JOSÉ VICTOR DE OLIVEIRA
ESTUDO DE METODOLOGIAS PARA A
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE JUMENTO
(EQUUS ASINUS) POR MEIO DE TESTES
LABORATORIAIS E FERTILIDADE
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual
Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Campus de
Botucatu, para a obtenção do título de Mestre em
Medicina Veterinária (Área de Concentração:
Reprodução Animal)
Orientador: Prof. Dr. Frederico Ozanan Papa
Botucatu
2005
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Oliveira, José Victor de
Estudo de metodologias para a criopreservação de sêmen de jumento
(Equus Asinus) por meio de testes laboratoriais e fertilidade / José Victor de
Oliveira. – Botucatu : [s.n.], 2005.
Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade Estadual Paulista, 2005.
Orientador: Prof. Dr. Frederico Ozanan Papa.
Assunto CAPES: 50504002
1. Reprodução animal.
CDD 636.0824
Palavras chave: Eqüídeo; Sêmen; Criopreservação; Crioprotetores; Citologia
uterina; Teste de fertilidade
DEDICO
A Deus, por tudo que representa,
A minha esposa Glauce pelo constante apoio e incentivo, aos meus
filhos Pedro e Marcelo pela compreensão e sacrifícios vividos ao longo desta
jornada,
A minha mãe Laizinha que sempre acreditou na minha vitória, ofereço
este título como forma de amenizar a dor pela recente partida de meu pai,
Ao meu pai Sebastião, que durante a sua existência sempre esteve
presente, auxiliando a descoberta de caminhos que proporcionassem as
minhas conquistas, dedico este trabalho.
Agradecimentos
À amizade e orientações do profesor Frederico Ozanan Papa, que foram
valiosas na minha formação desde a residência veterinária.
Aos professores Marco Antonio Alvarenga e Cezinande de Meira, além
de amigos, tiveram participação decisiva na realização desta pós-graduação.
Aos companheiros de pós-graduação Márcio, Dell’Aqua, Felipe, Carlos
Frederico, Luciana, Letícia, André, pelo excelente convívio e coleguismo no
período.
Às conversas estimulantes do Prof. Sony Dimas Bicudo e Maria Denise
Lopes, durante o curso de mestrado.
Ao Prof. Rubens Paes Arruda pelo auxílio e ensinamentos.
Ao Flávio Dutra de Resende, pelo apoio proporcionado na obtenção
deste título.
Aos companheiros do “Posto de Equideocultura de Colina”, Francisco
Raul Abbot de Oliveira Perdigão e Celso Augusto, pelo infindável entusiasmo.
Aos colegas de trabalho: João, Márcia, Fabinho, Mineiro, Zé Baiano,
Zezé, Mauro, Édson, Sebastião e Zé Luiz que auxiliaram na execução prática
deste trabalho.
Aos funcionários do Departamento de Reprodução, Edilson, Valter,
Marquinho e Miguel, que me ajudaram em suas respectivas áreas.
Aos colegas não mencionados, que contribuíram de alguma forma para
a concretização deste trabalho.
ÍNDICE
Página
LISTA DE FIGURAS .............................................................................
vi
LISTA DE TABELAS ............................................................................
viii
LISTA DE ANEXOS ............................................................................
x
RESUMO .............. ..............................................................................
11
ABSTRACT .........................................................................................
13
1 INTRODUÇÃO ................................................................................
15
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................
18
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................
39
3.1
PRIMEIRO
EXPERIMENTO
AVALIAÇÃO
LABORATORIAL
3.1.1 ANIMAIS ...................................................................
3.1.2 COLHEITA DO SÊMEN ............................................
3.1.3 ESTIMATIVA DA OSMOLARIDADE E pH - SÊMEN
FRESCO ...................................................................
3.1.4 AVALIAÇÃO COMPUTADORIZADA - SÊMEN “in
natura” ........................................................................
3.1.5 MORFOLOGIA
ESPERMÁTICA
–
SÊMEN
FRESCO ..........................................................................
3.1.6 AVALIAÇÃO
DA
CONCENTRAÇÃO
E
INTEGRIDADE
DA
MEMBRANA
PLASMÁTICA
(CHOQUE OSMÓTICO) ............................................
3.1.7 AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA
PLASMÁTICA – SONDAS FLUORESCENTES ........
3.1.8 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS PARA
CRIOPRESERVAÇÃO ...............................................
3.1.9 AVALIAÇÃO COMPUTADORIZADA - SÊMEN
CONGELADO ............................................................
3.1.10 AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA
PLASMÁTICA - SÊMEN CONGELADO .....................
3.2 SEGUNDO EXPERIMENTO - TESTE DE FERTILIDADE A
CAMPO ...............................................................................
40
40
41
41
41
42
42
43
44
44
44
Página
3.3 TERCEIRO EXPERIMENTO - CITOLOGIA UTERINA ........
48
4
METODOLOGIA ESTATÍSTICA ........ ...........................................
50
5
RESULTADOS ... .........................................................................
51
6
DISCUSSÃO ... .............................................................................
72
7 CONCLUSÕES .............................................................................
91
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...........................................................
92
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................
93
10 ANEXOS ... ..................................................................................
105
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos
diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5, M6,
M7, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8,
P9, P10, sobre o parâmetro motilidade total
(MOT).
Figura 2 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos
diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5, M6,
M7, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8,
P9 e P10, sobre o parâmetro motilidade
progressiva (MOP).
Figura 3 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos
diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5, M6,
M7, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8,
P9 e P10, sobre o parâmetro LIN.
Figura 4 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos
diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5, M6,
M7, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8,
P9 e P10, sobre o parâmetro fluorescência (FLU).
Figura 5 - Média e desvio padrão referentes ao parâmetro VCL,
na comparação entre os resultados dos tratamentos:
M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, P1, P2,
P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9 e P10.
Figura 6 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos
diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7,
M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9 e
P10 sobre o parâmetro VAP.
Figura 7 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos
diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7,
M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9 e
P10 sobre o parâmetro VSL.
Figura 8 – Valores médios encontrados para contagem de
neutrófilos em esfregaços uterinos de 5 jumentas
obtidos nos momentos 0, 6 e 24 horas após a
inseminação artificial de 4 mL de sêmen in-natura de
jumento.
55
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vi
Página
Figura 9 – Valores médios encontrados para contagem de
neutrófilos em esfregaços uterinos de 5 jumentas
obtidos nos momentos 0, 6 e 24 horas após a
inseminação artificial de 4 mL de diluente MP- 50.
Figura 10 – Valores médios e desvio padrão encontrados para
contagem de neutrófilos em esfregaços uterinos de 5
jumentas obtidos nos momentos 0, 6 e 24 horas
após a inseminação artificial com 8 palhetas
(800x106 de sptz) de sêmen congelado de jumento.
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69
vii
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 - Valores médios e desvio padrão, para as
características de motilidade total (MT),motilidade
progressiva (MP), a linearidade (LIN), obtidos
através do CASA e integridade de membrana
plasmática (FLUO) avaliadas pela fluorescência,
após a descongelação de sêmen de jumento,
envasados em meio macrotubo ( M - 2,5 mL) com
diluente
MP50
e
10
formulações
de
crioprotetores.
Tabela 2 - Valores médios e desvio padrão, para as
características de motilidade total (MT),motilidade
progressiva (MP), a linearidade (LIN), obtidos
através do CASA e integridade de membrana
plasmática (FLUO) avaliadas pela fluorescência,
após a descongelação de sêmen de jumento,
envasados em palheta (P - 0,5 mL) com diluente
MP50 e 10 formulações de crioprotetores.
Tabela 3 – Valores médios e desvio padrão, para as
características de VCL, VAP e VSL avaliados
pelo CASA, após a descongelação de sêmen de
jumento, envasados em meio macrotubo ( M 2,5 mL) ou palheta (P - 0,5 mL) com diluente
MP50 e 10 formulações de crioprotetores.
Tabela 4 -
Tabela 5 -
Tabela 6
Efeito do uso do sêmen de jumento congelado
em meio MP50, com diferentes crioprotetores,
utilizado no corpo uterino de jumentas, em dois
momentos pré e pós-ovulação, com dose
inseminante total de 800 x 106 sptz., sem
desglicerolização, sobre a taxa de fertilidade.
Efeito do uso do sêmen de jumento congelado
com glicerol, utilizado no corpo e corno uterino
homolateral à ovulação de jumentas, após
ovulação, com dose inseminante total de 800 x
106 ou 1600 106 sptz., com ou sem
desglicerolização, sobre a taxa de fertilidade.
- Efeito do uso do sêmen de jumento congelado
em meio MP50, utilizado no corpo uterino de
éguas após-ovulação, com dose inseminante
total de 800 x 106 sptz., sem desglicerolização,
sobre a taxa de fertilidade.
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60
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66
viii
Página
Tabela 7 –
Tabela 8 –
Tabela 9 –
Tabela 10 –
Efeito da inseminação artificial em jumentas com
4 mL de sêmen in-natura (G1), 4 mL de diluente
com crioprotetor (G2) e sêmen congelado
(800x106 de sptz - G3) avaliados pela contagem
de polimorfonucleares através de citologia
uterina nos momentos 6 e 24 horas pósinseminação.
Valores médios e desvio padrão obtidos para
contagem de polimorfonucleares em esfregaços
uterinos de jumentas, dos 3 grupos: G1 (sêmen
fresco - 4 mL), G2 (diluente com crioprotetor - 4
mL) e G3 (sêmen congelado - 8 palhetas de 0,5
mL), nos momentos 6 e 24 horas após
inseminação.
Características de peso e altura de animais das
raças Brasileiro e o Poitou
Valores médios dos diâmetros dos cornos
uterinos entre jumentas da raça Brasileira e
potras da raça Brasileira de Hipismo.
71
71
84
85
ix
LISTA DE ANEXOS
Página
Anexo 1 – Formulação do meio diluente de Kenney
105
Anexo 2 – Ajuste do HTM – IVOS – 10 para as realizações das
análises seminais em eqüinos
106
Anexo 3 – Soluções de estoque para utilização na técnica de
fluorescência para avaliação de integridade de
membrana plasmática do espermatozóide
Anexo 4 – Solução de trabalho para coloração fluorescente para
avaliação da integridade de membrana plasmática
do espermatozóide.
Anexo 5 – Diluente MP50
107
107
108
x
RESUMO
O presente trabalho teve os objetivos: avaliar laboratorialmente o sêmen
congelado de asininos através do Hamilton Thorne (HTMA); determinar os
indices de fertilidade do sêmen criopreservado em jumentas e éguas e verificar
a resposta uterina das jumentas perante o sêmen “in-natura”, diluente e
congelado.
No experimento 1 as amostras de sêmen, foram criopreservados em
dois criotubos: meio macrotubo – 2,5 mL (M) ou palheta – 0,5 mL (P) com
diluente MP50 e dez formulações de crioprotetores: 1= 2% DMSO e 2% DF; 2=
3% DF; 3= 2% MF e 2% de Glicerol; 4= 2% dimetil acetamida e 2% de glicerol;
5= 3% metil formamida; 6= 3% de dimetil acetamida; 7= 3% glicerol e 2%
dimetil acetamida; 8= (Specific Patogen Free) 3% glicerol e 2% dimetil
formamida; 9= 3% Dimetil sulfóxido e 2% glicerol; 10= 1% etilieno glicol + 3%
dimetil sulfóxido e 1% dimetil formamida.
As comparações realizadas entre os 2 tipos de envase, meio macrotubo
e palhetas, não demonstraram superioridade (P>0,05) entre si, não havendo
interação com as formulações utilizadas, nos parâmetros analisados.
Para as características de motilidade total foi verificado que os
tratamentos M4, P4 e P6 foram superiores ao M7 e P5 (P<0,05) a avaliação da
motilidade
progressiva
exclusivamente
mostrou
qua
a
formulação
M4
se
distingüiu
do M7 (P<0,05). O estudo da linearidade (LIN), apontou
diferença exclusivamente entre os tratamentos M3 e M6 (P<0,05). Os valores
obtidos de VCL (velocidade real), de VAP (velocidade do trajeto espermático) e
de VSL (velocidade retílinea) proporcionaram resultados semelhantes entre os
tratamentos
(P>0,05).
Na
avaliação
da
membrana
plasmática
pela
11
fluorescência, foi encontrado maior valor para o tratamento P6, que diferiu
significativamente de P5 e M7, além disso o tratamento P4 se diferenciou de
P5 (P<0,05). As demais comparações para esse parâmetro não divergiram
entre si (P>0,05).
No experimento 2, os testes de fertilidade em jumentas, não geraram
gestações apesar das formulações de crioprotetores, o local de deposição do
sêmen (corpo ou intracornual homolateral à ovulação), a inseminação com ou
sem desglicerolização, quantidade de células espermáticas empregadas, o
momento da inseminação e a execução ou não da desglicerolização. Por outro
lado o mesmo protocolo usado em éguas proporcionou 40% de prenhez (4/10).
No experimento 3, as jumentas foram inseminadas com sêmen “in
natura” ou diluente ou sêmen congelado. As avaliações dos três grupos pela
citologia uterina, nos dois momentos estudados (6 e 24 horas), monstraram
que a resposta inflamatória, dentro dos períodos citados, foram semelhantes
independente do elemento agressor.
Pelos resultados laboratoriais, foi possível demonstrar a viabilidade da
substituição
do
glicerol
por
outros
crioprotetores
alternativos,
para
criopreservação do sêmen de jumentos. Embora não tenha resultado em
gestações em jumentas, contudo o mesmo protocolo proporcionou prenhez em
éguas. Foi demonstrado também que a resposta uterina de jumentas foi
semelhante nos três grupos, e revelou que o insucesso nas gestações em
jumentas não deve ser creditado a uma resposta uterina excerbada e/ou
prolongada.
Palavras-chave: Eqüídeo, Sêmen; Criopreservação; Crioprotetores; Citologia
uterina; teste de fertilidade.
12
ABSTRACT
The current paper aimed at conducting laboratoty tests in order to
evaluate the frozen semen of the asinines, determining the fertility rate of
semen cryopreserved in female donkeys and mares and also verifying the
uterine response of female donkeys to the “in natura”, MP50 extender and
frozen semen.
In experiment 1, the semen samples were cryopreserved in two
cryotubes: half macro tube 2.5 mL (M) or pallets – 0.5 mL (P) with MP50
diluting and ten formulations of cryoprotectors: 1= 2% DMSO and 2% DF; 2=
3% DF; 3= 2% MF and 2% of glycerol; 4= 2% dimethyl acetamide and 2% of
glycerol; 5= 3% methyl formamide; 6= 3% of dimethyl acetamide; 7= 3%
glycerol and 2% dimethyl acetamide; 8= (Specific Patogen Free) 3% glycerol
and 2% dimethyl formamide; 9= 3% dimethyl sulfoxide and 2% glycerol; 10= 1%
ethylene glycol + 3% dimethyl sulfoxide and 1% dimethyl formamide.
The comparisons made between the two types of packing, did not show
superiority (P>0.05) between themselves, and there was no interaction with the
used formulations within the analyzed parameters.
Regarding the characteristic total motility, it has been verified that the
M4, P4 and P6 treatments were superior to the M7 and P5 (P<0,05). The
evaluation of the progressive motility showed that the M4 formulation differed
exclusively from the M7 (P<0,05). The linearity study demonstrated difference
particularly between the M3 and M6 treatments (P<0,05). The values of real
velocity, sperm direction velocity and linear velocity did not show similar results
between the treatments (P>0,05). Concerning the evaluation of the plasma
membrane by fluorescence, a higher value was found for the P6 treatment,
13
which differed significantly from the P5 and M7. Moreover, the P4 treatment
was different form the P5 (P<0,05). The other comparisons made within this
parameter did not diverge between themselves (P>0,05).
In experiment 2, the fertility tests in female donkeys did not result in
pregnancy, despite the cryoprotectors formulations, the place where the semen
was inseminated (body or deep uterine to ovulation), insemination with or
without desglicerolization, quantity of sperm cells applied, the insemination
moment and the possible desglicerolization performance. On the other hand,
the same protocol used with mares resulted in 40% of pregnancy (4/10).
In experiment 3, the female donkeys were inseminated with “in natura”
or extender MP50 or frozen semen. The evaluation of the three groups by the
uterine cytology, at the two studied moments (0 e 6 hours), showed that the
responses, within the studied periods, were similar regardless the aggressor
element.
Through the laboratory results, it was possible to demonstrate the
viability of glycerol replacement by other cryoprotectors in order to cryopreserve
the donkeys´ semen. Although it did not result in pregnancy concerning female
donkeys, the same protocol culminated in pregnacy concerning mares.
Furthermore, it has been demonstrated that the female donkeys uterine
response was similar in the three groups. In addition, it has been revealed that
the lack of success in female donkeys pregnancy must not be credited to a long
and exacerbating uterine response.
Key words: Equideo; Semen; Cryopreservation; Cryoprotetors; Uterine
cytology; Fertility tests.
14
1- INTRODUÇÃO:
O uso da inseminação artificial com sêmen congelado é a principal
ferramenta utilizada no melhoramento genético animal pela maioria das
espécies domesticadas, conquanto ainda pouco praticada com os eqüídeos.
Apesar dos resultados envolvendo a congelação de espermatozóides (sptz)
eqüinos ter sido divulgado há muito tempo (Barker & Gandier, 1957), as
pesquisas nessa espécie se intensificaram mais tardiamente.
Embora hoje menos conservadoras que outrora, as dificuldades
impostas pelas associações de criadores, ao uso de sêmen congelado,
transformaram-se em importante barreira para a sua disseminação e em
conseqüência as pesquisas e a expansão técnica se apequenaram (Squires et
al., 1999).
Apesar disto, os estudos sobre o tema, em eqüinos, são significativos
(Papa e Alvarenga, 1984; Neves Neto et al, 1995; Papa et al, 1998; Alvarenga
et al., 1998; Trimeche et al., 1999); todavia os problemas persistem, embora
não sejam exclusivos desta espécie (Holt, 2000). Por este motivo, vários
centros de pesquisa no mundo todo, procuram uma metodologia para saná-los;
conseqüentemente, é compreensível o fato de não haver uma universalmente
aceita para eqüinos, como a existente para bovinos, segundo Samper et al.
(1998).
A indústria eqüina vê nesta busca, a perspectiva de empregar as
tecnologias geradas para maximizar o uso de garanhões, derrubar barreiras
geográficas, eliminar ou diminuir a propagação de doenças sexualmente
transmissíveis e possibilitar o uso de animais já mortos (Squires et al 1999).
15
Segundo Guerra (2003), deve-se destacar que o período atual mostra o
Brasil detentor do terceiro maior rebanho eqüídeo do mundo, cerca de 6
milhões de cabeças, onde as diversas atividades deste segmento do
agronegócio emprega 500 mil pessoas diretamente, mais do que a poderosa
indústria
automobilística;
vemos
ainda
o
uso
cada
vez
maior
das
biotecnologias, incluindo o crescimento do emprego de sêmen congelado.
Uma outra finalidade desta tecnologia é a preservação de material
genético por um inesgotável período de tempo, propiciando a formação de um
banco de germoplasma, conhecido como preservação “ex situ”. (Mariante et al.,
2000).
Algumas raças de asininos, devido a seu abate indiscriminado, e mesmo
a pouca atenção recebida em relação a atividade reprodutiva, estão hoje sob
risco de extinção. Como exemplo temos o Jumento Poitou, com 180
exemplares no mundo e o Jumento Brasileiro com aproximadamente 80
cabeças (Philippe, 1994; Mariante et al., 2000).
Apesar de não terem um número preciso, Mariante et al. (2000)
relataram que a raça jumento Brasileiro encontra-se em risco de extinção, com
seu maior núcleo criatório situado no Pólo Regional de Desenvolvimento
Tecnológico dos Agronegócios da Alta Mogiana em Colina/SP – APTA
(PRDTAAM), antigo Posto de Eqüideocultura de Colina/SP. Os autores
apontaram ainda que, o emprego da criopreservação dos espermatozóides,
constitui-se em forte aliado para sua preservação e expansão.
Outro fato importante é que, segundo trabalho de Dos Santos (1994),
embora o produto proveniente do cruzamento entre jumento e égua, seja
bastante desejável no meio rural, pois reúne as melhores características destas
16
espécies em um único animal (mula ou burro), torna-se difícil sua obtenção de
forma natural, pois sua proximidade genética não impede a aversão mútua.
McDonnel (1998) e Lodi et al. (1995) esclarecem que em decorrência do
comportamento sexual e reprodutivo das éguas serem diferentes daquele visto
em jumentas, o índice de fertilidade de cobertura a pasto é menor quando um
jumento é usado para acasalar éguas, que o encontrado em jumentas. Tal
inconveniente pode ser contornado com o uso da Inseminação Artificial (IA).
Os poucos trabalhos encontrados, em asininos, realizaram somente
testes laboratoriais, (Polge e Minotakis, 1964; Arruda et al., 1989; Dos Santos,
1994; Silva et al., 1997), ou fizeram uso do teste de fertilidade somente em
éguas (Vieira et al., 1985; Arruda et al., 1986; Papa et al., 1999) ou realizaram
em condições diferentes (animais e país) da nossa (Trimeche et al., 1998),
necessitando, portanto, que alguns pontos sejam esclarecidos.
Por estas razões o presente estudo teve como objetivos: 1) Testar
formulações de crioprotetores no diluente MP-50; 2) Avaliar o índice de
fertilidade em jumentas e éguas e 3) Avaliar a resposta inflamatória uterina de
asininos frente à agressão espermática.
17
2- REVISÃO DA LITERATURA
Conforme relata Mariante et al. (2002), por cinco séculos houve uma
seleção natural das várias espécies animais trazidas pelos portugueses logo do
descobrimento do Brasil, e que hoje se reflete em animais adaptados nos
diversos tipos de meio ambiente do nosso país. Informam ainda que raças
exóticas começaram a ser importadas no início do século passado e embora
fossem mais produtivas, não possuíam resistência às doenças e aos parasitas
do novo ambiente, como os animais “nativos”. Apesar desta adversidade, aos
poucos estas novas raças extenderam seu domínio e tomaram o lugar dos
animais já existentes, deixando alguns em risco de extinção.
Como exemplar desta saga, os asininos da raça Brasileira que tiveram
sua origem em jumentos importados da Itália quee possuíam alto grau de
sangue de animais africanos, no Brasil foram acasalados com jumentos vindos
de Portugal e suas colônias africanas. Como núcleo importante na criação
destes animais, destacaram-se os do município de Barretos, Colina, Franca e
Batatais. Sua formação teve por base animais de porte forte, ágeis e
resistentes, tendo sido conhecidos inicialmente como jumento Paulista
(Mariante et al., 2000).
Os mesmos autores destacam que em 1939 foi criada a associação de
criadores que, embora com curta existência, estabeleceu o padrão racial e
passou a denominá-lo de jumento Brasileiro. Em decorrência da mecanização
do campo, ao longo do tempo sua importância no campo diminuiu o que
contribuiu para reduzir bastante seu número. Felizmente um núcleo de criação
destes animais puros, com baixa consangüinidade está localizado na sede do
PRDTAAM.
18
Alguns trabalhos executados com esta espécie revelaram características
peculiares que os tornam interessantes, apontando-os como candidatos a
modelos biológicos especificamente na área da reprodução animal (Henry et
al., 1991; Trimeche et al., 1998; Vendramini et al., 1998; Oliveira et al, 2002).
Comizzoli et al. (2000) destacaram algumas técnicas de reprodução
assistida (criopreservação de gametas, inseminação artificial, transferência de
embriões e fecundação “in vitro”) como ferramentas importantes que permitem
a propagação das espécies em risco de extinção, tanto selvagens, como
domesticadas. Os pesquisadores sugerem que estas técnicas são as melhores
escolhas para o nascimento de vários produtos de ascendentes escolhidos,
evitando-se a consangüinidade.
Henson (1992) cita que o objetivo da conservação animal é manter a
biodiversidade, sendo que a perda de uma única espécie pode afetar o
funcionamento do ecossitema inteiro.
O uso de sêmen congelado, como uma das biotecnologias mais antigas,
tem se mostrado um forte aliado no aumento da produtividade animal e na
preservação animal (banco de germoplasma).
Desde que Polge et al. (1949) demonstraram a possibilidade de manter
o movimento espermático de garanhões após sua descongelação, houve um
interesse ao longo dos anos, renovado mais recentemente pelo acréscimo no
número de associações que permitem seu uso. Amann et al. (1987) informaram
que as restrições a sua utilização decorrem da falta de homogenidade entre as
resposta dos garanhões (indivíduos), bem como entre os ejaculados deles
próprios, sendo um dos fatores mais importantes na determinação da taxa de
prenhez de éguas. Os espermatozóides eqüinos são menos tolerantes ao
19
processo de congelação/descongelação que os bovinos e sofrem mais lesões
neste ciclo a ponto de reduzir sua viabilidade no trato reprodutivo da fêmea
(Samper et al., 1998; Squires et al., 1999).
Embora a maior parte da literatura enfoque a criopreservação das
células espermáticas somente durante este processo, os espermatozóides são
passíveis de lesões físicas e/ou estruturais antes, durante e após a
criopreservação (Graham, 1998). Apesar dos espermatozóides não disporem
de vários componentes celulares como o retículo endoplasmático, lisossomas,
e boa parte de seu citoplasma, o restante é ainda muito complexo, possuindo
múltiplos compartimentos celulares, membranas e estruturas subcelulares. Um
outro detalhe de particular interesse para os criobiologistas, é o fato que o DNA
destas células está condensado a ponto de impedir que seus genes se
expressem, impossibilitando-as de realizar um auto-reparo a qualquer dano
sofrido (Graham, 1998).
2.1 - Bases da criopreservação espermática
De acordo com Arruda (2000), para os espermatozóides sobreviverem à
criopreservação é necessário que estas células estejam em um meio que lhes
confira nutrientes e proteção físico-químicas, associado a uma curva ótima de
congelação.
Para serem ainda férteis, os espermatozóides deverão ultrapassar todas
as dificuldades impostas, preservando as seguintes características: morfologia
aceitável, metabolismo para produção de energia, motilidade progressiva,
membranas plasmáticas e acrossomal estabilizadas e a presença de enzimas
para fertilização, segundo Squires et al., (1999). A célula espermática é
20
revestida mais externamente pela membrana plasmática (MP) que é composta
de uma camada bimolecular de lipídios (fosfolipídeos, glicolipídios e colesterol),
e proteínas. É metabolicamente ativa e devido a sua composição é
impermeável a maioria das moléculas. Tem um importante papel de isolar a
célula do meio exterior e regula reações com o meio que a cerca, controlando o
fluxo de água e eletrólitos (Cooper, 1996). Por ser a estrutura mais lesada nos
processos de congelação celular, a membrana plasmática recebeu vários
estudos que permitiram seu melhor conhecimento.
As proteínas entremeadas na bicamada lipídica mediam a maioria das
funções da membrana (transporte específico de moléculas). O posicionamento
delas servem como pontos de conexão da membrana ao citoesqueleto e/ou à
matrix extracelular ou célula adjacente, enquanto outras proteínas servem de
receptores para detectar e traduzir sinais químicos do ambiente celular (Alberts
et al., 1994).
Atualmente, o estado físico da biomembrana tem tomado a atenção dos
pesquisadores. O modelo de mosaico-fluído apresenta um dinamismo de suas
estruturas, nos quais os componentes são móveis, permitindo uma série de
interações transitórias ou semipermanentes, tornando as membranas celulares
estruturas dinâmicas fluidas e possibilitando uma movimentação de moléculas
no plano da membrana (Karp, 1996).
Parks, (1997) observou que os espermatozóides dos mamíferos são
muito sensíveis ao resfriamento da temperatura corporal ao ponto de
congelamento da água. Os efeitos do choque frio afetam a permeabilidade da
membrana. Sua etiologia envolve danos na estrutura celular e função
metabólica, provavelmente causada por alterações dos constituintes da
21
membrana. O mesmo autor descreve que o decréscimo da temperatura causa
uma fase de transição termotrópica nas membranas dos espermatozóides, que
passam da fase líquida cristalina para a fase de gel, resultando em uma
estrutura mais rígida devido ao rearranjo dos componentes da biomembrana e
a separação dos lipídios dentro do mesmo plano. Esta migração pode criar
microdomínios, modificando as proteínas circundantes, levando a uma
alteração da permeabilidade da membrana à água e solutos, além disso foi
verificado que o grau da extensão desta injúria, dependerá da relação
colesterol/fosfolipídio e proteína/fosfolipídio e também do grau de saturação da
cadeia de hidrocarbonos.
Devido a diferenças na composição dos contituintes da membrana, o
efeito do resfriamento entre as espécies não é o mesmo. As células
espermáticas do cavalo e carneiro são muito sensíveis, enquanto que as do
homem e coelho são mais resistentes (Parks, 1997; Darin-Bennett et al., 1977).
O efeito do choque pode ser prevenido ou atenuado através do controle
da taxa de resfriamento, ou adicionando compostos ao diluente seminal, tais
como gema de ovo ou leite (Parks, 1997).
A queda da temperatura até 4ºC reduz a atividade metabólica celular e
permite prolongar sua vida. Contudo, devido ao espermatozóide possuir uma
limitada atividade biosintética e depender principalmente dos processos
catabólicos, sua atividade metabólica restante o direciona à morte. Para cessar
o processo metabólico há a necessidade de abaixar a temperatura a –130ºC,
onde as reações químicas não se processam (Mazur, 1990).
A integridade estrutural da membrana plasmática é determinada pela
temperatura e pela solução na qual ela está contida; na temperatura corporal a
22
membrana está fluída. Essa característica é decorrente da ampla mobilidade
lateral dos fosfolipídeos, porém não possuem a mesma facilidade de se
movimentar entre as faces externa e interna (Amman e Graham, 1993; Cooper,
1996; Graham, 1998).
Para a realização da criopreservação é imposto aos espermatozóides,
entre 19 ºC e 5ºC, o primeiro estresse térmico. Nesta faixa de temperatura a
MP passa por uma fase de transição, do estado líquido cristalino para o de gel,
podendo
ocorrer
perda
de
movimentos
progressivos,
alterações
nas
membranas plasmática e acrossomal, sendo o primeiro desafio para estas
células (Watson, 1981).
Quando a temperatura do meio atinge entre –5ºC e –10ºC, cristais de
gelo se formam, a partir da água pura no meio extracelular, porém protegido
pela membrana plasmática o meio intra-celular não se congela, (super
refrigerado). Segundo Mazur (1984), o ponto de congelação de uma solução é
determinado pela concentração de solutos que ela participa. Em decorrência, a
água do interior da célula flui por osmose para o meio externo e também se
congela. Os outros elementos do meio extracelular (sais, proteínas e gorduras),
permanecem na porção não congelada (Amman e Graham, 1993; Holt, 2000).
Com a temperatura diminuindo, mais moléculas de água se cristalizam,
resultando em uma concentração maior de solutos na fração não congelada,
que formarão os “canais não congelados” (Squires et al. 1999).
Mazur (1984) verificou que ao congelar os espermatozóides em
nitrogênio líquido (-196o C), os espermatozóides residem em canais de solução
não congelados. Sendo que Amann et al. (1987) afirmam que somente as
células localizadas neste local sobreviverão ao processo da criopreservação.
23
De acordo com Mazur (1984) a adição de substâncias crioprotetoras é
necessária para aumentar o volume dos “canais não congelados” pois danos
celulares ocorrem quando esta fração, não congelada, situa-se abaixo de 812% do volume total.
A taxa de congelação também pode causar lesões nas células. Segundo
Mazur (1990), caso a célula sofra uma queda de temperatura muito rápida, que
não
permita
a
sua
desidratação,
ocorrerá
a
congelação
intracelular
(macrocristais), lesando seu interior. Se essa congelação for muito lenta, estas
células poderão se desidratar excessivamente em decorrência do meio exterior
muito
concentrado,
não
formando
grandes
cristais
intracelular,
mas
desencadeando um desarranjo morfofuncional pela desidratação intracelular
exagerada.
Da mesma forma a descongelação poderá causar sérios inconvenientes
que deixarão esta célula com sua sobrevivência e/ou funcionamento
comprometidos. Squires et al. (1999), indica que a taxa de descongelação deve
ser o mesmo que a da congelação (lenta/lenta ou rápida/rápida).
2.2 - Principais crioprotetores utilizados para eqüídeos
A procura por substâncias com propriedades crioprotetoras tem sido
motivo de pesquisa de vários criobilogistas. Essa busca tem sido impulsionada
pelo fato de somente uma parte dos garanhões apresentarem sêmen com uma
boa resposta à congelação, com os meios utilizados, conforme atestam Arruda
et al. (1989a) e Alvarenga et al. (2000). Ao longo de vários anos uma gama de
24
substâncias tem sido utilizadas para fornecer proteção adequada às células
espermáticas durante a criopreservação.
Ashwood-Smith (1987) e Keith, (1998) afirmaram que um bom
crioprotetor deve possuir baixo peso molecular, com alta solubilidade em água
e baixa toxicidade celular. Observando a literatura é possível encontrar uma
divisão básica que agrega os crioprotetores em penetrantes e não penetrantes.
Ashwood-Smith (1987) elencou uma série de compostos penetrantes, da
família dos álcoois (etanol, etileno glicol, glicerol, metanol, entre outros), das
amidas (acetamida, formamida, lactamida entre outras) e o dimetil sulfóxido
(DMSO) com características crioprotetoras.
O mecanismo de ação dos crioprotetores não está bem compreendido.
Watson (1981) sugere que estas substâncias atuem através de propriedade
coligativa com a água. Uma propriedade coligativa é a depressão do ponto de
congelação de uma solução. Estes compostos modificam a característica da
molécula da água, reduzindo a formação de cristais de gelo atuando como
solvente e diminuindo a concentração de solutos no meio externo.
Exemplificando, uma solução que contenha glicerol, disporá de mais água não
congelada do que outra sem o glicerol, aumentando o volume dos canais de
solventes não congelados, reduzindo a concentração de sais das porções não
congeladas (Dalimata et al. 1997; Mazur 1980). Além disto, estas substâncias
atuam na membrana celular estabilizando o complexo: água, lipídeo e proteína
(Rowe 1966).
25
2.2.1 – Crioprotetores penetrantes
a) GLICEROL
Embora o glicerol seja um importante elemento e o mais utilizado
protetor na congelação do sêmen eqüídeo (Martim et al., 1979; Papa et al.,
1999) possue, ao lado da sua função atenuadora de criolesões celulares,
conhecidos efeitos tóxicos em espermatozóides.
Pesquisas têm apontado prejuízos à fertilidade quando é usado sêmen
criopreservado eqüino com glicerol. Elas reportaram lesões tais como:
desnaturação proteica, alteração na interação e indução da proteína-livre da
membrana; mudanças de eventos citoplasmáticos por causa do aumento de
viscosidade intracelular, alteração direta da membrana plasmática (Demick et
al.; 1976; Hamerstedt e Graham; 1992). Landim e Alvarenga et al. (1993)
também detectaram toxidez para embriões tratados para congelamento, que
lesaram organelas intracelulares como mitocôndria.
Pace & Sullivan (1975) também observaram que as taxas de prenhez
por égua foram mais altas para as inseminadas com sêmen diluído sem glicerol
(50%) do que sêmen diluído contendo 7% de glicerol (35%). Um decréscimo
acentuado da fertilidade de sêmen de garanhões refrigerados em meio diluente
contendo glicerol por um período de duas horas, foi evidenciado por Demick et
al. (1976).
No entanto outros autores obtiveram boas taxas de gestações como
Martin et al. (1979) 63%; Loomis et al (1983) 51,3%; Papa et al. (1999) 66% e
Dell’Aqua (2000) 50%, através de sêmen criopreservado com glicerol.
26
A estrutura do glicerol possue 3 carbonos e grupos hidroxilas que lhe
capacita a se ligar com o hidrogênio das moléculas de água, além de
possibilitar a estabilização da membrana celular (Nash, 1966). Kundu et al.
2000) porém, destacaram que os radicais hidroxilas efetuam ligações entre si
reduzindo a oportunidade das ligações com as moléculas da água, diminuindo
sua efetividade.
b) DIMETILSULFÓXIDO
O dimetilsulfóxido (DMSO) pode realizar ligações de hidrogênio com
grupos OH através do seu radical sulfóxido, levando o ponto de congelação da
solução mais abaixo (Murthy, 1998). Esta substância possue a característica de
se ligar com os grupos fosfatos da biomembrana, conferindo uma proteção a
baixas temperaturas (Kundu et al., 2000).
Chenier et al. (1998) realizaram a comparação entre alguns crioprotetores:
(glicerol, etilenoglicol, dietilenoglicol, propilenoglicol e DMSO), concluíram que
que as amostras com etilenoglicol apresentaram motilidade progressiva menor
que aquelas com glicerol ou DMSO. Os autores fizeram uso de sêmen
criopreservado com DMSO e alcançaram 78% de fertilidade.
Landim-Alvarenga et al. (2001), relataram que o DMSO na concentração
de 1,0M foi menos efetivo (p<0,05) em relação ao glicerol (0,55M) nos
parâmetros de motilidade total e progressiva computadorizada (25,8% e 12,6%,
42,1% e 23,1%, respectivamente) e resultados similares foram observados em
relação à viabilidade celular (citometria de fluxo) e integridade acrossomal
(microscopia eletrônica de transmissão).
27
c) ETILENOGLICOL
É classificado como álcool, possui quatro pares de elétrons isolados
pelos quais pode efetuar ligações com hidrogênio ou doar dois hidrogênios,
sendo possível fazer ligações com a membrana celular (Keith, 1998; Kundu,
2000)
Trabalhando com sêmen eqüino, Alvarenga et al. (2000a) avaliaram o
uso do glicerol (5%), etilenoglicol a 5% e 10% e etilenoglicol (2%) associado ao
glicerol (3%), verificaram que a motilidade foi, respectivamente 34%, 36,5%,
29,25% e 34,7%, com significância favorável para o etilenoglicol 5% (P<0,05).
Resultados laboratoriais semelhantes obtidos para sêmen eqüino
congelado com etilenoglicol isolado ou associado ao glicerol em concentrações
diversas, foram demonstrados por Cottorello et al (2001). Neves Neto et al.
(1995) verificaram melhores resultados para fertilidade quando usaram sêmen
eqüino criopreservado com etilenoglicol em relação ao glicerol.
d) AMIDAS
O uso de amidas é pequeno em eqüinos, mas seus resultados mostramse promissores (Alvarenga et al. 2000b; Medeiros et al. 2000; Gomes et al.
2002).
As amidas possuem dois grupos funcionais: as aminas (com nitrogênio)
e o outro grupo (ácido carboxílico – com oxigênio). Possuem três pontos para
se ligarem ao hidrogênio da água, metade do que apresenta o glicerol. No
entanto por serem mais solúveis em água e possuírem menor viscosidade que
o glicerol atravessam a membrana com maior velocidade que o glicerol,
28
acarretando menos lesões à biomembrana (Nash, 1966; Ball & Vo, 2001a,b). A
adição do grupo metil à molécula de acetamida e formamida, tornaram estas
substâncias melhores crioprotetoras.
Medeiros (2000) usou sêmen congelado em dimetilformamida de
eqüinos e alcançou 40% de gestação, enquanto que as amostras processadas
em glicerol 5% não geraram prenhezes.
Gomes et al. (2002) ao usarem dimetilformamida, metilformamida,
dimetilacetamida e glicerol verificaram que a motilidade total e progressiva
foram mais expresivas para as células espermáticas conservadas pela
dimetilformamida.
Vidament et al. (2002) encontraram 46%, 58% e 50% de fertilidade
quando fizeram uso de sêmen criopreservado com glicerol (2% e 3%) ou com
dimetilformamida (2%) em éguas.
Sêmen eqüino congelado em acetamida (5%) por Snoeck et al. (2002)
gerou 23,3% (7/30) de prenhez, sinalizando aos autores que mais estudos
necessitam serem realizados para aclarar os baixos níveis de fertilidade.
Os valores verificados por Graham (2000) para motilidade quando usou
a concentração de 0,55M para os crioprotetores glicerol, acetamida,
metilacetamida, formamida, metilformamida e dimetilformamida, foram maiores
para as células espermáticas congeladas em glicerol (P<0,05). Em uma
segunda fase experimental ele alterou as concentrações para 0,6M e 0,9M das
seguintes
substâncias:
glicerol,
metilformamida,
dimetilformamida
e
etilenoglicol que proporcionou valores melhores quando a concentração foi
maior, sendo que somente houve diferença significativa para as amostras
protegidas pelo etilenoglicol a 0,6M que obtve a menor motilidade.
29
Segundo Dalimata et al. (1997) o uso combinado de crioprotetores
propicia uma melhor crioproteção aos espermatozóides do que emprego de um
deles isolado, aparentando possuírem efeitos distintos e somatórios,
favorecendo uma maior proteção celular. Por outro lado deve ser destacado
que a presença do crioprotetor nos diluentes está limitada ao equilíbrio entre
sua proteção e toxidez (Squires et al. 1999).
2.2.2 - NÃO PENETRANTES
Incluem-se nesta categoria os açúcares (lactose, frutose, rafinose ou
threalose), polímeros sintéticos (metil celulose). Esta categoria protege as
células basicamente através de efeitos osmóticos. As células em suspensão
em um meio hipertônico perdem seu conteúdo de água. Desta forma diminuem
a possibilidade de formação de cristais dentro da célula. Estes componentes
agem como solutos ou colóides, não servindo como solventes (Graham, 1998).
Neste grupo é citado algumas substâncias como aditivos dos
extensores, para se evitar danos celulares na fase de resfriamento, prevenção
do choque-térmico. Os diluidores utilizados para criopreservação do sêmen
eqüino possuem lipídios ou moléculas lipofílicas, presentes na gema de ovo
(GO) e/ou leite desnatado. Sua função se deve à ação de moléculas de baixa
densidade, em particular os fosfolipídeos, que atuam estabilizando a MP da
célula do espermatozóides, embora não se tenha detectado interação entre
estes fosfolipídeos e membranas do espermatozóides. Outro elemento
incorporado é o etilenodiaminotetracético (EDTA), que pode se ligar ao cálcio e
magnésio, reduzindo a sua entrada na célula, visto que o seu excesso provoca
lesões celulares, durante o resfriamento (Arruda, 2000). O OEP (orvus-Es
30
paste),
um
agente
emulsificante
de
gordura
que
disponibiliza
mais
fosfolipídeos, reforçando a proteção à MP (Martin et al., 1979).
2.3 - Principais diluentes e crioprotetores utilizados para jumentos
É conhecido que, para a congelação dos espermatozóides, é preciso
utilizar diluidores adequados, pois a sobrevivência destas células somente com
o plasma seminal torna-se impróprio. Segundo Snoek (2003), estes extensores
possuem em sua constituição básica: a) solventes - diluindo outros
componentes do meio; b) tampões e substâncias não iônicas – que atuam na
manutenção da osmolaridade e pH do meio; c) macromoléculas da gema do
ovo e/ou leite – protegem do choque térmico; d) carboidratos – fonte de energia
das células; e) antibióticos – cerceando o crescimento bacteriano; f)
detergentes – favorece melhor interação entre os lipídios do meio e a
membrana plasmática, aperfeiçoando sua estabilidade; g) quelantes – ligam-se
ao cálcio e ao magnésio limitando seus movimentos pela membrana e h)
crioprotetores penetrantes ou intracelulares.
Os meios diluentes para congelação, utilizados com sucesso em
jumento, são o Merck-gema (Vieira et al., 1985), Arruda et al. (1986 e 1989),
Silva et al. (1997), T2-94 (Trimeche et al. 1996, 1997, 1998) e o M9H (Papa et
al., 1999).
Vieira et al. (1985) utilizaram o extensor Merck-gema para congelarem
em palhetas de 0,5 mL sêmen de Jumentos na concentração de 250 x106
espermatozóides/palheta. A avaliação da motilidade progressiva alcançou 40%.
Foram usados 20 ciclos estrais e alcançaram 6 prenhezes (33%) em éguas.
31
Arruda et al (1986) fizeram uso do mesmo extensor para congelar
sêmen de jumentos (250 x106 espermatozóides/palheta), em palhetas e após
16 ciclos estrais de éguas alcançaram 44% de gestações. Este grupo em 1989
fez uso do mesmo diluente e após avaliação laboratorial encontraram 44% de
motilidade progressiva para sêmen de jumento após descongelação.
Silva et al. (1997) congelaram sêmen de jumentos, na concentração de
100 x106 espermatozóides/mL, em dois criotubos também utilizando Merckgema.
Trimeche et al. (1996), testaram concentrações de glutamina (GLU) em
meio INRA 82, e através da análise computadorizada do sêmen, determinaram
que a melhor concentração de GLU foi 80 mM. Salientaram que a associação
da GLU e glicerol foi necessário para um melhor resultado, indicando que
possuem mecanismos de criopreservação diferentes.
Ao compararem as gemas dos ovos de galinha (GOG) e codorna (GOC),
Trimeche et al. (1997) encontraram que a composição geral era igual, embora
a
GOC
possuía
significativamente
mais
phosphatidylcholina,
menos
phosphatidylethanolamine e uma menor taxa de ácidos polinsaturados :
saturados que a GOG. Utilizaram a GOC ou de GOG, no meio INRA 82,
processaram o sêmen de jumento Poitou para congelação, acompanhada da
análise computadorizada do sêmen. Os resultados foram superiores para o
sêmen proveniente do meio com GOC. Os autores creditam este fato às
características da GOC.
Papa et al. (1999) fizeram uso de sêmen de jumento congelado em
M9H, composto a base de Merk-gema (Martin et al., 1979), adicionado de meio
32
a base de leite desnatado e glicose (Kenney et al., 1975) acrescido de Basal
Medium Eagle (BME).
Deve-se ressaltar que o comportamento do sêmen eqüino durante a
congelação varia de animal para animal, não possuindo uniformidade de
resultados, como confirmam os testes laboratoriais efetuados por Arruda et al.
(2003), que ao criopreservarem sêmen eqüino em Merck-gema com glicerol
(5%) ou etilenoglicol (5%), ou em INRA82 com as mesmas concentrações de
crioprotetores ou em leite desnatado com os mesmos crioprotetores e
concentrações. Verificaram que embora houvessem diferenças entre os
crioprotetores e diluentes, também detectaram influência de garanhões,
diluidores e interação entre estes dois elementos. Os autores finalizam
sugerindo que seja empregado diversos diluidores e crioprotetores para cada
animal, associado a bateria de testes, antes de adotar um programa de
congelação.
2.4 - DESGLICEROLIZAÇÃO
O fato do meio uterino possuir valores isosmóticos ao do plasma seminal
“in natura”, pressupõe que o uso do sêmen criopreservado anisosmótico, ao
ser depositado na fêmea, sua membrana plasmática sofreria danos causados
pelo choque osmótico decorrente do abrupto influxo de água no interior da
célula espermática para equilibrar os ambientes celulares externo e interno.
Alguns pesquisadores têm chamado a atenção para a remoção do
glicerol após a descongelação. Ball (2001), estudou a retirada do GLI de
33
espermatozóides dos eqüinos, em uma ou em várias etapas. O autor analisou
a motilidade e a integridade das membranas e encontrou que quando o
espermatozóides era abruptamente retornado em meio isotônico (1 passo),
houve redução (P<0,01) da percentagem de vivos e acrossoma íntegro,
quando comparado às células com várias passagens (7). Salienta o autor que a
rápida retirada do GLI em meio isosmótico parece ser o aspecto mais nocivo do
estresse osmótico.
Vidament et al. (2001), fizeram a retirada do GLI através de 1 ou vários
passos (diluições fixas) e não encontrou diferença significativa, 38% X 36%
respectivamente, entre os métodos estudados, para a característica motilidade
em sêmen congelado de garanhões.
Vieira et al. (1985) inseminaram 9 éguas, com 4 palhetas de sêmen de
jumento diluídas em 10 mL (1:5) de extensor anisosmótico, para alcançarem a
concentração final de 400 a 500 x106 células viáveis que proporcionaram
66,7% de éguas gestantes.
Dez éguas foram trabalhadas por Arruda et al. (1986) que as
inseminaram com 400 a 500 x106 espermatozóides viáveis, de jumento,
previamente desglicerolizados em 10 mL de meio sem crioprotetor (1:5) e
alcançaram 70% de animais prenhes.
Há também o relato de Trimeche et al. (1998) que dividiram as jumentas
em dois grupos. O protocolo utilizado pelos autores destaca que para cada
animal, vinte palhetas foram descongeladas e usadas: em um grupo o sêmen,
pré inseminação, foi diluído em 10 mL de extensor desprovido de glicerol (1:1);
no grupo restante inseminaram com a mesma concentração espermática sem a
34
desglicerolização. Obtendo resultado positivo somente no grupo que recebeu
sêmen desglicerolizado onde 62% (8/13) das jumentas ficaram gestantes.
2.5 - Avaliação do sêmen
a) Laboratorial
Como alternativa para a análise ótica do sêmen tem sido utilizada a
avaliação computadorizada. Um exemplo destes aparelhos é o Hamilton Thorn
(HTMA), que consiste de um microscópio com contraste de fase, um
digitalizador de imagens e um computador que além das mensurações da
motilidade
total
e
progressiva
dos
espermatozóides
avalia
outras
características como a linearidade, velocidades espermáticas, percentagem de
espermatozóides
rápidos
deslocamento,
lateral
da
cabeça
dos
espermatozóides entre outras (Jasko et al., 1992).
A avaliação computadorizada do sêmen vem sendo usada por cientistas
pois
permite
que
várias
características
possam
ser
minuciosamente
observadas de forma mais precisa que a análise ótica subjetiva (Moses et al.
1995). Embora limitado, a
avaliação da motilidade é um parâmetro útil da
viabilidade espermática, sendo que o emprego do analisador computadorizado
torna-se uma opção mais segura para a determinação das características de
motilidade e trajetórias individuais do sêmen eqüino (Varner, 1991).
Ferreira (2000) quando fez uso da análise computadorizada do sêmen
(HTMA) citou que alguns cuidados devem ser respeitados para evitar falhas,
como concentração espermática adequada para que não haja intersecções das
trajetórias espermáticas; sendo útil se proceder uma diluição com extensores,
35
cujas partículas necessitam ser menores que as células espermáticas, para
que não as confundam com espermatozóides parados. Afirmou após a análise
de sêmen eqüino congelado em vários diluentes, que a técnica permitiu um
criterioso e fiel estudo das amostras testadas.
b) Avaliação da Integridade da membrana plasmática:
O diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) e o iodeto de propídio (IP)
são empregados para avaliarem a integridade da membrana plasmática. O
princípio desta técnica está na hidrólise do CFDA dentro da célula por
esterases inespecíficas, transformando-o em carboxifluoresceína livre que fica
retida no interior da célula pela biomembrana íntegra, deixando a célula com a
coloração verde. O IP possui afinidade pelo DNA. Esta substância não
consegue ultrapassar a membrana íntegra que lhe é impermeável. Sua
penetração torna-se possível somente quando a membrana está lesada, assim
esta sonda se ligará ao DNA celular e o tingirá de vermelho. Assim a célula
corada integralmente de verde possuirá a MP íntegra (Harrison & Vickers,
1990; Zúccari, 1998).
b) Reação inflamatória uterina
A endometrite é considerada uma das principais causas de infertilidade
em éguas podendo influir negativamente nos índices de fertilidade, trazendo
sérios impactos na “indústria eqüina”. Como relatam Fumuso et al. (2003) as
causas são variadas: a) endometrite aguda após cobertura ou associada a
doenças
venéreas;
b)
endometrite
infecciosa
crônica;
c)
endometrite
36
persistente
pós-cobertura
e
d)
endometrite
degenerativa
crônica
(endometriose).
O quadro agudo desenvolvido pós-cobertura está caracterizada por um
afluxo de células de defesa, principalmente os neutrófilos para o lumen uterino.
Trata-se de um mecanismo fisiológico que desempenha o papel de “limpeza”,
retirando o excesso de células (espermáticas e bactérias), além de plasma
seminal oriundos do coito ou inseminação realizada. (Katila, 2001; Le Blanc et
al. 1998).
Conforme Reilas (2001) antes da implantação e placentação, o embrião
é dependente da nutrição histotrófica (secreções do lumen uterino) e um meio
uterino impróprio é importante causa de mortalidade embrionária, que possui
uma alta incidência em eqüinos.
Uma forma rápida e fácil de detectar a presença e grau da inflamação
uterina é através da citologia uterina pela presença de polimorfos nucleares
(PMN) no esfregaço (Wingfield Digby, 1978; Reilas, 2001).
Dell’Aqua Jr. et al. (2003) inseminaram 30 éguas e nas amostras de
citologia uterina colhidas duas horas após, não encontraram diferenças entre
os animais que receberam ou não, plasma seminal. Os autores salientaram
que o plasma semimal não evitou a reação inflamatória.
Reilas (2001) encontrou alta resposta neutrofílica uterina, sendo que os
valores maiores foram para as amostras de lavado uterino provenientes dos
animais que receberam sêmen congelado e 10 mL de sêmen fresco (P>0,05),
enquanto
que
os
animais
infundidos
com
Merck-gema
sem
células
espermáticas diferiram (P<0,001) dos grupos anteriores.
37
O mecanismo desencadeador das contrações uterinas que auxiliam na
drenagem uterina, encontra-se nos hormônios (oxitocina e prostaglandina)
presentes no ejaculado dos garanhões (Watson et al. 1999).
Dados de Kotilainen et al. (1994) com sêmen congelado, sugerem o uso
cada vez menor das doses inseminantes. Estes autores apresentaram
resultados que demonstraram o aumento da resposta uterina (PMN) ao se
elevar a concentração celular em um mesmo volume empregado. Por outro
lado os estudos de Nikolopoulos & Watson (2000) informaram que a
percentagem de PMN foi maior quando éguas foram inseminadas com 2 X 109
espermatozóides quando comparadas ao grupo trabalhado com 20 x109
espermatozóides em um mesmo volume. Estes resultados aparentemente
conflitantes podem ser explicados, baseado na eficiência do animal em debelar
a inflamação. Baseado em Katila et al. (1995) a maior contagem de PMN
ocorre cerca de 8 horas após a ofensa, sendo que 48 horas depois poucos
neutrófilos são encontrados em fêmeas normais. Kotilainen et al. (1994)
realizou a colheita das amostras após as 6 horas (cerca do pico de resposta),
enquanto Nikolopoulos e Watson (2000) a fizeram 48 horas após a
Inseminação artificial. É possível que a forte reação inflamatória do pico (animal
competente),
tenha eliminado as células e outros contaminantes tão
eficazmente, que somente traços desta reação tenha permanecido 48 horas
após.
38
3. MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo foi desenvolvido em três etapas, sendo a primeira
realizada no Departamento de Reprodução Animal e Radiologia VeterináriaFMVZ-UNESP-Botucatu-SP através das avaliações laboratoriais do sêmen
processado para criopreservação com o diluidor MP50 (Papa et al. 2002), no
qual foram usadas associação de dez (10) formulações de crioprotetores: 1=
2% dimetil sulfóxido (DMSO) e 2% dimetil formamida (DF); 2= 3% dimetil
formamida (DF); 3= 2% metil formamida (MF) e 2% de Glicerol (GLI); 4= 2%
dimetil acetamida (DA) e 2% de glicerol (GLI); 5= 3% metil formamida (MF); 6=
3% de dimetil acetamida (DA); 7= 3% glicerol (GLI) e 2% dimetil acetamida
(DA); 8= (Specific Patogen Free) 3% glicerol (GLI) e 2% dimetil acetamida
(DA); 9= 3% dimetil sulfóxido (DMSO) e 2% glicerol (GLI); 10= 1% etilieno glicol
(EG) + 3% dimetil sulfóxido (DMSO) e 1% dimetil formamida (DF) em dois (2)
tipos de envase, meio macro-tubo (2,5 mL) e palheta (0,5 mL).
Na etapa seguinte, foram executados os testes de fertilidade a campo
nas dependências do Pólo Regional de Desenvolvimento Tecnológico dos
Agronegócios da Alta Mogiana (PRDTAAM)–Colina/SP (Latitude 220S e
Longitude 480W) e no Centro de Reprodução e Biotecnologia Eqüina
(CERBEQ), situado na fazenda experimental Lajeado, Botucatu/SP.
A terceira etapa foi realizada no PRDTAAM no qual monitorou-se a
resposta inflamatória das jumentas após a inseminação artificial por meio da
citologia uterina.
Antes da execução dessas etapas foi realizado um ensaio piloto, visando
a avaliação laboratorial dos diluentes e crioprotetores com 4 jumentos, o qual
revelou similaridade dos resultados analisados, evidenciando que não havia
39
influência do elemento animal nos parâmetros analisados. Com base nesses
dados e no delineamento do trabalho em relação ao teste de fertilidade a
campo, optou-se por utilizar o único jumento com histórico positivo neste teste,
para realização das demais etapas.
3.1. Primeiro Experimento – Testes laboratoriais e processamento das
amostras para a criopreservação
3.1.1) Animais
Com objetivo de avaliar o sêmen fresco e testar diferentes
crioprotetores, e suas combinações, além de formas de envase, foi utilizado um
jumento da raça Pega, saudável e de fertilidade comprovada, com idade de 8
anos, alojado nas dependências do CERBEQ. Antes da fase experimental,
foram realizadas 10 colheitas seriadas em 10 dias consecutivos, para a
estabilização da reserva extra-gonadal.
3.1.2) Colheita do sêmen
O sêmen foi obtido por vagina artificial modelo Botucatu, com auxílio
de fêmeas asininas em cio, adequadamente contidas. Foram processados 13
ejaculados, que após filtração e determinação do volume em proveta
milimétrica, foram analisados suas características microscópicas. Ao sêmen foi
adicionado o diluente, para centrifugação, descrito por Papa et al. (1998), na
proporção 1:1.
Os resultados oriundos das avaliações do sêmen fresco serviram para
descartar qualquer ejaculado fora dos padrões recomendados.
40
3.1.3) Estimativa da osmolaridade e pH – sêmen “in natura”
Para a avaliação da osmolaridade, utilizou-se uma alíquota de 250
µL de sêmen, a qual foi mensurada em um osmômetro da marca Osmomette
A®-Precison Systems, InC. A leitura do pH foi realizada com auxilio de um pHmetro B 374 da marca Micronal® em 2 mL de sêmen.
3.1.4) Avaliação computadorizada dos parâmetros de motilidade do
sêmen fresco - sêmen “in natura”
Para a avaliação do sêmen, utilizou-se a técnica da análise
computadorizada com o equipamento Hamilton Thorn (HTMA), munido de uma
câmara Makler mantida a 37 0C, calibrado de acordo com as especificações de
Ferreira et al. (2000) - Anexo 2.
Foram avaliados os seguintes parâmetros: motilidade total (MT) e
motilidade
progressiva
(MP)
expressos
em
percentagem,
velocidade
espermática ao longo de uma trajetória média (VAP – expresso em
µm/segundo), velocidade espermática considerando uma trajetória retilínea
com origem entre o primeiro e último ponto analisado (VSL – expresso em
µm/segundo), velocidade espermática real (VCL – expresso em µm/segundo),
linearidade (LIN - expresso em percentagem).
3.1.5) Morfologia espermática - sêmen “in natura”
A análise da patologia espermática foi realizada através de
esfregaços de sêmen corados pelo método de Karras modificado (Papa et al,
1988). Foram contados 200 (duzentas) células espermáticas e classificadas
41
segundo critério de Mies Filho (1987). Estes resultados serviram para descartar
qualquer ejaculado fora dos padrões recomendados.
3.1.6) Avaliação da concentração e da integridade da membrana
plasmática espermática (choque osmótico) - sêmen “in natura”
A concentração foi realizada através da contagem em câmara de
Neubauer, após diluição de 1:20 (1 gota de sêmen + 19 gotas de água
destilada aquecida a 37ºC). Após a sedimentação das células, procedeu-se a
leitura em microscópio de contraste de fase (Jenamed 2, Carl Zeiss).
Em seguida realizou-se a avaliação da integridade da membrana
plasmática pelo choque osmótico, sendo aproveitado a amostra existente na
câmara. Para tanto, 200 células foram contadas e interpretadas de acordo com
Dell’Aqua et al. (2000).
3.1.7) Avaliação da integridade da membrana plasmática espermática
através de sondas fluorescentes - sêmen fresco
Sua execução seguiu o estabelecido por Harrison & Vickers (1990)
e modificado por Zuccari (1998). Em um ependorf, previamente identificado, 10
µl do sêmen foi diluído em 40 µl da solução de trabalho (Anexo 4), produzida a
partir da solução de estoque (Anexo 3). Este frasco era mantido em caixa de
isopor com tampa até o momento da leitura. Em uma sala escura, seu
conteúdo sofreu homogeneização, e a seguir uma alíquota foi depositada entre
a lâmina e lamínula para ser examinada em microscopia de epifluorescência
(BX 60, Olympus America INC., aumento de 400X), através da excitação em
filtro BW. De acordo com a coloração apresentada, as 200 células contadas
42
foram classificadas em íntegras (verdes) ou lesadas (vermelhas e/ou verde e
vermelhas), com seu resultado expresso em percentagem.
3.1.8) Processamento das amostras para a criopreservação
Paralelamente a essas análises o sêmen, previamente diluído, foi
fracionado em tubos de ensaio cônicos identificados de 1 a 20 e expostos à
centrifugação de 600g por 10 minutos (centrifuga FANEN®, modelo Baby).
Desprezado o sobrenadante, o “pellet” foi ressuspendido com
diluidor MP50 (Anexo 5), observando a concentração final de 200x106 sptz/mL
e envasados em palhetas de 0,5 mL ou macrotubos de 2,5 mL, com as
seguintes formulações de crioprotetores:
Meios
Diluentes
Crioprotetores
2% dimetil sulfóxido (DMSO1) + 2% dimetil formamida
(DF1)
1
MP50
2
MP50
(3 %) DF1
3
MP50
2% metil formamida (MF1)+2% glicerol (GLI1)
4
MP50
2% dimetil acetamida (DA1)+2% GLI1
5
MP50
3% MF1
6
MP50
3% DA1
7
MP50
3% GLI1+2% DF1
8
MP50
MP 50 (gema de ovo livre de patógenos)+ 3% GLI1 +
2% DF1
9
MP50
3% DMSO1 + 2%GLI1
10
MP50
1% Etileno Glicol (EG1)+3% DMSO1 + 1% DF1
Após o envase as doses foram estabilizadas em geladeira2, por 60
minutos a 50C, em seguida mantidas por 20 minutos a 6cm acima do nível do
1
Reagentes Sigma
43
nitrogênio (Papa et al. 2002) e finalmente imersas no nitrogênio líquido, em
caixa de isopor 40 litros.
3.1.9) Avaliação computadorizada dos parâmetros da motilidade - sêmen
criopreservado.
A descongelação das amostras foi realizada em banho-maria a
46oC por 20 segundos para palhetas de 0,5mL e 50 segundos para os meio
macrotubos (2,5 mL) (Dell’Aqua 2000). Os critérios de avaliação foram os
mesmos usados no item 3.1.4.
3.1.10) Avaliação da integridade da membrana plasmática espermática
através de sondas fluorescentes - sêmen criopreservado.
Sua descrição segue a mesma utilizada no item 3.1.7.
3.2. Segundo Experimento – Inseminação artificial com o uso de sêmen
criopreservado.
3.2.1) Animais
Foram utilizadas para o teste de fertilidade 51 fêmeas asininas e 10
éguas da raça Brasileira de Hipismo, sendo 30 da raça Brasileira oriundas do
PRDTAAM/Colina-SP, 6 da raça Pega da Fazenda de Produção e Pesquisa
da FMVZ-UNESP-Botucatu-SP e 15 originados de plantel de bom nível
zootécnico, pertencentes à Fazenda localizada no município de Echaporã-SP.
As
2
fêmeas
da
raça
Pega
foram
mantidas
nas
dependências
do
Geladeira portátil para adaptação de sêmen com temperatura regulável e termômetro digital - Minitüb®
44
CERBEQ/Botucatu-SP, para facilitar a execução do acompanhamento do
desenvolvimento folicular e inseminações.
As éguas pertenciam ao PRDTAAM e possuíam histórico de boa
habilidade reprodutora. Esse plantel possuía bom estado corporal e ao longo
dessa etapa receberam suplementação volumosa e concentrada adequadas,
quando necessária, bem como água e mineralização “ad libitum”. Antes de
iniciar as inseminações as mesmas foram desverminadas.
3.2.1.1) Comparação entre diferentes crioprotetores e associações destes
através da inseminação artificial em jumentas, pré e pós-ovulação.
Com base nos resultados laboratoriais, onde não foram observadas
diferenças estatísticas entre as duas formas de envasamento utilizadas na
congelação de sêmen, procedeu-se o teste de fertilidade em jumentas com 6
formulações de crioprotetores: 1= 2% dimetil sulfóxido+2% dimetil formamida;
2= 3 % dimetil formamida; 4= 2% dimetil acetamida+2% glicerol; 6= 3% dimetil
acetamida;7= 3% glicerol+2% dimetil formamida e 9= 3% dimetil sulfóxido + 2%
glicerol, na apresentação palheta de 0,5 mL.
As jumentas foram rufiadas diariamente e a partir da detecção do
cio foram examinadas através da palpação transretal e de ultra-som (Scanner
480 - Pie Medical; transdutor linear de 5 Mhz). Quando da identificação de um
folículo com 35 mm de diâmetro, as fêmeas receberam 2500 UI de hCG®
endovenosa, sendo inseminadas 36 horas após a aplicação do hCG® e dentro
de 6 horas após a ovulação. Para proceder à inseminação artificial foram
®
®
Vetecor
Vetecor
45
descongeladas 8 palhetas de 0,5 mL de sêmen do tratamento escolhido,
mergulhando-as em água aquecida a 460C por 20 segundos (Dell’Aqua, 2000).
As palhetas eram então secas e tinham suas extremidades cortadas
e vertia-se, cuidadosamente, seus conteúdos em uma seringa de vidro
esterilizada e previamente aquecida.
A inseminação era realizada através de pipeta (Plástico – Barretos /
PB plástico) via vaginal com auxilio da mão enluvada, para a ultrapassagem do
cérvice. A deposição do sêmen era realizada ± 2 cm dentro do corpo uterino,
com a aplicação de uma coluna de ar suficiente para assegurar o uso total da
dose inseminante (4 mL). Após 15 dias os animais eram examinados para
investigação de gestação. O quadro abaixo ilustra o número de animais
inseminados pelas respectivas formulações de crioprotetores.
Formulação utilizada (*) Número de animais inseminados
1
8
2
9
4
8
6
10
7
9
9
9
(*)1= 2% dimetil sulfóxido+2% dimetil formamida; 2= 3 % dimetil formamida; 4=
2% dimetil acetamida+2% glicerol; 6= 3% dimetil acetamida;7= 3% glicerol+2%
dimetil formamida e 9= 3% dimetil sulfóxido + 2% glicerol
Face aos resultados de fertilidade obtidos nesta fase inicial foram
desenvolvidos os seguintes ensaios:
46
3.2.1.2) Comparação entre diferentes doses inseminantes 800 ou 1600
x106 de espermatozóides totais, com a formulação 7 (3% glicerol + 2%
dimetil formamida), pós-ovulação.
Neste ensaio utilizou-se 18 jumentas da raça Brasileira onde os
procedimentos de rufiação, exames ginecológicos e aplicação de hCG®,
seguiram a mesma metodologia descrita no item anterior. Após a aplicação do
indutor da ovulação, os animais passaram a ser monitorados a cada 6 horas, e
detectada a ovulação eram inseminados com o conteúdo de 8 (800 x 106
espermatozóides)
no
corpo
uterino
ou
16
palhetas
(1600
x
106
espermatozóides) no corno ipsilateral à ovulação. O diagnóstico de gestação
ocorreu 15 dias após.
3.2.1.3) Inseminação artificial pós ovulação com dose total de 800x106 de
espermatozóides com meio 7 (3% glicerol + 2% dimetil formamida),
desglicerolizado, pós-ovulação.
Neste ensaio foram manejadas dez fêmeas asininas para a Inseminação
como descrito no item 3.2.1.1 da fase 1. O procedimento de descongelação
seguiu a descrição na letra a do item 3.2. Após o depósito do conteúdo das
palhetas (8) em um tubo a 37ºC, foi acrescido lentamente 4 mL do meio
Kenney (1975), também pré-aquecido, alcançando volume total de 8 ml. O
sêmen foi depositado no ápice do corno ipsilateral após a ovulação com auxilio
de pipeta flexível (Minitüb), conforme descrição no item 3.2.1.3.
®
Vetecor
47
3.2.1.5) Inseminação artificial de éguas pós ovulação com dose total de
800x106 de sptz com a formulação 7 (3% glicerol+2% dimetil formamida),
no corpo uterino
Nesta fase foram utilizadas 10 éguas da raça Brasileira de Hipismo,
descritas anteriormente. Os animais foram rufiados em dias alternados e após
a detecção de cio, foram avaliados ginecologicamente através da palpação e
ultra-sonografia diariamente.
Os folículos foram monitorados e ao atingirem 35 mm de diâmetro, estes
animais receberam 2500 UI de hCG (Vetecor – Laboratório Calier Ltda.)
endovenosa e examinadas a cada 6 horas até a ovulação. O sêmen foi
descongelado a 460C por 20 segundos, e o conteúdo de 8 palhetas foi
transferido para uma seringa de vidro esterilizada e pré-aquecida.
As inseminações foram realizadas no corpo do útero e o diagnóstico de
gestação foi realizado após 15 dias da IA.
3.3 Terceiro Experimento – Avaliação da resposta inflamatória uterina
pós-inseminação artificial.
O presente experimento foi delineado para verificar se a reação
inflamatória pós-inseminação artificial, em jumentas, poderia ser um fator
determinante do insucesso quando do uso do sêmen congelado de jumentos
em fêmeas asininas.
Para tanto, desafiou-se as jumentas através do uso da inseminação
artificial com sêmen fresco, sêmen congelado e a infusão de diluente da
48
congelação (MP50) com o crioprotetor 7 (3% glicerol+2% dimetil formamida),
porém sem as células espermáticas de jumentos.
Preliminarmente efetuou-se uma triagem através do ultra-som e da
citologia uterina e aquelas que possuíam conteúdo líquido no útero ou
neutrófilos no esfregaço foram descartadas. O manejo reprodutivo destas
fêmeas se espelhou nos respectivos ítens vistos anteriormente.
Foram utilizados 15 ciclos estrais de 10 jumentas. Os animais ao se
apresentarem em estro, eram examinados e então inseminadas ou infundidas
aleatoriamente com um dos 3 tratamentos.
Três grupos foram formados, com mesmo número de repetições: G1Inseminadas com 4 mL de sêmen de jumento in-natura; G2- Infundidas com 4
mL de diluente para congelamento (3); G3- Inseminadas com o conteúdo de 8
palhetas de sêmen de asinino congelado (4 mL). Tanto nas inseminações
como nas colheitas seriadas das amostras, as jumentas foram contidas em
troncos individuais e sofreram criteriosa higiene do períneo e vulva.
Aliou-se a este período a avaliação ultra-sonográfica quanto ao acúmulo
de fluído uterino. As amostras citológicas foram obtidas da região do corpo
uterino, com escova ginecológica (Koplast Comercial e Industrial Ltda – SP)
auxiliado por um aparelho em aço inox, nos momentos 6 e 24 horas após as
inseminações (Alvarenga et al., 1990).
O aparelho consiste de um tubo cilíndrico com 58 cm de comprimento e
uma haste interna pouco maior (61 cm), ambos em inox. A haste possui uma
extremidade em forma de manivela e a outra que corre por dentro do tubo é
afilada o suficiente para prender as escovas. Para obtermos as amostras de
citologia, utilizou-se a mão enluvada que conduziu o aparelho introduzindo-o
49
pela cérvice. A escova era então exposta ao endométrio onde uma suave
escarificação, através de movimentos circulares da haste, obtinha-se uma
amostra desse órgão. Em seguida puxava-se a haste para “proteger” a escova,
evitando-se assim sua “contaminação” por células estranhas ao útero, sendo o
aparelho retirado do animal.
Os esfregaços confeccionados cobriam toda a superfície da lâmina
previamente identificadas na sua parte fosca, sendo corados com Panótico e
avaliados através de microscopia ótica (objetiva de imersão), onde procedeu-se
a contagem diferencial entre neutrófilos e células de descamação uterina
(Alvarenga et al., 1990).
4 - METODOLOGIA ESTATÍSTICA EMPREGADA:
Para análise das variáveis estudadas foi utilizada a análise de variância,
seguida do método de Tukey para comparações múltiplas.
Para o estudo das correlações utilizou-se o coeficiente de correlação de
Pearson, e para a variável polimorfos nucleares foi usado a análise de perfil,
onde analisou-se grupos e momentos. O nível de significância utilizado foi de
5%.
50
5 - RESULTADOS
Experimento 1 – Avaliação do sêmen congelado:
A avaliação de 2 tipos de envase: M = meio macro tubo (2,5 mL) e P=
palheta de (0,5 mL), todos com diluente MP50 associado às seguintes
formulações de crioprotetores: 1= 2% dimetil sulfóxido (DMSO) e 2% dimetil
formamida (DF); 2= 3% dimetil formamida (DF); 3= 2% dimetil formamida (DF)
e 2% de Glicerol; 4= 2% dimetil acetamida (DA) e 2% de glicerol; 5= 3% metil
formamida (MF); 6= 3% de dimetil acetamida (DA); 7= 3% glicerol e 2% dimetil
acetamida (DA); 8= (Specific Patogen Free) 3% glicerol e 2% dimetil formamida
(DF); 9= 3% dimetil sulfóxido (DMSO) e 2% glicerol; 10= 1% etilieno glicol +
3% dimetil sulfóxido (DMSO) e 1% dimetil formamida (DF), para sêmen
congelado de jumento, foi realizada através do CASA e pelo teste da
integridade de membrana plasmática aferida pela fluorescência.
As comparações realizadas entre os 2 tipos de envase, meio macrotubo
e palhetas, não demonstraram superioridade (P>0,05) entre si, não havendo
interação com as formulações utilizadas, nos parâmetros analisados.
Para a característica de motilidade total (MOT), mensurada pela
microscopia computadorizada, os tratamentos M4, P4 e P6 (73,0; 69,4 e 69,2,
respectivamente) somente foram superiores (P<0,05) ao M7 (49,4) e P5 (51,8),
enquanto que as demais comparações M1, M2, M3, M5, M6, M8, M9, M10, P1,
P2, P3, P7, P8, P9 e P10 (respectivamente, 60,0; 64,6; 66,2; 58,4; 65,1; 59,8;
62,6; 60,8; 63,6; 63,9; 66,9; 61,8; 68,1; 65,2; 62,1) não diferiram
nesse
parâmetro (P<0,05). (Tabela 1, 2 e Figura 1).
51
Quanto à motilidade progressiva (MOP), avaliada pela microscopia
computadorizada, o resultado mais expressivo foi o tratamento M4 (46,7),
tendo se distingüido exclusivamente (P<0,05) do M7 (31,7), enquanto para os
demais tratamentos M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, P1, P2, P3,
P4, P5, P6, P7, P8, P9 e P10 (respectivamente, 36,3; 37,8; 41,1; 46,7; 36,2;
40,3; 31,7; 37,9; 39,0; 37,5; 36,5; 37,7; 44,3; 43,5; 34,8; 42,2; 40,0; 44,8; 39,2;
37,7) não foi encontrada diferença estatística (P>0,05). (Tabelas 1, 2 e Figura
2)
Em relação ao estudo da linearidade (LIN), realizada com auxílio do
microscópio computadorizado, foi encontrado diferença (P<0,05) entre os
tratamentos M3 e M6 (58,0 e 38,5). Os demais resultados M1, M2, M4, M5, M8,
M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9 e P10 (45,5; 50,8; 42,7; 49,8;
46,6; 45,8; 49,2; 45,9; 46,7; 50,0; 53,4; 51,9; 40,6; 52,6; 49,0; 55,3; 47,7; 47,4
respectivamente) foram semelhantes (P>0,05). (Tabela 1, 2 e Figura 3)
Na avaliação da integridade da membrana plasmática pela fluorescência
(Iodeto de propídio e carboxifluoresceína), auxiliado pelo microscópio de
epifluorescência, foi encontrado maior valor para o tratamento P6 (48,6) que
apresentou diferença significativa para P5 (30,3) e M7 (31,9) P<0,05. O
tratamento P4 (47,8) diferiu somente de P5 (P<0,05). As demais comparações
para esse parâmetro não apresentaram divergência estatística (P>0,05) M1,
M2, M3, M4, M5, M6, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P7, P8, P9 e P10 (38,2; 42,0;
38,2; 45,6; 34,8; 41,0; 31,9; 37,0; 38,8; 40,5; 44,0; 42,3; 40,8; 41,1; 40,8; 43,3;
41,7, respectivamente). (Tabelas 1, 2 e Figura 4).
52
Tabela 1 – Valor médio e desvio padrão, para as características de motilidade
total (MOT),motilidade progressiva (MOP), a linearidade (LIN),
obtidos através do HTMA e integridade de membrana plasmática
(FLUO) avaliadas pela fluorescência, após a descongelação de
sêmen de jumento, envasados em meio macrotubo ( M - 2,5 mL)
Parâmetros
Tratamentos
MOT
MOP
LIN
FLUO
M1
60,0 ± 9,3ab
36,3 ± 7,0ab
45,5 ± 8,4ab
38,2 ± 9,6abc
M2
64,6 ± 7,5ab
37,8 ± 8,8ab
50,8 ± 10,8 ab
42,0 ± 14,6abc
M3
66,2 ± 10,9ab
41,7 ± 8,6ab
58,0 ± 12,4a
38,2 ± 10,1abc
M4
73,0 ± 8,2a
46, 7 ± 10,3a
42,7 ± 11,4 ab
45,6 ± 12,8abc
M5
58,4 ± 10,5ab
36,2 ± 7,7ab
49,8 ± 10,7 ab
34,8 ± 14,0abc
M6
65,1 ± 11,7ab
40,3 ± 8,7ab
38,5 ± 13,2b
41,0 ± 12,2abc
M7
49,4 ± 13,5b
31,7 ± 10,3b
46,6 ± 12,6 ab
31,9 ± 10,9bc
M8
59,8 ± 9,7ab
37,9 ± 8,3ab
45,8 ± 10,4 ab
37,0 ± 7,5abc
M9
62,6 ± 13,8ab
39,0 ± 8,4ab
49,2 ± 8,7 ab
38,8 ± 10,4abc
M10
60,8 ± 11,2ab
37,5 ± 12,4ab
45,9 ± 13,5 ab
40,5 ± 9,7abc
MÉDIA
61,99 ± 10,7
37,6 ± 9,1
47,28 ± 11,2
38,88 ± 11,2
GERAL
1
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem estatisticamente
M= meio macro tubo (2,5 mL) todos com diluente MP50 associado aos
seguintes crioprotetores: 1= 2% DMSO e 2% DF; 2= 3% DF; 3= 2% MF e 2%
de Glicerol; 4= 2% dimetil acetamida e 2% de glicerol; 5= 3% metil formamida;
6= 3% de dimetil acetamida; 7= 3% glicerol e 2% dimetil acetamida; 8=
(Specific Patogen Free) 3% glicerol e 2% dimetil formamida; 9= 3% Dimetil
sulfóxido e 2% glicerol; 10= 1% etilieno glicol + 3% dimetil sulfóxido e 1%
dimetil formamida.
53
Tabela 2 – Valor médio e desvio padrão, para as características de motilidade
total (MOT),motilidade progressiva (MOP), a linearidade (LIN),
obtidos através do HTMA e integridade de membrana plasmática
(FLUO) avaliadas pela fluorescência, após a descongelação de
sêmen de jumento, envasados em palhetas ( P - 0,5 mL)
Parâmetros
Tratamentos
MOT
MOP
LIN
FLUO
P1
63,6 ± 8,9ab
36,5 ± 5,0ab
46,7 ± 6,5 ab
44,0 ± 10,2abc
P2
63,9 ± 8,9ab
37,7 ± 7,4ab
50,0 ± 9,1 ab
42,3 ± 7,5abc
P3
66,9 ± 7,8ab
44,3 ± 7,1ab
53,4 ± 9,7 ab
40,8 ± 6,6abc
P4
69,4 ± 7,0a
43,5 ± 7,1ab
51,9 ± 7,8 ab
47,8 ± 10,4ab
P5
51,8 ± 10,9b
34,8 ± 8,4ab
40,6 ± 10,3 ab
30,3 ± 8,7c
P6
69,2 ± 8,7a
42,2 ± 9,5ab
52,6 ± 10,9 ab
48,6 ± 10,8a
P7
61,8 ± 11,7ab
40,0 ± 9,0ab
49,0 ± 11,6 ab
41,1 ± 11,6abc
P8
68,1 ± 6,9ab
44,8 ± 8,9ab
55,3 ± 9,5 ab
40,8 ± 10,0abc
P9
65,2 ± 12,5ab
39,2 ± 9,9ab
47,7 ± 11 ab
43,3 ± 11,1abc
P10
62,1 ± 7,2ab
37,7 ± 6,6ab
47,4 ± 7,7 ab
41,7 ± 7,3abc
MÉDIA
64,2 ± 9,1
40,5 ± 7,9
49,5 ± 9,41
42,1 ± 9,41
GERAL
1
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem estatisticamente
P= palheta de 0,5 mL todos com diluente MP50 associado aos seguintes
crioprotetores: 1= 2% DMSO e 2% DF; 2= 3% DF; 3= 2% MF e 2% de Glicerol;
4= 2% dimetil acetamida e 2% de glicerol; 5= 3% metil formamida; 6= 3% de
dimetil acetamida; 7= 3% glicerol e 2% dimetil acetamida; 8= (Specific Patogen
Free) 3% glicerol e 2% dimetil formamida; 9= 3% Dimetil sulfóxido e 2%
glicerol; 10= 1% etilieno glicol + 3% dimetil sulfóxido e 1% dimetil formamida.
54
55
Motilidade total (%)
M1
P1
M2
P2
M3
P3
M4
P4
MEIO MACROTUBO
M5
P5
M6
P6
M7
P7
M8
P8
M9
P9
PALHETA
M10
P10
Figura 1 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5,
M6, M7, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, sobre o parâmetro motilidade
total (MOT).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
56
0
10
20
30
40
50
60
70
80
M1
P1
M2
P2
M3
P3
M4
P4
MEIO MACROTUBO
M5
P5
M6
P6
M7
P7
M8
P8
M9
P9
PALHETA
M10
P10
Figura 2 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5, M6,
M7, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9 e P10, sobre o parâmetro motilidade
progressiva (MOP).
Motilidade progressiva (%)
57
M1
P1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
M2
P2
M3
P3
M4
P4
MEIO MACROTUBO
M5
P5
M6
P6
M7
P7
M8
P8
M9
P9
PALHETA
M10
P10
Figura 3 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5,
M6, M7, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9 e P10, sobre o parâmetro
linearidade (LIN).
Linearidade (%)
58
Células íntegras (%)
M2
P2
M3
P3
M4
P4
MEIO MACROTUBO
M5
P5
M6
P6
M7
P7
M8
P8
M9
P9
PALHETA
Figura 4 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos diversos tratamentos M1, M2,
M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9 e P10,
sobre o parâmetro integridade da membrana plamática (FLUO).
M1
P1
0
10
20
30
40
50
60
70
M10
P10
Nos resultados referentes aos parâmetros de velocidade espermática
estimada pelo HTM-IVOS-10, os valores de VCL (velocidade real) não
apresentaram
divergências
estatísticas
(P>0,05)
entre
os
tratamentos
empregados M1, M2, M3, M4, M5, M6, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P7, P8, P9 e
P10 (161,7; 164,4; 157; 157; 152,8; 165,8; 161,6; 160; 150,9; 156,3; 155,7;
166,3;
159,6;
150,4;
160,6;
161,1;
169,2;
160,9;
152,9;
154,9,
respectivamente). Em relação a VAP (velocidade do trajeto espermático)
tampouco foi observada distinção estatística (P>0,05) relacionada aos
tratamentos propostos M1, M2, M3, M4, M5, M6, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P7,
P8, P9 e P10 (respectivamente, 85,8; 84,3; 86,8; 86,8; 84,7; 86; 86,2; 83,1;
87,1; 86,9; 85,9; 84,8; 87,5; 87; 88,3; 85,4; 86,3; 86,6; 86,9; 85,1). Para os
valores
de
VSL
(velocidade
retilínea)
os
tratamentos
utilizados
não
apresentaram superioridade estatística quando cotejados M1, M2, M3, M4, M5,
M6, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P7, P8, P9 e P10 (51,3; 50,5; 54,6; 53,5; 54,1;
50,1; 51,6; 55,5; 54,1; 53; 50,8; 50,2; 53,5; 53,5; 51,8; 53,3; 50,9; 52; 52,4; 50,
respectivamente) (Tabela 3 e Figuras 5, 6 e 7).
59
Tabela 3– Valor médio e desvio padrão de velocidade espermática estimada
pelo HTMA, para as características de VCL (velocidade real), VAP
(velocidade do trajeto espermático) e VSL (velocidade retílinea),
após a descongelação de sêmen de jumento, envasados em meio
macrotubo ( M - 2,5 mL) ou palheta (P - 0,5 mL) com diluente
MP50 e 10 formulações de crioprotetores.
Parâmetros
Tratamentos
VCL
VAP
VSL
M1
161, 7 ± 19,8
85,8 ± 3,2
51,3 ± 5,1
M2
164,4 ± 10,0
84,3 ± 4,2
50,5 ± 5,2
M3
157,0 ± 19,2
86,8 ± 3,6
54,6 ± 5,8
M4
157,0 ± 9,0
86,8 ± 3,0
53,5 ± 5,1
M5
152, 8 ± 11,7
84,7 ± 8,1
54,1 ± 3,7
M6
165,8 ± 10,6
86,0 ± 2,0
50,1 ± 2,9
M7
161,6 ± 10,1
86,2 ± 2,7
51,6 ± 3,7
M8
160,0 ± 11,5
83,1 ± 13,3
55,5 ± 5,4
M9
150,9 ± 10,5
87,1 ± 3,2
54,1 ± 5,2
M10
156,3 ± 13,8
86,9 ± 2,6
53,0 ± 4,2
P1
155,7 ± 8,4
85,9 ± 3,2
50,8 ± 4,6
P2
166,3 ± 12,3
84,8 ± 3,7
50,2 ± 5,0
P3
159,6 ± 12,5
87,5 ± 2,3
53,5 ± 3,6
P4
150,4 ± 14,6
87,0 ± 2,6
53,5 ± 2,7
P5
160,6 ± 17,2
88,3 ± 2,5
51,8 ± 5,4
P6
161,1 ± 9,9
85,4 ± 2,3
53,3 ± 2,3
P7
169,2 ± 15,6
86,3 ± 3,0
50,9 ± 4,0
P8
160,9 ± 10,1
86,6 ± 2,3
52,0 ± 3,1
P9
152,9 ± 16,1
86,9 ± 3,5
52,4 ± 3,9
P10
154,9 ± 10,2
85,1 ± 2,2
50,0 ± 2,3
M= meio macro tubo (2,5 mL) e P= palheta de 0,5 mL todos com diluente MP50
associado aos seguintes crioprotetores: 1= 2% DMSO e 2% DF; 2= 3% DF; 3=
2% MF e 2% de Glicerol; 4= 2% dimetil acetamida e 2% de glicerol; 5= 3%
metil formamida; 6= 3% de dimetil acetamida; 7= 3% glicerol e 2% dimetil
acetamida; 8= (Specific Patogen Free) 3% glicerol e 2% dimetil formamida; 9=
3% Dimetil sulfóxido e 2% glicerol; 10= 1% etilieno glicol + 3% dimetil sulfóxido
e 1% dimetil formamida.
60
61
VCL (um/s)
M2
P2
M1
P1
P3
M3
P4
M4
MEIO MACROTUBO
P5
M5
P6
M6
P7
M7
P8
M8
P9
M9
PALHETA
P10
M10
Figura 5 - Média e desvio padrão referentes ao parâmetro VCL (velocidade real), na comparação entre os
resultados dos tratamentos: M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5,
P6, P7, P8, P9 e P10.
80
100
120
140
160
180
200
62
VAP (um/s)
0
20
40
60
80
100
120
M2
P2
M3
P3
M4
P4
M5
P5
M6
P6
M7
P7
M8
P8
M9
P9
PALHETA
M10
P10
Figura 6 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7,
M8, M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9 e P10 sobre o parâmetro VAP (velocidade do
trajeto espermático).
M1
P1
MEIO MACROTUBO
63
VSL (um/s)
M1
P1
M2
P2
M3
P3
M4
P4
MEIO MACROTUBO
M5
P5
M6
P6
M7
P7
M8
P8
M9
P9
PALHETA
M10
P10
Figura 7 – Média e desvio padrão referentes ao efeito dos diversos tratamentos M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8,
M9, M10, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9 e P10 sobre o parâmetro VSL (velocidade retilínea).
0
10
20
30
40
50
60
70
SEGUNDO EXPERIMENTO – Teste de Fertilidade a Campo
Os resultados de fertilidade alcançados com sêmen congelado de
jumentos em jumentas foram nulos (Tabela 4 e 5). As formulações de
crioprotetores, o local de deposição do sêmen (corpo ou intracornual
homolateral à ovulação), a inseminação com ou sem desglicerolização,
quantidade de células espermáticas empregadas (800 ou 1600 x 106 de sptz),
o momento da inseminação (pré e pós-ovulação ou somente pós-ovulação)
como também o volume utilizado (4 e 8 mL) resultaram em resultados
indistintos.
A tabela 6 ilustra a taxa de fertilidade em éguas. Quando se utilizou
éguas como avaliadoras da viabilidade espermática do sêmen criopreservado
de jumento, foi aferido 40% de gestações (4/10).
64
65
Quantidade de
Formulação Número de
Momento da
0
Espécie
Volume
Local da
Taxa de
N de espermatozóides
do
animais
desglicerolização
Inseminação
usada
palhetas
/ dose
inseminado
inseminação prenhez
crioprotetor inseminados
Artificial
inseminante
Pré e Pós
Corpo
Asinina
P1
8
8
800 x 106
Não
4 mL
0%
ovulação
uterino
Pré e Pós
Corpo
Asinina
P2
9
8
800 x 106
Não
4 mL
0%
ovulação
uterino
Pré e Pós
Corpo
Asinina
P4
8
8
800 x 106
Não
4 mL
0%
ovulação
uterino
Pré e Pós
Corpo
Não
4 mL
0%
Asinina
P6
10
8
800 x 106
ovulação
uterino
Pré e Pós
Corpo
Asinina
P7
9
8
800 x 106
Não
4 mL
0%
ovulação
uterino
Pré e Pós
Corpo
Não
4 mL
0%
Asinina
P9
9
8
800 x 106
ovulação
uterino
Crioprotetores – P1 (2% dimetil sulfóxido e 2% dimetil formamida); P2 (3% dimetil formamida); P4 (2% dimetil acetamida e 2%
glicerol); P6 (3% de dimetil acetamida); P7 (3% glicerol e 2% dimetil formamida); P9 (3% dimetil sulfóxido e 2% glicerol)
Tabela 4- Efeito do uso do sêmen de jumento congelado em meio MP50, com diferentes crioprotetores, utilizado no corpo
uterino de jumentas, em dois momentos pré e pós-ovulação, com dose inseminante total de 800 x 106 sptz., sem
desglicerolização, sobre a taxa de fertilidade.
66
Quantidade de
Formulação Número de
Momento da
0
Espécie
N de espermatozóides
Volume
Local da
Taxa de
do
animais
desglicerolização
Inseminação
usada
palhetas
/ dose
inseminado
inseminação prenhez
crioprotetor inseminados
Artificial
inseminante
PósCorpo do
Eqüina
P7
10
8
800 x 106
Não
4 mL
40%
ovulação
útero
Crioprotetor - P7 (3% glicerol e 2% dimetil formamida)
Tabela 6 - Efeito do uso do sêmen de jumento congelado em meio MP50, utilizado no corpo uterino de éguas após-ovulação, com
dose inseminante total de 800 x 106 sptz., sem desglicerolização, sobre a taxa de fertilidade.
Quantidade de
Formulação Número de
Momento da
0
Espécie
Volume
Local da
Taxa de
N de espermatozóides
do
animais
desglicerolização
Inseminação
usada
palhetas
/ dose
inseminado
inseminação prenhez
crioprotetor inseminados
Artificial
inseminante
PósCorpo
Asinina
P7
10
8
800 x 106
Não
4 mL
0%
ovulação
uterino
PósHomolateral
Asinina
P7
10
16
1600x106
Não
8 mL
0%
ovulação
à ovulação
PósHomolateral
Asinina
P7
10
8
800 x 106
Sim
8 mL
0%
ovulação
à ovulação
Crioprotetor – P7 (3% de glicerol + 2% de dimetil acetamida);
Tabela 5 - Efeito do uso do sêmen de jumento congelado com glicerol, utilizado no corpo e corno uterino ipsilateral à ovulação de
jumentas, após ovulação, com dose inseminante total de 800 x 106 ou 1600 106 sptz., com ou sem desglicerolização,
sobre a taxa de fertilidade.
Resultados
Experimento 3 - Citologia uterina
São apresentados na figura 8 os resultados individuais de citologia
uterina, nos momentos 6 e 24 horas após inseminação com 4 mL de sêmen innatura, em 5 jumentas do grupo 1.
Polimorfonucleares (%)
100
90
80
70
60
6 horas
24 horas
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
Animais
Figura 8 – Valores médios encontrados para contagem de neutrófilos em
esfregaços uterinos de 5 jumentas obtidos nos momentos 6 e
24 horas após a inseminação artificial de 4 mL de sêmen innatura de jumento.
67
A figura 9 apresenta os resultados da citologia uterina, individualizado,
realizado em 5 jumentas do grupo 2. Às 6 e 24 horas após inseminação
artificial de 4 mL do diluente MP50.
Polimorfonucleares (%)
120
100
80
6 horas
24 horas
60
40
20
0
1
2
3
4
5
Animais
Figura 9 – Valores médios encontrados para contagem de neutrófilos em
esfregaços uterinos de 5 jumentas obtidos nos momentos 6 e 24
horas após a inseminação artificial de 4 mL de diluente MP- 50.
68
A figura 10 particulariza os resultados da citologia uterina, dos 5 animais
utilizados no grupo 3. Estes animais foram inseminados com sêmen congelado
com dose total de 800x106 de sptz e avaliados às 6 e 24 horas pós
inseminação.
Polimorfonucleares (%)
100
90
80
70
60
6 horas
24 horas
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
Animais
Figura 10 – Valores médios e desvio padrão encontrados para contagem
de neutrófilos em esfregaços uterinos de 5 jumentas obtidos
nos momentos 6 e 24 horas após a inseminação artificial com
8 palhetas (800x106 de sptz) de sêmen congelado de jumento.
69
Na Tabela 7 verificamos que a avaliação citológica dos esfregaços
uterinos das jumentas revelou acentuada resposta de PMN, nos 3 tratamentos,
6 horas após a inseminação, independente do estímulo causal (P<0,05), muito
embora a reação inflamatória neste momento não propiciou diferença
significativa entre os tratamentos empregados (P>0,05).
Nesta análise foi detectado que os animais do grupo 1 inseminados com
sêmen fresco (4 mL), os do grupo 2 que receberam sêmen congelado (800x106
de sptz) e os do grupo 3 que foram inseminados com diluente para
congelamento (4 mL) apresentaram elevados percentuais de PMN às 6 horas;
no entanto suas médias resultaram muito próximas (79; 77,6; 84,6,
respectivamente), não apresentaram distinção estatística P>0,05.
Na colheita seguinte, às 24 horas pós IA, houve uma brusca queda dos
valores de PMN nos esfregaços dos grupos 1, 2 e 3 (40,1; 25,2; 19,6,
respectivamente). Novamente as médias encontradas neste período não foram
afetadas pelo grupo (P>0,05), embora o valor do grupo 1 tenha sido
numericamente maior que os demais (Tabela 7).
Cotejando as médias dos momentos 6 e 24 horas, dentro dos grupos,
evidenciou divergência estatística (P<0,05 - Tabela 7), entre os 2 momentos.
70
Tabela 7 – Efeito da inseminação artificial em jumentas com 4 mL de sêmen innatura (G1), 4 mL de diluente com crioprotetor (G2) e sêmen
congelado (800x106 de sptz - G3) avaliados pela contagem de
polimorfonucleares através de citologia uterina nos momentos 6 e
24 horas pós-inseminação.
Grupos
Momentos após a inseminação artificial
6 horas *
24 horas *
G1
79,0 ± 7,1 a
40,1 ± 8,8 b
G2
84,6 ± 7,9 a
19,6 ± 5,6 b
G3
77,6 ± 19,3 a
25,4 ± 9,2 b
(*) Média ± dp
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem estatisticamente (P>0,05).
Médias seguidas de letras diferentes na mesma linha diferem estatisticamente (P<0,05).
O estudo da Tabela 8 mostra que a análise estatística realizada para
avaliar os momentos (6 e 24 horas), após as inseminações artificiais,
desconsiderando os grupos (G1, G2 e G3), revela diferença (P<0,05) entre os
momentos.
Tabela 8 – Valor médio e desvio padrão obtidos para contagem de
polimorfonucleares em esfregaços uterinos de jumentas, dos 3
grupos: G1 (sêmen fresco - 4 mL), G2 (diluente com crioprotetor
- 4 mL) e G3 (sêmen congelado - 8 palhetas de 0,5 mL), nos
momentos 6 e 24 horas após inseminação.
Média Geral
Grupos
G1, G2 e G3
Momentos
6 horas (*)
24 horas (*)
80,4 ± 3,7 a
28,4 ± 10,6 b
(*) – Média ± dp
Médias seguidas de letras diferentes na mesma linha diferem estatisticamente (P<0,05).
71
6 - DISCUSSÃO
6.1 - AVALIAÇÃO LABORATORIAL
6.1.1 - AVALIAÇÃO DOS CRIOPROTETORES
Em certas raças de eqüinos, como animais de salto, o uso de sêmen
criopreservado ocorre há mais tempo e suas associações de criadores são
mais afeitas ao uso desta tecnologia. Em decorrência disto, associado a
seleção de garanhões para este fim, estes animais apresentam melhores
resultados de congelabilidade quando comparados a outras raças e
consequentemente apresentam bons índices de fertilidade. No entanto a
grande maioria dos garanhões experimenta baixos índices de fertilidade
quando se faz uso de sêmen congelado, sendo uma forte barreira a difusão
desta tecnologia em escala maior. Uma retrospectiva indica que nos anos
recentes pouco progresso ocorreu, e que na espécie asinina os avanços não
foram diferentes. O estudo de crioprotetores alternativos surge como uma linha
estimulante para atenuar a grande dificuldade no congelamento do sêmen
eqüídeo. Keith (1998) sugere o uso de outros crioprotetores para alguns
garanhões que não congelam bem com glicerol. Com raciocínio semelhante e
embasado em seus resultados Arruda et al (2003) apontam o teste de
diferentes formulações de meios e crioprotetores para cada garanhão antes de
se iniciar um programa de congelação de sêmen.
Orientados neste sentido, foram realizados protocolos de congelamento
de sêmen asinino para avaliar, laboratorialmente, tipos de envase e
crioprotetores; teste de fertilidade a campo e exames citológicos do útero da
72
fêmea asinina após inseminações, investigando as possívels causas da baixa
fertilidade.
Embora Papa et al (1999) tivessem obtidos resultados de prenhez, em
éguas, com sêmen de jumento criopreservado em meio M9H, utilizamos no
presente trabalho o diluente MP50, baseado em trabalho que encontrou
melhores valores de motilidade e integridade de membrana plasmática
(P<0,05) embora a fertilidade não tenha apresentado diferença estatística
(P>0,05) ao compará-lo ao M9H e FR-4 (Neves Neto et al. 2003). Assim a
procura por diluentes que permitam preservar adequadamente as células
espermáticas eqüinas do frio, tem sido objeto de numerosas pesquisas em uma
intensidade comparável ao desenvolvimento de tecnologia laboratorial que
possibilite predizer sem contestação o potencial fertilizante da amostra
examinada (Arruda et al., 2000; Alvarenga et al., 2000 a,b; Papa et al., 2002;
Dell’aqua Jr, et al., 2000).
Entre os parâmetros aferidos pelo HTMA: MOT; MOP; LIN, VCL; VSL e
VAP, e a integridade da MP pela FLU, houve diferença significativa entre as
diversas formulações de crioprotetores deste ensaio. Os resultados da variável
MOT para os diluidores M7 (3% glicerol e 2% dimetil acetamida) e P5 (3%
metil formamida) foram os piores; 49,4% e 51,8% respectivamente. Estes
números foram diferentes (P<0,05) somente do M4, P4 (2% dimetil acetamida e
2% de glicerol) e P6(3% de dimetil acetamida) respectivamente 73%, 69,4% e
69,2%.
Embora M7 (3% glicerol
e 2% dimetil acetamida) e P5 (3% metil
formamida) tenham sido para a variável MOT os piores crioprotetores das
combinações testadas, foram equivalentes ou melhores que os verificados por
73
Medeiros et al. (2002), que usaram amidas (dimetil acetamida, metil formamida
ou dimetil formamida) e glicerol isoladamente ou combinados em diversas
proporções no extensor para sêmen eqüino cujos resultados oscilaram entre
27,9% e 59%.
Os resultados deste experimento superaram também os encontrados por
Gomes et al. (2002) para MOT de espermatozóides de garanhões Mangalarga
Marchador, avaliados pelo CASA, criopreservados em glicerol 5%; DF 5%; MF
5% e 3% de DA, bem como aos observados por Graham (2000) para a mesma
característica, ao avaliar sêmen eqüino congelado com diversos crioprotetores
(glicerol, metil formamida, dimetil formamida e etilenoglicol) em várias
concentrações (0,6M e 0,9M).
Em relação aos resultados do parâmetro de motilidade progressiva
(MOP) somente duas composições diferiram (P<0,05) entre si: M4 (2% dimetil
acetamida e 2% de glicerol) 46,7% e M7 (3% glicerol e 2% dimetil acetamida)
31,7%. Contudo M7 não diferiu de P7 nem M4 de P4 (P>0,05), sugerindo a
inexistência de ação do tipo de envase nas formulações testadas para este
parâmetro.
Arruda et al. (1986 e 1989) fizeram uso de diluidor a base de LactoseEDTA- Gema de ovo e glicerol, para congelar sêmen de jumento e através da
microscopia ótica encontraram valores acima de 40% para MOP, próximos da
maioria dos resultados do presente experimento. Já Papa et al. (1999)
verificaram valores mais expressivos para MOP (superiores a 50%), quando
utilizaram M9H (Merck-gema+Kenney e meio de cultura celular BME)
associado ao glicerol para congelar sêmen de asininos.
74
Os resultados do presente experimento estão em concordância aos
obtidos por Silva et al. (1997) que avaliaram a MOP após descongelamento de
espermatozóides asininos, no meio Lactose- EDTA- Gema de ovo e glicerol em
macrotubo (30%) e tubos de alumínio (40%).
No parâmetro linearidade (LIN) somente existiram diferenças (P<0,05)
entre M3 (2% metil formamida e 2% de Glicerol) 58% e M6 (3% de dimetil
acetamida) 38,5%. Existe semelhança entre os resultados deste trabalho aos
de Papa et al (2002), que encontraram para a mesma variável números entre
41,7% a 48,2% para amostras de sêmen eqüino criopreservado em MP50 e
associação de glicerol e dimetil-formamida. Em trabalho realizado por Arruda
(2000) foram encontradas variações entre 56,3% e 48,6% entre 6 formulações,
sendo que houve diferença (P<0,05) favorável ao glicerol 5% em relação ao
etilenoglicol 5%.
Juliani et al. (2003) avaliararam sêmen congelado de Mangalarga
Marchador com concentrações variadas dos crioprotetores (glicerol e
acetamida) e encontraram os melhores valores para fluorescência, quando
utilizaram acetamida a 3,5%.
Rossi et al (2003) não encontraram diferenças (P>0,05) nas variáveis
MOT, MOP, VCL, RAP e FLU ao utilizarem as combinações de crioprotetores:
dimetil-formamida 2% + DMSO 2%; dimetil-formamida 3%; metil-formamida 2%
+ glicerol 2%; metil-formamida 3%; dimetil-acetamida 2% + glicerol 2%; dimetilacetamida 3%; dimetil-formamida 2% + glicerol 3%, quando usados na
criopreservação de sêmen eqüinos de diversas raças; e justificaram tais
resultados devido ao emprego do MP50 como diluente, por sua adequada e
75
eficiente composição, que proporcionou suficiente crioproteção às células
espermáticas.
Alternativa ao uso do glicerol, tem motivado várias pesquisas desde que
se conheceu os efeitos deletérios da adição deste crioprotetor em sêmen
fresco e congelado (Pace et al., 1975; Murdoch et al., 1978). Embora estudos
estejam sendo realizados em eqüinos, na literatura consultada não há citação
desta prática em asininos. As amidas, por possuírem baixo peso molecular,
ultrapassam a membrana plasmática com mais facilidade, proporcionando
menor estresse osmótico e causando menos criolesões. A forma de ação do
dimetil sulfóxido (DMSO) não está clara, provavelmente deve estar também
relacionada a seu baixo peso molecular que favorece sua penetração na
membrana plasmática (Ball et al., 2001b). Com relação ao DMSO não houve
possibilidade de comparação e discussão dos resultados encontrados frente a
literatura, visto que inexiste na bibliografia consultada trabalhos utilizando como
crioprotetor espermático para asininos.
Arruda (2000), apoiado em seus resultados, afirma que quanto maiores
forem os valores para MOT, MOP, VAP, VSL, VCL e LIN, melhor será a
qualidade espermática para cada uma das características estudadas.
Os resultados de motilidade total computadorizada obtidos pelos
tratamentos P1; P2; P4; P6; P7 e P9 (63,6%; 63,9%; 69,4%; 69,2%; 61,8%;
65,2% respectivamente), formas usadas para o teste de fertilidade a campo,
superaram os resultados laboratoriais para a mesma variável verificado por
Trimeche et al. (1998) 53,4%.
Da mesma forma, os dados de VCL 155,7; 166,3; 150,4; 161,1; 169,2 e
152,9 e para VAP 85,9; 84,8; 87; 85,4; 86,3 e 86,9 respectivamente para P1,
76
P2, P4, P6, P7 e P9 obtidos no presente experimento foram mais expressivos
que os encontrados por Trimeche et al. (1998) respectivamente 69 e 64,4.
Por outro lado os valores determinados neste trabalho para VSL 50,8;
50,2; 53,5; 53,3; 50,9 e 52,9 obedecendo a mesma sequência de tratamentos
descrita anteriormente, foram inferiores ao determinado por Trimeche et al.
(1998) 62,4; cujo resultado para motilidade progressiva (56,6%) também
suplantou os resultados encontrados neste experimento 36,5%; 37,7%; 43,5%;
42,2%; 40% e 39,2% (respectivamente P1, P2, P4, P6, P7 e P9).
Trimeche et al. (1998) encontraram valores superiores para LIN (81,5) e
integridade de membrana plasmática (IMP) de 54,8% quando comparados aos
valores de LIN 46,7; 50; 51,9; 52,6; 49; 47,7 e IMP 44%; 42,3%; 47,8%; 48,6%;
41,1% e 43,3% (respectivamente P1, P2, P4, P6, P7 e P9) deste experimento.
Uma possível explicação aos resultados desfavoráveis do presente
ensaio se deve primeiramente à diferença entre a metodologia empregada para
aferição da IMP nos dois experimentos. Enquanto a metodologia deste ensaio
foi feita através da fluorescência (Harrison & Vickers, 1990 e modificado por
Zuccari, 1998), Trimeche et al. (1998) fizeram uso do choque hiposmótico
(CHO), porém eles não mencionaram se realizaram o desconto da
percentagem de caudas patologicamente dobradas já existentes anteriores ao
CHO.
Hirai et al. (1997) encontraram que maiores quantidades de gema de
ovo no extensor causou elevação de sua viscosidade e afetou positivamente a
linearidade analisada pelo CASA. Ressalte-se que Ferreira (2000) trabalhando
com avaliação computadorizada do movimento espermático de sêmen eqüino
77
congelado em vários meios, encontrou que diluentes com formulações com
maior concentração de gema de ovo apresentam valores melhores de LIN.
Quando se compara os diluentes usados verificamos que o T2-94
(Trimeche et al. 1998) emprega 10% de gema de ovo, enquanto o MP50
usado neste experimento utiliza somente 5% de gema de ovo (anexo), e isto
explica os valores maiores de linearidade encontrado pelos pesquisadores.
As formulações usadas (amidas e DMSO) para criopreservar a célula
espermática de jumento permitiu que fosse abolida ou diminuída a
concentração de glicerol, com vantagens nos parâmetros relacionados aos
dados de Trimeche et al. (1998) que usaram glicerol a 4%.
No experimento 1 a avaliação dos métodos de envase em meio
macrotubo (2,5 mL) e palhetas (0,5 mL), para sêmen criopreservado de
jumento, não mostrou superioridade de qualquer deles (P>0,05) nas variáveis
analisadas: MOT, MOP, LIN, FLU, VAP, VCL e VCL. Os resultados
encontrados sugerem indiferente escolha dos métodos de envase para a
realização da criopreservação do sêmen de jumento, não oferecendo portanto
qualquer interação entre o invólucro e as formulações estudadas, apesar da
palheta 0,5 mL, apresentar maior facilidade de armazenamento e na
descongelação.
Estes dados, no entanto, estão em desacordo com os encontrados por
diversos autores. Dell’Aqua Júnior (2000) encontrou melhores características
de motilidades total, progressiva, VCL, VSL e integridade da membrana
plasmática (FLU) para as amostras de sêmen de garanhões processados tanto
em palhetas (0,5 mL) e mini palhetas (0,25 mL) quando comparados ao
macrotubo (4 mL)
(P<0,05). Papa et al. (1991), relataram diferenças na
78
motilidade do sêmen eqüino armazenado em palhetas e macrotubos, favorável
à palheta (36% e 26% respectivamente) após o teste de termo resistência.
Alvarenga et al. (2000a) verificaram queda da motilidade e elevada taxa de
crioinjúria na ultra-estrutura acrossomal, das células espermáticas contidas no
macrotubo em relação às palhetas, independente do crioprotetor usado, glicerol
ou etileno glicol. Ao comparar motilidade para amostras congeladas em
palhetas e macrotubos, Heitland et al. (1996) encontraram superioridade para
as amostras preservadas em volumes menores. Contudo outros trabalhos não
verificaram
diferenças
entre
invólucros
de
volumes
diferentes
para
criopreservação de sêmen asinino. Os valores verificados por Silva et al (1997),
para motilidade e vigor após teste de termo resistência, não divergiram para as
células espermáticas de jumento, envasados em macrotubo (4mL) e tubo de
alumínio (10mL). Samper et al (1994) reportaram valores semelhantes (P>0,05)
para fertilidade, quando usaram sêmen de garanhões em palhetas e meio
macrotubos 64,3% e 59,8%, respectivamente.
Apesar da disponibilidade limitada de estudos nos quais existam
comparações entre dois ou mais sistemas de envase para sêmen congelado de
asininos (Silva et al 1997), o uso de palhetas é o mais empregado para este
processo em jumentos como atestam Vieira et al (1985), Arruda et al (1986),
Arruda et al (1989b), Trimeche et al. (1996), Trimeche et al. (1997), Trimeche et
al. (1998) e Papa et al. (1999).
Os resultados dos métodos de envase, na maioria das vezes, não
podem ser comparados entre si, devido a fatores distintos como: diluente,
crioprotetor,
concentração
espermática
processada,
dose
inseminante,
momento da inseminação (Squires et al., 1999).
79
Os relatos literários apontam resultados não uniformes, ora verificando
diferenças outras vezes não, entre os sistemas de envase. Isto é refletido nos
vários centros de estudos de reprodução eqüina do mundo, onde faz-se uso
dos diversos criotubos, não ocorrendo padronização (Samper et al., 1998).
Apesar desse tópico apresentar-se ainda em estudos, há uma expansão do
uso das palhetas sobre os demais sistemas, baseado em uma melhor
acomodação dentro do container com nitrogênio e segurança na manipulação
das partidas de sêmen, além das características físicas que demonstram
vantagens nos recipientes de diâmetro menor, favorecendo-os durante as
trocas de temperatura, tanto na congelação como na descongelação das
amostras de sêmen.
Por outro lado, as discrepâncias entre os resultados não são
adequadamente explicadas. Para Davies (1999) é provável que haja efeito do
diluente nos resultados experimentais, portanto podemos considerar que o
resultado alcançado por este experimento, pode estar relacionado a proteção
apresentada pelo meio usado MP-50, em ambos recipientes, visto que o
mesmo é composto de várias substâncias tampões que estabilizam e mantém
as condições ideais durante o processo de criopreservação.
6.2 - TESTE DE FERTILIDADE A CAMPO
Segundo Graham (1998) apesar de terem sido desenvolvidos vários
testes em laboratórios úteis para avaliar no mesmo momento e em um grande
número de células, múltiplas características do espermatozóide adequados
para descartar amostras de baixa qualidade, tais testes não foram ainda
capazes de predizer com acurácia sua fertilidade, pois não permitem avaliar
80
todos os predicados necessários que uma célula deve possuir para ser fértil,
fazendo-se necessário o teste de fertilidade a campo.
De acordo com a literatura consultada, os pesquisadores que fizeram
uso do teste de campo para avaliar o sêmen de jumento criopreservado, foram
poucos e em número limitado de fêmeas (Vieira et al, 1985; Arruda et al., 1986;
Trimeche et al., 1998; Papa et al., 1999), sendo que destes somente Trimeche
et al. (1998) fez uso de fêmeas asininas, os demais serviram-se de éguas.
Os resultados nulos de fertilidade, em jumentas, em que pese o extenso
número de ciclos empregados, as várias formas de inseminações (corpo do
útero ou intra cornual), a dose inseminante, os momentos das inseminações
(pré e pós ovulação ou somente pós ovulação), com ou sem desglicerolização,
contrasta com os resultados de Trimeche et al (1998).
De acordo com esses pesquisadores, anteriormente, não havia na
literatura descrição de sucesso na criopreservação de sêmen de jumentos, que
alcançaram 38% de gestação (8/21), somente nos animais inseminados com
sêmen previamente desglicerolizado.
Os resultados do presente experimento com sêmen submetido a
desglicerolização (Tabela 5) contrastam com os encontrados por Trimeche et al
(1998). As gestações em éguas, conseguidas por Vieira et al. (1985) e Arruda
et al. (1986), também foram através da diluição do sêmen de jumentos com
Kenney momentos antes do seu uso (1:5; sêmen:diluente), embora em
proporção superior a usada por Trimeche et al (1998) (1:1; sêmen:diluente).
Nenhum
dos
autores
acima
realizaram
avaliações
laboratoriais,
que
demonstrasse os efeitos da desglicerolização antes da inseminação, nas
células espermáticas de jumentos.
81
O efeito da saída do glicerol em sêmen de carneiros congelado em meio
a base de leite desnatado, Tris e gema de ovo e glicerol (4%), foi avaliado por
Fiser et al. (1989), que não encontraram diferenças laboratoriais para
motilidade
e
integridade
de
acrossoma,
quando
as
células
após
descongelamento, alcançaram a isosmolaridade ao receber adição de extensor
sem glicerol, por volumes fixos de 0,45 mL, multipassos (10 vezes, 1 a cada 3
minutos) ou em passo único 4,5 mL, que resultaram em osmolaridade final de
405 mOsm.
Vidament et al. (2000) realizaram testes após desglicerolização em
sêmen eqüino monitorando a motilidade e VAP pelo CASA. O extensor
utilizado neste experimento foi o INRA 82 com concentrações variadas (2,8%,
3,2%, 3,7% e 4,7%) de glicerol e após o descongelamento foi diluído no
mesmo extensor de acordo com o esquema: controle 1- volume fixo (1v:4v –
sêmen:diluente) com osmolaridade final variável; controle 2- volume variável e
osmolaridade final fixa (365 mOsm); controle 3- multipassos, 11 a 21 passos
de osmolaridade fixa (25 mOsm; 1 minuto por passo) e osmolaridade final de
365 mOsm. Os autores verificaram que os parâmetros usados não
demonstraram diferenças entre os tratamentos (P>0,05).
Observações realizadas por Wessel et al (2001), permitiram que
discorressem sobre o efeito da entrada e saída do crioprotetor de
espermatozóides eqüinos, tanto para sêmen “in natura” como criopreservado.
Realizando testes em sêmen descongelado, onde não encontraram diferenças
para as características de motilidade e viabilidade espermática, entre
tratamentos por multipassos ou passo único na retirada do glicerol. Os dados
permitiram aos autores teorizar que as criolesões, ocorridas na membrana
82
plasmática do sêmen eqüino, interferiram na rápida remoção do glicerol após a
diluição em meio isotônico.
O efeito da desglicerolização em sêmen eqüino é ainda motivo de
estudo, situando-se em estágio inicial. É muito significativo o resultado de
prenhez em jumentas alcançado por Trimeche et al. (1998) somente quando da
retirada do glicerol antes da inseminação artificial, no entanto a forma
executada (1 passo) não seria a mais adequada, pois o estresse osmótico
causado ainda seria grande, provavelmente acentuando crioinjúrias existentes
ou mesmo expondo-as. O propósito deste método é evitar a brusca mudança
osmótica existente entre o sêmen descongelado em meio acima de (1200
mOsm) e o meio uterino (cerca de 300 mOsm), porém da forma como foi
realizado é bastante discutível se o estresse osmótico tenha sido evitado.
Indiferentemente de como os estudos sobre o assunto são interpretados,
eles não provêm suficiente explicação sobre a manutenção da capacidade
fecundante dos espermatozóides de asininos, após efeito da desglicerolização
da forma executada, pois os resultados nulos de fertilidade da maioria das
pesquisas executadas não repetiram os achados de fertilidade de Trimeche et
al. (1998).
O número de células espermáticas por dose inseminante, em eqüinos, é
controverso. Samper & Morris (1998), em um levantamento realizado em 25
laboratórios do mundo, verificaram valores variando de 250 a 700x106 de
células por dose.
Dell’Aqua (2000), utilizando doses inseminantes de 50,
100, 300 e 800 x106 de sptz não obtendo diferenças significativas para taxa de
prenhez em éguas.
83
Relatos na literatura informam que Trimeche et al. (1998) utilizaram
sêmen congelado de jumento com 600 x106 de sptz em jumentas Poitou,
gerando 38% de prenhez. Usando 400 a 500 x106 de sptz viáveis,
homolateralmente à ovulação, Vieira et al (1985) conseguiram 33% de
gestações. Arruda et al. (1986) utilizaram 400 a 500 x106 de sptz viáveis
depositados no corpo uterino de éguas e alcançaram 35% de gestações. Já
Papa et al. (1999) trabalhando com sêmen de jumentos na dose de 800 x106 de
sptz alcançaram 66% de gestações.
Após a IA no corpo do útero da jumenta da raça Brasileira, com o
volume (20 mL) sugerido por Trimeche (1998), foi verificado refluxo do sêmen.
É possível que as diferenças zoomorfológicas raciais estejam implicadas neste
caso (tabela 9).
Tabela 9– Características de peso e altura de animais das raças
Brasileiro e o Poitou (Adaptado de Chieffi, 1947)
RAÇAS
CARACTERÍSTICAS
BRASILEIRO
POITOU
Peso (Kg)
Altura (m)
240 – 350
1,15 – 1,30
260 – 600
1,32 – 1,53
Por não dispor dos diâmetros dos cornos uterinos de jumentas da raça
Poitou, a comparação foi realizada entre jumentas Brasileira e potras da raça
Brasileira de Hipismo, com 2 anos, que apresentavam valores corporais
próximos aos da raça Poitou, (tabela 10).
84
Tabela 10 – Valores médios dos diâmetros dos cornos uterinos
entre jumentas da raça Brasileira e potras da raça
Brasileira de Hipismo.
Potras
Jumentas
Características
n=15
n=15
486
304
Peso (Kg)
1,58
1,28
Altura (m)
Diâmetro médio do corno
34
22,6
uterino (mm)
Baseados nos valores apresentados, sugere-se o emprego da
inseminação artificial intracornual ipsilateral ao folículo dominante, sendo este
método mais apropriado ao uso de um volume maior de sêmen sem refluxo, o
que concorrerá para uma maior possibilidade de colonização da junção útero
tubárica (JUT).
O uso de inseminação intracornual em éguas, tem sido usado como
alternativa ao corpo uterino e resultados auspiciosos foram divulgados por
estudos que objetivaram maximizar o uso do ejaculado por reduzir a dose
inseminante e eliminar ou diminuir barreiras uterinas, favorecendo uma maior
colonização da JUT.
Fêo (1991) verificou que o número de sptz apresentou tendência a ser
maior no lado da IA quando comparado a aplicação do sêmen no corno uterino.
No teste a campo ocorreu expressiva vantagem (P<0,0001) para as gestações
obtidas através da IA intracornual, 66% (48/32), em oposição as do corpo
uterino 32% (25/8). Nie e Johnson (2000) utilizaram 1x106 de sptz móveis
ipsilateral ao folículo dominante, com uma pipeta flexível, com taxas de
fertilização de 18,8% e 7,1%, separados ou não pelo Sephadex e expressaram
que o uso de doses inseminantes com concentração maior, depositada na JUT,
poderá tornar mais eficiente o uso do garanhão, do que a dose de 500x106 de
85
células viáveis, quando depositado no corpo uterino. Em um número
expressivo de éguas Sánchez et al. (2004) executaram um programa de
transferência de embriões. Utilizaram sêmen congelado em 473 fêmeas e
sêmen refrigerado em 247 éguas, com taxa de recuperação embrionária de
46% e 42% respectivamente (P>0,05). Os autores destacaram que o número
reduzido de células, 100 x 106 e 200 x 106 (respectivamente sêmen congelado
e refrigerado), depositados no ápice do corno (pipeta minitub), permitiu
alcançar bons índices de recuperação embrionária e ampliou o número de
embriões produzidos pela dose convencional.
No presente experimento, a aplicação do sêmen no corno uterino
ipsilateral à ovulação de jumentas não produziu gestação.
A taxa de fertilidade alcançada em éguas (40%), neste trabalho, estão
consonantes com os verificados por Trimeche et al. (1998) 38%, Papa et al.
(1999) 66%, Vieira et al. (1985) 26% e Arruda et al (1986) 35%.
Os valores mais elevados de Papa et al. (1999) provavelmente não
expressaram a realidade, pois os autores usaram somente 3 ciclos com 2
prenhezes. Diante dos resultados dos demais grupos de pesquisadores, que
empregaram número maior de estros, é plausível supor que o nível alcançado
por Papa et al (1999) esteja sobrevalorizado.
Ao analisar os dados sobre fertilidade com sêmen congelado de
eqüinos, os valores encontrados para jumentos são equivalentes quando a
observação em cavalos é ampliada para diferenças raças inclusive as de baixa
congelabilidade. Contudo, os baixos índices de fertilidade verificados com o
uso de sêmen criopreservado de jumentos chama atenção.
86
A literatura sobre a fisiologia reprodutiva de jumentos aponta uma
concentração espermática superior aos eqüinos (Morais, 1990; Mello et al.,
2000; Arruda et al., 1989a; Dos Santos, 1994). Baseado nessas informações,
foram realizadas inseminações no corno uterino homolateral à ovulação em
jumentas com concentração total de 1,6 x109 de sptz, sem lograr êxito em
gestações.
6.3 - AVALIAÇÃO CITOLÓGICA DO ÚTERO DE ASININAS PÓSINSEMINAÇÃO
A fertilidade pode estar comprometida caso exista um quadro de
inflamação uterina no momento da descida do embrião (Kotilainen et al., 1994).
Nesta linha de pensamento, levando-se em consideração a existência em
“éguas susceptíveis” de reações inflamatórias uterinas que persistem por dias,
foi desenvolvida uma fase de estudo para monitorar uma possível reação
exacerbada da jumenta ao sêmen congelado que viesse a comprometer sua
fertilidade.
Deve-se ressaltar que nos estudos sobre fertilidade e citologia, todos os
animais foram examinados pela ultrasonografia e em nenhum deles foi
detectado conteúdo líquido no útero (antes das inseminações artificiais).
Os resultados da avaliação da citologia uterina das jumentas revelou que
no momento 6 horas após a inseminação, qualquer dos estímulos realizados:
G1- sêmen in natura; G2- diluente ou G3- sêmen congelado, gerou uma
intensa reação inflamatória, sem distinção entre eles (P>0,05), onde foram
observados respectivamente 79%, 84% e 77,6% de polimorfonucleares nos
esfregaços.
87
As leituras das amostras recuperadas após às 24 horas das
inseminações, revelaram um decréscimo acentuado no percentual de
polimorfonucleares, nos 3 grupos: 40%; 19,6% e 25,4% (G1; G2 e G3,
respectivamente), novamente não diferindo entre si. No entanto, apresentaram
diferenças significativas (P<0,05) dentro dos 3 grupos, com os valores
anteriores respectivos (6 horas).
Esta reação uterina é esperada, ocorrendo após a inseminação artificial
ou monta natural, quando há uma infecção por germes oportunistas
e
componentes seminais (Zerbe et al., 2003).
O abrupto aumento dos polimorfonucleares nos esfregaços uterinos das
jumentas refletiu o influxo de neutrófilos no lumen uterino, que possuem o
papel de eliminar deste órgão elementos agressores.
O maior percentual de neutrófilos encontrado para G1 às 24 horas
(40%), observados neste experimento, se assemelha aos verificados por
Bollwein et al. (2003), que ao infundirem éguas com diluente ou inseminarem
com sêmen diluído ou sêmen “in natura”, encontraram para este último grupo a
maior concentração de PMN nos esfregaços uterinos. Tais resultados podem
ser explicados, provavelmente, devido a uma contaminação do sêmen usado
(bactérias) que impediram uma queda maior dos neutrófilos, nos esfregaços
deste grupo. Podendo também estar associado um deficiente relaxamento
cervical que impediu uma melhor drenagem uterina, fato sugerido por Gomes
(2002) que encontrou uma pronunciada resposta uterina dos animais
inseminados no corpo uterino com dose convencional (800 x106 de sptz), em
todos os momentos – 6 e 24 horas (P<0,05).
88
Kakeya et al. (1998) trabalharam com 3 grupos de éguas que receberam
sêmen com diluente a base de leite desnatado, sêmen com extensor a base de
gema de ovo e sêmen “in natura” e observaram que a citologia apresentou
resultados semelhantes entre os três grupos (P>0,05) nos momentos
estudados (1 hora e 24 horas após as Inseminações).
Verificamos que tanto o sêmen “in natura”, como as células
criopreservadas
ou
os
componentes
do
meio
(desprovidos
de
espermatozóides) ofereceram um forte estímulo à reação inflamatória, pois
possuem elementos antigênicos importantes que produziram respostas
uterinas semelhantes.
Contudo, a queda apresentada no momento 24 horas pós Inseminação
sugere a eficiência dos mecanismos de defesa uterino das jumentas para
debelar a reação ocorrida, caracterizando como transitória e normal a
inflamação detectada.
Tanto Troedson et al (1998) como Watson (2000) alegaram que a
resposta uterina frente ao sêmen congelado pode alterar a fertilidade dos
fêmeas trabalhadas, caso o mecanismo de defesa do órgão esteja
comprometido, levando a um atraso na “higienização” do útero.
Embora não tenhamos na literatura comparações entre jumentas, os
dados gerados pelo nosso ensaio apontam que os animais não possuíam falha
para debelar a infecção provocada, podendo ser consideradas “fêmeas
competentes”.
Desta forma vericamos que, em nosso experimento, as jumentas
produziram respostas uterinas semelhantes em todos tratamentos e momentos;
e que a ausência de gestação em asininos, aparentemente, não está
89
relacionada a uma reação inflamatória mais exacerbada ou persistente ao
sêmen congelado, que comprometa a higidez deste órgão.
Por outro lado, não foi possível detectar e corrigir uma provável falha na
metodologia para alcançar fertilidade em jumentas com o uso de sêmen
criopreservado. Face às dificuldades para se lograr êxito na gestação de
asininos, deve-se retornar ao estudo da fisiologia, endocrinologia e anatomia
do trato genital da jumenta com relação a uma provável incompatibilidade na
interação do sêmen congelado com o aparelho reprodutor das jumentas, pois o
mesmo protocolo proporcionou, em fêmeas de espécie diferente (égua), um
índice de fertilidade satisfatório.
90
7- CONCLUSÕES
Com base nas condições do presente experimento podemos concluir:
-
O uso do MP50 associado as diversas combinações de crioprotetores
proporcionou similar proteção aos espermatozóides de jumentos
envasado tanto em meio-macrotubo (2,5 mL) como em palhetas (0,5
mL).
-
Não há influência na congelabilidade quando se utiliza os crioprotetores
e suas combinações no diluidor MP50 para o sêmen de jumentos.
- O método de envase não interferiu na qualidade do sêmen descongelado.
-
Apesar do uso de diversos crioprotetores, concentrações, volumes,
desglicerolização, momentos e local de inseminação, não foi possível
obter gestação em jumentas, com o uso do sêmen de jumento
congelado.
-
O uso do sêmen de jumentos criopreservado, em éguas, resultou em
índices de fertilidade satisfatório.
-
A reação inflamatória em jumentas, verificada neste trabalho, não
parece ser fator determinante do insucesso, quando do emprego do
sêmen criopreservado em asininos.
91
8- CONSIDERAÇÕES FINAIS
-
Novas pesquisas deverão ser realizadas para determinar os fatores
relacionados ao insucesso do emprego do sêmen congelado em
asininos.
92
8 - BIBLIOGRAFIA
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104
9 - ANEXOS
Anexo 1 - Formulação do meio diluente de Kenney (Kenney et al.,1975)
CONSTITUINTE
QUANTIDADE
Glicose
49g
Leite desnatado
24g
Bicarbonato de sódio a 10%
7,5ml
Gentamicina
200mg
Água bidestilada
1000ml
105
Anexo 2 - Ajuste do HTMA – IVOS – 10 para as realizações das análises
seminais em eqüinos (Ferreira, 2000).
Parâmetros
Número de pontos examinados
Ajuste
30
Contraste das células em relação ao campo
60 pixels
Tamanho mínimo das células
3 pixels
Contraste para células móveis
30 pixels
Limite inferior para o índice retilíneo
80%
Referência para velocidade média (VAP)
<70µm/s
Referência para velocidade lenta (VCL)
<30µm/s
Referência para velocidade lenta (VSL)
<20µm/s
Limite inferior de tamanho
0,62 pixel
Limite superior de tamanho
2,98 pixel
Limite inferior de intensidade
0,24
Limite superior de intensidade
1,19
Limite inferior de alongamento
0%
Limite superior de alongamento
100%
Lentos contados como móveis
Não
Magnificação
1,95
106
Anexo 3 - Soluções de estoque para utilização na técnica de fluorescência
para avaliação de integridade de membrana plasmática do
espermatozóide.
Soluções
Estoque IP
Componentes
Quantidade
Iodeto de Propídio
10 mg
Solução Fisiológica
20 mL
Diacetato de Carboxifluoresceína
9,2 mg
Dimetilsulfóxido
20 mL
Formalina 40%
1 mL
Solução Fisiológica
79 mL
Estoque CFDA
Estoque de
Formaldeído
Estoque de citrato de
sódio
Citrato de Sódio
3g
Solução Fisiológica
100 mL
Anexo 4 – Solução de trabalho para coloração fluorescente para avaliação da
integridade de membrana plasmática do espermatozóide.
Solução
Solução de citrato de sódio 3%
Volume
0,96 mL
Solução de formaldeído
10 µl
Solução de Iodeto de Propídio
10 µl
Solução de Carboxifluoresceína
20 µl
107
Anexo 5 - Diluente MP50
- Solução Inicial (para 100 mL de diluente)
Ingredientes
1- Água deionizada e destilada
(aquecida)
2- Glicose anidra1
3- Citrato de Sódio1
4- EDTA1
5- Lactose1
6- gema de ovo
7- OEP2
Quantidade
70 mL
2,267 g
0,030 g
0,0183 g
2,549 g
4,760 mL
0,158 mL
- Solução Final
Ingredientes
1- Solução Inicial totalmente
dissolvida
2- Leite em pó desnatado3
3- Citrato de Potássio1
4- Rafinose1
5- Hepes1
6- DME4
7- Amicacina1
8- Bicarbonato de Sódio 10%1
9- Ägua deionizada e destilada
aquecida qsp
Quantidade
75 mL
2,475 g
0,032 g
0,060 g
0,188 g
0,344 g
0,020 g
0,6 mL
95 mL
Após completa dissolução da solução final, centrifugar a 5000rpm/20min
e, se necessário corrigir novamente o volume para 95 mL e adicionar os
crioprotetores.
108