MICROBIOLOGIA
O almanaque
Características principais da vida celular
1. Metabolismo – Interacções entre a célula e o ambiente. 4. Comunicação – As células comunicam e interagem através de químicos que são libertados ou apanhados. 2. Reprodução (crescimento) – As Substâncias químicas do ambiente são transformadas em novas células, através das células já existentes. 5. Movimento *‐ Os organismos vivos são capazes de se movimentarem através de flagelos. 3. Diferenciação *– Formação de uma estrutura celular que normalmente faz parte do ciclo da vida (ex.: esporo). 6. Evolução – As células têm genes e evoluem de forma a adquirirem novas propriedades biológicas. As árvores filogenéticas mostram a evolução entre as células. * Diferenciação e Movimento não são propriedades comuns a todos os microrganismos. Designação dos Microrganismos
Ex. Pseudomonas putida IST21 Estirpe
Género Espécie (Itálico ou sublinhado) Pseudomonas sp. várias espécies Objectivo da Microbiologia Entender o modo como os microrganismos funcionam, de modo a: • Explorar os aspectos benéficos à sua actividade; • Prevenir/evitar os aspectos negativos. 2 Técnicas Básicas da Microbiologia • Preparação de meios de cultura A composição de um meio de cultura depende da espécie que sepretende cultivar. Micronutrientes: Macronutrientes: • Crómio • Carbono (~50%) • Cobalto • Oxigénio (~20%) • Cobre • Azoto (~14%) Elementos • Manganês • Hidrogénio (~8%) essenciais • Fósforo (~3%) • Molibdénio • Enxofre (~1%) • Niquel • Potássio • Selénio • Magnésio • Tungsténio • Sódio • Vanádio • Cálcio • Zinco • Ferro • Ferro
Vitaminas – factores de crescimento essenciais. Meios de cultura sintéticos ou definidos – composição química conhecida. Meios de cultura complexos – composição exacta desconhecida. Têm alguns ingredientes como Peptonas (fonte de carbono, de energia e de azoto), Extracto de Levedura (fonte de vitaminas, carbono, azoto e minerais), Extracto de Carne, etc. Meio Selectivo – suprime o crescimento de determinados organismos em benefício de outros. Meio Diferencial – permite distinguir microrganismos com base na capacidade de metabolizar componentes específicos presentes no meio de cultura e/ou na morfologia das células. Permite, por vezes, a identificação de microrganismos com base nas suas características biológicas. • Isolamento de culturas puras Técnica de Riscado em meio sólido 3
Técnica de Espalhamento em meio sólido Colónia – Cultura pura de um microrganismo. Cultura pura – Cultura de células genética e morfologicamente idênticas. Morfologia de colónias – depende do microrganismo, mas também pode depender das condições ambientai, tais como, quantidade de oxigénio, nutrientes disponíveis, etc. Postulados de Koch (primeiro cientista a definir cultura pura e a isolar colónias de bactérias em meios de cultura sólidos): 1. O organismo patogénico suspeito devia estar presente em todos os animais doentes e ausente nos animais saudáveis; 2. O organismo suspeito era cultivado em cultura pura; 3. Células de uma cultura pura do organismo suspeito deviam provocar a doença no animal saudável; 4. O organismo voltava a ser isolado e mostrava‐se que era igual ao original. 4 Isolamento de colónias e enumeração de Unidades Formadoras de Colónias (UFC) Passo 1. Diluições sucessivas. Passo 2. Transferir 0,1mL de cada uma das diluições para as placas de agar. Passo 3. Esterilizar a vareta de vidro em L e espalhar a amostra na superfície do agar. Passo 4. Incubar. Passo 5. Contar as colónias das placas que contenham 20‐300 colónias. 10‐3
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10‐4
Nº colónias x 10 x (diluição)‐1 UFC/ml de suspensão (A) Nº colónias x 103 x (diluição)‐1 UFC/100ml de suspensão de solo/10g Cultura de enriquecimento – Isolamento de microrganismos pouco abundantes e com requerimentos nutricionais específicos, a partir de populações mistas. 5
Crescimento em meios de cultura selectivos 1º enriquecimento em meio líquido; 2º isolamento de colónias em meio sólido. Limitações das técnicas de isolamento de colónias ‐ Apenas 1‐10% dos microrganismos funcionais presentes nos ambientes naturais são cultiváveis em meios de cultura laboratoriais conhecidos. Exploração das potencialidades dos microrganismos “não‐cultiváveis” nos meios de cultura laboratoriais conhecidos ‐ Desenvolvimento de métodos moleculares (não dependentes do cultivo) para pesquisa e identificação (ex.: Análise de DNA, RNA, proteínas); ‐ Procura de “novas fórmulas” para cultivo de microrganismos. • Técnicas de assépsia e de esterilização Esterilização no laboratório: • Calor: ‐ Calor seco – em estufa (pouco eficiente e aplicado apenas a material resistente a altas temperaturas); ‐ Calor húmido (vapor de água saturado) – na autoclave. A esterilização na autoclave é feita a 121ºC durante pelo menos 15minutos para assegurar a destrruição dos endósporos das bactérias, pois estas são as estruturas biológicas mais resistentes ao calor. • Radiação ultra‐violeta (limitada a superfícies) • Filtração (aplicada a líquidos e gases) Esterilização do ar por filtração: ‐ Máscaras cirurgicas; ‐ Rolhas de algodão nos frascos para cultivar microrganismos; ‐ Filtros HEPA (“high‐efficiency particulate air filters”) Usados em: ‐ Câmaras de fluxo laminar de segurança biológica; ‐ Salas limpas. • Manutenção de células viáveis no laboratório Metodologias que permitem a manutenção de células viáveis, não contaminadas e inalteradas nas suas propriedades: • Em rampas ou placas de Petri contendo meio sólido (dias ou semanas); • Congelação (anos) ‐ Em azoto líquido (‐196oC); ‐ Em arcas congeladoras (‐70oC); 6 •
Liofilização – desidratação das células por sublimação de água congelada, sob vácuo (anos, décadas) • Microscopia Técnicas Microscópicas Poder de Resolução do Microscópio Óptico composto Distância mínima entre dois objectos. Quanto menos o d maior o poder de resolução Comprimento de onda da luz que incide no objeto Abertura Índice de refracção do meio angular entre a lâmina de vidro e a lente da objectiva η=1 Ar η=1,52 vidro; óleo de imersão Vários Tipos de Microscópio Óptico Composto: • Microscópio de campo claro • Microscópio de campo escuro • Microscópio de contraste de fase • Microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC) • Microscópio de fluorescência Maior contraste Campo Claro Campo de contraste de fase Campo escuro 7
Saccharomyces cerevisae Luz visível Ideal para observar células coradas Ideal para observar células vivas, não coradas Baixo contraste Melhor contraste Melhor contraste que campo claro Contraste de fase Contraste de interferência diferencial Paramecium Imagem tridimensional colorida Melhor resolução que contraste de fase Excelente para observar células vivas Microscópio de Fluorescência ‐ Expõe o objecto a radiação ultra‐violeta, violeta ou azul; ‐ Aplicações: ‐ Visualização de células (coradas com fluorocromos ou autofluorescentes); ‐ Distinção entre células viáveis/activas e mortas; − Diagnóstico rápido de microrganismos específicos em Giardia sp. amostras clínicas, ambientais, alimentares, etc. Exemplo. Imunofluorescência − O anticorpo é combinado com fluorocromo; − O anticorpo combinado é adicionado às células fixadas sobre uma lâmina e liga‐se aos antigénios do microrgansimo que se pretende detectar; 8 − As células às quais o anticorpo se ligou fluorescem depois de serem sujeitas a radiação. Os anticorpos são moléculas produzidas por um animal infectado (resposta imunitária) e que têm a capacidade de se ligar aos antigéneos que induziram a sua produção. Microscópio confocal de laser: −
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Usa luz emitida por laser para iluminar um plano do objecto de cada vez; Células são coradas com fluorocromo; Imagem bi‐dimensional ou tri‐dimensional; Aplicações: ‐ Análise de camadas de microrganismos em biofilmes; ‐ Análise do conteúdo microbiano de amostras expessas, em profundidade; ‐ Ecologia microbiana. Coloração de preparações de células: ●
Aumenta o contraste das células ou estruturas subcelulares; ● Acentua características morfológicas específicas; ● Preserva preparações; ● Facilita diagnóstico de microrganismos específicos (ex.: Coloração de Gram); Passos Principais: 1. Fixação ‐ Fixação química (preserva estrutura subcelular fina) ‐ Fixação por acção do calor 2. Tratamento da preparação com corantes ‐ Coloração simples ‐ Coloração diferencial (mais do que um corante) ‐ divide microrganismos em grupos com base na sua coloração (ex.: Coloração de Gram); ‐ Coloração de estruturas específicas Microscópio electrónico de transmissão: ●
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usa um feixe de electrões; permite resolver estruturas mais pequenas que o microscópio óptico; imagem bi‐dimensional; Aplicação: ‐ observação de virus; ‐ observação da ultraestrutura interna de células do tipo eucariótico e procariótico; preparação da amostra complexa e morosa. 9
Microscópio electrónico de varrimento: ●
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usa electrões reflectidos pela superfície do objecto para formar a imagem; imagem tri‐dimensional; observação de características da superfície de células e virus e estrutura de colónias, directamente na superfície de tecidos, etc. Impacto dos Microrganismos no ambiente e nas actividades humanas Principais razões subjacentes à diminuição da incidência de doenças infecciosas: − Melhor compreensão dos agentes microbianos causadores de doença e dos processos de transmissão e desenvolvimento; − Melhoramento das práticas sanitárias; − Descoberta e uso de agentes antimicrobianos; − Descoberta e uso de vacinas. Modelos celulares utilizados em Investigação Básica: Processos Biológicos Modelos DNA como a substância genética Batérias e vírus Mecanismo da expressão genética Código Genético Vias metabólicas essenciais Bactérias Enzimas de restrição Transcriptase reversa vírus Mecanismos de resistência a multiplas drogas Bactérias e fungos „
Actividades benéficas nos Ambientes Naturais ●
10 Microflora natural – competem com microrganismos patogénicos e produzem alguns nutrientes para o organismo hospedeiro; Microflora natural no ser humano ‐ Barreira de defesa contra microrganismos patogénicos; ‐ Participação na nutrição. Um desequilíbrio na flora microbiana natural pode causar infecções e doenças. Bactérias da pele: ‐ eliminam pele morta; ‐ impedem a invasão por bactérias patogénicas. Os microrganismos da epiderme variam com: ‐ Modificação das condições meteorológicas; ‐ Exposição à luz solar; ‐ Uso de cosméticos; ‐ Higiene pessoal. ●
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Alimentos ●
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Produção de bebidas fermentadas; Produção de alimentos; Conservação de alimentos – ácido láctico, ácido acético, bacteriocinas,etc; Aditivos Probióticos – Microrganismos ou substâncias por eles sintetizadas que promovem a saúde e o crescimento (Lactobacillus sp.) Energia/Ambiente ●
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Decomposição de matéria orgânica morta – reciclagem de nutrientes na biosfera; Reciclagem de nutrientes inorgânicos; Fertilidade do solo (fixação de azoto, nitrificação) – algumas bactérias fixam o N2 atmosférico e convertem‐no em NH3 para ser utilizado pelas plantas. Outras transformam NH3 em nitrato; Sobrevivência do gado e outros ruminantes – digestão da celulose; Controlo de pestes – biopesticidas microbianos naturais; Base das cadeias alimentares e ciclos de nutrientes aquáticos e terrestres; Produção de oxigénio ‐ microrganismos fotossintéticos aquáticos; Destruição de compostos tóxicos – biodegradação de compostos tóxicos naturais e artificiais; Produção de metanol/biocombustível; Produção de etanol/combustível, solvente industrial; Biorremediação – despoluição de solos e ambientes aquáticos/marinhos, biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo, pesticidas, solventes; Tratamento biológico de esgotos e águas residuais; Recuperação/lexiviação de minérios Biotecnologia ●
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Produção de Antibióticos – muitos microrganismos sintetizam compostos químicos que impedem o crescimento de outros microrganismos patogénicos; Produção de outros produtos farmacêuticos – por microrganismos geneticamente manipulados; Produção de enzimas, vitaminas, aminoácidos, bioinsecticidas, etc.; −
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Algumas Bactérias famosas (Procariotas) Escherichia coli (bactéria natural do intestino); Cianobactéria (fotossíntese oxigénica); 11
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Pseudomonas sp. (biodegração de compostos orgânicos poluentes no ambiente); Bacillus anthracis (ANTRAX); Lactobacillus acidophilus (fermento lácteo do iogurte); Staphylococcus aureus (patogéneo humano) −
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Alguns fungos famosos (Eucariotas) Saccharomyces cerevisiae (levedura do pão e da cerveja); Cogumelos; Fungo filamentoso (ou bolor) Alguns fungos famosos (Eucariotas) Papel: ‐ são predadores de bactérias; ‐ decompositores de matéria orgânica; ‐ parasitas em animais; ‐agentes causadores de doenças intestinais. Exemplos: ‐ Giardia lamblia ‐ Paramecium sp. ‐ Amoeba
Algumas microalgas Famosas (Eucariotas)
Papel: ‐ base da cadeias cadeias alimentares aquáticas e marinhas; ‐ oxigenação do Ambiente; ‐ responsáveis por eutrofização (proliferação excessiva de algas o que leva a um aumento de microrganismos); ‐ síntese toxinas; ‐ produção de carotenóides. Exemplos: ‐ Spirogyra ‐ Volvox ‐ Chlorella ‐ Diatomáceas (indicadores da qualidade da água – presença de poluição) Introdução à classificação de microrganismos 12 Sistema dos 5 Reinos Interpretação da árvore filogenética universal ●
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Aspectos evolutivos revelados por esta abordagem: As espécies dos domínios Bacteria, Archaea e Eukarya divergiram de um organismo ancestral no início da história da Terra; Os microrganismos procariotas evoluiram separadamente formando os domínios Bacteria e Archaea; Espécies do domínio Archaea estão mais próximas filogeneticamente dos eucariotas do que de espécies de Bacteria; Células eucarióticas contêm genes dos domínios Eukarya e Bacteria. A sequenciação do rRNA das mitocôndrias e cloroplastos revelou que eles derivam de linhagens específicas de células do tipo Bacteria, que outrora terão estabelecido endosimbioses estáveis com outras células e evoluido formando células do tipo eucariótico (Teoria Endossimbiótica). Seres vivos divididos por três domínios: Eukarya: − Microrganismos: protozoários, microalgas, fungos; − Organismos superiores: animais, plantas, algas multicelulares; 13
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14 Archaea: − Maior parte das bactérias extremófilas; − Bactérias produtoras de gás metano. Bacteria − Todas as outras bactérias. Microrganismos Procariotas Formas e tamanhos das células do tipo procariótico Células procariótica Parede celular de procariotas – extrutura rigida situada externamente à membrana plasmática. Tem como funções: •
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Dar forma e integridade à célula; Proteger a célula da lise osmótica; Contribuir para a patogenicidade de algumas bactérias; Proteger a célula de substâncias tóxicas. A parede celular e a protecção osmótica •
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Osmose: movimento de água através de uma membrana selectivamente permeável, de soluções diluídas para mais concentradas. As células estão geralmente em soluções hipotónicas: [soluto]fora da célula < [soluto]dentro da célula 15
A parede celular protege contra a lise osmótica •
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Lise Osmótica: Pode ocorrer quando as células estão em soluções hipotónicas; O movimento de água para o interior das células causa aumento de volume que culmina na lise da célula, devido à diferença de pressão osmótica. A parede celular não protege contra a plasmólise •
Plasmólise ‐ Ocorre quando as células estão em soluções hipertónicas. ‐ A água sai da célula causando o encolhimento do citoplasma que resulta em perda de viabilidade da célula. As bactérias dividem‐se em dois grupos com base na estrutura e composição da parede celular: bactérias Gram positivas e Gram negativas. As bactérias gram positivas e gram negativas distinguem‐se com base na resposta à coloração de Gram. 16 Lise osmótica A lise osmótica é o rompimento da membrana celular e ocorre por acção da lisoenzima (hidrólise da ligação β 1‐4 no peptidoglicano) ou do antibiótico penicilina (que inibe a síntese do mesmo). Por suspensão das células em meio isotónico ou ligeiramente hipertónico e tratamento com penicilina podem obter‐se: o
Protoplastos são células sem parede celular (obtêm‐se a partir de Gram‐positivas); o
Esferoplastos são células sem peptidoglicano, mas com membrana (obtêm‐se a partir de Gram‐
negativas) Tanto os protoplastos como os esferoplastos são sensíveis a modificações da pressão osmótica do meio extracelular, porque quando suspensos em meios hipotónicos (diluídos) sofrem lise devido à entrada descontrolada de água. Nas bactérias do domínio Archaea (Arqueobactérias) (ex: Methanobacterium), o componente principal da parede celular é o Pseudopeptidoglicano: Monómero: ‐Açucares: N‐acetilglucosamida; N‐acetiltalosaminurónico ‐Ligações glicosídicas: β 1‐3 INSENSÍVEIS À LISE ‐Ponte entre cadeias: resíduo de glutamato Parede celular de Bactérias Gram‐positivas: A parede celular deste tipo de bactérias contém essencialmente peptidoglicano e ácidos teióicos: estes últimos são polímeros de glicerol ou ribitol ligados por grupos fosfato, que podem ter açúcares ou D‐
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alanina ligados e conferem carga negativa à superfície celular, permitindo ligar catiões divalentes. Parede celular de Bactérias Gram‐negativas A parede deste tipo de bactérias consiste numa fina camada de peptidoglicano, rodeada por uma membrana externa composta por lípidos, lipoproteínas e lipopolissacáridos (LPS). As características da parede são: o
As Lipoproteínas de Braun ligam fortemente a membrana externa ao peptidoglicano; o
Os locais de adesão são locais de contacto directo entre a membrana plasmática e a membrana externa, permitindo a saída e entrada directamente nestes locais; o
A membrana externa é mais permeável que a plasmática devido à presença de porinas e proteínas transportadoras; o
As porinas formam canais através dos quais pequenas moléculas são capazes de passar. O Lipopolissacárido (LPS): Importância do LPS Antigénio O
Protecção contra as defesas do hospedeiro Região central Contribui para a carga negativa da superfície da célula Hidrófila Lípido A 1. Ajuda a estabilizar a estrutura da membrana externa; Hidrófobo 2. Pode ser uma endotoxina que causa infecçõesÆsintomas no hospedeiro 18 Citoplasma Encontra‐se entre a membrana e o nucleóide e é uma estrutura organizada no que respeita à localização de proteínas Ribossomas o
Constituídos por proteínas e RNA; o
Local da síntese de proteínas; o
Mais pequenos (70S) que os dos eucariotas (80S) S: unidade Svedburg (sedimentação) Nucleóide Plasmídeos o
Região com forma irregular; o
Localização do cromossoma: o
Molécula de DNA cadeia dupla, geralmente circular o
Tamanho variável entre 0,5 e 10 Mpb (106 pares de bases) o
Uma cópia por célula (normalmente) o
90% do genoma de E. coli codifica para proteínas o
Pequenas moléculas de DNA em cadeia dupla o
Existem e replicam‐se independentemente do cromossoma o
Não são necessários para o crescimento e reprodução da célula o
Podem conter genes que conferem vantagem selectiva às células que os albergam (ex.: resistência a drogas, transformação e/ou degradação de compostos tóxicos o
Grânulos de materiais orgânicos ou inorgânicos produzidos pela célula o
Frequentemente usados como materiais de reserva (ex.: para energia e biossíntese) o
Quantidade depende do estado nutricional da célula Grânulos Orgânicos (reserva de carbono e energia): Corpos de Inclusão o
Glicogénio (polímero de glucose) ex.: Bactérias E. coli, Salmonella, Bacillus, também em fungos o
Amido (polímero de Glucose: amilose, amilopectina) ex.: géneros Clostridium, Acetobacter o
Granulações lipídicas de poli‐β‐hidroxibutirato (PHB) (polímero de β‐
hidroxibutirato. ex.: géneros Alcaligenes, Bacillus 19
Grânulos Inorgânicos: o
Polifosfato: Grânulos de volutina (polímeros lineares de ortofosfato (ex.: Spirillum volutens): reserva de fósforo para a síntese de ácidos nucleicos e fosfolípidos; o
Enxofre: material de reserva energética em bactérias que oxidam compostos de enxofre reduzidos (como o H2S) e acumulam temporariamente S0 o
Agregados de várias estruturas cilíndricas ocas o
Presentes em bactérias aquáticas (ex.: cianobactérias, bactérias púrpura e Vacúolos gasosos verdes e algumas bactérias aquáticas não fotossintéticas; o
Permitem regular a profundidade a que vivem (capacidade para flutuar consoante as necessidades de luminosidade) Magnetossomas o
Contêm ferro sob a forma de magnetite (Fe3O4); o
São usados para orientar as células no campo magnético terrestre (magnetotaxia) o
Algumas espécies de bactérias aquáticas ex.: Aquaspirillum magnetotacticum Componentes exteriores à parede celular Cápsula: É uma camada formada, geralmente, por polissacáridos, exterior à parede celular, dificilmente removida pela célula e observável no microscópio óptico, por coloração negativa. As suas funções são: o
Favorecer a adesão a superfícies; o
Proteger de condições ambientais desfavoráveis (ex.: desidratação); o
Proteger das defesas do hospedeiro que infecta (ex.: fagocitose) o
Proteger de infecções por vírus; o
Proteger do stress osmótico Fímbrias: (seta vermelha) apêndices pequenos e finos, constituídos por proteínas (até 1000/célula) que medeiam a adesão a superfícies (por ex.: reconhecem receptores nas células dos tecidos que colonizam e infectam). Pilus sexual: (seta azul) semelhantes às fímbrias, mas mais grossos e menos numerosos (1‐10/célula) e são necessários para a conjugação entre bactérias (transferência de plasmídeos e cromossomas) 20 Flagelos: permitem a locomoção das células: 1.
Monotríquico e polar: 1 flagelo numa extremidade celular 2.
Peritríquico: vários flagelos à volta de toda a superfície da célula 3.
Lofotríquico: tufos de vários flagelos numa ou em ambas as extremidades das células O flagelo roda como uma ventoinha no sentido ou contra o movimento dos ponteiros do relógio. É constituído por três partes: 1.
Filamento: cilindro rígido e oco, composto por subunidades proteicas – flagelina; 2.
Gancho: liga o filamento ao corpo basal; 3.
Corpo basal: série de anéis que provocam o movimento flagelar Quimiotaxia: movimento na direcção de um composto químico atractivo ou para longe de um repelente: a concentração destes compostos é detectada por quimioreceptores existentes na superfície das células. É um processo complexo, mas rápido (as respostas ocorrem em menos de 20 milissegundos), e envolve a alteração conformacional de proteínas. Endósporo bacteriano É uma estrutura dormente (não tem actividade metabólica), produzida (processo chamado ESPORULAÇÃO ver figura) por certas bactérias Gram‐positivas (ex.: géneros Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus, etc.) quando sujeitas a condições ambientais extremas: ausência de nutrientes, desidratação, etc., e que resiste a agressões ambientais (calor, radiação UV, desinfectantes químicos). A forma do esporo e localização na célula tem valor taxionómico: pode ser terminal, subterminal ou central. O envólucro do esporo é constituído por várias camadas de proteínas: é impermeável e responsável pela resistência à entrada de compostos químicos. O núcleo contém algumas estruturas celulares da célula vegetativa, como ribossomas e ácidos nucleicos. O constituinte principal do endósporo é o dipicolinato de cálcio (complexo formado entre o ácido dipicolínico e iões cálcio). O que torna o endósporo tão resistente é: 1.
os complexos de cálcio com ácido dipicolínico intercalados nas bases do DNA, estabilizando‐o; 21
2.
a desidratação do interior do endósporo inactivando enzimas (ausência de actividade metabólica); 3.
camada espessa a proteger o interior; 4.
rico em enzimas de reparação do DNA Germinação dos endósporos: 1.
O endósporo absorve água e incha; 2.
o ácido dipicolínico é excretado; 3.
inicia‐se a síntese de macromoléculas; 4.
inicia‐se a actividade enzimática e metabólica; 5.
protoplasto do endósporo sintetiza componentes novos, emerge do envólucro e entra em ciclo de vida vegetativo. A germinação é inibida em ambientes ácidos (aplicação na conservação de alimentos) Estrutura do endósporo 22 Esporogénese Células Eucarióticas o
Estrutura rodeada por uma membrana e que alberga todo o material genético: Membrana Nuclear: o
É constituída por uma membrana externa e outra interna que delimitam o núcleo; Núcleo o
É atravessada por poros nucleares que permitem o transporte de moléculas para dentro e fora do núcleo Nucléolo: Ribossomas o
Pode haver mais que 1 nucléolo/núcleo; o
Não tem membrana; o
Local de fabrico dos ribossomas, síntese e processamento de rRNA o
80S (subunidades 60S + 40S); o
Podem estar ligados ao retículo endoplasmático ou livres no citoplasma; o
Constituídos por proteínas e RNA; o
Local de síntese de proteínas o
Rede irregular de túbulos e sacos (cisterna) envolvidos por uma membrana
o
Existe continuidade entre a membrana externa e o RE o
Maior organelo o
Síntese/transporte de proteínas (ex: membranares, excretadas, …), lípidos e outros materiais dentro da célula e para a membrana plasmática Retículo Endoplasmático (RE) o
Local de síntese de membranas lipídicas; o
Síntese dos constituintes dos lisossomas RE rugoso (granulado): o
Contém ribossomas ligados na sua face externa; o
Envolvido no processamento e transporte de proteínas que vão ser localizadas na membrana plasmática (ex: proteínas transmembranares, proteínas envolvidas no transporte de solutos) ou que vão ser excretadas para fora da célula (ex: enzimas extracelulares). RE liso (não granulado): o
Não contém ribossomas; o
Síntese de lípidos componentes das membranas biológicas (ex: 23
fosfolípidos, esteróidies (colesterol – animais; ergosterol ‐ fungos) Complexo de Golgi o
Organelo membranar constituído por sacos empilhados uns sobre os outros (cisternae); o
É uma fábrica onde proteínas e lípidos recebidos do RE são processados e transportados aos seus locais de destino o
Glicosilação de proteínas o
Síntese de esfingomielina e glicolípidos; o
Síntese de hemicelulose e pectina em plantas o
São vesículas membranares que contêm enzimas hidrolíticas necessárias para a digestão de macromoléculas (proteínas, lípidos, polissacáridos, ácidos nucleicos); Lisossomas o
O pH do lúmen é ácido e mantido através de uma bomba de protões (H+ para dentro do lisossoma por transporte activo primário), com hidrólise de ATP; o
Realiza a digestão intracelular de macromoléculas e organelos não funcionais; o
Permite a reciclagem de moléculas para nova biossíntese; o
Defesa do hospedeiro infectado; o
Aquisição de nutrientes (endocitose – entrada na célula de moléculas vindas do exterior, através da formação de vesículas com origem na membrana plasmática o
Organelo que se pensa ter resultado de um processo de endosimbiose. A sua principal função é produzir energia: é o local onde se realizam as reacções do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (ciclo TCA) – oxidação de acetil‐CoA a CO2, com formação de NADH e FADH2. (fontes de acetil‐CoA: piruvato Mitocôndria proveniente da glicólise, e ácidos gordos, importados do citoplasma; o
Local onde é gerado ATP, em resultado do transporte electrónico e fosforilação oxidativa; o
Presente em células de protozoários, fungos e em organismos superiores Matriz: o
DNA (molécula circular fechada). Várias cópias por organelo. Os seus genes codificam para proteínas envolvidas no transporte electrónico e nas reacções de fosforilação oxidativa e para rRNA e alguns tRNA 24 o
Ribossomas (70S) o
Enzimas envolvidas na oxidação β de ácidos gordos a acetil‐CoA e no ciclo TCA Membrana interna: o
Contém a cadeia de transporte de electrões: cataliza a transferência de electrões do NADH e FADH2 gerados no ciclo TCA, para o oxigénio molecular, gerando um gradiente de protões através da membrana; o
Contém a enzima F0‐F1: usa a energia potencial do gradiente transmembranar para catalisar a síntese de ATP a partir de ADP o
Pequenos organelos rodeados por uma membrana localizados no citoplasma. Podem existir em grande número. o
Contêm enzimas envolvidas em várias reacções metabólicas o
Oxidação de ácidos gordos: fonte importante de energia metabólica para vários organismos (em células animais ocorre em peroxissomas e nas mitocôndrias; em leveduras e plantas ocorre maioritariamente nos peroxissomas Peroxissomas o
Levam a cabo reacções de oxidação de diversos compostos (ácidos gordos, ácido úrico, aminoácidos, porinas) intracelulares, conduzindo à produção de peróxido de hidrogénio (H2O2). Este é tóxico e é decomposto pela enzima catalase. o
Em células animais participam na absorção e digestão de gorduras e estão também envolvidos na síntese de colesterol (por exemplo, abundantes nas células do fígado e rins) o
Organelo que se pensa ter resultado de um processo de endosimbiose; encontra‐se em plantas e algas; o
Local onde se realiza a fotossíntese Membranas tilacóides (grana): Cloroplasto o
Local onde se encontra a clorofila e os componentes da cadeia de transporte electrónico, envolvidos nas reacções luminosas da fotossíntese: captação de luz para gerar energia na forma de ATP e NAPH e formação de O2 Matriz (estroma): o
DNA (molécula circular fechada) o
Ribossomas (70S) o
Enzimas envolvidas nas reacções da fase escura da fotossíntese: fixação de CO2 com formação de hidratos de carbono 25
o
Local onde se encontram todos os organelos e é responsável pela forma e movimento celular. Contém o citoesqueleto: rede de microfilamentos, microtúbulos e filamentos intermédios. Microfilamentos: o
Estruturas flexíveis formadas pala polimerização de monómeros de actina, formando uma estrutura em hélice Microtúbulos: Citoplasma o
Cilindros ocos e rígidos compostos por tubulina, que participam no transporte intracelular de substâncias, e estão envolvidos no movimento de organelos. Participam na forma da célula. Estão ancorados nos centrossomas e participam na interfase (estendem‐se para a periferia onde servem de trilhos para o transporte de organelos) e na mitose (formam o fuso mitótico assegurando a separação equitativa dos cromossomas palas duas células‐filhas Cílios e Flagelos o
Ambos servem para locomoção e têm origem em microtúbulos o
Os cílios funcionam como remos e os flagelos têm movimento ondulante o
Cobertura rígida de composição variável; em muitos casos os componentes principais são polissacáridos: Microalgas (celulose e pectina); Fungos (quitina, celulose e glucan). Excepção: Diatomáceas (sílica). o
Parede Celular A quitina é um polissacárido insolúvel composto por unidades de N‐
acetilglucosamina. Pensa‐se que a quitina tenha potencial para substituir futuramente alguns produtos de plástico, com a vantagem de ser biodegradável, e que possa ser utilizada na construção civil como material de extrema resistência à pressão. Até ao momento ainda não foi possível a síntese in vitro Exemplos de microrganismos eucariotas: Fungos (leveduras, fungos miceliais ou filamentosos), Protozoários, Microalgas. 26 Membranas Biológicas – Composição e estrutura o
A membrana plasmática é constituída por lípidos e proteínas: os lípidos formam uma bicamada e as proteínas estão embebidas ou associadas aos lípidos. o
É uma estrutura organizada, flexível e dinâmica, estabilizada por ligações de H e por interacções hidrofóbicas (entre os lípidos e as proteínas de natureza anfipática). o
É uma barreira selectivamente permeável a compostos químicos. Os fosfolípidos são moléculas anfipáticas (têm uma região hidrofílica/polar e uma hidrofóbica/apolar). A atracção entre as regiões não polares dos ácidos gordos das duas camadas de fosfolípidos contribui para a permeabilidade selectiva da membrana. 27
Diferenças entre os fosfolípidos dos três domínios: Bactéria e Eukarya R Ácido gordo Tipo de Ligação Ligação ÉSTER entre glicerol e R Archaea Cadeia lateral alifática – o isopropeno é a unidade repetida Ligação ÉTER entre glicerol e R o
Lípidos e estruturas da membrana de bactérias do domínio Archaea: A monocamada lipídica/bifitanilo é bastante resistente e encontrada em algumas espécies (ex. bactérias hipertermofílicas do domínio Archaea. O fitanilo é uma cadeia alifática ramificada composta por unidades repetidas do hidrocarboneto isopropeno (C5). 28 o
Outros lípidos membranares. Estes lípidos conferem alguma rigidez e estabilidade às membranas devido à sua estrutura planar rígida o
Esteróides, como o ergosterol (fungos) ou o colesterol (animais), existem em membranas de eucariotas; o
Hopanóides existem em membranas de procariotas Estrutura das membranas biológicas – Modelo do mosaico fluido As proteínas membranares podem ser: o
Proteínas periféricas: fracamente associadas à membrana e fáceis de remover; o
Proteínas integrais: embebidas nas membranas e difíceis de remover. Reparar: A unidade das membranas é semelhante em bactérias, outros microrganismos, animais e plantas. 29
Funções principais da membrana plasmática 1.
Barreira permeável: previne perda de metabolitos essenciais e controla a entrada de nutrientes e saída de solutos (ex. composto tóxicos): algumas passam livremente através da membrana, outras necessitam de transporte mediado ou catalizado por permeases (proteínas transportadoras localizadas na membrana); 2.
Local de realização de processos metabólicos essenciais, como o transporte de electrões e a fosforilação oxidativa; 3.
Onde estão localizadas moléculas receptoras envolvidas na detecção e resposta a estímulos do meio ambiente; 4.
Conservação de energia: local de geração e uso do gradiente de protões; 5.
Âncora de proteínas: localização de proteínas envolvidas no transporte, bioenergética e quimiotaxia. Transporte de solutos através da membrana o
A permeabilidade da bicamada fosfolipídica depende da natureza química das moléculas em causa; o
É impermeável à maior parte dos nutrientes e solutos essenciais; o
Tem baixa permeabilidade a iões ou moléculas polares ou com carga eléctrica Tipos de transporte membranar: 1.
Transporte não mediado/ Difusão simples ou passiva; o
Movimento não específico das moléculas de um soluto através da membrana; o
Ocorre a favor do gradiente de concentração; o
A entrada dá‐se por dissolução das moléculas na fase lipídica da membrana => quanto mais pequena (água, etanol, gases) e/ou lipossolúvel (hidrocarbonetos (do petróleo), compostos aromáticos, compostos organoclorados (pesticidas, solventes orgânicos)) for a molécula, mais facilmente entra; o
A lipossolubilidade do soluto pode ser avaliada com base na mediação do coeficiente de partição n‐octanol/água (KOW ou P): Coeficiente de Hansch = log P = log ([X]fase octanol)/[X]fase aquosa) O valor deste coeficiente é uma medida da biodisponibilidade de um composto para os organismos expostos a esse composto: permite prever a capacidade de bioconcentração e bioacumulação dos compostos em células de tecidos de animais ou de plantas => determina o grau de toxicidade do composto 30 2.
Transporte mediado/catalizado por proteínas transportadoras ou permeases ou "carriers" 2.1. Difusão facilitada o
É semelhante à difusão passiva na direcção do movimento (também é a favor do gradiente de concentração), na velocidade de transporte (também é função do gradiente de concentração) e o movimento do soluto não depende do fornecimento de energia; o
As diferenças são que recorre a proteínas transportadoras (permeases/"carrier") que sofrem modificação conformacional; basta haver um pequeno gradiente de concentração para que as moléculas entrem; o
Em muitos organismos serve para transportar glicerol, açúcares, e aminoácidos; o
A velocidade de transporte de um soluto aumenta mais rapidamente a baixas concentrações do soluto. Esta difusão atinge um valor máximo quando o transportador atinge a saturação Æ velocidade máxima de transporte Velocidade de transporte em função do gradiente Difusão facilitada (com permeases) de concentração para a difusão passiva e difusão facilitada 2.2. Transporte activo o
Envolve permeases => há uma cinética de saturação; o
Processo depende de energia obtida por hidrólise de uma ou mais moléculas de ATP (sistemas de transporte activo primário); por geração de um gradiente electroquímico de iões (H+, Na+, K+) (sistemas de transporte activo secundário); 31
o
Movimento contra o gradiente de concentração => as moléculas são concentradas no interior da célula => é um processo acumulativo, permitindo assegurar taxas metabólicas elevadas; o
Os sistemas de transporte activo primário, por exemplo, transportadores do tipo ABC, existem em bactérias dos domínios Archaea e Bacteria e em eucariotas, existindo alguns que transportam para fora da célula (responsáveis pela resistência a certos antibióticos. Em bactérias Gram‐
negativas envolve a captação inicial da molécula de nutriente por uma proteína periplasmática o
Existem três tipos de transporte activo secundário: Uniporte, Antiporte e Simporte Segue‐se um exemplo de transporte activo em bactérias: 32 1. Os protões são expelidos no transporte electrónico
=> Formação de um gradiente electroquímico de
protões
2. Antiporte Na+/H+ para formação de gradiente
electroquímico de Na+
3. O sódio liga-se à permease
4. A forma do local de ligação do soluto modifica-se e o
soluto (açúcar, aminoácido)
5. A conformação da permease altera-se para que o
sódio entre na célula, o que é seguido da dissociação da
molécula de soluto da proteína (mecanismo de
Simporte)
Translocação por grupo o
As moléculas são modificadas quimicamente durante o transporte; o
Processo depende de energia o
O sistema PTS (fosfoenolpiruvato ‐ fosfotransferase) em bactérias, para transporte de glucose, envolve a transferência sequencial de fosfato do fosfoenolpiruvato (PEP – metabolito da glicólise) através de um sistema de proteínas intermediárias. A última (Enzima IIc) transporta e fosforila uma molécula de glucose para o interior da célula Características gerais dos sistemas de transporte mediados por proteínas: o
Cinética de saturação tipo Michaelis‐Menten: velocidade máxima e Ks ‐ constante de afinidade da permease para o soluto; 33
Especificidade: em geral, a permease é específica para um nutriente ou grupo de o
substratos quimicamente relacionados; Indução: síntese de permease é induzida pela presença do substrato no meio extracelular o
Cinética do tipo Michaelis‐Menten Reparar: As células necessitam frequentemente de transportar solutos a elevadas velocidades através da membrana de modo a cobrir as suas necessidades metabólicas de crescimento. Tal é obtido através de uma grande diversidade de sistemas de transporte de solutos. Transporte de ferro: o
O ião férrico, Fe3+, tem baixa solubilidade em meio aquoso e está, por isso, pouco disponível para ser transportado para o interior da célula; o
Os microrganismos produzem e excretam sideróforos para captar esses iões por complexação. Sideróforos: o
Moléculas de baixo peso molecular; o
Sintetizadas e excretadas por bactérias e fungos quando a concentração de ferro no meio é baixa; o
O complexo que forma com o ião férrico é posteriormente reconhecido por proteínas receptoras específicas e transportado para o interior da célula; o
34 São importantes factores de virulência. Categorias Nutricionais dos microrganismos Fonte de carbono Fonte de energia CO2
Autotrofismo Sol Compostos Orgânicos Heterotrofismo Compostos orgânicos Fototrofismo Quimioorganotrofismo reduzidos Compostos inorgânicos Quimiolitotrofismo reduzidos A diversidade microbiana resulta, em grande parte, da diversidade metabólica dos microrganismos, em particular das diversas estratégias para sintetizar ATP (BIOENERGÉTICA) que os microrganismos apresentam. Não esquecer: Catabolismo = Produção de energia; Anabolismo = consumo de energia Relação dos microrganismos com o oxigénio Grupo Relação com O2
Tipo de metabolismo Aeróbio obrigatório Necessário Respiração aeróbica Aeróbio facultativo Não necessário, mas preferível Respiração aeróbica e anaeróbica e fermentação Microaerofílico Necessário em níveis mais baixo Respiração aeróbica que os atmosféricos Anaeróbio aerotolerante Não necessário, preferível CO2
Fermentação Anaeróbio obrigatório Prejudica ou mata Fermentação ou respiração anaeróbica 35
o
Oxigénio e stresse oxidativo: As espécies reactivas formadas na cadeia de transporte electrónico (anião superóxido, peróxido de hidrogénio e radical hidroxilo) são extremamente tóxicas para as células causando, por exemplo, a oxidação de macromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos) e alterações nos lípidos das membranas celulares (redução da capacidade da bicamada lipídica como barreira de permeabilidade a solutos), etc. o
Apesar de existirem enzimas que destroem as espécies tóxicas, como a catalase, peroxidase, superóxido dismutase ou a acção combinada delas, nem todos os organismos estão protegidos. Metabolismo Quimioorganotrófico (Protozoários, fungos e maior parte das bactérias fotossintéticas): A obtenção de energia dá‐se a partir de compostos orgânicos e, a partir destes, pode ocorrer respiração aeróbica, respiração anaeróbica ou fermentação. A produção de aceitadores de electrões conduz à síntese de ATP por fosforilação. Um dos produtos principais é o dióxido de carbono. Pelo fluxo de carbono sintetizam‐se novas moléculas: biossíntese. Não esquecer que a conservação de energia, na respiração, se dá na membrana plasmática (pela fosforilação oxidativa), e na fermentação é pela fosforilação oxidativa ao nível do substrato. EXTRA: Revisão de conceitos de Bioquímica Respiração: oxidação completa de compostos orgânicos, com utilização de um aceitador de electrões externo (exógeno) para contrabalançar reacções de oxidação ‐ redução usadas para gerar ATP. A maior parte do ATP é formada por fosforilação oxidativa com base num gradiente protónico (força H+‐motriz) estabelecido através de membranas (membrana plasmática em procariotas ou membrana interna da 36 mitocôndria em eucariotas). Quanto à natureza dos aceitadores finais de electrões, são conhecidos 2 situações genéricas: 1. Respiração aeróbia Oxigénio como aceitador final de electrões na Cadeia de Transporte de Electrões membranar. A transferência de electrões de NADH e FADH2 para o O2 através dos componentes da cadeia de transporte de electrões conduz ao estabelecimento do Gradiente transmembranar de Protões (força H+‐motriz). Este gradiente é a força motriz para a síntese de ATP pela ATPase (ou ATPsintase). O O2 é reduzido a H2O. Este processo rende grandes quantidades de energia. 2. Respiração anaeróbia Compostos inorgânicos, tais como nitrato, sulfato, dióxido de Carbono (ou carbonato), etc. são aceitadores finais de electrões na Cadeia de Transporte de Electrões que estabelece o Gradiente transmembranar de Protões (força H+‐motriz) para síntese de ATP. Nesses processos, os compostos inorgânicos são reduzidos. Presente em bactérias. Fermentação: ocorre frequentemente em condições anaeróbias (ausência de O2). O substrato orgânico sofre oxidação parcial. Não requer um aceitador de electrões externo – o equilíbrio de reacções de oxidação ‐ redução é obtido com base em metabolitos intermediários (endógenos) resultantes da oxidação da molécula de substrato orgânico (por exemplo, na glicólise). ATP é sintetizado por fosforilação a nível do substrato. Encontramos diferentes vias fermentativas em diferentes microrganismos (eucariotas ou procariotas), as quais rendem diferentes produtos finais. O rendimento energético para a célula é mais baixo que o da respiração. Passos principais do catabolismo aeróbio num organismo quimiorganoheterotrófico: 37
1. Hidrólise das macromoléculas disponíveis no Ambiente
(por bactérias, fungos, protozoários, produtores de enzimas
hidrolíticas)
2. Fontes de energia diferentes são canalizadas para vias
degradativas comuns
3. Posição central do ciclo TCA
4. As linhas a tracejado mostram os fluxos de electrões
(transportados por NADH e FADH2) para a Cadeia de
Transporte de Electrões
5. Síntese de ATP, por fosforilação oxidativa. O2 é o aceitador
final de electrões na cadeia respiratória
Respiração Anaeróbia Com moléculas que sejam melhores dadoras de electrões como o CH3COO‐, o CH4 e o HS‐, ocorre acetogénese (bactérias acetogénicas), metanogénese (bactérias metanogénicas) e redução do sulfato (bactérias sulfato ‐ redutoras), respectivamente. Todas estas bactérias são anaeróbicas obrigatórias. Nota: H2S é tóxico. Com melhores aceitadores de electrões, como o NO2‐, N2O ou N2 ocorre desnitrificação (bactérias desnitrificantes ‐ aeróbias facultativas). A respiração anaeróbia usa outros aceitadores de electrões (sem ser o O2), permitindo a respiração de bactérias específicas em ambientes onde o O2 está ausente (elevada importância ecológica); geralmente o rendimento energético é mais baixo (que na respiração aeróbia), porque o potencial redutor do aceitador de electrões é menos positivo do que o do O2. Fermentação o
É usado, frequentemente, o piruvato ou derivado (proveniente da glicólise) como aceitador de electrões endógeno; o
O ATP é formado por oxidação a nível do substrato; o
Apenas uma pequena parte do composto orgânico é usada para biossíntese; o
São produzidos diferentes produtos para diferentes fermentações (ácidos, álcoois, lactato, etc.) 38 Metabolismo Quimiolitotrófico o
Obtenção de energia a partir da oxidação de compostos inorgânicos dadores de electrões; o
Têm elevada importância ecológica (nos ciclos biogeoquímicos dos elementos); o
A maior parte realiza respiração aeróbia; mas, algumas são anaeróbias (aceitadores finais de electrões podem ser o nitrato ou o sulfato); o
ATP sintetizado por fosforilação oxidativa; o
Os electrões são libertados directamente do composto inorgânico reduzido para os componentes da Cadeia de Transporte de Electrões localizada na membrana plasmática, e transferidos para aceitador final, que sofre redução. o
O rendimento energético é baixo. Tipo de Quimiolitotrofismo Bactérias Dador de electrões Aceitador de electrões Oxidação de H2
Bactérias do hidrogénio H2
O2
Nitrificação Bactérias nitrificantes NO2‐, NH4+
O2
Bactérias do enxofre S0, H2S NO3‐
Bactérias do ferro Fe2+, S0, H2S O2
Oxidação de enxofre (exemplo de um metabolismo quimiolitotrófico anaeróbico) Oxidação de ferro Origem das fontes de energia: o
Actividade vulcânica (H2S); o
Agricultura (Amónia; nitrito) o
Actividades mineiras (Fe2+) o
Queima de combustíveis fósseis e lixo (H2S; NH3) o
Biológicas – decomposição microbiana de matéria orgânica (por exemplo, H2S; NH3; H2) 39
Fluxo de electrões na Cadeia de Transporte de Electrões de uma Bactéria Nitrificante 1.Oxida‐se nitrito a nitrato, e ocorre transporte de electrões no sentido normal, de modo a gerar gradiente electroquímico de protões transmembranar (força H+‐motriz) para a síntese de ATP por fosforilação oxidativa. 2.Uma parte da força ‐ H+ ‐ motriz estabelecida na Cadeia de transporte de Electrões directa é usada para forçar o fluxo de electrões no sentido inverso – cadeia de transporte de electrões inversa (contra o gradiente de potencial de redução) do nitrito para NAD+, de modo a gerar NADH (fonte de electrões para fixação de CO2 – ciclo de Calvin). 40 Importante: Também os fototróficos podem usar como fonte de carbono o dióxido de carbono (fotoautotróficos) ou compostos orgânicos (fotohetrotróficos). Na natureza, alguns microrganismos mudam o metabolismo, dependendo dos recursos que têm disponíveis. Fotossíntese A fotossíntese pode ser anoxigénica (o poder redutor é formado a partir de H2S, S ou H2, dependendo da espécie bacteriana), em bactérias púrpura verde, ou oxigénica (a luz captada também é usada na fotólise da água, gerando O2 e poder redutor, necessário para a fixação do CO2), em microalgas, cianobactérias e plantas. Em ambas, a obtenção de energia é a partir da luz, mas a fotossíntese anoxigénica dá‐se na ausência de oxigénio. Isolamento de microrganismos a partir do ambiente natural Factores importantes: 1. Inóculo (fonte dos microrganismos); 2. Composição meio de cultura; 3. Condições ambientais (oxigénio; Temperatura, pH, luminosidade, etc.) Exemplo 1. Isolamento de bactérias desnitrificantes (por exemplo Pseudomonas – respiração anaeróbia); Importância – remoção de nitrato de águas residuais em ETARs) 1.
Inóculo: solo, sedimentos de lagos 2.
Meio de cultura: ácidos orgânicos, como fontes de C e energia; NO32‐ como aceitador de electrões; 3.
Ausência de ar (O2). 41
Exemplo 2 Isolamento de bactérias nitrificantes (por exemplo Nitrobacter – quimiolitoautotrófica aeróbia); Importância – fertilização dos solos com nitrato 1.
Inóculo: solo, lama 2.
Meio de cultura: ausência de Carbono orgânico (para seleccionar bactérias autotróficas); NO2– como dador de electrões; 3.
42 Presença de O2 / ar (porque é aeróbia); ausência de luz (para eliminar fotoautotróficas) Importância dos microrganismos no ecossistema: ∗
∗
∗
Produção primária de matéria orgânica por microrganismos autotróficos Consumo directo ou primário por consumidores primários Mineralização: decomposição de compostos orgânicos complexos com formação de compostos simples Os microrganismos têm um papel fundamental na reciclagem dos vários elementos químicos no ambiente (Carbono, azoto, enxofre e ferro) Crescimento microbiano: aumento do número de células do microrganismo ao longo do tempo. Pode ser quantificado em termos de 9
9
9
Número de células Densidade óptica da cultura (DO) Massa celular (biomassa) Grande parte dos microganismos multiplica‐se por fissão binária (maioria das bactérias) ou por gemulação (maioria das leveduras). Em ambos os casos, uma célula dará origem a duas ao fim de um certo período de tempo – tempo de geração ou duplicação. Métodos para avaliar a concentração de células numa população microbiana: Contagem directa do número de células: 1. Câmaras de contagem 2. Contadores electrónicos. Estas duas técnicas avaliam números totais de células. Contudo não distinguem células mortas de não viáveis. Contagem de células viáveis: 43
Recorre‐se a técnicas de contagem em placa em que um volume conhecido de uma suspensão de microrganismos é espalhado na superfície de um meio de cultura solidificado. As colónias que se desenvolvem, após incubação adequada, são contadas e os resultados vêm expressos em termos de unidades formadoras de colónias (UFC) Métodos indirectos: œ Método espectrofotométrico – permite estimar a concentração de células numa suspensão pela passagem de um feixe de luz através dela. (mais células → mais luz desviada → menos luz transmitida) œ Determinação da massa molecular – envolve a pesagem de células presentes na cultura microbiana (processo moroso) 44 Fases do crescimento microbiano em descontínuo (“batch”) œ Fase de latência, durante a qual o organismo se ajusta ao novo meio (ex. síntese de enzimas) œ Fase exponencial, nesta fase a população cresce com taxa específica de crescimento máxima. œ Fase estacionária, correspondente ao esgotamento de nutrientes e/ou acumulação de metabolito tóxico. No entanto, parte das células podem permanecer viáveis durante algumas horas à custa do consumo de materiais de reserva endógenos (possível produção de endósporos) œ Fase de morte, perda irreversível da capacidade de divisão celular Crescimento diáuxico: em meios contendo por exemplo duas substâncias como fonte de carbono e energia os microrganismos podem controlar a utilização destes, de modo a que um seja consumido primeiro e depois o outro. Nestas condições o declive da recta não é constante e surgem breves intervalos (fase de latência) que correspondem á adaptação das células ao novo substrato. Relativamente à fase de crescimento exponencial: ~ Estimativa da taxa específica de crescimento da população ln N t = ln N 0 + μ (t − t 0 ) Taxa específica de crescimento 45
~ Estimativa do tempo de duplicação da população, g g=
ln 2
μ
Factores que afectam o crescimento microbiano i.
ii.
iii.
iv.
v.
Concentração do nutriente limitante Temperatura pH Disponibilidade de água Oxigénio Factores ambientais
i. Concentração do nutriente limitante Nutriente limitante do crescimento S: o seu esgotamento no meio de cultura leva a que a população microbiana entre na fase estacionária e o crescimento pare. O transporte das moléculas de nutrientes através de sistemas de transporte transmembranar mediado por enzimas e de vários passos metabólicos catalizados por enzimas. •
A taxa específica de crescimento, µ depende da concentração de nutriente limitante μ = μ máx
S
Ks + S
(Equação de MONOD) µmáx
46 µmáx representa o valor quando [S] se encontra
em concentração saturante (sistemas de
transporte transmembranar para o nutriente S
estão saturadas) e Ks é uma constante de
semi-saturação
que
corresponde
à
concentração de substrato, [S], que permite a
taxa de crescimento igual a metade da µmáx.
Ks reflecte a afinidade dos sistemas de
transporte transmenbranar para a molécula do
nutriente limitante
Ks Os valores das constantes µmáx e Ks dependem: o Das características intrínsecas do microrganismo o Do substrato limitante usado para o crescimento o Das condições ambientais (temperatura, pH,…) Cultura contínua de microrganismo no quimiostato Na cultura em descontínuo os microrganismos estão sujeitos a uma modificação contínua do meio, porque os substratos são consumidos e os produtos de metabolismo se vão acumulando, não podendo por isso o crescimento exponencial ser mantido indefinidamente. Nos sistemas de cultura contínuas a população microbiana é mantida continuamente em fase de crescimento equilibrado, isto é, num estado estacionário, por remoção de parte da cultura de microrganismos que é substituída por meio fresco, sendo o caudal de alimentação igual ao caudal de saída. Recorre‐se ao quimiostato, que opera por fornecimento do nutriente essencial que limita o crescimento a uma taxa constante de modo a que a densidade celular (biomassa) e a taxa de crescimento do microrganismo se ajustam a este fornecimento. Taxa de diluição: traduz o volume que entra e sai do fermentador, por unidade de tempo e por unidade de volume Caudal de alimentação do meio fresco = caudal de saída da cultura (F) 47
Volume da cultura no quimiostato = V constante D=
F
V
Em estado estacionário: a taxa específica de crescimento corresponde ao valor da taxa de diluição (μ =D) → a taxa específica de crescimento do microrganismo é controlada pela taxa de diluição a que o quimiostato opera (D) “WASHOUT”
Quanto maior for a taxa de diluição maior a taxa de crescimento da população. No entanto, para D ≥ Dc o crescimento celular não consegue compensar a diluição da cultura e a população e a população de células sai do quimiostato (“WASHOUT” – lavagem do quimiostato). Vantagens do crescimento microbiano em contínuo: • Permite manter população microbiana na fase exponencial do crescimento durante períodos longos • Permite obter produto com características constantes durante períodos de tempos longos • Permite obter maiores produtividades • É possível obter culturas em crescimento exponencial e com taxas específicas de crescimento diferente através da alteração da taxa de diluição É possível seleccionar uma população de células dum microrganismo único, que seja muito competitivo e metabolize muito eficientemente um composto orgânico face a outros microrganismos menos competitivos eventualmente presentes na população mista inicial Desvantagens: • Contaminação da cultura 48 • Degenerescência da cultura (devido a mutações espontâneas) ii. Temperatura A temperatura interfere em fenómenos enzimáticos e no metabolismo celular, que dependem dela para o bom funcionamento. Para cada microrganismo é possível defenir: ƒ Temperatura máxima – acima da qual o microrganismo morre (geralmente por desnaturação proteica) ƒ Temperatura óptima – aquela que proporciona uma maior taxa de multiplicação ƒ Temperatura mínima – abaixo da qual o metabolismo do microrganismo cessa Quanto à temperatura óptima, as bactérias classificam‐se em •
•
•
•
Mesofilos com T óptima ~25‐40ºC Psicrófilos com T óptima ~4‐10ºC Termófilos com T óptima> 45ºC Hipertermófilos com T óptima> 80ºc Adaptações moleculares à psicrofilia: 9
9
Proteínas e enzimas que são estáveis a temperaturas baixas Membranas com maior proporção de ácidos gordos insaturados face a ácidos gordos saturados nos fosfolípidos da bicamada lipidica Adaptações moleculares à termofilia: 9
9
9
9
Proteínas estáveis a temperaturas altas Síntese e acumulação de solutos compatíveis no citoplasma Membranas com maior proporção de ácidos gordos saturados face a ácidos gordos insaturados, nos fosfolipidos da bicamada lipidica. Membranas ricas no hidrocarboneto isopropeno; estrutura em monocamada lipídica. iii. pH do meio Os microrganismos classificam‐se em: Acidófilos Neutrófilos Alcalófilo 49
iv. Disponibilidade de água O crescimento microbiano depende da quantidade de água disponível no meio extracelular (expresso em termos de actividade de água, aw). (Baixo aw pressão osmótica elevada; alta aw pressão osmótica baixa) Deste modo, os microrganismos podem ser halófilos, halotolerantes, osmófilos ou halófilos extremos de acordo com as condições de actividade de água em que vivem. 
Adaptações de certos microrganismos ao crescimento em meios com baixa aw Acumulação intracelular de solutos compatíveis, aumentando deste modo a aw intracelular equilibrando‐a com a aw extracelular. Isto é possível devido á síntese de polialcoois ou transporte activo de iões K+ para o interior da célula. Microrganismos extremófilos “EXTREMOZYMES” Enzimas que funcionam em condições ∗
∗
∗
termófilos ou hipertermófilos Acidófilos ou alcalófilos halófilos Crescimento microbiano nos ambientes naturais: Limitação do crescimento por factores ambientais: 50 •
Lei do mínimo: a biomassa total de um organismo particular é limitada pelo nutriente presente com mais baixa concentração; a taxa de crescimento depende frequentemente da concentração desse nutriente •
Lei da tolerância: a certos limites ambientais as populações microbianas podem não crescer, independentemente da disponibilidade de nutrientes Resposta dos micorganismos a níveis baixos de nutrientes: •
Modificações morfológicas (menor tamanho das células → maior área superficial para transferência de nutrientes → maior taxa metabólica → Crescimento mais rápido •
Formação de biofilmes : comunidade estruturada de células adetentes a uma superfície inerte ou viva embebidas numa matriz de polissacárido de origem microbiana. Vantagens dos biofilmes: 1. Protecção relativamente a condições agressoras ou a fagocitose por células do sistema imunitário 2. Maior disponibilidade de nutrientes 3. Estabelecimento de relações que podem ser benéficas, como por exemplo comunicação entre células envolvendo moléculas sensoras ou troca de material genético = Controlo dos microrganismos = Agentes anti microbianos físicos: ∗
∗
∗
∗
Filtração Frio Calor Radiação Calor 51
Principais alvos: •
•
Proteínas → desnaturação térmica → inactivação de enzimas Membranas celulares → desorganização da bicamada lipidica → perda da função de barreira semi‐permeável Tempo de redução decimal, DT: intervalo de tempo para matar 90% de um dado microrganismo quando sujeita à temperatura T (i.e. fracção de sobreviventes diminui de 100 para 10% durante o período de tempo Dt) Processos que recorrem ao calor para controlar microrganismos: ™ Esterilização (calor húmido, autoclave, ou seco) ™ Pasteurização ™ Radiação -
Raios X e gama – produz electrões e radicais com potente acção oxidante que causam alteração e rotura de DNA e proteínas → morte das células -
Radiação ultra‐violeta – Pode conduzir a mutações e à morte dos microrganismos devido á formação de dímeros de timina no DNA. Reparação de danos: • Fotoreactivação • Reactivação no escuro Luz visível – intensidades altas podem gerar um agente oxidante potente que leva á foto‐oxidação de proteínas e ácidos nucleicos Resposta á foto‐oxidação: Pigmentos como carotenóides protegemos microrganismos expostos à luz dos danos por foto‐oxidaçaõ. -
Medição da actividade de agentes antimicrobianos: ™ Método das diluições sucessivas – Valores de MIC 52 A actividade antimicrobiana de um composto químico pode ser medida com base na determinação da concentração mais baixa desse composto necessária para inibir completamente o crescimento do microrganismo ™ Método da difusão em agar‐ diâmetros dos halos de inibição Aplicado por exemplo na determinação da susceptibilidade de estirpes bacterianas a antibióticos Agentes bacteriostáticos ou Fungistáticos : causam inibição de crescimento Germicidas: mata microrganismos patogénicos ou não (não mata necessariamente endósporos) Certos compostos químicos com acção antimicrobiana podem ser usados nos seres vivos para o controlo de doenças infecciosas ‐ agentes antimicrobianos de uso terapêutico. Os agentes quimioterapêuticos podem ser moléculas produzidas por microrganismos ou plantas com efeito contra outros microrganismos (antibióticos) ou podem ser moléculas com as mesmas propriedades mas sintetizadas quimicamente (agentes sintéticos). Um aspecto crítico de um agente quimioterapêutico é a sua toxicidade selectiva, isto é, a sua capacidade para inibir ou matar bactérias ou outro microrganismo patogénico sem afectar adversamente o hospedeiro. Cada agente ou grupo de agentes quimioterapêuticos tem um espectro de acção antimicrobiana.s antibióticos com acção antibacteriana são especialmente úteis no tratamento de doenças infecciosas causadas por bactérias patogénicas 53
Controlo dos microrganismos por agentes antimicrobianos
•
Desinfectantes, antisépticos e esterilizantes,etc (agentes antimicrobianos químicos) o Exemplos e modos de acção. Agente Tipo de agente Alcoóis Desinfectantes e Antisépticos Acção ‐ Acção bactericida e fungicida, mas não esporicida; Inactivam alguns virus ‐ Desnaturam proteínas e desorganizam membranascelulares Desnaturação de proteínas e ruptura de membranas Compostos fenólicos Desinfectantes Halogéneos (1)Anti‐séptico da pele
Agente oxidante •
(1) Iodo e compostos iodados •
(2) Cloro e compostos clorados Compostos quaternários de amónio (2) Agente oxidante ‐ Concentrações altas podem inactivar esporos (2) ‐ Oxida constituintes celulares ‐ Destrói células vegetativas de bactérias e fungos, mas não esporos actua sobre alguns virus ‐ Pode reagir com matéria orgânica e formar compostos carcinogénicos (1)Detergentes (1) ‐ Causam ruptura das membranas celulares (2)Detergentes catiónicos Metais pesados (prata, zinco, cobre) (1) ‐ Oxida constituintes celulares e reage com proteínas causando a sua inactivação. Antisépticos ou desinfectantes ‐ Actuam como emulsionantes (2) ‐ Matam maior parte das bactérias, ou endosporos ‐ Estabelecem ligações com grupos específicos de proteínas, inactivando‐as ou levando à sua precipitação ‐ Acção bactericida, fungicida, virucida e esporocida; Aldeidos Agentes alquilantes, ‐ combinam‐se com ácidos nucleicos e proteínas e causam a sua inactivação. Gases esterilizantes 54 ‐ Esterilizante ‐ Agentes alquilantes ‐ Acção microbicida e esporocida ‐ Combinam‐se com proteínas inactivando‐as 55
AGENTES ANTIMICROBIANOS PARA USO TERAPÊUTICO
Agentes quimioterapêutico ‐ agentes antimicrobianos são usados para controlar e tratar in vivo doenças infecciosas, actuam sobre um número mais ou menos limitado de microrganismos. Alvos biológicos de agentes quimioterapêuticos ANTIBACTERIANOS Estes agentes actuam selectivamente sobre o crescimento ou viabilidade de bactérias. 56 Alvos biológicos de agentes quimioterapêuticos ANTIFUNGICOS ‐ Toxicidade selectiva é mais difícil de conseguir; ‐ Algumas drogas só podem ser usadas topicamente, devido ao grau de toxicidade para hospedeiros. Resistência a drogas antimicrobianas
Definição: Capacidade adquirida dum microrganismo patogénico para resistir aos efeitos de um agente quimioterapêutico ao qual era susceptível. Causa: •
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uso indiscriminado de drogas antimicrobianas uso excessivo de produtos de limpeza pessoais ou domésticos com agentes antibacterianos, etc. Exemplos de bactérias patogénicas Humanas que se tornaram resistentes: Pseudomonas aeruginosa, staphylococcus aureus 57
Mecanismos de resistência a drogas em estirpes microbianas resistentes: ‐ Redução da permeabilidade da parede e membrana plasmática à droga; ‐ Inactivação da droga devido a modificação química ou quebra da molécula (acção enzimática) ‐ Desenvolvimento de via bioquímica alternativa ‐ Expulsão da droga para fora da célula por sistema de transporte activo (efluxo) A resistência resulta da selecção e expressão de genes específicos, presentes em plasmídeos (Plasmídeos R –de Resistência) ou no genoma bacterianos. Prevenção e Soluções : 58 Higiene; imunização; prática clínica adequada; Procura de novas drogas antimicrobianas através de design computarizado Aumento do conhecimento sobre mecanismos de resistência (era pós‐genómica) Modificação e transferência da informação genética
Definições básicas: Estirpe ou clone‐ uma população de células geneticamente idênticas Gene‐ um fragmento de DNA em que a sequência de bases, após transcrição e tradução, origina uma proteína com uma sequência de aminoácidos bem definida Genoma‐ conjunto de todos os genes de um organismo. As bactérias são haplóides (1 cópia de cada um dos genes do genoma). Genótipo‐ conjunto de genes específico que um organismo possui. leu, leu‐ Fenótipo‐ propriedade observável. A expressão fenotípica é profundamente influenciada por factores ambientais. Leu+, Leu‐ Principais mecanismos que geram variabilidade genética nas bactérias •
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Mutação Transposição Transferência de genes ( veiculada por plasmídeos) Recombinações entre regiões das moléculas do DNA Mutação Definição ‐ qualquer alteração permanente de uma sequência de bases do DNA, mesmo que não tenha efeito detectável no fenótipo. Pode levar ao estabelecimento de uma subpopulação. 59
Mutações podem ser: •
•
Espontâneas; Induzidas; Mutações espontâneas (ausência de qualquer agentemutagénico, aleatórias, pouco freqentes) •
Tautomerismo de bases – a mutação resulta de erros na replicação do DNA devido à incorporação de nucleótidos contendo formas tautoméricas (isómeros que se diferenciam na posição de um grupo funcional). •
Mutação espontânea por transição ‐ Neste tipo de mutação uma purina é substituída por outra purina diferente ou uma pirimidina por outra pirimidina diferente •
60 Adição e eliminação de bases ‐ pode ocorrer um escorregamento numa das cadeias (cadeia em formação ou parental) que leva à formação de um “laço” estabilizado por ligações de –H na sequência repetitiva. A continuação da replicação de DNA leva à adição ou remoção de nucleotídeo(s), respectivamente ex: •
Transposões – A mutação pode ocorrer por inserção da sequência de inserção ou do transposão complexo dentro da sequência codificante de um gene ou na sua região reguladora Nota: O que é um transposão? •
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•
segmentos de DNA móveis não possuem funções auto‐replicativas não necessita de regiões de homologia entre o transposão e o local do DNA onde se vai inserir • requer a enzima transposase e extremidades contendo sequências de repetição invertida (IR) Os transposões complexos podem transportar genes diversos que conferem resistência antibiotica. Algumas consequências desta mutação: •
•
interrupção ou activação da transcrição de um gene transferência de genes particulares para plasmídeos, ou de plasmídeos para o genoma; Os níveis de mutação espontânea são controlados pela actividade de polimerases 5´‐3´ e exonucleases 3´‐5´. 61
Mutações induzidas: (presença de agente mutagénico) Agentes mutagénicos: (são agentes que estimulam a taxa de mutação (~ 1000 x)) • Químicos • Físcos Agentes mutagénicos químicos: •
Incorporação de análogos de bases – O crescimento de uma população de células na presença deste análogo origina uma descendência de células onde ocorreu substituição de bases (par A‐T par G‐C) Ex. 5‐bromouracilo. •
Agentes alquilantes – Responsáveis pelo emparelhamento errado de bases tornando mais lábil as ligações entre elas. Ex de agentes alquilantes: Hidroxilamina, Metanossulfonato de etilo (SEM) •
Desaminação oxidativa das bases por acção de HNO2 – O HNO2 promove a saída do grupo NH2 das bases azotadas o que provoca ligações mais lábeis ou ligações entre bases não correspondentes. 62 Neste exemplo a citosina é desaminada a uracilo, o qual liga a adenina em vez de guanina •
Agentes que se intercalam entre as bases da cadeia dupla de DNA – Estes agentes causam mutações do tipo "frameshift". Ex. Brometo de etídeo, Acridina laranja, proflavina Agentes mutagénicos físicos: •
Radiação UV – Leva à formação de dímeros de timina adjacentes por acção de radiação UV (~ 260nm) causando distorções na cadeia de DNA. Esta mutação pode ser reparada por acção fotoquimica Efeito das mutações ao nível das proteínas • Mutação "missense" ‐ Mutação pontual num codão pode levar à substituição de um aminoácido por outro, resultando numa proteína deficiente. • Mutação "nonsense“(sem sentido) ‐ Origina o aparecimento de um codão STOP, tendo como consequência a produção de uma proteína sem actividade. • Mutação "frameshif” (mutação desfasada) ‐ A adição ou eliminação de pares de bases não múltiplos de 3, leva à alteração da grelha de leitura aberta do segmento de DNA que codifica para uma proteína. • Mutação silenciosa ‐ Devido à degenerescência do código genético, nem todas as mutações são expressas fenotipicamente • Mutação neutra ‐ Resulta na codificação de um aminoácido diferente, mas funcionalmente equivalente 63
Expressão das mutações (A detecção de mutantes só é possível se as alterações ocorridas no património genético do microrganismo causar uma alteração de fenótipo) •
"Forward mutation” (mutação directa) A seguir a uma primeira mutação directa, podem seguir‐se mutações (mutação inversa ou mutação supressão) que restabelece ou substitui por um equivalente Î restabelecimento do fenótipo original: •
"Reverse mutation" (mutação inversa). Ex: • "Suppressor mutation" (mutação supressão) Selecção de mutantes –O objectivo é a produção de mutantes para investigação ou melhoramento de estirpes para fins biotecnológicos. Tipos de mutantes: •
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Letais Condicionais ‐ (as mutações são expressas só em determinadas condições ambientais) Morfológicos – (mutantes que por exemplo promovem a pigmentação) Resistência a um composto Bioquímicos – (levam a alterações metabólicas) o Auxotróficos ‐ Necessitam de um produto de uma via metabólica como nutriente em meio o
64 mínimo, porque não são capazes de o sintetizar Prototróficos ‐ Crescem em meio mínimo sem suplementos Selecção indirecta (negativa)‐ uso da tecnica de réplica plating •
A selecção indirecta permite detectar mutantes condicionais e bioquímicos A técnica de réplica plating : é usada para identificar mutantes que perderam por exemplo a capacidade de sintetizar um nutriente essencial Selecção directa (positiva) • A selecção directa permite detectar mutantes morfológicos e de resistência e ainda mutantes auxotróficos que se tornam prototróficos. Teste de Ames – usado para despistar a potencial acção mutagénica de compostos químicos; recorre a mutantes auxotóficos de bactérias (ex. Mutante His‐ de Salmolella sp.); é analisada a frequência de reversão de auxotróficos a prototróficos por acção do composto O teste de Ames é usado na detecção de compostos carcinogénicos 65
Processos de transferência de material genético Os plasmideos podem ser de vários tipos: Plasmídeos Bacterianos: •
São elementos genéticos (DNA em cadeia dupla), circulares ou lineares •
Têm replicação autónoma •
Podem existir em cópia única ou haver múltiplas cópias •
Podem ser eliminados (“curing”) de forma: •
Expontânea •
Induzida •
São dispensáveis à viabilidade celular •
Alguns plasmídeos são epissomas (conseguem integrar no cromossoma hospedeiro) •
Alguns plasmídeos são conjugativos e podem aderir com a receptora por: • “pilus”ou tubo de conjugação • Conjugação (através de uma ponte citoplasmática) Podem conferir vantagem selectiva em determinados ambientes Plasmídeos Col (Em Escherichia coli, Salmonella sp., Enterobacter sp.) •
Codificam para colicinas (bacteriocinas) •
Alguns destes plasmídeos são conjugativos •
Alguns também contêm genes de resistência p.ex resistência a antibióticos Plasmídeos de virulência 66 •
Contêm genes de virulência e tornam a bactéria mais patogénica Ex. genes que conferem resistência aos mecanismos de defesa do hospedeiro (p.ex. Síntese de cápsula) Plasmídeos metabólicos •
Contêm genes envolvidos em processos metabólicos Ex. genes responsáveis pela fixação biológica de azoto Plasmideos que conferem resistência a antibióticos Factores de Resistência : • PlasmídeosR • Têmgenes quecodificamparaa resistênciaa antibióticos, metaispesados (Hg, Ni, Co), etc. • Algunssãoconjugativos • Geralmentenãose integramno cromossoma Plasmídeo F, • Factor F de fertilidade ou plasmídio F ‐ fundamental na conjugação bacteriana. • O factor F pode existir na célula bacteriana de 2 formas diferentes: ‐livre no citoplasma; ‐integrado no cromossoma (epissoma) 67
68 Integração do factor F ‐ na E. Coli. A integração é mediada por sequências de inserção (IS) 3 Mecanismos principais na transferência de material genético ‐ Conjugação (ex plasmideos conjugados) ‐ Transformação ‐ Transdução Conjugação Bacteriana •
Transferência de DNA por contacto directo entre as células • Contacto directo entre as células foi provado pela experiência de tubo em U. 69
ConjugaçãoF+x F‐ F+ ‐ estirpe dador contem o factor F F‐ ‐ estirpe receptor n~\ao contem o factor F • O factor F replica pelo mecanismo círculo rolante, duplica e é transferido • A transferência genética é unidirecional (de F+paraF‐) • A estirper eceptoratorna‐se F+ • A estirpe dadora continua F+ Pode ocorrer em algumas bactérias Gram‐.positivas (E. coli, Pseudomonassp., etc.) e em algumas espécies Gram‐positivas (p.ex. dos géneros Bacillus, Streptococcus, Staphylococcus, etc) 70 ConjugaçãoHfrx F‐ • Estirpe Hfr (“High frequency of recombination)” •
A estirpe dadora contém o factor F (epissoma) •
O DNA das células Hfr duplica pelo mecanismo circulo rolante e começa a ser transferido • Neste caso, a frequência de transferência do cromossoma é muito alta em comparação com a do Factor F por células F+ • Existe transferência de genes quer do plasmídeo, quer do cromossoma até haver quebra da ligação entre as células. • A célula receptora pode continuar F‐, se parte do plasmídeo F não é transferida 71
ConjugaçãoF’ x F‐ O plasmíde o F é um epissoma, pelo que pode libertar‐se do cromossoma bacteriano ‐ excisão. • PlasmídeoF¢ • Forma‐se por excisão incorrecta do cromossoma • Pode levar consigo mais do que 1 gene do cromossoma onde estava integrado • Célula Hfr passa a F ́ • A célulaF¢ transfer esse plasmídeo para uma célula receptoraF‐ (mecanismo virtualmente semelhante a o da conjugaçãoF+xF‐) A ‐ Genes cromossomais A parte rosa ‐ factor F integrado no cromossoma circular maior Nota: Os genes cromossomais (A) nem sempre tem que se integrados na célula para se expressarem As células receptores tornam‐se F´e são parcialmente diploides (possuem dois conjuntos do gene A) 72 Os genes bacterianos podem ser difundidos através deste mecanismo Transferência de DNA por transformação Comprovação da sua existência: Experiência de Griffith Definição: É a entrada de DNA livre existente no meio ambiente das células e sua incorporação estável numa célula receptora competente. É um processo aleatório A sua frequência em células competentes é muito frequente Espécies naturalmente competentes: Espécies pertencentes Aos géneros Haemophilus Streptococcus Bacillus Azotobacter Pseudomonas, etc 73
Mecansimo de transformação em células competentes •
As células competentes podem fixar fragmentos de DNA numa proteína receptora específica da parede celular, não discrimina o tipo de DNA •
O fragmento de DNA, em cadeia simples, vai ser alinhado com região homóloga, ocorrendo recombinação entre as cadeias (mediado por produto do gene RecA) •
Fragmentos que não encontrem região homóloga no cromossoma desaparecerão (após algumas gerações) 74 Transformação Artificial em bactérias Pode se tornar as células temporariamente competentes por: •
Tratamento das células com cloreto de cálcio e/ou outros iões, seguido de choque térmico; •
Electroporação ou electrotransformação Transdução Generalizada Definição: É a transferência de genes bacterianos entre células diferentes mediada por virus que infectam bactérias (designados por bacteriófagos ou fagos) • Resulta do facto de fragmentos do DNA da bacteria hospedeira entrar em, por engano, na cabeça do fago aquando da sua replicação e maturação–pode ocorer durante o Ciclo Lítico de replicação de virus em bactérias infectadas. 75
Classificação e Identificação de micorganismos
Taxonomia – Ciência que distribui os organismos por categorias taxonómicas ou taxa que traduzem o seu grau de semelhança. Divide‐se em: •
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•
Classificação – define a forma de distribuição dos organismos em grupos taxonómicos; Nomenclatura – atribui nomes aos grupos taxonómicos de acordo com regras pré‐estabelecidas; Identificação – é o processo de determinar a que grupo taxonómico pertence um determinado isolado. Espécie – unidade básica da taxonomia microbiana. É definida como: •
•
um conjunto de estirpes que partilham muitas características estáveis e diferem significativamente de outros grupos de estirpes; um conjunto de estirpes cuja composição G+C do genoma é idêntica e em que a sequência de nucleotídeos do DNA apresenta 70% ou mais semelhança. Género – grupo bem definido de uma ou mais espécies, claramente separado de outros géneros. 76 Utiliza‐se um sistema binomial para a designação de uma espécie, sendo o género (primeiro nome) por vezes abreviado à inicial. 77
Todos os organismos vivos estão distribuidos por 3 divisões maiores: os domínios Bacteria, Archaea e Eukarya. Estirpe: •
•
•
população de organismos que se distingue de outras dentro de um taxon descende de um único organismo ou cultura pura variam entre elas de varias formas: • Biovar – diferenças bioquímicas e fisiológicas • Morfovar – diferenças morfológicas • Serovar – difere nas propriedades antigénicas Estirpe tipo: 5. é a primeira estirpe da espécie a ser estudada 6. é geralmente a mais bem caracterizada 7. não é necessariamente o membro mais representativo da espécie 78 Características taxonómicas: 7. Clássicas: 8. morfologia – forma, tamanho, reacção gram, flagelo (se tiver) 9. fisiologia e metabolismo – mecanismo de conservação energética; relação com oxigénio; temperatura, pH, e tolerância/necessidade salina;capacidade de usar os vários carbonos, nitrogénio e fontes de enxofre; factor de crescimento; pigmentos; patogencidade; sensibilidade antibiótica 10. ecológica – ciclo de vida, relações simbióticas, capacidade de causar doenças em hospedeiros, habitat preferencial, factores que influenciam o crescimento 11. análise genética – capacidade de troca de informação genética por transformação e conjugação (geralmente confinados ao género), existencia de plasmideos (embora a informação neles contida possa induzir em erro) 12. Moleculares: 13. Ácidos nucleicos 14. Proteinas 15. Lípidos Os testes comerciais sao baseados principalmente em características fisiológicas e bioquímicas, e os perfis de caracteristicas observados (de culturas puras) sao comparados com bases de dados. SISTEMAS DE CLASSIFICAÇÃO: Classificação natural – dispõe os organismos em grupos cujos membros partilham muitas características, e reflecte a natureza biológica dos organismos. Executada por dois métodos: •
•
Fenético (classificação fenética) – agrupa os organismos com base em semelhanças fenotípicas, características estas com o mesmo peso; é o melhor método para comparar o maior número de propriedades possível Filogenético (classificação filogenética) – agrupa os organismos com base na sua provável proximidade evolutiva (filogenética) – baseia‐se usualmente na comparação directa de material genético (ex. DNA, RNA) ou produtos de genes 79
TAXONOMIA NUMÉRICA É usada para estabelecer um sistema de classificação, e envolve os seguintes passos: •
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Todas as propriedades testadas têm o mesmo peso (1 = tem caracteristica ; 2 = nao tem característica) Determinação dos coeficientes de semelhança • Coeficiente “simple matching” baseado em todas as características, quer estejam presentes ou ausentes • Coeficiente de Jaccard que ignora as características ausentes nos dois organismos Usa computadores para comparar organismos (em 50 ou mais características) Construção de matrizes de similaridade Construção de dendogramas (diagramas em árvores) que relacionam os microrganismos entre si. Um grupo de organismos com um grau de semelhança superior a 80% é uma espécie bacteriana. Classificação molecular – é feita através da comparação de proteínas, de perfis de lipidos, da comparação da composição dos àcidos nucleicos (ex. Conteúdo G+C do DNA), da hibridação de ácidos nucleicos, da comparação de sequências de bases de ácidos nucleicos. Comparação de proteínas – comparação da mobilidade electroforética, de propriedades enzimáticas e a determinação de sequências de aminoácidos, e respectivo alinhamento das sequências. HIBRIDAÇÃO DNA: DNA como ferramenta taxonómica – Mede o grau de similaridade (ou homologia) no DNA de dois organismos (pelo emparelhamento de duas moléculas de DNA desnaturadas) 80 Ecotipo – população de células que competem para um mesmo recurso Nova espécie – população de células que se distingue genéticamente das células do ecotipo original Filogenia (ou classificação filogenética) Traduz a história evolutiva de um grupo de organismos; A hierarquia taxonómica revela relações evolutivas ou filogenéticas Evolução – alterações numa linhagem de descendência ao longo do tempo, conduzindo a novas variedades e espécies. Relaçoes evolutivas sao mostradas em árvores filogenéticas. CLASSIFICAÇÃO FILOGENÉTICA Baseia‐se na comparação directa das sequências de material genético (genes) ou dos seus produtos (proteínas) •Ácidos nucleicos e proteínas funcionalmente idênticos podem ser usados para medir a evolução dos organismos ao longo do tempo • Baseiam‐se em alguns pressupostos – As sequências alteram‐se gradualmente ao longo do tempo – Essas alterações são relativamente aleatórias 81
– A quantidade de alterações aumenta linearmente com o tempo Os ribossomas são moléculas de RNA ribossómico (rRNA) são excelentes ferramentas para determinar relações evolutivas entre organismos – CRONÓMETROS EVOLUTIVOS. Isto porque: ‐ São universais (estão presentes em todos os organismos vivos e com a mesma função) ‐ A sua função não se alterou ao longo do processo evolutivo ‐ Contém várias regiões em que a sequência de nucleotídeos é conservada em todos os tipos de células As sequências do rRNA 16S (em procariotas) e do rRNA18S (o equivalente em eucariotas) é a mais usada em taxonomia. A sequência de bases nestas moléculas de rRNA é muito conservada ao long o do processo evolutivo. 82 PASSOS PRINCIPAIS ENVOLVIDOS NA OBTENÇÃO DE ÁRVORES FILOGENÉTICAS BASEADAS NA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOSDO rRNA: 1. Extracção do DNA de células de cada um dos microrganismos que se pretende comparar 2. A partir do DNA obtido em (a) são feitas muitas cópias do gene que codifica o 16S rRNA em cada um dos microrganismos, por recurso à técnica de PCR. A técnica de PCR baseia‐se na realização in vitro do processo natural de replicação de DNA que ocorre in vivo. Permite obter muitas cópias iguais de um gene específico. 3. Sequenciação dos genes que codificam o 16S rRNA de cada microrganismo; 4. Alinhamento das sequências de nucleotídeos dos genes que codificam o 16S rRNA para pesquisar semelhanças e diferenças, por recurso a ferramentas informáticas especializadas (p.ex. disponíveis no site “Ribossomal Database Project”; nesta base de dados está depositada uma colecção de cerca de 160 000 sequências de 16S rRNAs – dado de Nov 2006). 5. Um algoritmo permite fazer comparações e calcular distâncias evolutivas, dois a dois, e constrói uma árvore filogenética que mostra as diferenças nas sequências do rRNA entre os organismos analisados: neste exemplo microrganismos 1 e 3 são parentes mais próximos (provavelmente, pertencem à mesma categoria taxonómica), do que 2 e 3 ou 1 e 2. 83