de etanol em relação à silagem controle, os valores
similares da atividade da ADH, nesta última data de abertura, não permitiu melhores
relações entre as variáveis e a atividade da ADH.
Não foram verificadas nenhuma relação entre os teores de etanol e ácidos
orgânicos e as variáveis relacionadas às perdas com as contagens de leveduras e
bactérias, não sendo por isso apresentados os valores. Esse fato nos indica que os
ácidos orgânicos não foram eficiêntes no controle do desenvolvimento das leveduras.
101
Além disso, não houve relação entre o controle no desenvolvimento da levedura e a
síntese de etanol e a diminuição nas perdas de MS e CS das silagens.
Tabela 16 – Coeficientes de correlação (r) entre as variáveis relacionadas a composição
químico bromatológica e às perdas em silagens de cana-de-açúcar
Et
CS
FN
MS
DG
GS
RC
LT
C2
C3
Et
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
CS
-0.77*
---
---
---
---
---
---
---
---
FN
ns
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
MS
DG
GS
PMS
LT
C2
C3
0.70
-0.84
**
-0.98
**
0.83
*
0.83
*
-0.78
*
-0.78
*
0,38
ns
---0.84
0.96
**
**
0.82
*
-0.97
**
-0.97
**
0.47
0.93
ns
---0.78
*
-0.77
*
0.77
*
0.76
*
-0.58
ns
**
-0.75*
ns
*
0,63
-0,71
--0.89
**
-0.97
**
-0.98
**
0.65
0.96
ns
**
0,58
ns
---0.88
**
-0.89
**
0.84
**
0.84
**
0,68
*
0,99
-0.99
**
-0.62
-0.96
ns
**
-0,57
ns
--0.60
0.95
ns
**
-0,57
ns
--0.63
0,93
ns
**
--0,67
--*
---
ET=Etanol (%MS); CS=Carboidratos solúveis (%MS); FN=Fibra em detergente neutro (%MS); MS=Máteria seca
(%); DG= Digestibilidade “in vitro” da máteria seca (%); GS=perda por gases (%); PMS=Perda de MS (%);
AL=Ácido lático (%MS); C2=Ácido acético (%MS); C3=Ácido propiônico. nsNão significativo; *Diferença
significativa a (p<0,05), **Diferença significativa a (p<0,01).
4.4 Discussão
4.4.1 Compósição químico-bromatológica inicial da cana-de-açúcar
As análises químico bromatológicas da cana-de-açúcar utilizada na preparação
das silagens estão representadas na Tabela 3. Os valores de matéria seca estão em
concordância com a maioria dos trabalhos apresentados na literatura (AROEIRA, et al.
1992; CARVALHO, 1992; PEREIRA et al., 1996, MIRANDA et al., 1999; RODRIGUES &
BARBOSA, 1999; PEREIRA et al., 2001; AZEVEDO et al., 2003; FERNANDES et al.,
2003). Na média, os teores de FDN encontrados foram próximos aos encontrados por
Azevedo et al. (2003) e Fernandes et al. (2003), que avaliaram 15 variedades industriais
com 16 meses (48,8 e 48,5%). Os teores de PB da cana estão próximos aos
encontrados por Coan et al. (2002), Molina et al. (2002), Pedroso et al. (2005) e Freitas
et al. (2006), na média 2% na matéria seca, nos tratamentos sem adição de uréia. A
102
concentração de PB da cana-de-açúcar após a adição de uréia atingiu os valores
próximos aos esperados de 10% na MS. Os teores de carboidratos solúveis foram
próximos e acima dos encontrados por Pedroso et al. (2003) e Bernardes et al. (2002)
de 17,8 e 24%, porém bem inferiores aos observados por Alli et al. (1982) e Campos et
al. (2001) de 52, 46,9%, respectivamente. Os valores de DVIVMS da cana-de-açúcar
utilizada estiveram próximos aos limites estabelecidos por Rodrigues (2001), de 58 a
69% ao estudar dezoito variedades e de Campos et al (2006), de 60,9%, no entanto,
abaixo dos valores obtidos por Freitas et al. (2006), de 77,5% na MS.
4.4.2 Teor de matéria seca (MS) e matéria mineral (CZ)
Resultados referentes ao teor de MS das silagens (Tabelas 6 e 7) revelaram
valores usualmente encontrados na literatura, de média 28,40% e, diferentes entre si em
função dos tratamentos e do tempo de fermentação. Queiroz (2006) analisando
diferentes aditivos em silagens de cana-de-açúcar obteve após 120 dias de fermentação
valores tambem em torno de 23%. Pedroso (2003), trabalhando com o mesmo tipo
forragem obteve 26,6% de MS, enquanto Freitas et al. (2006) observaram valores bem
inferiores, de 21,40% MS.
Observa-se, pela análise de tendência temporal que primeiro, entre o 1º e o 7º dia
não houve diferenças entre tratamentos, havendo uma pequena queda nos teores
médios de matéria seca do 3º ao 7º dia. A diferença observada entre aditivos, após o 7º
dia, permitiu o ajuste dos tratamentos em diferentes modelos relacionando a queda dos
teores de MS com o tempo de ensilagem. Isso mostra que os aditivos influenciaram,
alterando as taxas e o período em que ocorreram as quedas dos teores de matéria
seca, bem como no teor de MS final entre as silagens.
As diferenças entre aditivos são em parte explicadas pelas altas correlações entre
o teor de MS e as perdas fermentativas (correlação negativa de 0,97 para as perdas
gasosas, tabela 16). Queiroz (2006), ao estudar, da mesma forma, diferentes aditivos na
ensilagem da cana-de-açúcar, encontrou valores altos e bem semelhantes aos obtidos
nesse ensaio, de 92% de correlação negativa com as perdas por gases,
respectivamente.
103
Observa-se que as silagens sem aditivos, em que não houve controle da
fermentação alcoólica, as perdas de matéria seca foram altas e nos período inicial da
fermentação, até o 15º. O uso de aditivos fez com que a fermentação fosse menos
intensa, prolongando as perdas até o 110º dia de fermentação, além de diminuir as
perdas, no caso dos aditivos uréia e L. buchneri mais Pediococcus.
No caso da adição de uréia, a mesma tendência de resultados foi verificado por
Pedroso (2003), que observou elevações de 1,1 e 1,3 unidades percentuais no teor de
MS de silagens de cana-de-açúcar adicionadas de 0,5% MV de uréia, em relação às
silagens sem aditivos. Shmidt (2006), observou 13,7% de redução nos teores de MS das
silagens aditivadas com uréia, contra 17,6% nas silagens sem aditivos. No presente
ensaio foram encontrados valores de 24,7 nas silagens com uréia contra 28,6% nas sem
aditivos, respectivamente.
Não existem relatos sobre o uso da combinação de bactérias homo e
heteroláticas em silagens de cana. Entretanto, a maioria dos trabalhos mostra aumentos
na recuperação de MS pelo uso deste aditivo em outras culturas. Adesogan e Salawu
(2004) estudando o efeito de vários aditivos em silagens de trigo, verificaram com o uso
da combinação de bactérias, diminuição de 4% na queda dos teores de MS em relação
à silagem controle. Driehuis et al. (2001), trabalhando com silagens de gramíneas,
observaram menores perdas nos teores de máteria seca, apenas quando Pediococcus
foi adicionado junto ao L. buchneri na concentração de 3x105 ufc g-1 MV. As silagens
aditivadas com L. buchneri na concentração 1x105 ufc/g MV não apresentaram
diferenças das silagens sem aditivos.
As silagens aditivadas com L. buchneri apenas, apesar de apresentar menores
taxas nas perdas de MS, em relação às silagens controle, não foram eficientes em
reduzi-las nas últimas datas de abertura, apresentando os mesmos teores de MS das
silagens sem aditivos, aos 110 dias de ensilagem.
Muitos dos benefícios envolvendo o uso do L. buchneri são resultantes dos
efeitos deste em diversos fatores envolvendo a fase pós-abertura do silo, ou seja, em
geral os resultados que normalmente justificam a utilização do L. buchneri não são
relacionados com a dinâmica fermentativa. Kung jr. e Ranjit (2001) observaram queda
nos teores de MS em silagens de cevada com 1x105 ufc/g e 5x105 ufc/g de 6,8 e 8,8%,
104
contra 5,3% nas silagens controle. Freitas et al. (2006) da mesma forma não encontrou
diferenças na queda dos teores de MS entre as silagens controle e as silagens
aditivadas com L. buchneri apenas sendo na média de 25,3%.
Na figura 7 são apresentados as curvas, as equações de regressão e os valores
de r2 para os teores de MS durante a ensilagem obtidas pelas silagens de cana-deaçúcar com os diferentes aditivos. Nota-se que a silagem controle de fermentação inicial
mais intensa e até o 15º dia apenas, obteve melhor ajuste dos dados em polinômio de
terceiro grau. As silagens uréia e as silagens com L. buchneri mais Pediococcus por
diminuirem as taxas fermentativas e a queda dos teores de MS tiveram melhor ajuste
dos dados em equações lineares. A silagem L buchneri por apresentar maiores
reduções nos teores de MS entre o 7º e 15º e entre o 35º e o 110º apresentou relação
de segundo grau. Podemos concluir que a medida que há um controle da fermentaçao
alcóolica e uma diminuição na redução dos teores de MS, as equações obtidas mudam
partindo de polinômios de maior complexidade (3º grau), para modelos mais simples
com menores inclinações.
Figura 7 – Efeitos dos diferentes aditivos nos teores de MS durante a ensilagem de cana-de-açúcar com
diferentes aditivos
105
Os teores de cinzas variando entre 2,30 a 2,73% nas silagens (tabelas 6 e 7)
estão abaixo dos valores encontrados na literatura. Alcântara et al. (1989) encontraram
valores variando de 4,6 contra 7,03, nas silagens de cana-de-açúcar sem aditivos e com
NaOH, respectivamente. Kung Jr. e Stanley (1982) observaram teores médios de CZ de
6,39% em silagens de cana-de-açúcar colhidas variando de 6 a 24 meses de
crescimento vegetativo.
Da mesma forma que foi demonstrado por Pedroso et al. (2005) houve um
aumento no teor de matéria mineral em função do tempo. As diferenças entre
tratamento foram observadas a partir do 7º dia de ensilagem e se devem, em parte,
devido as diferenças em perdas de MS. Segundo Shmidt (2006), as maiores perdas de
MS acarretam aumento relativo no teor desta fração. Assim, observa-se que as silagens
controle e aditivadas apenas com L. buchneri apresentaram os maiores teores de cinzas
aos 110 dias de ensilagem, em média 13% superior do que os teores das silagens com
uréia e com L. buchneri mais pediococcus. Efeito semelhantes foi observado por
Pedroso (2003) obtendo teores de CZ 12,9% superiores nas silagens de cana aditivadas
com uréia em relação a cana fresca e, apenas 2% superior nas silagens aditivadas com
L. buchneri.
4.4.3 Teores de FDN, carboidratos solúveis (CS) e DVIVMS
Resultados referentes aos teores de FDN das silagens de cana-de-açúcar são
mostrados nas Tabelas 6 e 8, apresentando similaridade aos dados encontrados na
literatura (QUEIROZ, 2006).
As observações dos teores FDN, através da análise temporal, desdobrando as
interações efeitos dos aditivos nos tempos de abertura, apresentaram relações de certa
forma semelhantes e opostas aos teores de MS. Da mesma forma ao teor de MS, não
houve diferença entre aditivos até o 7º dia de fermentação, observando-se pequenos
aumentos médios nos teores de FDN entre o 3º e o 7º dia.
Nas silagens sem aditivos houve um rápido acúmulo de FDN, estabilizando os
valores após o 15º dia de fermentação. Os aditivos uréia e a combinação de bactérias L.
106
buchneri mais Pediococcus, diminuíram as taxas de acúmulo de FDN e no teor final de
FDN, enquanto que a adição de L. buchneri isoladamente foi semelhante as silagens
controle.
Silagens de cana-de-açúcar, em que se verificam altas taxas fermentativas, a
fração fibrosa pode ser acrescida percentualmente em condições de intensa formação
de
efluentes,
no
proporcionalmente
qual
ao
os
componentes
aumento
na
solúveis
fração
menos
em
água
são
reduzidos
e
insolúvel,
fermentável
particularmente os constituintes da parede celular (Van SOEST, 1992). Assim, nas
silagens controle e L. buchneri, em que não foram controlados a fermentação alcoólica,
o que poderia frear a atividade de leveduras, e o consumo de carboidratos solúveis,
houve um acúmulo de H2O e de componentes fibrosos (McDONALD et al., 1991).
Na tabela 17 são apresentadas as equações de predição do acúmulo de FDN
durante o tempo de ensilagem. A medida que o aditivo controlou a fermentação,
novamente o melhor ajuste dos dados foi obtido com modelos mais simples. Assim, no
caso das silagens aditivadas com L. buchneri mais Pediococcus, de menores valores
nos três tempos finais de ensilagem, a equação linear foi a mais adequada para predizer
a evolução nos teores de FDN com o aumento no tempo de fermentação.
Os valores de FDN das silagens aditivadas com uréia, apesar de estatisticamente
semelhantes à silagem controle aos 110 dias, foram numericamente inferior, com taxas
menores de acúmulo durante a ensilagem. A falta de diferença significativa para o
acúmulo de FDN aos 110 dias, entre as silagens com uréia e as silagens controle, devese em parte a grande variabilidade nos dados e o pequeno número de repetições (n=2).
Caso tivessem sido usados um número maior de unidades experimentais a diferença de
quase 5% nos teores de FDN refletiria em diferenca estatística. Nas silagens com uréia
a equação que melhor pode predizer os dados foi a de segundo grau diferentemente
das silagens controle e as silagens aditivadas apenas com L. buchneri com melhores
ajustes em polinômios de terceiro grau (Tabela 17).
107
Tabela 17 - Equações de regressão do acúmulo de FDN durante o tempo de ensilagem
para os diferentes aditivos
Teores de FDN (Y =%MS ) em função dos dias (x)
Controle
Y = 45,11 +1,71x -0,036x2 +0,00021x3; r2 = 0,91
Uréia 1%
Y = 46,88 +0,59x -0,004036x2; r2 = 0,87
L buchneri
Y = 43,72 +2,34x -0,060x2 +0,00037x3; r2 = 0,93
L. buchn + Ped
Y = 47,54 +0,12x; r2 = 0,75
Através das regressões são estimadas taxas de acúmulo de FDN nas silagens
controle e nas silagens aditivada com L. buchneri até o 15º dia, de 0,34 e 0,31% por dia,
respectivamente. Nas silagens uréia, as taxas de acúmulo de FDN foram de 0,25 até o
15º dia e de 0,19% por dia entre o 15 e 35º dia. As silagens com a combinação de
bacterias, pelo maior controle da fermentação obtiveram taxa constante de 0,12% por
dia, durante todo o tempo de ensilagem.
Apesar dos valores de FDN nas silagens de cana aditivadas apenas com L.
buchneri não serem diferentes dos dados das silagens sem aditivos, como se esperava,
estão de acordo com grande parte dos dados obtidos na literatura. Taylor et al. (2002)
investigando o efeito do L. buchneri sobre a fermentação e valor nutricional de silagens
de cevada, constataram valores similares de FDN (62,6%
e 65,8% da MS), assim
como, nos teores de carboidratos solúveis (2,59% da MS e 2,78% da MS) nas silagens
controle e nas silagens aditivadas com L. buchneri 5x106 ufc g-1, respectivamente.
Freitas et al. (2006) encontrou valores maiores para os teores de FDN (64,7e 60,3 % da
MS) e menores para carboidratos solúveis (4,8 e 6,4 % da MS) nas silagens aditivadas
com L. buchneri 5x104 em relação as silagens sem aditivos, respectivamente.
No entanto, Siqueira et al. (2005) constataram baixos valores de FDN em
silagens de cana-de-açúcar tratadas com L. buchneri em comparação aos valores
obtidos na silagem controle, 66,7% MS e 75,1% MS, respectivamente. Esse resultado
se deve em parte a maior recuperação (68%) dos carboidratos solúveis na silagem
tratada, contra somente 40,8% na silagem controle, mostrando a grande divergencia dos
dados encontrados na literatura, no caso da aditivação com o L. bucnheri.
108
A maioria dos trabalhos mostra uma diminuição nos teores de FDN nas silagens
aditivadas com uréia em relação às silagens de cana-de-açúcar sem aditivos. Alli et al.
(1983) estudando o efeito da adição de amônia em silagens de cana verificou
diminuição de quase 22% nos teores de FDN em relação às silagens controle.
Junqueira(2006), utilizando diferentes doses de uréia, 1,0, 1,5 e 2,0% na MV de silagens
de cana-de-açúcar obteve os maiores teores de FDN (75%) na menor dose (1,0% MV).
Lucci et al. (2003) trabalhando com cana-de-açúcar in natura e na forma de silagem com
diferentes concentrações de uréia 0, 0,5 e 1% MV, observaram diminuição do teor de
FDN com a dose de 0,5% MV (71,71% MS) de uréia em relação ao tratamento controle
(75,73% MS), sem que, contudo tal efeito fosse observado na dose de 1% MV (74,63%
MS).
O fato das maiores concentrações de uréia resultarem em menores valores de
FDN vai de acordo com a hipótese da hidrólise e solubilização das frações fibrosas pela
ação da uréia. No entanto, no presente estudo, pela alta correlação negativa entre o
acúmulo de FDN e a queda nos teores de MS (-0,78), bem como pela similaridade na
tendência temporal entre essas duas variáveis, talvez a possibilidade de ocorrência de
hidrolise dos componentes da fibra (hemicelulose) seja pequena, podendo ser um efeito
secundário e marginal, como observado por Shmidt (2006).
Varios trabalhos tem demonstrado que maiores teores de MS nas silagens estão
relacionados a menores acúmulos de FDN. Kung Jr. e Stanley (1982), trabalhando com
silagens de cana, verificaram que, à medida que se aumentavam os teores de materia
seca pelo uso de plantas colhidas mais tardeamente, diminuiam-se os teores de FDN.
Freitas et al. (2006) do mesmo modo observou que dos aditivos testado, os que
proporcionaram menores perdas de MS, promoveram menores acúmulos de FDN nas
silagens de cana-de-açúcar.
Os dados relacionados as perdas de carboidratos solúveis e acúmulo de FDN em
silagens aditivadas com a combinação de bactérias homo e heteroláticas, são
divergentes. Adesogan e Salawu (2004), trabalhando com silagens de trigo e cevada em
combinação ou não, observaram grande variaçao nos resultados de perdas de
carboidratos solúveis e acúmulos de FDN, relacionados a este aditivo. Os resultados
mostraram valores semelhantes e um pouco maiores nos teores de carboidratos
109
solúveis pela aditivação com a combinação de bactérias muitas vezes não
representando diferenças estatísticas.
Driehuis et al. (2001), em tres experimentos estudando o efeito do uso de
bacterias homo e heteroláticas em combinação ou não, em silagens de gramíneas,
verificaram em um dos ensaios, menores perdas de carboidratos solúveis e menores
perdas de MS em relação à silagem controle. Os autores concluíram que parte das
vantagens da inoculação conjunta com bactérias homoláticas foi frear um pouco a
atividade do L .buchneri, verificado pela maior relação ácido lático:acético do que na
silagem apenas com L. buchneri. Assim, foram reduzindas as perdas de MS e acúmulos
de FDN. Neste estudo o uso de bactérias heteroláticas apenas, apesar dos altos valores
de ácido acético, de estabilidade aeróbica e menor contagens de leveduras, foram as
que tiveram as maiores perdas de MS sendo superiores as silagens sem aditivos.
A alta correlação negativa entre os teores de FDN e o teor de MS possibilitou o
ajuste de uma regressão associando esses dois fatores (Figura 8). Os dados são bem
consistentes em mostrar menores acúmulos de FDN em silagens com maiores teores de
MS. Pela relação estabelecida, podemos inferir que caso se tenha 1% de queda no teor
de MS das silagens em média haverá aumentos de 2,31% nos teores de FDN.
110
Figura 8 – Relação entre os teores de FDN e teores de MS
Os dados referentes ao teor de carboidratos solúveis presentes nas silagens
estão apresentados na tabela 9. Houve grande diminuição no teor de carboidratos se
comparado as silagem em relação à planta in natura antes do momento de fechamento
dos silos. Dos 25,03% MS de carboidratos solúveis restaram em média 5,06% da MS,
sendo que houve diferença, para este parâmetro, em função dos aditivos usados, em
todos os tempos de abertura.
Apesar da pequena perda de MS até os 7 dias de ensilagem, houve grandes
perdas de carboidratos solúveis neste período, principalmente nas silagens controle e
nas aditivadas com uréia. Duas hipóteses podem ser formuladas para explicar esse
efeito: 1) o baixo número de repetições utilizadas no experimento (n=2). Esse fato faz
com que, no caso de variáveis com alto coeficiente de variação (peculiar a análise por
espectrofotometria), não permitiu a obtenção de maior exatidão, que caracterizasse
melhor essas silagens no início da fermentação; 2) os carboidratos solúveis das silagens
podem ter sido inicialmente metabolizados a outros compostos, mais estáveis que o
111
etanol, como outros álcoois e aldeídos, não constituíndo assim perda de MS, embora
sejam observadas reduções na fração CS.
Com excessão das silagens aditivadas com L. buchneri apenas, as demais
silagens apresentaram modelos similares de queda dos teores de MS e CS, bem como,
de modo contrário, ao acúmulo nos teores de FDN, a partir do 7º dia de ensilagem. As
silagens aditivadas apenas com L. buchneri não apresentaram as mesmas tendências
devido à queda brusca nos teores de CS entre o 15º e 35º dia, sem que fosse
acompanhado em aumento nos teores de FDN e queda nos teores de MS neste
período.
Os tratamentos com combinação de bacterias L. buchneri mais Pediococcus
resultaram em maiores valores residuais de carboidratos solúveis. Pelos problemas
anteriormente discutidos, como a alta variabilidade nas análises de CS e o pequeno
número de repetições fizeram com que as silagens com uréia fossem estatisticamente
semelhantes às silagens controle, apesar de ter quase o dobro do teor de CS, no 110º
dia de ensilagem. As silagens aditivadas com L. buchneri apenas, pela queda brusca
nos teores de CS a partir do 15º, foram semelhantes às silagens controle no 110º dia.
Os resultados obtidos neste ensaio, em parte refletem a ação de cada aditivo, e o
tipo e intensidade da fermentação observada. Silagens sem aditivos apresentam
decréscimo acentuado no teor de carboidratos solúveis em função do tempo de
ensilagem, de maneira inversa ao observado para perdas gasosas e produção de
etanol. Segundo Pedroso et al. (2005), a síntese de etanol pelos microrganismos
indesejáveis, principalmente levedura, é feita com base na utilização dos carboidratos,
gerando com isso CO2, responsável pelo aumento nas perdas gasosas e
consequentemente, pelo aumento em perdas totais de matéria seca.
As perdas de CS nas silagens controle foram próximas às relatadas por Alli et al.,
1982, Alli et al., 1983 e Freitas et al., 2003 de 93, 96, 89% e bem superior aos valores
obtidos por Pedroso de 61%.
Alguns trabalhos mostram que as silagens aditivadas com L. buchneri, mesmo
quando houve controle da atividade de leveduras e da produção de álcool,
apresentaram altas perdas de MS e de CS, sendo semelhantes as silagens sem aditivos
(PEDROSO 2003). Isto se deve ao fato que durante a síntese de ácido acético pelas
112
bactérias heteroláticas há perdas de MS, próximas a 4,8% do substrato (McDONALD et
al., 1991), o que pode levar a um menor teor de CS residuáis e nos teores de MS no
final da ensilagem. Pedroso et al. (2003) verificaram que o uso de L. buchneri reduziu o
teor de carboidratos, mesmo em relação à silagem controle, 5,69% contra 9,13% da MS,
respectivamente. No entanto, Queiroz (2006), mostrou haver preservação de
carboidratos solúveis, em silagens de cana adicionadas de L. buchneri quando
comparado ao tratamento controle, 3,66% MS e 1,79% MS, respectivamente.
Em relação a aditivação com uréia, tanto Pedroso (2003), Junqueira (2006) e
Shmidt (2006), não encontraram diferenças nos teores de CS em relação a silagem
controle. No entanto, Alli et al. (1983) obteve reduções de 46,4% nas perdas de CS
solúveis, nas silagens aditivadas com amônia em relação às silagens controle. Esses
divergencias nos fazem concordar com as hipóteses levantadas de que a grande
varieabilidade e a imprecisão na determinação desta variável, talvez não mostrem a real
situação e ação dos aditivos.
Os resultados dos teores de CS em silagens com a combinação de bacterias L.
buchneri mais Pediococcus não são consistentes, devido ao pequeno número de
trabalhos e as grandes diferenças entre forragens. Driehuis et al. (2001), em três
ensaios com silagens de gramíneas, verificaram em apenas um deles, grande aumento
na preservação dos carboidratos solúveis. Neste ensaio, foram obtidos, nas silagens
com combinação de bactérias, teores semelhantes de ácido lático em relação às
silagens inoculadas apenas com bactérias homoláticas (98,75 g kg-1 MS). No entanto, os
teores de ácido acético foram superiores com a combinação de bactérias (22,3 vs 9,3 g
kg-1 MS), fazendo com que houvessem aumentos na taxa de acidificação e no pH final,
restringindo a fermentação e as perdas de CS, sem que fossem perdidos as
características de maiores estabilidades no pós-abertura.
Nos outros dois ensaios realizados por Driehuis et al. (2001), as silagens
aditivadas com a combinação de bactérias obtiveram grandes aumentos nos teores de
ácido acético, em relação a silagem aditivada com bactérias homoláticas apenas (60, 7
vs 18,8 g kg-1 MS), sem que fossem, no entanto, acompanhado com altos valores de
ácido lático.
113
Corroborando com as próprias conclusões feitas por esses autores, o sucesso do
uso de bactérias homo e heteroláticas, depende da viabilidade e a atividade dessas
bactérias em conjunto. Nas silagens aditivadas, em que apenas uma bactéria se torna
mais ativa, há grandes perdas de matéria seca e de carboidratos solúveis. Parece que
a vantagem no uso de bactérias homoláticas está em reduzir um pouco a atividade do L.
buchneri, preservando os açúcares, além de diminuir a atividade de leveduras, o que
ocorreu neste experimento.
Os desdobramentos dos valores de digestibilidade in vitro da MS na três últimas
datas de abertura são apresentados na tabela 8. Não houve diferença entre os aditivos
até o 15º dia de ensilagem, sendo que as digestibilidades in vitro da MS foram
superiores para as silagens aditivadas com uréia e para as silagens com L. buchneri
mais Pediococcus aos 110 dias de ensilagem. O ganho em digestibilidade destas
silagens e principalmente da silagem aditivada com a combinação de bactérias, esteve
associado ao menor teor de FDN e maior de CS.
Pedroso (2003) avaliando diversos aditivos na ensilagem de cana-de-açúcar
verificou em silagens com 0,5% de uréia, aumentos na digestibilidade de 45,4 para
50,3%. Castro Neto utilizando, da mesma forma 0,5% de uréia observou pequena
elevação nos teores de digestibilidade (45,3 para 48,5%). Shmidt (2006) observou em
média 3% de aumento em digestibilidade nas silagens de cana aditivadas com 1% de
uréia, atribuindo esse fato aos menores valores de FDN obtido nessas silagens.
Os resultados do uso do L. buchneri em combinação ou não com bactérias
homoláticas não são consistentes na obtenção de resultados positivos, quando a
manutenção da digestibilidade em relação ao material original. Adesogan et al. (2003),
não verificaram diferença nas digestibilidade in vitro e nas digestibilidades aparentes in
vivo, em estudos com ovelhas, utilizando silagens de grãos de trigo aditivadas com L.
buchneri em relação às silagens controle.
O valor nutritivo de silagem de cana-de-açúcar inoculada com L. buchneri foi
avaliado por Siqueira et al. (2005). Os autores concluíram haver maior teor de
carboidratos não fibrosos e maior digestibilidade da matéria seca em silagens aditivadas
com L. buchneri em comparação as silagens tratadas com a associação de bactérias
(“P.acidipropionici” + “L.plantarum”), uréia ou benzoato de sódio.
114
Pedroso (2003) não encontrou diferença na digestibilidade entre as silagens
aditivadas com L. buchneri em relação às silagens controle (em média 45%), no entanto,
observou aumento na eficiência alimentar destas silagens em estudo com novilhas. A
melhor conversão alimentar apresentada pelos animais recebendo a silagem aditivada
(7,73 kg MS/kg GPD), em comparação com os animais recebendo a silagem controle
(9,37 kg MS/kg GPD), foi o resultado de um consumo similar, associado a um ganho de
peso diário 32% maior para os animais comendo a silagem preservada com a bactéria.
Adesogan e Salawu (2004), em diversos ensaios com silagens de trigo e cevada,
aditivadas com L. buchneri em combinação ou não com bactérias homoláticas,
observaram aumentos numéricos nos valores de digestibilidade da matéria orgânica,
porém não sendo estatisticamente diferente das silagens controle.
Nas três ultimas datas de abertura, pelas diferentes taxas e amplitudes de
redução nos valores de digestibilidade entre os aditivos, diferentes modelos foram
ajustados para explicar os valores de digestibilidade durante a fermentação. Esperavase que os modelos ajustados fossem semelhantes aos modelos obtidos para os teores
de CS e de forma oposta aos dos teores de FDN. Este fato não ocorreu por várias
razões, como a queda nos valores de digestibilidade do tratamento controle acima do
15º dia, o que não foi observado para a queda nos teores de CS após esse período.
Além disso, não foram observadas diferenças nos dados de digestibilidade nas silagens
com L. buchneri apenas, após 35 dias, apesar das reduções nos teor de CS e acúmulo
de FDN neste período. Isto se deve em parte, por serem variáveis diferentes, com
metodologias de análise próprias e variações entre resultados, inerentes a cada
variável, não permitindo que melhores respostas fossem obtidas.
A alta correlação obtida entre as variáveis CS, FDN e DVIVMS (Tabela 16) indica
que grande parte da preservação do valor nutricional da silagem (digestibilidade) se
deve ao controle da fermentação alcoólica, que se reflete na diminuição das perdas de
CS e no acúmulo de FDN (Figura 9).
115
Figura 9 – Relação entre os teores de FDN, CS e a DVIVMS
4.4.4 Produção de efluentes, gases e perdas totais de MS
Os dados de produção de efluentes, nas três primeiras datas, de abertura são
apresentados na tabela 8. Diferentemente dos dados apresentados por Pedroso et al.
(2005), esperava-se que haveria aumentos na produção de efluentes após 15 de
ensilagem, e que os diferentes aditivos, por influenciar nas perdas de MS, teriam valores
diferentes de efluentes no final da ensilagem.
Existem poucos dados sobre perda de efluentes em silagens de cana. Os dados
apresentados foram bem altos aos evidenciados por Pedroso et at., (2003), de 15,1 kg
ton-1 de MV na silagem sem aditivo. Esses valores são alcançados em função das
perdas de matéria seca, e produção de água metabólica chegando a reduzir o nível de
matéria seca da silagem em ate 22%, como verificado nas silagens controle deste
estudo (McDonald et al., 1991).
Junqueira (2006) avaliando a adição de diferentes doses de uréia (1,0; 1,5 e 2,0%
da MV) e o aditivo microbiano L. buchneri em silagens de cana-de-açúcar, também não
verificou diferenças entre tratamentos para a produção de efluentes. A cana utilizada
tinha valores de MS próximas ao deste experimento, em média 32,1%, no entanto os
valores de produção de efluentes foram bem inferiores e em média 7,2 kg t-1 MV.
116
Siqueira (2005) testando diferentes combinações de aditivos químicos e
microbianos verificou diferenças entre os aditivos, obtendo produções entre 56,5 e 98,4
kg t-1 MV. Em média as combinações de aditivos microbianos e uréia apresentaram
redução de 4,1 kg t-1 na produção de efluentes em relação às silagens sem aditivos.
Shmidt (2006), estudando o efeito da ensilagem de duas variedades de cana-deaçúcar, não obteve diferenças na produção de efluentes pela adição de uréia, o que
concorda com os dados do presente estudo.
Os dados de perdas de MS e gasosas são apresentados na Tabela 11. A
produção de gases (% da MS) e a perda total de MS (PMS) na ensilagem estiveram
intimamente associadas, sendo que, em média, a perda por gases respondeu de 80 a
90% das perdas totais de MS.
Outro fato interessante é a observação de que a produção de gases e as perdas
de MS estiveram altamente correlacionadas com o teor de MS, sendo ajustados
modelos semelhantes de predição destes valores. Provavelmente, a alta correlação
negativa existente entre as perdas gasosas e o teor de matéria seca da silagem
(Tabelas 16) é resultado das equações usadas para os cálculos de perdas, como pode
ser observado no item material e métodos.
A provável explicação está no fato de que, nas silagens com elevada perda por
gases há o desaparecimento de matéria seca, em especial carboidratos solúveis, que
resultaria em silagens com menor teor de matéria seca final como pode ser observado
na tabela 7 e 9.
A existência de correlações significativas e positivas entre as porções fibrosas da
planta e as perdas gasosas decorre, provavelmente, do fato dessas variáveis
apresentarem correlação negativa com o principal substrato para a geração de gases,
os carboidratos solúveis, utilizados durante a fermentação conforme mostrado na figura
11.
Os resultados obtidos para produção de gases e PMS estão dentro do que se
observa na literatura, contudo dados muito divergentes são encontrados, isso porque
inúmeras variáveis podem alterar as perdas gasosas. No caso deste experimento e
inúmeros outros, a determinação de matéria seca foi feita por secagem em estufa, não
sendo levados em consideração as perdas por volatilização dos ácidos graxos e do
117
etanol (McDONALD et al., 1991). Nestes casos, os teores de matéria seca podem ter
erros de até 20% o que justifica em parte as diferenças entre experimentos, e a grande
amplitude alcançada neste estudo. Outros fatores que interferem nas perdas por gases
são os teores de matéria seca original da forragem, o próprio material a ser ensilado, e o
tipo de fermentação predominante. Como nos diferentes estudos consultados, há
diferenças entre as variedades e a idade da cana utilizada, o teor de MS original e o teor
de etanol obtido entre as silagens, existem grandes diferenças entre experimentos em
relação às perdas de MS.
Constata-se que os tratamentos com menores perdas de MS e de carboidratos
solúveis tiveram as menores perdas por gases. Do mesmo modo ao observado
anteriormente, o tratamento controle por não controlar a fermentação alcoólica,
apresentou perdas iniciais maiores, tendendo a se estabilizar após 15 dias de
ensilagem. O uso de aditivos, por controlar as perdas reduziu suas taxas, fez com que
essas se estendessem até o final da ensilagem.
Neste ensaio a adição do L. buchneri, em combinação com Pediococcus foi
eficiente, obtendo menores perdas por gases e de MS em relação ao tratamento
controle. Do mesmo modo ao observado para teores de FDN e CS, existem grandes
contrastes entre os resultados apresentados na literatura quanto ao uso de bactérias
homo e heteroláticas em conjunto. Como se esperava, os melhores resultados foram
obtidos nos tratamentos que apresentaram menores perdas de CS (ADESOGAN e
SALAWU, 2004).
O tratamento uréia, apesar de diminuir as taxas com que ocorreram as perdas de
MS, não diferiu do tratamento controle. Isto se deve em parte aos problemas levantados
anteriormente, como o baixo número de repetições e a variabilidade entre amostras
fazendo com que mesmo apresentando diferenças de 5% nas perdas de MS, em
relação ao tratamento controle, não representou significância estatística.
Pedroso (2003) avaliou a uréia como aditivo na ensilagem da cana-de-açúcar em
dois experimentos distintos. Em um obteve redução na produção de gases (de 10,3 para
8,2% da MS) e a perda total de MS (de 18,2 para 12,2%). Em um segundo experimento,
a mesma dose de uréia (0,5% da MS), reduziu a produção de gases (de 6,1 para 5,5%
da MS), embora tenha elevado as perdas totais de MS de 6,8 para 12,2%.
118
Junqueira (2006) observou redução na produção de gases, de 22,2 para 16,0;
16,9 e 14,5% da MS e nas perdas totais de MS, de 22,7 para 16,7; 17,6 e 15,1%, para
doses de 1,0; 1,5 e 2,0% de uréia na MV, respectivamente. Shmidt (2006), do mesmo
modo, observou reduções nas perdas de por gases e MS total com adição de uréia.
Principalmente nas silagens utilizando cana cortada aos 12 meses obteve reduções em
torno de 50% na produção de gases e perdas de MS, em relação as silagens sem
aditivos, respectivamente.
A aditivação de silagens de cana-de-açúcar com L. buchneri apenas, por
apresentar altas perdas de CS no final da ensilagem, não foi eficiente na redução da
produção de gases e perdas de MS em relação às silagens sem aditivos. Essas
observações contrariam os relatos de Pedroso et al. (2005), observando reduções nas
perdas gasosas (9,7 para 8,4% na MS) e melhora significativa na recuperação de MS
(80,9 para 90,5%) nas silagens de cana aditivada em relação à silagem controle,
respectivamente. De modo semelhante, o trabalho com silagens de cana-de-açúcar
apresentado por Siqueira (2005), obteve maiores recuperações de matéria seca da
silagem de cana-de-açúcar aditivada com L. buchneri em relação à silagem controle
(80,8 vs 67,5%).
Muitos dos benefícios envolvendo o uso do L. buchneri são resultantes dos
efeitos deste em diversos fatores envolvendo a fase pós-abertura do silo, ou seja, em
geral os resultados que normalmente justificam a utilização do L. buchneri não são
relacionados com a dinâmica fermentativa. Conforme observado por Driehuis et al,
(2001) aumentos gradativos na adição de L. buchneri em silagens de milho resultaram
em perdas de MS 2.8 vezes maiores do que o a silagem controle. Kung Jr e Ranjit
(2001) observaram recuperações de matéria seca em silagens de cevada com
1x105ufc/g e 5 x105ufc/g (91,8% e 89,5%), abaixo da recuperação obtida na silagem
controle (92,9%). Contudo, os mesmos autores obtiveram recuperação igual ao controle
(92,6%) em silagens com 106ufc/g.
Driehuis et al. (1999) observaram as mesmas tendências ao obter perdas de MS
maiores em baixas doses de inoculação de L. buchneri e menores quando a adição era
triplicada. Junqueira (2006) obteve maior recuperação de MS em silagens cana-deaçúcar tratadas com L. buchneri 5x104 ufc/g (84,48%) em comparação ao observado na
119
silagem controle (77,26%), no entanto, Freitas et al. (2006), com a mesma dose não
encontrou diferenças entre os tratamentos.
Os dados obtidos na literatura relativos à dinâmica fermentativa em silagens
aditivadas com L. buchneri ainda são erráticos. Parece haver uma dose considerada
mínima para que durante a fermentação haja perspectiva positiva de sua utilização.
Parece haver diferenças quanto, a dinâmica fermentativa dependendo da forragem, do
teor de MS inicial e do poder tampão do material original. Mais pesquisas devem ser
realizadas, buscando a total compreensão de todas as variáveis envolvidas no processo
(DRIEHUIS et al., 2001).
4.4.5 Teores de PB e pH
Conforme esperado, silagens adicionadas de uréia apresentaram maior teor de
PB que as silagens sem aditivos em todos os tempos de abertura (Tabela 9). Não foram
verificadas diferenças entre os demais aditivos e as silagens controle quanto ao teor de
PB e, apesar de aumento numérico, apenas nas silagens aditivadas com uréia houve
diferenças significativas entre as datas de abertura dos silos.
Diferentemente de Pedroso et al. (2005), não houve diminuição na concentração
de PB até o 3º dia após o fechamento do silo. Segundo o autor, essas perdas iniciais
podem ser creditadas à perda de amônia produzida pela ação proteolítica das enzimas
das células da forragem, além da ação de enterobactérias e clostridiuns, que atuam
enquanto o pH da silagem não é suficientemente baixo para a inibição do processo
catalítico. Como o pH da silagem (Tabela 9), atingiu valores inferiores a 4,0 até o 3º dia
de fermentação, a proteólise foi interrompida e as proteínas da silagem tiveram aumento
em concentração devido, principalmente, à perda de carboidratos solúveis (CS) na
forma de CO2 e água, pelo metabolismo das leveduras (McDONALD et al., 1991).
As perdas de MS parecem ter grande influência sobre o teor final de PB das
silagens. Esse efeito é perceptível, ao comparar as silagens, principalmente nas
aditivadas com uréia. Nas demais silagens, apesar de não serem verificadas diferenças
estatístiscas, a menor perda de MS fez com que a combinação de bactérias
120
apresentasse menores valores de PB em relação às com L. buchneri apenas e as
silagens sem aditivos.
Tanto Siqueira et al. (2004) e Shmidt (2006), ao avaliarem a inclusão de uréia nas
silagens de cana-de-açúcar obtiveram pequenos teores de N-NH3, e altas recuperações
de N inicial. Corroborando com os dados apresentados no presente ensaio, o aumento
do teor de PB se deve principalmente a queda nos teores de MS.
O pH das silagens alcançou valores bem abaixo dos valores encontrados na
literatura (ALLI et al., 1982, KUNG JR., & STANLEY, 1982, COAN et al., 2002;
PEDROSO et al., 2003 e FREITAS et al., 2006). A adição de uréia as silagens de canade-açúcar fez com que, pelo efeito tamponante da uréia (VILELA, 1998), obtivessem
maiores pH. Estes resultados podem, em parte, explicar os efeitos benéficos obtidos
pelo nitrogênio no controle da produção de etanol, nas menores MS e na melhora na
digestibilidade em relação à silagem controle.
Uma das especulações a respeito da ação dos aditivos nitrogenados em silagens
de cana-de-açúcar seria que a elevação do pH nos primeiros estágios fermantativos
favoreceria o desenvolvimento de bactérias lácticas. No caso de silagens de cana-deaçúcar o pH cai rapidamente a valores menores que 3, favorecendo o desenvolvimento
leveduras que conseguem sobreviver em pH próximo a 2 (McDONALD et al., 1991).
Esse maior tamponamento nas silagens pela uréia, aliado a um substrato com maior
nível protéico pode levar a formação de um ambiente mais favorável para
desenvolvimento das bactérias.
Outro fator interessante a ser observado é um aumento, apesar de não
significativo no pH das silagens aditivadas com L. buchneri do 35º ao 110º dia. O
provável consumo de ácido lático pelas bactérias heteroláticas, transformando-o em
ácido acético e 1,2-propanodiol, devem ter provocado esse aumento no pH.
4.4.6 Teores de etanol e ácido orgânicos
Dentre os ácidos orgânicos analisados, apenas os teores de ácido propiônico não
apresentaram diferença entre os aditivos testados. No entanto, houve diferenças nos
121
teores deste composto entre as datas de abertura e, interação tempo de abertura e
aditivos aos 35 dias de ensilagem.
As concentrações de ácido propiônico nas silagens estão dentro da faixa de 0 a
1% para serem classificadas como silagens de boa qualidade, como citado por
Mahanna (1993), no entanto foram bem inferiores aos valores observados por Freitas et
al. (2006), de 0,7 a 1,9% na MS. O propionato é um dos ácidos de cadeia curta de maior
efeito sobre os microrganismos, reduzindo o crescimento de leveduras em pequenas
concentrações. Essa caracteristica se deve tanto pela ação a nível citoplasmatico, pelo
abaixamento do pH celular, como através do impedindo do transporte de aminoácidos
entre as membranas celulares (FREESE et al., 1973). Segundo Moon (1983), estudando
4 espécies de leveduras houve inibição do crescimento de leveduras pelo propionato a
partir de 6 mmol L-1 o que foi alcançado pelas silagens. Entretanto, como relatado pelo
mesmo autor, somente em concentrações entre 10 a 20 mmol L-1 houve redução de
50% no crescimento por duas especies de leveduras, e para as espécies Hansenula
canadensis e Endomycopsis burtonii apenas em concentrações de 30 mmol L-1.
Na figura 10 são apresentadas as curvas de regressão dos valores de ácido
propiônico nas silagens. Pelo gráfico podemos observar a maior variação dos
resultados, apenas aos 35 dias de ensilagem, data em que foi obtida interação entre o
tempo de abertura e aditivos. Interessante observar que nesta data, os tratamentos
uréia e L. buchneri mais Pediococcus obtiveram os maiores valores, em média 26,22
mmol L-1, bem superiores às silagens controle e aditivadas com apenas L. buchneri, de
8,97 e 12,55 mmol L-1.
Esses maiores valores, nas silagens aditivadas com uréia e com a combinação
de bactérias, são próximos aos indicados por Moon (1983), para controle das espécies
de levedura, podendo representar uma das explicações para o maior controle das
leveduras, da menor fermentação alcoólica e das menores perdas totais de MS nestas
silagens.
122
Figura 10 – Teores de ácido propiônico durante a silagens de cana-de-açúcar
Os teores de etanol das silagens de cana-de-açúcar estão apresentados na
Tabela 12, sendo condizentes com o que é frequentemente observado na literatura
(JUNQUEIRA, 2006). Houve diferenças quanto aos aditivos, quanto às datas de
abertura e interação significativa entre os aditivos nas três datas finais de abertura dos
silos.
Houve diminuição na concentração de etanol, nas silagens uréia e L. buchneri
mais Pediococcus após 15 dias de ensilagem, enquanto que no tratamento controle e
adicionado apenas com L. buchneri essa redução ocorreu apenas após 35 dias de
ensilagem. Isso se deve as perdas por volatilização, já que os minisilos foram equipados
com válvulas para escape de gases, do mesmo modo ao observado por Pedroso et al.
(2005).
Apesar dos CS serem a fonte de açúcares para a produção de etanol, as análises
da tendência temporal dos dados não mostrou similaridade entre as taxas de aumento
nos teores de etanol e a queda nos teores de CS nas silagens. Esta falta de conecção
entre os valores de CS e etanol são em parte explicados pelo pequeno número de
repetições e as análises tanto de álcool quanto de carboidratos solúveis ter grande
variação intrínseca associada, como comentado anteriormente. Além disso, parte dos
123
CS podem ter sido inicialmente transformados em aldeídos ou álcoois superiores, não
sendo, necessariamente uma perda de MS ou conversão a álcool, apesar de não
contabilizar mais nos valores de CS, em determinado tempo de fermentação.
A fermentação alcoólica foi dominante nas silagens sem aditivos e na silagem
aditivada com L. buchneri apenas, tendo o ácido acético e lático detectados em segunda
ordem (Tabela 12 e 13), nestas silagens. A produção de etanol na silagem de cana-deaçúcar sem aditivos foi bem inferior aos valores obtidos por Kung Jr. & Stanley (1982) e
Freitas et al. (2006) (17,8 e 15,5%), porem superiores aos valores encontrados por
Preston et al. (1976) de média 6,12%. Valores mais próximos foram obtidos por Alli et al.
(1982), Alli et al. (1983) e Pedroso et at., (2005), de 9, 7 e 7 na matéria seca,
respectivamente.
Esperava-se que as silagens de cana-de-açúcar aditivadas com L. buchneri em
conjunto ou não com bactérias homoláticas levasse a reduções significativas na
produção de etanol pela inibição no desenvolvimento das leveduras. As bactérias
heteroláticas têm a capacidade de converter parte do ácido lático formado durante as
primeiras fermentações a ácido acético e 1,2-propanodiol sob condições de anaerobiose
(OUDE ELFERINK et al., 2001). Sabe-se que a quantidade de ácido acético não
dissociado é um dos fatores mais importantes a ser considerado nos mecanismos de
inibição do crescimento de leveduras (MOON 1983), sendo que normalmente leveduras
são controladas por valores de ácido acético acima de 5,6 g L-1 no meio de cultura (94
mmol L-1) (Woolford, 1975), ou seja, 2% de ácido acético na MS em silagens com 25%.
Freitas et al. (2006), analisando diferentes aditivos e a inclusão de resíduos da
soja em silagens de cana-de-açúcar, não encontrou diferenças entre as silagens
aditivadas com L. buchneri e as silagens controle de 19,3 e 17,8% da MS
respectivamente. Queiroz (2006), não encontrou diferenças entre os teores de etanol
entre a aditivação com L. buchneri e as silagens sem aditivos, de 6,45 e 7,91% da MS,
respectivamente.
No entanto, Pedroso (2003) avaliando o efeito de aditivos bacterianos, como L.
pantarum e L. buchneri, e químicos, benzoato de sódio, sorbato de potássio e uréia,
concluiu que o L. buchneri foi um dos mais promissores aditivos, pois diminuiu a
produção de etanol na silagem e aumentou a estabilidade aeróbia. A silagem aditivada
124
com L. buchneri apresentou
teor de etanol de 1,9% da MS enquanto na silagem
controle o teor chegou a 4,05 % da MS.
Junqueira (2006), da mesma forma, obteve o menor teor de etanol nas silagens
aditivadas com L. buchneri (3,46%), em relação a todos os outros tratamentos, sendo
que a silagem controle apresentou um teor de 5,75%.
Os tratamentos uréia e L.buchneri em combinação com Pediococcus foram, neste
experimento, eficiêntes em controlar a fermentação alcoólica. Após 15 dias de
ensilagem não se verificaram mais aumentos nos teores de etanol nestas silagens,
sendo aos 110 dias, 77 e 84% menores os teores de etanol nestas silagens, em relação
às silagens controle, respectivamente.
Os resultados do uso da uréia no controle da síntese de etanol são contraditórios,
porém verifica-se uma tendência nos dados obtidos na literatura quanto a melhora na
fermentação e diminuição nos teores de álcool com esse aditivo.
Alguns trabalhos como o de Pedroso (2003) não verificaram diferenças quanto ao
uso deste aditivo. Neste trabalho não houve efeito da uréia sobre o teor de etanol das
silagens, com valores variando entre 3,5 e 4,2% da MS, embora as perdas de MS
tenham sido menores nas silagens aditivadas com uréia. Andrade et al. (2001)
analisaram silagens de cana-de-açúcar adicionada de uréia (0,5% da MV), observaram
teores de ácidos lático e acético de 4,14 e 0,91%, e teores altos de etanol, em torno de
12,9% da MS.
No entanto, avaliando a mesma dose de uréia na ensilagem da cana-de-açúcar,
Castro Neto (2003) verificou teores de ácidos lático, acético e etanol de 4,7; 1,9 e 12,9%
da MS para silagens controle, e 8,0; 2,3 e 8,9% da MS para silagens aditivadas. Neste
caso foram evidenciados efeitos positivos da uréia sobre aumentos na produção de
ácidos orgânicos e na redução no teor de etanol das silagens.
Junqueira (2006) avaliou diferentes doses de uréia na ensilagem da cana-deaçúcar e verificou o efeito positivo sobre os teores de etanol, com médias de 5,7; 3,1;
4,1; e 2,6% da MS, para as silagens controle e adicionadas de 1,0; 1,5 e 2,0% na MV.
Poucos são os trabalhos avaliando o uso de aditivos com combinação de
bacterias homo e heteroláticas, não havendo qualquer trabalho com silagens de canade-açúcar. Sobre o uso de bacterias homoláticas, resultados de vários estudos
125
mostraram que essas bactérias diminuíam a estabilidade aeróbica por não controlar
leveduras (Bolsen et al., 1992 e Ranjit & Kung Jr., 2000) e, no caso da cana, com
fermentação principalmente alcoólica realizada por leveduras, o seu uso de forma
isolada não foi promissor (PEDROSO, 2003).
Silva (2003) avaliou aditivo comercial contendo bactérias homoláticas, fubá de
milho e a associação dos dois aditivos na ensilagem da cana-de-açúcar, e observou
teores de ácido lático entre 1,8 e 2,1 da MS; ácido acético entre 1,5 e 8,3% da MS e
etanol entre 12,3 e 17,4% da MS. A autora não verificou benefício dos aditivos sobre as
características fermentativas e produção de efluentes das silagens.
Entretanto, em recentes estudos, o uso da combinação de bactérias homo e
heterolática conseguiu aumentar a taxa de acidificação da massa ensilada, reduzir o pH
final, porem controlando leveduras pela maior produção de ácido acético (DRIEHUIS et
al., 2001 e ADESOGAN E SALAWU, 2004), como ocorrido neste estudo. Os resultados
são erráticos, não tendo apenas uma direção nos resultados e parece haver várias
razões e variáveis envolvidas no sucesso deste aditivo. Os vários fatores são, a própria
característica do material a ser ensilado e seu poder tampão, o teor de MS seca original
do material e os teores dos ácidos orgânicos e a relação entre eles (DRIEHUIS et al.,
2001).
Neste experimento, as concentrações de ácido acético (Tabela 10), das silagens
foram altas e superiores aos valores observados em silagens de cana por Freitas et al.
2006, de 2,6 a 4,5% e por Andrade et al. 2001, em que todos os tratamentos obtiveram
variação de 0,9 a 2,2%. Os valores de ácido acético das silagens foram, do mesmo
modo, superiores à valores observados por Ranjit & Kung Jr. (2000) de 3,6% e próximas
aos valores encontrados por Nishino (2003), de 6,33%, utilizando,
nos dois casos,
silagens de milho adicionadas de L. buchneri na grandeza de Log de 106 ufc g-1 MS.
Todos os valores de ácido acético observados pelas silagens, no presente estudo, foram
bem superiores aos valores mínimos de 200 mmol L-1, indicados para redução em 50%
no crescimento de leveduras (MOON, 1983).
Observou-se diferenças nos teores de ácido acético entre os aditivos apenas nas
duas datas finais de abertura dos silos. Os maiores valores de ácido acético foram
obtidos com a adição da combinação de bactérias L. buchneri e Pediococcus a partir
126
dos 35 dias com valores altos e em torno de 9,26% da MS nestas silagens, aos 110 dias
de ensilagem. As silagens aditivadas com uréia obtiveram teores de ácido ácético
superiores à silagem controle e com L. buchneri apenas aos 110 dias. Não houve
diferenças das silagens aditivadas apenas com L. buchneri em relação as silagem sem
aditivos aos 110 dias de fermentação, diferentemente do que geralmente é observado
na literatura (FREITAS et al., 2006).
Várias especulações podem ser levantadas para explicar a explicar a falta de
efeito apresentado pelas silagens aditivadas apenas com L. buchneri sobre os teores de
ácido acético, no presente ensaio. Primeiro seria a quantidade de bactérias adicionadas
(3,64 x 105 ufc/g MV), possivelmente insuficiente para influenciar na fermentação, na
produção dos ácidos orgânicos e na diminuição na síntese de etanol. Os resultados
obtidos, com pouco efeito deste aditivo sobre a população de leveduras, são um
indicativo de que a dosagem foi incapaz de promover melhoras na conservação da
silagem. Vários trabalhos têm mostrado reduções sobre a população de leveduras
apenas com uso de L. buchneri na ordem de 106 ufc/g MV (DRIEHUIS et al., 1999;
RANJIT & KUNG, JR., 2000).
Outra tentativa de tentar explicar a ausência de efeito na fermentação pela adição
de L. buchneri nas silagens de cana-de-açúcar, seria a não viabilidade das bactérias
utilizadas no experimento, na massa ensilada. Talvez um modo de verificar esta
hipótese fosse pela quantificação do 1,2-propanodiol e comparar os dados com os das
silagens não aditivadas. Oude Elferink et al., (2001) mostraram que 1,2-propanodiol é
produzido junto com o ácido acético durante a degradação anaeróbica do ácido lático
pela ação do L. buchneri, podendo se acumular na massa ensilada e assim, mostrar
diferenças na fermentação e na ação do aditivo, em relação à silagens não aditivadas.
No entanto, como algumas silagens não apresentam 1,2-propanodiol, devido à presença
de bactérias L. diolivorans que degradam este composto a 1-propanol e a ácido
propiônico (KROONEMAN et al. 2002), podem ser difíceis conclusões na observação
dos dados (WEINBERG et al., 1999). No presente estudo não foram determinadas as
concentrações de 1,2-propanodiol, não sendo possível qualquer inferência a respeito.
A participação do ácido lático foi mensurada nas silagens e está apresentada na
Tabela 11. Houve grandes diferenças entre os aditivos, nos tempos de abertura e
127
interação entre aditivos e as datas de abertura a partir dos 7 dias de ensilagem. Os
maiores valores de ácido lático, em todos as silagens, foram obtidos aos 35 dias de
fermentação, apresentando redução nos teores, após essa data. Este fato foi, da
mesma forma, mostrado por Queiroz (2006), observando redução nos teores de lactato,
em torno de 50%, entre 80º e 140º dias de abertura. Provavelmente, isto se deve a
utilização deste composto como substrato pelos microorganismos da silagem
(DRIEHUIS, 1999), e que concorda como o aumento no pH das silagens na última data
de abertura.
As concentrações de ácido lático apresentadas pelas silagens controle e com L.
buchneri apenas foram, durante a fermentação, bem inferiores aos valores observados
por Andrade et al. (2001), como também por Freitas et al. (2002), em torno de 4,3% da
MS e por Kung Jr. & Stanley (1982), de 2,82 e 5,62% nas silagens produzidas com
cana-de-açúcar com 24 e 6 meses. Esses baixos valores, nesses dois tratamentos,
podem ser entendidos como causa ou talvez como consequencia da fermentação
predominantemente alcoólica (KUNG JR. E STANLEY, 1982). Entretanto, em quaisquer
das silagens e datas de abertura deste experimento, não foram obtidos valores próximos
aos valores determinados por Moon (1983), em torno de 400 mmol/L, que promove
redução de 50% no crescimento das espécies de leveduras estudadas (figura 11).
128
Figura 11 - Teores de ácido lático durante a silagens de cana-de-açúcar
No caso das silagens aditivadas com uréia e com a combinação de bactérias
homo e heterolática, os valores próximos a 6% da MS (200 mmol L-1), foram altos e
superiores à silagem controle aos 35 dias de fermentação. Aos 110 dias, a alta
interconversão do ácido lático a ácido acético (DRIEHUIS et al., 2001), fez com que
estas silagens apresentassem, apesar de valores superiores à silagem controle, valores
com baixa magnitude, relativamente.
O efeito positivo da uréia sobre o teor de ácido lático das silagens no presente
ensaio pode estar relacionado a vários fatores. Primeiro, esse efeito pode ser decorrente
do aumento do suprimento de nitrogênio, que estimula o desenvolvimento de bactérias
ácido láticas nas silagens e sua consequente síntese de lactato (McDONALD et al.,
1991). Outra hipótese seria pelo menor consumo de lactato por leveduras, devido a
inibição do desenvolvimento pela uréia (BRITT E HUBER, 1982). Também há
especulações de que doses maiores de uréia poderiam elevar discretamente o poder
tampão das silagens, exigindo assim maior conversão de CS até ácido lático para obter
acidez titulável necessária à estabilização da massa.
Desse modo, vários autores têm evidenciado altas doses de ácido lático em
silagens adicionadas de uréia. Andrade et al. (2001) analisaram silagens de cana-de-
129
açúcar adicionada de uréia (0,5% da MV) e observaram teores de ácidos lático e acético
de 4,14 e 0,91%. Avaliando a mesma dose de uréia na ensilagem da cana-de-açúcar,
Castro Neto (2003) verificou teores de ácidos lático, acético e etanol de 4,7; 1,9 e 12,9%
da MS para silagens controle, e 8,0; 2,3 e 8,9% da MS para silagens aditivadas,
evidenciando efeito positivo da uréia sobre aumentos na produção de ácidos orgânicos
e redução no teor de etanol das silagens.
Os valores das relações ácido lático:C2 e C3:C2 estão representados na tabela
11 e variaram em média de 0,085 a 1,12:1 e 0,015 a 0,111:1, respectivamente. Foram
verificados efeitos dos aditivos, dos tempos de abertura e interação aditivos tempos de
abertura para esses parâmetros. Houve aumentos nas relações entre os ácidos em
todas as silagens até os 35 dias de fermentação, e consequente queda nestas relações
pelo aumento nos teores de acido ácético até os 110 dias.
Poucos são os trabalhos encontrados na literatura que apresentam teores de
ácidos orgânicos em silagens de cana-de-açúcar, e não foram encontrados trabalhos
em que se fazem relações entre eles associado-os com valores de produção de gases e
perdas de MS durante a ensilagem da cana-de-açúcar.
Não há um consenso quanto a valores mínimos aceitáveis bem como, há grandes
diferenças entre experimentos, sem uma lógica comum entre os teores obtidos por
esses ácidos e possíveis predições nos teores de etanol. Para ilustrar esse fato
podemos tomar como exemplo o estudo feito por Kung Jr. e Stanley (1982), que
avaliaram diferentes idades de corte das plantas de cana-de-açucar (6, 9, 12, 15 e 24
meses) e o efeito sobre a qualidade das silagens. Os autores verificaram ausência de
efeito das idades de corte sobre os teores dos ácidos, com valores médios de 4,75% de
ácido lático e 1,58% de ácido acetico na MS. Contudo, foi observado aumento linear no
teor de etanol com o aumento na idade das plantas (de 7,5 para 17,5% da MS), e
tendência de redução nos teores de ácido lático com o aumento do etanol.
Em estudo realizado por Silva (2003) ao avaliar vários aditivos comerciais
contendo bactérias homoláticas e fuba de milho, encontrando grandes diferenças entre
os teores de ácido acético, de 1,5 a 8,3% da MS nas silagens de cana-de-açúcar, porém
sem diferenças na produção de etanol com valores acima de 12% da MS.
130
No entanto,
no presente estudo, as análise dos teores de ácidos orgânicos,
aparenta possuir certa lógica em relação aos seus efeitos sobre os teores de etanol, nos
fazendo concluir e sugerir várias interações entre eles.
Como os dados de ácido acético foram altos em todas as silagens, em relação a
maioria dos trabalhos, e bem superior ao mínimo sugerido, por Moon (1983), de 200
mmol L-1, percebe-se que no caso da cana-de-açúcar, este composto talvez não seja o
principal fator associado ao controle de leveduras ou que, talvez se exijam maiores
quantidade deste ácido, como apresentado pelos tratamentos uréia e L. buchneri mais
Pediococcus para inibir a síntese de etanol. Uma possível explicação para este fato se
deve aos próprios mecanismos de controle do pH intracelular pelas leveduras. Como em
silagens de cana-de-açúcar existem altos conteúdos de açúcares soluvéis, pode haver
rápidos acúmulos de energia pelas leveduras e talvez controles bem mais precisos no
uso, desta energia, na extrusão dos ácidos orgânicos para fora da célula, controlando o
pH intracelular, podendo talvez garantir a permanencia desta no ambiente (McDONALD
et al., 1991).
Outro fato que em parte explica o sucesso do uso de combinações de bacterias e
do uso da uréia no controle da fermentação alcólica, no presente estudo, são os maiores
teores de ácido lático e a maior relação ácido lático: acético no 35º dia de fermentação,
coincidente com o período de grande inibição na síntese de etanol nestas silagens.
Corroborando com os dados de Driehuis et al. (2001), parece haver, álem dos teores
destes ácidos, um valor específico de relação entre eles que tavez garanta melhor
controle de leveduras e da fermentação. Esses autores em diversos estudos com
silagens de gramíneas, adicionadas de L. buchneri mais Pediococcus em combinação
ou não, observaram diferentes respostas quanto ao uso destes aditivos. De forma
surpreendente foi verificado que no único experimento em que o uso da combinação de
bacterias foi efetivo, os teores de ácido acético das silagens aditivadas foram menores
do que os das silagens controle. No entanto, a análise mais minunciosa dos dados nos
mostra que os teores de ácido acético, com o uso da combinação de bactérias, foram
superiores aos das silagens aditivadas apenas com bactérias homoláticas, além de
apresentarem os mesmos teores de ácido lático. Segundo Driehuis et al. (2001), o
sucesso do uso de combinações de bacterias ocorrerá somente se houver alta atividade
131
das bacterias homoláticas, reduzindo um pouco a ação do L. buchneri. Em outras
palavras, parece haver um sinergismo entre esses dois ácidos fazendo com que o
aumento conjunto tenha ação bem maior no controle da fermentação, do que apenas o
aumento expressivo de apenas um destes em detrimento de um segundo, como foi o
caso do presente estudo.
Para finalizar, deve ser destacado o grande aumento nos teores de ácido
propiônico e na relação C3: C2, também em torno do 35º dia de fermentação nos dois
tratamentos que apresentaram os menores teores de etanol. Da mesma forma, ao
comentado anteriormente, tanto os valores deste ácido quanto a sua relação mostraram
grande importância nas diferenças apresentadas pelos aditivos no controle das
leveduras e nas perdas de MS. Segundo Moon (1983), os valores da relação C3: C2
que garantiram menores taxas de crescimento das espécies de leveduras estudadas,
foram superiores a 0,05. Estes resultados concordam com os valores obtidos neste
estudo, onde os melhores tratamentos, uréia e L. buchneri mais Pediococcus, foram os
únicos que obtiveram relações C3: C2 acima de 0,05 aos 35 dias de ensilagem.
4.4.7 Atividade da Álcool desidrogenase (ADH)
Os resultados referentes à atividade enzimática do álcool desidrogenase das
silagens de cana-de-açúcar estão apresentados na Tabela 14. Houve efeito dos
aditivos, das datas de abertura e da interação aditivos nas datas de abertura a partir do
3º dia de ensilagem.
A análise mostrou semelhança com valores obtidos na literatura, estando os
dados de atividade da ADH na faixa normalmente aceita em ensaios com leveduras
(CASEY et al., 1984). Segundo Thomas et al. (1996), estudando os efeitos do nitrogênio
na atividade de uma série de enzimas glicolíticas em leveduras, as atividades
enzimáticas podem ser considerados reflexos das diferenças na própria síntese das
enzimas, já que o estudo é realizado utilizando idênticos ensaios para cada amostra.
Assim, os ensaios mostraram haver inibição, ou melhor dizendo, diminuição na
síntese da ADH como o uso da combinação de bactérias homo e hetero láticas em
todos os períodos de fermentação. O uso da uréia inibiu a atividade da ADH até os 35
132
dias de fermentação, porém teve a mesma
atividade que as silagens controle e
aditivadas com L. buchneri aos 110 dias de ensilagem, tratamentos com maiores valores
de atividade enzimática.
A inibição da atividade da ADH nas silagens aditivadas com uréia corrobora com
alguns estudos que verificaram que o nitrogênio pode diminuir a capacidade
fermentativa de leveduras (THOMAS et al., 1993). Há uma há uma série de enzimas na
via glicolítica que são afetados pelo estresse osmótico, por compostos que interferem na
fermentação, ou excesso ou falta de nutrientes como glicose e nitrogênio.
Thomas et al. (1993), trabalhando com duas dosagens de nitrogênio (1 e 10 mM)
e dois teores de glicose (5% e 35%) verificaram inibição de 2,5 vezes na atividade da
fosfofrutoquinase enzima chave na via glicolítica e de síntese de etanol, e pequena
diminuição na atividade da ADH de média 250 nmol / mg PB / minuto. Além disso, foram
verificados aumentos nas atividades das enzimas da rota das hexoses monofosfato.
Segundo Bruinenberg et al. (1983), algumas leveduras como a S. cerevisae não
possui transhidrogenases ou a isocitrato desidrogenase para gerar NADPH, agente
redutor utilizado no crescimento, tendo que obter esse composto através da rota das
hexoses monofosfato. O maior número e aumento de massa pelo aumento do teor de
nitrogênio do meio, fazem com que haja um desvio na rota de síntese de etanol, para a
maior síntese de NADPH e consequenemente para maior síntése de aminoácidos e
peptídeos, reduzindo a síntese de etanol.
Poucos trabalhos tentaram verificar o efeito de ácidos orgânicos na fermentação
e no crescimento de leveduras, assim como na atividade das enzimas ligadas a síntese
de etanol. Segundo (EDGLEY AND BROWN, 1983), a maioria dos trabalhos estão
relacionados ao esclarecimento da síntese de solutos compativeis ligados à adaptação
ao estresse osmótico, em ambientes de altos conteúdos de glicose.
No entanto, no trabalho realizado por Takahashi et al. (1999) há grandes
evidências da influência do ácido acético nas atividades do álcool desidrogenase e da
piruvato descarboxilase (PDC), enzimas ligadas à síntese de etanol. No estudo
realizado foi utilizado uma Escherichia coli, modificada geneticamente pela inclusão dos
genes que codificavam as enzimas ADH e PDC. Foi observado, pela ação do ácido
acético, diminuiçao na taxa de crescimento, na produção de biomassa e na atividade
133
dessas duas enzimas, sendo maior a inibição em menores valores de pH, como foi
observado no presente ensaio.
Um dos problemas encontrados no presente estudo foram os altos valores da
atividade da ADH no final da fermentação na maioria das silagens, principalmente nas
silagens aditivadas com uréia, tratamento que apresentou baixos valores de etanol. Uma
das explicações para esse fato pode estar relacionado às novas descobertas e estudos
dos genes ligados a síntese dessas enzimas em leveduras.
Sabe-se que durante a fermentação, as leveduras reciclam o NADH através da
conversão do acetaldeído a etanol. Se o oxigênio é subsequentemente disponível, o
acúmulo de etanol é reconvertido a acetaldeído. A conversão do aldeído a etanol é
catalizado pelo álcool desidrogenase (ADH), que em princípio pode catalizar a reação
em uma das duas direções (Piskur et al, 2006).
No entanto, através do estudo de Thomson et al. (2005), utilizando
Sacharomyces cerevisae, foi verificado que a atividade citoplamática da ADH é
codificada por dois genes que surgiram por um evento de duplicação de genes. Assim,
existem duas enzimas álcool desidrogenase distintas, ADH1 e ADH2, uma envolvida na
síntese e a outra, no consumo de etanol levando-o a acetaldeído novamente,
respectivamente. A ADH1 é expressa comumentemente, enquanto que ADH2 só é
expressa quando a concentração de açúcares diminui. A enzima ADH1 tem elevado Km
para o etanol, consistente com o fato do etanol de ser o produto da reação, enquanto
que o Km da ADH2 para o etanol é dez vezes menor, condizente com o fato do etanol
ser o substrato desta enzima.
O autor no estudo usou várias combinações e comparações de análises
genéticas sequenciais e reconstruiu o gene da antiga enzima ADH progenitora. Além
disso, regenerou novas formas de genes ADH, que representaram antigos
intermediários dessa enzima, caracterizando os parâmetros cinéticos e especificidade
de substrato dessas enzimas. A interpretação dos resultados mostrou que a duplicação
dos genes da ADH está predominantemente envolvida na geração e não no consumo de
etanol, sendo essa, uma vantagem da levedura sobre os demais microrganismos. A
produção de etanol proveu a levedura, vantagens sobre outros competidores, por ser o
134
etanol tóxico a maioria dos outros microrganismos, apesar de poder ser consumido pela
levedura, ou seja, ser utilizado posteriormente.
Como no presente estudo, os ensaios da ADH foram baseados na técnica,
proposta por Maitra e Lobo (1971), em que as determinações de atividade são obtidos
adicionando etanol como substrato e analisando a geração de NADH, talvez os dados
não mostrem a real situação e atividade da ADH que ocorre no silo. Por essa tecnica,
como podemos perceber a análise da ADH foi feita pelo sentido inverso da reação e,
como foi observado pelos novos estudos de genética, talvez não se trate da mesma
enzima envolvida na síntese de etanol, mas sim na síntese do acetaldeído. Como
existem diferenças entre as enzimas ADH1 e ADH2 quanto à afinidade e as eficiencias
de síntese de etanol, talvez isso, em parte, explique as maiores atividades da ADH,
obtidas neste experimento apenas no final da fermentação.
A análise dos dados e a revisão na literatura nos fez supor que talvez se tenha
melhores respostas dos fatos ocorridos na fermentação, caso fosse utilizada a técnica
proposta por Thomson et al. (2005) tendo como substrato o próprio acetaldeído e fosse
determinado o NAD+.
4.4.8 Contagem do número de Bactérias láticas (LAB) e Leveduras (LEV)
As contagens do número de bactérias e leveduras são apresentadas na tabela
15. Foram obtidos efeitos dos aditivos, dos tempos de ensilagem e interação aditivos
tempos de abertura, no caso das bactérias láticas, apenas até o 3º e no 15º dia de
ensilagem e, no caso das leveduras a partir do 7º dia de fermentação.
Em todos os tratamentos observa-se um declínio no número de bactérias a partir
do 7º dia de ensilagem chegando a valores baixos, em médias 2,25 ufc g-1 aos 110 dias
de fermentação. Este comportamento está relacionado ao controle da fermentação e
estabilizaçao da silagem através dos ácidos orgânicos (ROTZ E MUCK, 1994) e etanol
(DRIEHUIS & WIKSELAAR, 2000) produzidos, inibindo o desenvolvimento de
microrganismos.
O tratamento uréia obteve as maiores contagens iniciais de bactérias láticas,
sendo ao 3º dia de abertura superior estatísticamente às demais silagens. Esses
135
maiores valores se devem, provavelmente pelo maior teor de nitrogênio, aumentando a
capacidade de síntese protéica, além do maior poder tampão, através da liberação da
amônia pela uréia. Esses dois fatores podem ter extendendido a fermentação e
diminuído as taxas de queda de pH, possibililtando consequentemente, ambiente mais
favorável ao desenvolvimento de bactérias e maior síntese protéica (McDONALD et a.,
1991).
Ao 7º dia de fermentação, as silagens com aditivos microbianos tiveram maiores
contagens de bactérias láticas em relação às silagens sem aditivos. Vários trabalhos
têm mostrado que o uso de aditivos microbianos aumenta a contagem de bactérias
láticas durante a fermentação (BOLSEN et al. 1992). Shockey et al. (1988), aditivou
silagens de alfafa com um mistura de bactérias láticas e acompanhou as mudanças
fementativas durante os primeiros dias de ensilagem. Apesar de não encontrar
diferenças entre o uso de aditivos microbianos na composição química das silagens,
obteve grandes diferenças nas tendências de crescimento da população de bacterias
láticas.
Diferentemente do que é geralmente observado em outros trabalhos, não houve
inibição acentuada no desenvolvimento de leveduras durante a fermentação. Pedroso et
al. (2005), avaliando a ensilagem da cana-de-açúcar, observou maior contagem de
leveduras até o 2º dia, declinando a partir desse ponto a valores baixos, próximos a 2
log ufc g-1 aos 45 dias de fermentação. Alli e Backer (1983), obteve, primeiros dias de
fermentação, contagens de leveduras próximos aos do presente ensaio, no entanto, da
mesma forma ao observado por Pedroso et al. (2005), verificou decrescimos na
população de leveduras, com valores de 3,3 Log ufc g-1 aos 21 dias de ensilagem.
Valores mais próximos ao deste experimento foram obtidos recentemente por Freitas et
al. (2006), trabalhando com diversos aditivos em silagens de cana-de-açúcar. Os
autores observaram aos 45 dias de ensilagem valores em torno de 5 a 6 Log ufc g-1. A
adição de L. buchneri, nesse estudo, dimiuíu a população de leveduras, apesar de não
reduzir os teores de etanol nas silagens, da mesma forma ao observado pelo presente
trabalho.
As menores populações de leveduras foram obtidas nas silagens sem aditivos e
nas silagens aditivada com L. buchneri apenas, a partir do 7º dia de fermentação.
136
Contrário do que é normalmente apresentado pela literatura, não foi possível verificar a
relação entre a população de leveduras e as produções de etanol e de ácido acético.
Vários estudos utilizando o L. buchneri (DRIEHUS et al. 1999; RANJIT & KUNG 2000;
ALLI et al., 1983; PEDROSO, 2003) têm mostrado menores teores de etanol ou maior
estabilidade aeróbica, pela inibição no crescimento da população de leveduras. No
presente estudo, apesar da diminuição na população de leveduras pelo L. buchneri,
quando foi usado de forma isolada, não aumentou os teores de ácido acético e não
dimuíu o teor de etanol em relação às silagens sem aditivos.
No caso das silagens aditivadas com uréia, houve tendência de maiores
contagens de leveduras no início da fermentação, como observado por outros estudos
(MOLINA et al. 1997). Esperava-se que haveria controle da população de leveduras
devido à ação antifúngica do nitrogênio (BRITT E HUBER, 1975), o que também não foi
verificado nas silagens deste experimento. Apesar de não promoverem a diminuição na
população de leveduras nas silagens com a combinação de bactérias homo e
heteroláticas e nas silagens uréia, estas conseguiram inibir a atividade destes
microrganismo, levando ao final a menores perdas por gases e maiores recuperações
de matéria seca, em relação aos demais tratamentos (Tabela 11).
4.4.9 Diversidade Genética
Buscando investigar a dinâmica das comunidades microbianas durante a
fermentação, amostras de todos os dias de abertura das silagens de cana-de-açúcar,
com os diferentes aditivos, foram analisadas em relação às presenças ou não de
bandas DGGE.
A técnica de DGGE vem sendo muito utilizada para a análise de comunidades de
bactérias em ambientes naturais, inclusive no monitoramento de mudanças das
estruturas destas comunidades em função de fatores como poluição (MUYZER E
SMALLA, 1998). No entanto, é importante considerar algumas limitações quando a
utilizarmos para um estudo de ecologia de microrganismos.
Normalmente, considera-se cada banda no gel, após o DGGE, como
representando uma espécie microbiana. Porém, sabe-se que muitas bactérias possuem
137
mais de uma cópia do rDNA 16S, os quais podem apresentar diferentes mobilidades no
gel com gradientes desnaturante, resultando em múltiplas bandas da mesma espécie
microbiana (NUBEL et al., 1996). Além disso, apesar de teoricamente ser capaz de
distinguir fragmentos de DNA que diferem em apenas um par de bases, Jackson et al.
(2000), mostraram em seu estudo com E. Coli, que esta técnica não foi capaz de
identificar diferenças entre mutantes que continham dois pares de bases distintos no
fragmento de rDNA 16S. Isso significa que uma banda detectada no gel pode
representar mais de uma espécie bacteriana, com diferentes sequências, mas mesmo
conteúdo de G+C.
Outra limitação da técnica é a amplificação preferencial de algumas subpopulações dentro de uma comunidade microbiana complexa, durante o PCR, de modo
que as bandas observadas representaram apenas as espécies mais abundantes na
amostra (VERIANI et al., 1999). Adicionalmente os iniciadores utilizados também podem
interferir nos resultados (CHANG et al. 2000).
Devido a essas limitações, pode-se afirmar que o número de espécies presentes
em um ambiente como a silagem pode ser muito maior do que o estimado pela análise
de amplicons do rDNA 16S por DGGE. Esta técnica é mais adequada quando o objetivo
é compararar duas ou mais amostras, com no presente estudo (JACKSON, 2000). Se as
amostras apresentam padrões de bandeamento diferentes, então, certamente as
comunidades microbianas apresentam diferenças. Caso o padrão de bandeamento seja
o mesmo, então estas diferenças podem estar ou não presentes.
Inicialmente, o objetivo de utilizar a técnica do DGGE para a análise de
comunidades de bactérias nas silagens de cana-de-açúcar foi verificar o real efeito da
aplicação de aditivos nas silagens de cana-de-açúcar. Assim, poderiamos em parte
explicar as diferenças entre tratamentos e atribuir essas diferenças as mudanças nas
comunidades bacterianas ou na contagem de bactérias.
Outro objetivo, ao utilizar essa técnica, foi tentar verificar se o aditivo microbiano
utilizado foi viável durante a fermentação. Para isso, tentou-se além de extrair o DNA do
aditivo microbiano liofilizado, amplificar esse DNA e correr amostras em conjunto com as
demais e correlacionar a banda apresentada com as bandas das amostras de silagens.
Não foi possível fazer essa determinação porque, não se conseguiu amplificar o DNA
138
extraído. Talvez, a grande contaminação apresentada por polissacarídeos impediu o
sucesso da tentativa de amplificação do aditivo. Assim, não foi feitas inferências sobre a
viabilidade dos aditivos durante a fermetação.
Podemos perceber pelos valores de porcentagem de similaridade de bandas,
obtidos no grupamento hieráquico (Figura 8), que há grandes diferenças entre as
silagens em relação às espécies de bactérias apresentadas. Essa é a grande conclusão
a ser obtida, ou seja, os aditivos fizeram com que se modificassem as comunidades
bacterias na silagem de cana-de-açúcar.
Secundariamente podemos perceber que entre os aditivos testados, o uso do L.
buchneri mais pediococcus promoveu as maiores mudanças na diversidade microbiana
das silagens durante a fermentação. Durante a ensilagem verifica-se uma maior
semelhança entre as silagens uréia e com L. buchneri apenas. Além disso, podemos
perceber que a grande diferenças entre as silagens com L. buchneri em combinação ou
nao com Pediococcus diminui aos 110º dia de ensilagem. Isso talvez possa ser
explicado pelo maior desenvolvimento do L. buchneri, no final da fermentação, período
em que há consumo do ácido lático e produção do ácido acético e 1,2-propanodiol
(Driehuis et al., 2001).
4.5 Conclusões
O estudo da associação de aditivos na ensilagem de cana-de-açúcar
oferece a oportunidade para novos ganhos em relação às estratégias de manejo
atualmente recomendadas.
O tratamento utilizando a combinação de bactérias homo e heteroláticas, L.
buchneri mais Pediococcus, apresentaram características desejáveis para a ensilagem
de cana-de-açúcar, devido aos maiores teores dos ácidos orgânicos, inibição na síntese
etanol, maiores recuperações de carboidratos solúveis e digestibilidade final. Para tal,
novas
pesquisas
são
necessárias,
como
experimentos
testando
diferentes
concentrações, avaliação de estabilidade aeróbia e, sobretudo, estudos de desempenho
animal para definitiva recomendação.
O aditivo Lactobacillus buchneri 5x104 ufc g-1 quando adicionado isoladamente não
apresentou boa eficácia em relação às variáveis estudadas de fermentação. As
139
respostas discrepantes que têm sido relatadas com o uso desse microrganismo
sugerem a reavaliação das dosagens recomendadas para silagem de cana-de-açúcar.
O tratamento uréia 1% MV foi efetiva em controlar a produção de etanol, sendo
consistente em mostrar aumentos na digestibilidade em relação às silagens controle.
Parte da falta de diferenças significativas em relação à silagens controle em relação a
preservação de carboidratos solúveis, acúmulos de FDN e perdas de MS, está
relacionado a maior variabilidade dessas análises e o pequeno número de repetições do
experimento.
Os aditivos uréia e a combinação de bactérias L. buchneri mais Pediococcus foram
eficiêntes em controlar durante a fermentação, a atividade da álcool desidrogenase,
enzima envolvida na etapa final de síntese de etanol.
Os aditivos influênciaram no desenvolvimento da microflora epifítica promovendo
mudanças nas diversidades de espécies durante a fermentação.
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