Mutação e Reparação do DNA Aspectos Conceituais e Rotas Metabólicas Mutação e Reparação do DNA Aspectos Conceituais e Rotas Metabólicas Prof. Henrique Santana Costa, M.Sc. Prof. Antonio Márcio Teodoro Cordeiro Silva, M.Sc. Mutação Mutações → modificação súbita e hereditária no conjunto gênico de um organismo não explicável pela recombinação da variabilidade genética pré-existente. Mutante → organismo possuidor de uma forma alterada como resultado da presença de uma mutação. # Tipos aneuploidias → mudanças no número cromossômico. aberrações cromossômicas cromossomos. → mudanças grosseiras na estrutura dos mudanças dos genes individuais. 1. Atualmente, o termo mutação tem sido utilizado quando da presença de alterações detectadas em nível de genes individuais. Mutação Mutação # Geralmente, organismos portadores de uma mutação num determinado gene apresentam problemas em sua sobrevivência (sendo, assim, eliminados por seleção natural). # Contudo, nem toda mutação resulta numa conseqüências deletéria para seu portador. # mutação → fonte básica de toda variabilidade genética (matéria-prima para a evolução) Sem a mutação, todos genes existiriam apenas em uma forma. mutações espontâneas → resultam de funções celulares normais ou interações aleatórias com o ambiente. → podem ser aumentadas pelo tratamento com determinados compostos (agentes mutagênicos – mutações induzidas) → atuam diretamente no DNA. Mutação Síntese de Proteína Mutação pode alterar a síntese protéica Mutações Classificação Geral Mutação Cromossômica: Número ou Estrutura Mutações Gênicas: Genes individuais Mutação: Bom ou Ruim? A mutação é a fonte básica de toda variabilidade genética, fornecendo a matéria-prima para a evolução Processo Evolutivo Mutação como fonte de variabilidade 1. Recombinação: Rearranjos Novas combinações 2. Seleção Natural Preserva as combinações mais adaptadas 3. Ausência de Mutação Genes com apenas uma forma 1 2 3 Classificação das Mutações Quanto à Natureza 1. Mutação espontânea 2. Mutação induzida Mutagênese x Clastogênese x Teratogênese x Carcinogênese Mutações Cromossômicas Euploidia 1. 2. 3. 4. Conjunto de cromossomo de uma espécie Monoploidia: n cromossomos Diploidia: 2n cromossomos Triploidia: 3n cromossomos Poliploidia: mais de dois conjuntos Aneuploidia Número de cromossomos difere da espécie 1. Monossomia: 2n – 1 2. Trissomia: 2n + 1 3. Nulissomia: 2n – 2 Mutação # Mutação de ponto → modificação num único par de base (substituição, adição ou deleção) mau funcionamento do sistema replicativo mau funcionamento do sistema de reparo interferência química direta sobre uma das bases do DNA # Mutação letal condicional → letal num determinado ambiente (condições restritivas) Classes Mutantes auxotróficos → incapazes de sintetizar um metabólito essencial (aminoácido, purina, pirimidina, etc.) → crescem e se reproduzem quando o metabólito é fornecido pelo meio (condição permissiva) → não crescem quando o metabólito está ausente (condição restritiva) Mutação mutantes sensíveis à temperatura → crescerão numa determinada temperatura → aumento da labilidade ao calor ou ao frio do produto gênico mutado. mutantes sensíveis ao supressor → viáveis quando um segundo fator genético (supressor) está presente - mas inviáveis na ausência deste. # Mutações transmitidas à descendência → células germinativas # Mutações perpetuadas em células que descenderam da célula original na qual a mutação ocorreu (podendo não afetar o organismo inteiro) → células somáticas Rearranjos Cromossômicos 1. Inversões: Paracêntricas ou Pericêntricas Rearranjos Cromossômicos 2. Deleção: Terminal ou Intersticial Rearranjos Cromossômicos 3. Translocação: Recíproca ou Robertisoniana Rearranjos Cromossômicos 4. Duplicação x Replicação Mutantes em nível molecular modificações tautoméricas → flutuações químicas decorrentes de mudanças nas posições dos átomos (purinas, pirimidinas, grupamento amino, anel nitrogenado, etc.) → alteram o pareamento de bases normal. # Envolvem a substituição de um par de bases por outro → tipo mais comum de mutação # Transição → substituição de uma purina por outra purina, ou de uma pirimidina por outra pirimidina. # Transversão → substituição de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa. mutações que modificam a estrutura da leitura → envolve a adição ou deleção de um ou alguns pares de bases. → alteram a estrutura de leitura de todas as trincas de pares de bases no gene depois da mutação. Mutação Molecular Modificações Tautoméricas Mutação em Nível Molecular Transição A–T C–G T–A G–C Transversão A–T T–A C–G G–C Taxas de Mutações procariotos → 10-5 a 10-6 evento/locus/geração (mutação espontânea) eucariotos → estimativa semelhante à encontrada nos procariotos. # mutações silenciosas → sem efeito aparente # Hotspots → sítios de pares de bases mais susceptíveis à mutação. • Envolvem a troca de bases do DNA mas não causam a troca do aminoácido presente na proteína correspondente. • Levam à troca do aminoácido, mas a substituição não afeta a atividade da proteína (mutações neutras). Mutação em Nível Molecular Mutação em Nível Molecular Alteração do Quadro de Leitura (Frameshift) Mutação em Nível Molecular Deleção Mutação em Nível Molecular Inserção Mutação em Nível Molecular Sentido Trocado (Missense) Mutação em Nível Molecular Sem Sentido (Nonsense) Mutação em Nível Molecular Expansão de Repetição Radiação → porção do espectro eletromagnético que contém comprimentos de onda menores e de maior energia que a luz visível (0,1µm). Tipos ionizante → raios X, raios gama e raios cósmicos (úteis no diagnóstico médico pelo fato de poderem penetrar nos tecidos vivos). não-ionizante → luz ultravioleta. • No processo de penetração, a radiação ionizante colide com átomos da matéria causando a liberação de elétrons (formando radicais livres positivamente carregados – íons). • Quimicamente mais reativos quando comparados à átomos em seu estado estável normal. # a reatividade aumentada dos átomos presentes nas moléculas de DNA é a base dos efeitos mutagênicos da luz ultravioleta e da radiação ionizante. Mutação por Radiação Radiação ionizante → não envolve uma extensão de tempo. # a mesma dosagem de irradiação pode ser obtida por um longo período de tempo, ou uma alta intensidade num curto período. # mutações de ponto → diretamente proporcionais à dose de irradiação. # Teoria da cinética de colisão única → toda ionização tem uma probabilidade de induzir uma mutação. Mutação por Radiação Radiação ionizante Efeito direto Efeito indireto Radiação ionizante H2O H + OH Acidentes Radioativos Aberrações Estruturais Cariótipo - Metáfase Mutação por Radiação Radiação não-ionizante (luz ultravioleta) → não possui energia suficiente para induzir ionizações. # são absorvidos por purinas e pirimidinas (tornando-se mais reativas). ○ multicelulares → atingem apenas camadas de células superficiais. ○ unicelulares → potente agente mutagênico Formação de hidratos de pirimidina e dímeros de pirimidinas. # a relação entre a taxa de mutação e a dose de UV é muito variável, dependendo do tipo de mutação do organismo e das condições empregadas. Mutação por Radiação Mecanismos de reparo do DNA • Um mutante sobrevive quando sua troca genética não é prejudicial ou, mais raramente, é benéfica. • A maioria das mutações, contudo, são desvantajosas – impedindo a sobrevida celular. • mecanismos de reparo → revertem os efeitos de processos mutagênicos artificiais ou naturais sob o DNA. → muitos dos danos sofridos pelo DNA podem ser reparados porque a informação genética é preservada em ambas as fitas da dupla-hélice. → a informação perdida em uma fita pode ser recuperada através da fita complementar APLICAÇÕES PRÁTICAS DAS MUTAÇÕES • Apesar da maioria das mutações tornarem o organismo menos adaptado e serem, portanto, desvantajosas, há a possibilidade das mesmas desenvolverem novas características desejáveis. • Mutantes induzidos de cevada, trigo, aveia, soja, tomate – podem melhorar as linhagens cultivadas. • resistência à ferrugem, maior produção, maior quantidade de proteína, sementes sem casca, ente outro. → elucidam as vias pelas quais os processos biológicos ocorrem (isolamento e estudo das mutações nos genes que codificam enzimas envolvidas nas mais diversas atividades metabólicas) → dissecção de processos biológicos Reparação do DNA Tipos de Reparação do DNA 1. Reparação por fotorreatividade enzimática 2. Reparação de bases alteradas 3. Reparação por excisão de base 4. Reparação por excisão de nucleotídeos 5. Reparação de bases malpareadas 6. Sistema de reparação por resgate Reparação do DNA Reparação por Fotorreatividade Enzimática # dímeros de pirimidina → impedem a replicação e a expressão gênica • Fotoliase → catalisa uma 2ª reação fotoquímica, na presença de luz visível, desfazendo a mutação e refazendo as bases pirimídicas individuais. ETAPAS 1ª → reconhecimento da enzima ao dímero na ausência de luz. 2ª → após a absorção de luz, energia é fornecida para a conversão do dímero em monômeros de pirimidina. 3ª → dissociação da enzima do DNA. Reparação do DNA Reparação por Fotorreatividade Enzimática Fotorreativação 1. Fotoliase reconhece e se liga ao dímero 2. Absorção de luz Conversão em monômeros Reparação do DNA Reparação de Bases Alquiladas Ação de enzimas específicas: O6-Metilguanina-metiltransferase CH3-Cys-Enzima • Não há meios de recuperar a enzima metilada (necessidade de novas enzimas para cada grupamento metil removido). Reparação do DNA Reparo por excisão # A remoção de uma base defeituosa (ou não habitual) pode ocorrer a partir da: • clivagem da ligação base-açúcar (excisão de base) • incisão endonucleolítica nos dois lados da lesão • liberação de nucleotídeos • preenchimento da região pela ação da DNA-polimerase I e posterior ligação Reparação do DNA Reparação por excisão de base # A citosina do DNA é desaminada espontaneamente sendo, portanto, percebida pela uracil. • evento mutagênico potencial → formação de filamento apresentando pares de bases errôneos (AU no lugar de GC) ■ Etapas de reparo 1. Hidrólise da ligação glicosídica entre uracil e as moléculas de desoxirribose pela enzima uracil-DNA-glicosilase 2. Liberação da base nitrogenada errônea (formação do sítio AP) 3. Excisão da cadeia em regiões adjacentes à base perdida pela enzima AP endonuclease Reparação do DNA Reparação por excisão de base ■ Etapas de reparo 1. Hidrólise da ligação glicosídica entre uracil e as moléculas de desoxirribose pela enzima uracil-DNA-glicosilase 2. Liberação da base nitrogenada errônea (formação do sítio AP) 3. Excisão da cadeia em regiões adjacentes à base perdida pela enzima AP endonuclease 4. Inserção de citosina no local mutado pela enzima DNA-polimerase I 5. Ligação da fita corrigida pela enzima DNA-ligase Reparação do DNA Reparação do DNA Reparação por Excisão de Base Reparação do DNA Reparo por excisão de nucleotídeos ■ Um dos mais importantes e gerais mecanismos de reparo (REN) ETAPAS 1. Reconhecimento da lesão 2. Incisão da fita lesada em ambos os lados da lesão e a alguma distância desta 3. Excisão do segmento (oligonucleotídeo) contendo a lesão 4. Síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada como molde 5. Ligação # reação, a princípio, livre de erro Reparação do DNA Reparação por Excisão de Nucleotídeo (REN) 1. Reconhecimento da lesão 2. Incisão da fita lesada em ambos os lados da lesão 3. Excisão do seguimento contendo a lesão 4. Síntese do novo seguimento de DNA e Ligação Reparação do DNA REN: Sistema Uvr (E. coli) ATP Helicase 5’ 3’ 3’ (4 a 5nt) 5’ (8nt) Excisão de 12 a 13nt UvrD Enzimas de correção de erro • Algumas bases incorretamente pareadas escapam da correção realizada pela DNApolimerase # Remoção de bases mal pareadas → Qual das fitas contém o erro? Qual das bases é a errada? ■ Um dos mais importantes e gerais mecanismos de reparo (REN) → enzima de correção de erro ETAPAS 1. Reconhecimento da lesão 2. Incisão da fita lesada em ambos os lados da lesão e a alguma distância desta 3. Excisão do segmento (oligonucleotídeo) contendo a lesão 4. Síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada como molde 5. Ligação # sinal que direciona o sistema de excisão do erro exclusivamente para a fita recém-sintetizada → seqüências GATC próximas ao erro Reparação do DNA Sinalização por metilação de sítios específicos Reparação do DNA 1. Enzima de correção de erro liga-se à seqüência GATC não modificada e ao par de bases mal pareadas da mesma fita de DNA. 2. Enzima de correção de erro remove o segmento de DNA que inclui o erro da fita que contém a seqüência GATC não metilada. 3. DNA-polimerase substituindo a correta. preenche a fenda, base mal pareada pela # Modificações na adenina da seqüência GATC por metilases farão com que a enzima de correção não mais atue (não ocorrendo a excisão). Reparo sujeito ao erro • Existem ocasiões em que o dano no DNA é tão extremo que não há maneira de os mecanismos celulares de reparo corrigirem de forma precisa o erro → perda completa de um par de bases # Qual base deve ser inserida no local lesado? ■ Sistema de Reparo Sujeito ao Erro → qualquer uma das bases é inserida no local lesado a fim de garantir a continuidade do processo replicativo # possível indutor mutagênico (3/4 – 75%) ◙ Ainda assim, é mais vantajoso para a célula a incorporação de uma base errada do que não replicar mais. Reparação do DNA Reparação de Bases Malpareadas N6-Metiladenina (GATC) Padrão de metilação Replicação Divisão Celular Metiltransferase de Manutenção Metilação Reparação do DNA Reparação de Bases Malpareadas: Sistema Mut 1. MutS pb malpareado 2. Reconhece sítio do erro 3. MutL se liga a MutS 4. Deslizamento até GATC (ATP) 5. MutH Reconhece GATC 6. Cliva: GATC até o malpareamento 7. Remoção da fita clivada (SSB) 8. Síntese e ligação da nova fita Reparação do DNA Sistema de Reparação por Resgate 1. Dano impede a replicação 2. Cópias com lacuna no sítio lesado 3. Resgata-se a seqüência da fita normal 4. A lacuna da fita lesada é preenchida 5. A lacuna da fita normal é repolimerizada Conclusão Mutação: Alteração do código genético Efeito benéfico x Efeito maléfico Mutações cromossômicas numéricas/estruturais Mutações gênicas (Nível molecular) Mecanismos de reparação de erros Sistemas enzimáticos complexos que removem vários tipos de erros Manutenção da integridade do DNA