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Serviços Veterinários
Informações
2005-058
Compreendendo as infecções microbianas e os benefícios de Baytril®
Endotoxina e tratamento antimicrobiano
R. Froyman, F. Pirro
Fevereiro de 2005
2
Lipopolissacarídeo (LPS) ou endotoxina é um componente da membrana celular externa de
todas as bactérias Gram-negativas (G-va). Figura 1 a,b,c.
Do ponto de vista bioquímico, o LPS ou endotoxina possui uma camada de lipídios (lipídio A) e
uma camada de polissacarídeos. O lipídio A fixa o polissacarídeo à membrana externa da
bactéria. A endotoxina é estável no calor.
O lipídio A é um “dissacarídeo glucosamina fosforilado e acetilado por múltiplos ácidos
graxos”.
O lipídio A é a “porção tóxica” da endotoxina responsável pela ativação
generalizada da reação de fase aguda (RFA) após endotoxemia associada à
bacteremia. Enquanto o lipídio A é associado à toxicidade (endotoxemia), o polissacarídeo
(antígeno O) é específico à espécie da bactéria e está associado à imunogenicidade (p. ex.,
em diagnóstico sorológico).
O lipídio A aciona a liberação de citocinas mediadoras. Em bactérias Gram-positivas
que não possuem endotoxinas, o peptidoglicano (= ácido teicóico [AT] + ácido lipoteicóico
[ALT]) é responsável pelo estímulo de citocinas, mas esta molécula é consideravelmente
menos potente na estimulação da RFA do que a endotoxina de bactérias Gram-negativas.
Somente os animais vertebrados superiores são sensíveis à endotoxina e há variações
consideráveis entre as espécies de mamíferos. As aves são menos suscetíveis, mas não
inteiramente refratárias à endotoxina.
Suscetibilidade das espécies à endotoxina:
Equinos, bovinos > humanos, porcos > cães, gatos > aves
A endotoxina está sempre presente no trato GI (em quantidades variáveis), mas ela não é
absorvida se a mucosa estiver intacta. O caráter tóxico da endotoxina sérica/plasmática é
neutralizado pelos ácidos biliares (destruição da integridade do lipídio A).
A endotoxina sérica sistêmica exerce seus efeitos (RFA) em poucas horas.
A maior parte das endotoxinas de bactérias Gram-negativas liga-se à parede celular e, do
ponto de vista biológico, são de 20 a 50 vezes menos reativas do que as endotoxinas solúveis
livres. Somente as endotoxinas solúveis livres estimulam a RFA. O aumento das concentrações
de endotoxina sérica (“endotoxemia”) durante a bacteremia é um resultado direto da
desintegração da parede celular da bactéria.
A endotoxinas ligadas à parede celular são produzidas durante a fase exponencial da
multiplicação bacteriana. A endotoxina livre, que excede a quantidade necessária para a
síntese da parede celular, é produzida apenas em quantidades menores (cerca de 5-10 % do
total) durante a multiplicação bacteriana.
A endotoxina solúvel livre é liberada ...
Na autólise das bactérias na fase estacionária da multiplicação bacteriana. Esta é
apenas uma fração da população bacteriana, já que o restante da população
continua o crescimento para o próximo ciclo de multiplicação.
Após a lise bacteriana provocada pelos efeitos do complemento sérico e lisozima
livre.
Os bactericidas têm um impacto, dependendo do modo de ação, sobre as quantidades de
endotoxina livre liberadas: vide abaixo.
A interação bactericida-endotoxina
A. Liberação de endotoxina durante o tratamento bactericida
B. PK prolongada das fluoroquinolonas durante a endotoxemia
A interação bactericida-endotoxina
A. Liberação de endotoxina durante o tratamento bactericida
Existem dois componentes letais para uma infecção bacteriana séria: bacteremia (se
generalizada = sepse) e endotoxemia. Figura 2.
O dilema terapêutico das infecções por bactérias Gram-negativas:
Os bactericidas são necessários para combater a infecção (bacteremia): inibição
ou eliminação bacteriana.
Os bactericidas também afetam (aceleram?) a liberação de endotoxina ao
romper a membrana externa da bactéria: aumento da endotoxemia durante o
tratamento bactericida?
A interação bactericidas + liberação de endotoxina foi investigada exaustivamente, sobretudo
em condições in vitro.
Os resultados da quantificação de endotoxinas em estudos in vitro geralmente são
contraditórios, já que os vários testes (biológicos, imunológicos, radiométricos) não distinguem
de maneira idêntica os níveis de endotoxina total, ligada e livre. Somente esta última é
“biorreativa” e clinicamente relevante. Portanto, é extremamente importante diferenciar
a concentração de endotoxina de sua bioatividade.
As endotoxinas solúveis livres no soro podem ser quantificadas através do
“Teste do Limulus Clássico” (TLC) ou do teste do “Lisado de Amebócitos
Limulus” (LAL). Estes testes biológicos fundamentam-se no fato de que
quantidades muito pequenas de endotoxina coagulam as células
sanguíneas (=amebócitos) de Limulus polyphemus (caranguejo ferradura).
O verdadeiro impacto da bioatividade das endotoxinas pode ser determinado pela
medição in vivo das alterações do mediador citocina, ou então de seus efeitos clínicos e
biológicos (p. ex., reações de fase aguda como a hipotensão). Os estudos in vivo (p. ex.,
bacteremia/sepse em animais de laboratório) refletem melhor o verdadeiro impacto da
interação bactericida-endotoxina do que os estudos in vitro.
Via de regra, drogas bacteriostáticas não têm impacto.
Os antibióticos bactericidas com mecanismo de eliminação intracelular (síntese de proteínas
[p. ex., aminoglicosídeos] ou síntese de DNA [quinolonas]) têm um impacto irrelevante sobre
a liberação de endotoxina, ao passo que os antibióticos que atuam na parede celular (p. ex.,
β-lactâmicos, cefalosporinas) possuem um impacto significativo.
Os aminoglicosídeos (p. ex., gentamicina) provocam rápida eliminação bacteriana sem
alterações maiores da integridade da parece celular e da morfologia da bactéria.
β-lactâmicos e (fluoro)quinolonas são discutidos abaixo.
A. β-lactâmicos (penicilinas, monobactâmicos, carbapenêmicos, cefalosporinas).
Figuras 3a,b e 4.
Estes compostos inibem o crescimento celular ligando-se às principais proteínas ligantes de
penicilina (PBPs). Em consequência, altera-se a biossíntese do peptidoglicano (Figura 1a),
que é o principal componente estrutural da parede celular. Assim, a morfogênese bacteriana é
prejudicada (formação de esferoides ou filamentos), acompanhada de lise acentuada da
parede celular.
Há vários tipos de PBPs (1a, 1b, 2, 3, ... etc) e cada composto tem um espectro específico de
afinidade com a PBP.
As cefalosporinas de terceira geração (p.ex. cefotaxima, cefquinoma,
ceftiofur),
os
monobactâmicos
(p.ex.
aztreonam),
alguns
carbapenêmicos
(p.ex.,
meropenem)
e
as
ureidopenicilinas
antipseudomonas (p.ex., piperacilina) são altamente ativas para PBP-3.
A PBP-3 é responsável pela divisão celular e, uma vez inibida, a lise é
precedida por formas filamentosas muito longas (multissegmentadas) de
biomassa altíssima (e alta massa de endotoxina). Finalmente, com os βlactâmicos que apresentam afinidade por PBP-3, são liberadas grandes
quantidades de endotoxinas.
Outros β-lactâmicos possuem um espectro mais diversificado de atividade
para PBPs. A afinidade por PBP-1 leva à lise e morte celular muito
rapidamente. A endotoxina é liberada, mas em quantidades limitadas.
Com os β-lactâmicos ativos para PBP-2, p.ex, imipenem (um
carbapenêmico), também são produzidas quantidades pequenas de
endotoxina. A PBP-2 é responsável pelo crescimento longitudinal da célula
e, uma vez inibida, a lise bacteriana é precedida por formas celulares
arredondadas (esferóides).
B. (Fluoro)quinolonas
As quinolonas e fluoroquinolonas possuem atividade bactericida por inibirem a multiplicação
bacteriana (inibição das enzimas girase e topoisomerase IV). A morte bacteriana resulta
em bactérias inviáveis com autólise limitada da parede das células residuais.
1. Estudos in vitro mostraram que as FQs (moderadamente, em comparação com os βlactâmicos ligantes de PBP-3) aumentam a liberação de endotoxinas – dificilmente na fase
exponencial do crescimento, mas sobretudo na fase estacionária.
1.1 É importante ter em mente que, em casos de sepse/bacteremia, a morte das bactérias
metabolicamente ativas reduz drasticamente a contagem bacteriana (p.ex. para zero ou
poucas células por mL em algumas horas) em comparação com a multiplicação inibida (p.ex.
8-9 log10 células) de uma cultura-controle, além de limitar as quantidades absolutas de
endotoxina que podem ser liberadas durante a fase estacionária.
1.2 É igualmente importante lembrar que a análise retrospectiva mostrou que os níveis de
endotoxina de muitos estudos anteriores foram amplamente superestimados, já que os
métodos quantificavam a endotoxina total em vez da endotoxina biorreativa.
1.3 Apesar das observações in vitro (liberação precipitada de endotoxina com bactérias Gramnegativas expostas a FQs), nunca se observou o aumento de choque séptico e falência de
órgãos no tratamento com enrofloxacina e ciprofloxacina em humanos e animais!
2.1 Estudos in vivo com modelos animais confirmam o aumento das concentrações séricas de
endotoxina durante o tratamento com FQ/ciprofloxacina, mas estas concentrações
aumentadas de endotoxina não podem ser relacionadas ao aumento de ventos
clínicos, p.ex. hipotensão ou choque! Os aumentos de endotoxina in vitro e in vivo
(sérica) e do nível de exposição à FQ/ciprofloxacina (dose) não estão bem correlacionados
(Figuras 5a,b).
2.2 O trabalho de Nitsch et al. (sepse por E. coli em modelos de ratos) explica muito bem o
que ocorre in vivo: vide Figura 5c. Embora o aumento das concentrações de endotoxina sérica
seja mensurado durante o período de tratamento com ciprofloxacina (Figura 5a), estes níveis
aumentados NÃO se correlacionam com o efeito clínico esperado, associado à endotoxemia.
Normalmente, esperar-se-ia uma hipotensão mais severa mas, pelo contrário, a hipotensão é
substancialmente reduzida em comparação com os grupos nos quais outros antibióticos
(gentamicina, cefotaxima) induzem ao aumento da hipotensão!
2.3 Outros estudos in vivo (Khan et al., 2000; Purswani et al., 2002; Krehmeier et al., 2002;
Vianna et al., 2004: vide Figuras 6 e 7) mostraram que as FQs protegem contra a
mortalidade induzida por endotoxinas na sepse provocada por bactérias Gramnegativas por regularem para baixo (mecanismo desconhecido) a liberação das
citocinas mediadoras IL-6 e TNF-α. Estas últimas citocinas são responsáveis pelo início da
RFA, choque e morte.
A interação bactericida-endotoxina
B. PK prolongada das fluoroquinolonas durante a endotoxemia
As reações de fase 1 da metabolização in vivo de enrofloxacina e ciprofloxacina consistem
numa série de processos de oxidação (principalmente) e redução catalisados por um dos
principais complexos enzimáticos, i.e. “citocromo P450” (formado por 3 famílias principais
[CYP 1, 2 e 3]). As reações de fase 2 consistem na conjugação destes metabolitos primários
às funções hidrofóbicas (p.ex., ácido glucurônico)
Estudos (Lynn et al., 2003; Rao et al., 2000: Figuras 8 e 9) demonstraram que a
endotoxemia prolonga a farmacocinética de muitas drogas, entre elas
enrofloxacina e ciprofloxacina em animais. Este fenômeno deve-se provavelmente ao
efeito inibitório das citocinas mediadoras, disparado pela endotoxina, sobre o citocromo
microssomal P450 nos hepatócitos. De acordo com vários estudos (revisão: Monshouwer e
Witkamp, 2000), o óxido nítrico parece ser o principal mediador envolvido.
Figure 1A
Structure of a Gram-Negative Cell Wall
Porin
Protein
LPS
Polysaccharide
Lipid A
Outer membrane
Lipoprotein
Peptidoglycan
Cytoplasmic membrane
Phospholipid
Figura 1A
Estrutura da parede celular de bactéria Gram-negativa
Porina
Proteina
LPS
Polissacarídeo
Lipídio A
Membrana externa
Lipoproteína
Peptidoglicano
Membrana citoplasmática
Fosfolipídio
Figure 1B
O-Polysaccharide
Outer
Inner
Core
Lipid A
Figura 1B
Polissacarídeo O
Externo
Interno
Centro
Lipídio A
Figure 1C
Structure of a Gram-Positive Cell Wall
Surface proteins
Teichoic acid
Lipoteichoic acid
Peptidoglycan
NAM – NAG peptide
Cytoplasmic membrane
Figura 1C
Estrutura da parede celular de bactéria Gram-positiva
Proteínas da superfície
Ácido teicóico
Ácido lipoteicóico
Peptidoglicano
Peptídeo NAM – NAG
Membrana citoplasmática
Figura 1A
Figura 1B
Figura 1C
Figure 2
Resistance
Adaption
Endotoxic products*
Interaction with host defense
ANTIBIOTIC
BACTERIUM
HOST
Inhibition
Killing
Colonization
Infection
INFECTION OUTCOME
Figura 2
Resistência
Adaptação
Produtos endotóxicos*
Interação com as defesas do hospedeiro
ANTIBIÓTICO
BACTÉRIA
HOSPEDEIRO
Inibição
Eliminação
Colonização
Infecção
INFECÇÃO RESULTANTE
Figura 2
Penicilinas de primeira geração
Penicilinas resistentes à betalactamase
Aminopenicilinas
Ureidopenicilinas
Amidinopenicilinas
Penicilinas (penemas)
Carbapenêmicos
Monobactâmicos
Inibidores de beta-lactamase
Cefalosporinas (cefemas)
Benzilpenicilina (penicilina G),
Fenoximetilpenicilina (peniclina V)
Meticilina, nafcilina, oxacilina,
dicloxacilina
Amoxicilina/ampicilina
Piperacilina
Andinocilina, andinocilina pivoxil
Imipenem, meropenem
Aztreonam
Ácido clavulânico
Cefalotina, cefazolina, cefapirina,
cefalexina, cefaloridina, cefadrina,
cefadroxila
Primeira geração
Cefaclor, cefuroxima, cefoxitina,
cefotetan, cefamicina, cefamandol,
cefmetazol, ceforanida, cefonicida
Segunda geração
Cefotaxima, cefquinoma, ceftiofur,
cefixima, ceftriaxona, ceftizoxima,
ceftazidina, moxalactam, cefetamet,
protexil, cefoperazona, ceftazidima,
cefpiramida
Terceira geração
Quarta geração
Figure 3
Classification of betalactam antibiotics
Structural formula of
penicillin
Figura 3
Classificação dos
antibióticos betalactâmicos
Fórmula estrutural
da penicilina
Penicillin
Cephalosporin
Carbapenem
Monobactam
Core structures of
naturally occurring betalactams
Penicilínico
Cefalosporínico
Carbapenêmico
Monobactâmico
Estruturas centrais
de beta-lactâmicos
naturais
Figura 3
Cefepima, cefpiroma, cefclidina,
cefozopran
Figure 4
BETALACTAM ANTIBIOTIC
PBPs
Figura 4
ANTIBIÓTICO BETA-LACTÂMICO
PBPs [Proteínas Ligantes de Penicilina (Penicillin Binding
Proteins)]
BACTERIAL ENVELOPE GROWTH
Crescimento do envelope bacteriano
LATERAL WALL (PBP-1, PBP-2)
Parede lateral (PBP-1, PBP-2)
SEPTA (PBP-3)
Septos (PBP-3)
ROUND CELLS (PBP-2)
Células redondas (PBP-2)
SPHEROPLASTS OR FILAMENTS-BLEBS (PBP-1, PBP-2, Esferoplastos ou filamentos-vesículas (PBP-1, PBP-2,
PBP-3)
PBP-3)
FILAMENTS OR LARGE ROUND MULTISEPTATE CELLS FILAMENTOS OU GRANDES CÉLULAS REDONDAS
(PBP-3)
MULTISSEGMENTADAS
PRIMARY KILLING ACTIVITY
ATIVIDADE PRIMÁRIA DE ELIMINAÇÃO
PRIMARY GROWTH-INHIBITING ACTIVITY
ATIVIDADE PRIMÁRIA DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO
Figura 4. Os diversos processos da atividade bactericida dos beta-lactâmicos
Figure 5A
Ciprofloxacin, 3 mg/kg
Ciprofloxacin, 6 mg/kg
Untreated (0.9% NaCl)
Ciprofloxacin IV
Endotoxin, EU/mL
Time, h
Figura 5A
Ciprofloxacina, 3 mg/kg
Ciprofloxacina, 6 mg/kg
Não tratados (NaCl a 0,9%)
Ciprofloxacina IV
Endotoxina (UE/mL)
Tempo (h)
Nitsche et al. , 1996
Endotoxemia in vivo em ratos após provocação intraperitoneal com E. coli, com ou sem tratamento bactericida
concomitante (ciprofloxacina, 3 ou 6 mg/kg). Não há correlação positiva entre a endotoxemia e a dose de
ciprofloxacina.
Figura 5A
Figure 5B
Ciprofloxacin
Imipenem
Ceftazidime
Limulus test LPS concentration (ng/mL)
Control
Figura 5B
Ciprofloxacina
Imipenem
Ceftazidima
Concentração de LPS no teste do Limulus (ng/mL)
Controle
Trautmann et al. , 1996
Liberação de endotoxina livre (LPS) por E. coli in vitro, 4 h após a exposição ao bactericida (≥ 99% de
eliminação obtida). Não há relação óbvia ou acentuada entre a liberação de endotoxina e o nível de exposição à
ciprofloxacina (~dose).
Figure 5C
Endotoxin EU/mL
Sham infected
Untreated (0.9% NaCl)
Cefotaxime
Ciprofloxacin
Gentamicin
Imipenem
Figura 5C
Endotoxina (UE/mL)
Infecção simulada
Não tratados (NaCl a 0,9%)
Cefotaxima
Ciprofloxacina
Gentamicina
Imipenem
Nitsche et al. , 1996
Provocação intraperitoneal com E. coli em ratos com ou sem tratamento bactericida concomitante
(ciprofloxacina). Apesar do aumento da ocorrência de endotoxemia, não há hipotensão mediada por endotoxinas
em animais tratados com ciprofloxacina.
Grau de hipotensão
(mmHg)
Controle desafiado
Figure 6
Percent survival
Time (hours post injection of LPS)
Khan et al., 2000
Figura 6
Percentual de sobrevivência
Tempo (horas pós-injeção de LPS)
Injeção IV de endotoxinas (LPS) em camundongos e o efeito da administração de ciprofloxacina
1. redução significativa de TNF-α e IL-6 induzidos por endotoxina
2. proteção significativa contra a mortalidade induzida por endotoxinas
Figure 7
Serum TNF-α
Serum IL-6
Serum IL-2
Ciprofloxacin
Time after LPS challenge (h)
Figura 7
TNF-α sérico
IL-6 sérica
IL-2 sérica
Ciprofloxacina
Tempo após a provocação com LPS (h)
Purswani et al. , 2002
Provocação intraperitoneal com endotoxina (LPS) em camundongos pré-tratados ou não com ciprofloxacina:
[i] taxa de sobrevivência: a ciprofloxacina protege contra a mortalidade mediada por endotoxinas
[ii] resposta à citocina: ciprofloxacina reduz significativamente os níveis de TNF-α e IL-12
Ciprofloxacina
Figure 8
Plasma concentration
Time (h)
Figura 8
Concentração plasmática
Tempo (h)
Rao et al. , 2000
PK de enrofloxacina (soma enro+cipro) em cabras normais e febris (induzida por endotoxinas):
AUC (µg*h/ml) aumentada de 8,6 para 12,7 (aumento de 48%) e níveis séricos prolongados
Figura 8. Perfil de concentração plasmática média (± EP) –
tempo de enrofloxacina mais ciprofloxacina em cabras normais
(◊ n=6) e febris (■ n=5) após injeção i.v. única de enrofloxacina
(5 mg/kg).
Figure 9
Enrofloxacin concentration
Time (h)
Control
Dexamethasone
LPS
LPS-Dexamethasone
Figura 9
Concentração de enrofloxacina
Tempo (h)
Controle
Dexametasona
LPS
LPS-dexametasona
Post et al. , 2003
Efeito das endotoxinas (LPS) sobre a PK de enrofloxacina (ENR), todas injeções IV, em porcos:
[a] ENR-AUC (µg*h/ml) aumentada de 11,2 para 22,4 (aumento de 100%) e níveis séricos prolongados.
[b] não há inibição da excreção urinária de ENR.
[c] a dexametasona, que inibe os mediadores APR, neutraliza o efeito das endotoxinas sobre a PK de ENR.
Figura 9. Gráfico semilogarítmico das concentrações plasmáticas médias (n=6) de
enrofloxacina medidas em 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 e 72 h após a
administração de enrofloxacina. Administrou-se injeção i.v. única de enrofloxacina (5 mg/kg
de peso corporal em 0h) 24h após LPS ou LPS simulado. Três injeções de dexametasona
(0,5 mg/kg) foram administradas no período de –42, –24 e –12 h após injeção i.v. única de
LPS (2 µg/kg de peso corporal) em –24 h.