Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Uso de Células Tronco
na Terapia Celular:
Fundamentos e Perspectivas
Marco Antonio Zago
Pro-Reitor de Pesquisa da USP
Ribeirão Preto – Outubro 2010
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
A Miraculous Medicine
I have seen a medicine
That’s able to breathe life into a stone,
Quicken a rock, and make you dance canary
With spritely fire and motion, whose simple touch
Is powerful to araise King Pippen, nay,
To give great Charlemain a pen in 's hand
And write to her a love-line.
W. Shakespeare
All's Well That Ends Well
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Células tronco para a cegueira
Notícias na Imprensa
Cientistas britânicos pretendem usar células
tronco para tratar uma forma comum de cegueira
Pacientes cegos por queimaduras químicas
recuperaram a visão após implante de células
tronco em centro italiano
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Degeneração Macular Relacionada à Idade
Forma “úmida” Proliferação vascular
10% casos
Mais grave
Várias formas de tratamento
Forma “seca”
Atrofia
90% casos
Não há tratamento
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Fibroblastos humanos
OCT4, SOX2, NANOG, LIN28
iPS
iPS
EPR
Epitélio Pigmentado Retiniano
Neural
Epitélio
Cartilagem Intestinal
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Fibroblastos humanos
OCT4, SOX2, NANOG, LIN28
iPS
iPS
EPR
Epitélio Pigmentado Retiniano
Royal College of Surgeons
dystrophic rats
Neural
Epitélio
Cartilagem Intestinal
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Córnea e células tronco
Limbo contém as células tronco que repõem as células da
superfície da córnea
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Córnea e células tronco
Limbo contém as células tronco que repõem as células da
superfície da córnea
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Neovascularização
Deficiência parcial
Invasão da córnea pelo
Inflamação
Destruição (queimadura) epitélio conjuntival
Cicatrização
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Limbal Stem-Cell Therapy
and Long-Term Corneal Regeneration
Pacientes com perda de visão por queimadura da córnea
Células do limbo contralateral obtidas por biópsia, cultivadas e implantadas
Sucesso
Sucesso parcial
Insucesso
82 (77%)
14 (13%)
11 (10%)
p63-bright cells: holoclone forming cells in culture
Antes
Depois
NEJ Medicine 363:147, 2010
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
PESQUISA
Cientistas brasileiros testam o uso de
células-tronco contra cegueira
O Globo
RIO – O uso de células-tronco pode ser uma esperança para o tratamento
de problemas graves de visão, como a retinose pigmentar, que leva à
cegueria. .... Se der certo para retinose pigmentar – estima-se que no
Brasil 40 mil pessoas sofrem desse mal – o tratamento poderá ser testado
em outras doenças, como a degeneração macular relacionada com a idade
(DMRI) e a retinopatia diabética.
.... Daí a idéia de retirar as células da própria medula óssea desses
pacientes, que em seguida foram processadas e injetadas no vítreo do
globo ocular.
Células tronco hematopoéticas
Células tronco mesenquimais
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Mononuclears
Metho-Cult GFH4434 medium
Ficoll-Hypaque
gradient
14 days
37o C
5% CO2
Bone Marrow
Peripheral Blood
Umbilical Cord
Colonies
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
BFU-E
BFU-E
CFU-GM
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
CFU-GM
CFU-GEMM
Mononuclears
 - MEM
20% Fetal Calf Serum
72 hours
Remove
non-adherent cells
14 days
Ficoll-Hypaque
gradient
Trypsin
Detach cells
Bone Marrow
Umbilical Vein
Weekly
Diferenciação
Osteoblástica
Dexametasone
Ácido ascórbico
Diferenciação
Adipocítica
Insulina
Dexametasone
Indometacina
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Fontes de MSC em Humanos
Tecidos Adultos
Tecidos Fetais
Placenta
Medula óssea
Tecido adiposo
Veias e artérias
Medula óssea fetal
Fígado fetal
Sague periférico fetal
Sangue de cordão umbilical
Veia de cordão umbilical
Gônadas
Células fetais
Células maternas
MSC de veia umbilical
MSC
Sudan II
Fosfatase Alcalina
Von Kossa
H.E.
Colágeno II
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
mTOR
mTOR (FRAP1)
mammalian Target of Rapamycin
Serina/treonina proteino-cinase
Síntese Ciclina D1
Proliferação celular
Proteínas angiogênicas
Angiogênse
TSC1 e TSC2
Ativa metabolismo
Inibidores de mTOR
Inibidores de mTOR
rapanalogs
Tratamento de câncer
PTEN regulador (inibidor) de mTOR
Deleção de PTEN
Síndrome mielodisplásica
Leucemias
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Células-tronco:
Propriedades e Fontes
Blastocisto
Todos
os tecidos
do adulto
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Células-tronco Embrionárias
blastocisto
CT embrionários
adipócitos
epitélio
corpo embrióide
fibras musculares neurônios
*
corpo embrióide
Lygia V. Pereira
Instituto de Biologia
USP
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Propriedade Fundamental das Células-Tronco
Divisão Assimétrica
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Célula-tronco Instestinal
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição
Embrião
Endoderma
+Gata4/5 Massa Interna
+Oct3/4
+Sox2
+Klf4
(+cMyc)
CT Embrionária
iPS
Progenitores
+Cdx2
Trofoectoderma
Progenitores
Hematopoéticos
-Pax5
+Cebp
Fibroblastos
Músculos
+Myod
Cels Maduras
Células B
Macrófagos
Célula Acinar
Célula 
+Pdx1, Ng3n, Mafa
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Teratomas derivados de iPS
Takahashi & Yamanaka
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição
Embrião
Endoderma
+Gata4/5 Massa Interna
+Oct3/4
+Sox2
+Klf4
(+cMyc)
CT Embrionária
iPS
Progenitores
+Cdx2
Trofoectoderma
Progenitores
Hematopoéticos
-Pax5
+Cebp
Fibroblastos
Músculos
+Myod
Cels Maduras
Células B
Macrófagos
Célula Acinar
Célula 
+Pdx1, Ng3n, Mafa
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Células Tronco
Células tronco pluripotentes
• células tronco embrionárias (blastocisto 4-5 dias)
• células embrionárias germinais (feto 5-9 semanas)
• iPS (induced pluripotent stem cell)
Células tronco de adultos
• medula óssea
• vasos
• músculos esqueléticos
• fígado
• cérebro
• dentes
• intestino
• pele
• coração
Uso Terapêutico
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Doenças potencialmente tratáveis com
terapia celular com células-tronco
Diabete melito
Infarto do miocárdio
Miocardiopatias
Cirrose hepática
Câncer
Grandes defeitos ósseos
Doença de Parkinson
Doenças auto-imunes
Distrofias musculares
Cegueria
Doenças hematológicas
Doenças metabólicas
Doenças ósteo-articulares
Fibrose pulmonar
Defeitos da face
Vasculopatia periférica
D. vascular cerebral
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Doenças atualmente tratáveis com terapia
celular com células-tronco
Diabete melito
Infarto do miocárdio
Miocardiopatias
Cirrose hepática
Câncer
Grandes defeitos ósseos
Doença de Parkinson
Doenças auto-imunes
Distrofias musculares
Cegueira
Doenças hematológicas
Doenças metabólicas
Registros de
Trials Clínicos
The registration of all interventional trials is a
scientific, ethical and moral responsibility.
• There is a need to ensure that decisions about health care are
informed by all of the available evidence
• It is difficult to make informed decisions if publication bias and
selective reporting are present
The Declaration of Helsinki
Every clinical trial must be registered in a publicly
accessible database before recruitment of the first
subject.
International Committee of Medical Journal Editors
(ICMJE)
Obligation to Register Clinical Trials
The ICMJE believes that it is important to foster a
comprehensive, publicly available database of clinical trials.
Trials Results and the Media
Researchers will not publicize their work while their
manuscript is under consideration or awaiting publication.
Very little medical research has such clear and urgently
important clinical implications for the public’s health that
the news must be released before full publication in a
journal.
2.641 Studies with the tag: stem cells
2.418: hematopoietic stem cells
Clinical Trials.gov
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Estratégias de Terapia com Células Tronco
Estratégia
Fonte de Células
Células totipotentes
Células tronco embrionários
Células iPS
Cultura
Diferenciação
Injeção/transplante
Células tronco adultas tecido-específica
Medula óssea
Pele
Olho
S. nervoso
Isolamento
Enriquecimento, cultura
Injeção/transplante
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium
Donald Orlic, Jan Kajstura, Stefano Chimenti, Igor Jaloniuk, Stacie M. Anderson, Baosheng Li, James
Pickel, Ronald McKay, Bernardo Nadal-Ginardi, David M. Bodline, Annarosa Leri & Piero Anversa
Nature 410:701, 2000
Infarcted myocardium
Transplanted cells
Unknown molecular signal(s)
LVEDP
mm Hg
40
Cell migration to damaged area
30
Proliferation and
differentiation
20
10
C
Cytoplasmic proteins
Cardiac myosin
-Sarcomeric actin
Connexin 43
Infarction
+ BM cells
Nuclear proteins
Csx/Nkx2.5
MEF2
GATA-4
Functional competence
Transdiferenciação:
Fusão
Contaminação
Transdiferenciação:
Fusão
Contaminação
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Pesquisa Básica
Pesquisa Translacional
Pesquisa Clínica
Evidência Médica Sólida
Mudança da Abordagem Médica
Resultados
Avaliação
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Evidência Médica Sólida
Trials com resultados convincentes
Abordagem que modifica significativamente o
desfecho clínio em relação aos tratamentos
existentes estabelecidos
Resultados são obtidos consistentemente por
diferentes observadores
Vantagem adicional é suficientemente grande
para sobrepujar os riscos adicionais
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Evidência Médica Sólida
Exceto para os tratamentos com base em
transplante de células tronco hematopoéticas,
tratamento de lesões da córnea e o uso de MSC
como imunomoduladora,
Há evidência médica sólida, não controvertida,
que qualquer outra forma de terapia celular
com células-tronco adultas seja vantajosa em
um ambiente clínico?
Não, não há evidência
Terapia Celular: Estratégias
Substituição do tecido doente ou destruído
Células tronco tecido-específicas
Transplante de medula óssea
Transplante de células pancreáticas
Mesenquimais: osso e cartilagem
Pele cultivada
Células tronco embrionárias ou células iPS
Células de m. óssea: regeneração de outros órgãos
Imunoterapia + Transplante autólogo
Diabete melito tipo I
Efeito imuno-modulador
Cels. tronco mesenquimais
Terapia Celular de Doenças Cardíacas
Células Hematopoéticas
Precursores hematopoéticas não originam cardio-miócitos
MSC não originam cardiomócitos
Derivadas de tecido hematopoético (linhagem monocítica)
fundem-se com hepatócitos, cardiomiócitos, células de
Purkinje, CT intestinais
Precursoras hematopoéticas podem se incorporar no endotélio
MSC são imunossupressoras
MSC poderiam reduzir reação inflamatória
Precursoras da medula óssea poderiam secretar substâncias
bioativas localmente
Registered Clinical Trials with “Stem Cells”
Clinical Trials
Condition
Stem Cell
All
Heart Disease
127
4.489
Myocardial Ischemia
101
2.010
Myocardial Infarction
62
631
Coronary Disease
44
1.433
Heart Failure
36
934
Cardiomyopathies
20
218
Hypertension
9
2.218
Peripheral Vascular Disease
17
272
Stroke
13
887
Diabetic Angiopathies
3
226
Intracranial Hemorrhages
1
119
Evidence*
C
C
C
C
No
No
No
No
No
No
No
*Evidence = published results of convincing double-blind trials
C = contradictory or non-reproducible results
Registered Clinical Trials with MSC
Condition
Graft-versus-Host Disease
Heart Disease
Myocardial Ischemia
Heart Failure
Autoimmune Diseases
Bone Diseases
Diabetes Mellitus 2
Peripheral Vascular Disease
Stroke
Intestinal Disease
All studies
Clinical Trials
MSC Stem Cells
15
216
15
127
8
101
7
36
7
51
7
23
2
13
1
17
1
13
5
35
82
2.641
Evidence*
C
No
No
No
No
No
No
*Evidence = published results of convincing double-blind trials
C = contradictory or non-reproducible results
Conclusion: In patients with AMI and impaired
LVEF, treatment with BM cells does not lead to a
significant improvement of LVEF or volumes.
N= 20
N= 46
N= 51
Randomized Trials with BMC – Acute Myocardial Infarction
BOOST
Follow-up (mos)
Control/placebo
Treatment
Janssens
18
30
30
Improvement LVEF
C/P
51-54%
Treatment
50-56%
Mortality + Reinfarct
C/P
Treatment
3%
3%
ASTAMI
4
34
33
REPAIR-AMI
12
50
50
12
103
101
47-49%
49-52%
43-49%
41-49%
47-50%
48-54%
0%
6%
0%
2%
6%
2%
↑EF 3-4%
Changes observed with cell-therapy
are in the range observed with other
therapies
Captopril
Ramipril
Captopril
Valsantan
Carvedilol
Intracoronary Transplantation of PB or BM derived cells
Increase in LVEF = 3-4%
Changes in functional and morphometric parameters of LV
In the range observed with:
Reperfusion therapy
Beta-blockers
Interventions in the renin-angiotensin pathway
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Efeito Mecânico da Destruição Ventricular
no Infarto do Miocárdio
Ventrículo Esquerdo
200 g = 4 x 109 miócitos
Infarto
Destruição celular
25%
40%
1 bilhão miócitos
Insuficiência cardíaca
Choque cardiogênico
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Regeneração Cardíaca Verdadeira
Restauração 1 x 109 miócitos
Inserção nos sítios adequados
Junção eletromecânica
Contração síncrona com o restante do
miocárdio
Células da medula óssea não substituem cardiomiócitos
a
Purificação
Células LacZ-positivas
Fibrose
Medula Óssea
Doador
LacZ
Recipiente
b
Cardiomiócito
(sem LacZ)
Células GFP-positivas
Fibrose
Doador
GFP
Transfusão
direta
Recipiente
Lesão
Cardiomiócito
(sem GFP)
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas
Sem sucesso
Cardiomiócitos
Mioblastos esqueléticos
Músculos lisos
Fibroblastos
Precursores endoteliais
Medula óssea (total ou frações)
Células-tronco mesenquimais
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas
Perspectivas
Progenitores miocárdicos residentes
Células-tronco embrionárias
Injeção de fatores de crescimento
Transplante de células modificadas (terapia gênica)
iPS com diferenciação cardíaca
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero
Nelson et al, Circulation, 2009
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
iPS restaura função do miocárdio
após infarto experimental
Nelson et al, Circulation, 2009
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis
Nuclear reprogramming offers a revolutionary strategy for
embryo-independent derivation of pluripotent stem cells form
an ordinary adult source. iPS reverse cell fate to reset
embryonic-like potential of somatic tissue. In this way, iPS
have attained functions of natural embryonic stem cells to
produce all tissue types and develop the complete organism.
The proof-of-principle study here establishes the practical
application of bioengineered stem cells to respond to the
ischemic myocardium and heal the damaged areas with iPSderived integrated functional tissue.
Nelson et al, Circulation, 2009
ISSCR
Recommendations
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
http://www.isscr.org/clinical_trans/
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Guidelines for the Clinical Translation of Stem Cells
Chapter
Guidelines
Responsability for conduct
2
Cell processing and manufactures
8
Preclinical studies
9
Clinical research
14
Stem-cell based medical innovation
1
Considerations of social justice
5
Ongoing review of guidelines
1
Total
40
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 21
All studies involving clinical applications of stem cells
must be subject to independent review, approval, and
ongoing monitoring by human subjects research oversight
bodies with supplemental appropriate expertise to
evaluate the unique aspects of stem cell research and its
application in a variety of clinical disciplines.
This review and oversight process must be independent
of the investigator regardless of whether it occurs at the
institutional, regional or national level, and regardless of
whether investigators employ the services of a contract
research organization.
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 22
In countries where there is no official national regulatory
body, the ISSCR strongly encourages government to
develop a regulatory competence at the national,
regional, or local level to monitor interventions with
stem-cell based products.
The ISSCR will strive to provide professional advice to
those governing bodies interested in building their own
capacities for regulatory oversight.
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 26
Clinical research should compare new stem-cell based
therapies against the best medical therapy currently
available to the local population
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 33
Researchers should publish both positive and negative
results and adverse events. To ensure the integrity of
scientific information and to promote the highest
standard of professional conduct, researchers should
present their results at professional scientific conferences
or in peer-reviewed scientific journals before reporting
their research to the lay media or to patient advocacy
groups and associations.
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 23
The peer review process for stem cell-based clinical trials
should have appropriate expertise to evaluate (a) the in
vitro and in vivo preclinical studies that form the basis for
the clinical trial, and (b) the scientific underpinnings of
the trial protocol, the adequacy of planned end-points,
statistical considerations, and disease specific issues
related to human subject protection.
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 25
A stem cell-based must aim at being clinically competitive
or superior to existing therapies. If an efficacious therapy
already exists, the risks associated with a stem cell-based
approach must be low and must offer a potential
advantage (for example, better functional outcome;
single procedure versus life-long drug-therapy, reduction
of long-term costs)
Perspectivas
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Perspectivas para Terapias Inovadoras
Abordagens gerais
Transdiferenciação
Células Tronco Tecido-específicas
Reprogramação Nuclear (iPS)
Aplicações Específicas ou Focalizadas
Células Tronco Mesenquimais
Manipulação Imunológica seguida de transplante
de HSC
Deficiências Enzimáticas: Terapia Substitutiva
Manipulação Celular para Induzir ou Inibir a
Expressão de Gene(s) Específico(s)
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Terapias Inovadoras: os Gargalos
Células Tronco Tecido Específicas
Isolamento em números significativos
Obter a célula ou a combinação “correta”
iPS
Eficiência de indução
Indução mais “fisiológica”
Obter a diferenciação “correta”
Excluir células pluripotenciais