UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
AVALIAÇÃO DO INFILTRADO DE CÉLULAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO
NO ESTROMA DO COLO UTERINO DE PACIENTES COM NEOPLASIA
INTRA-EPITELIAL CERVICAL GRAU II – III APÓS TRATAMENTO COM
INTERFERON ALFA-2B INTRALESIONAL
FERNANDA ALVES MACHADO
UBERABA-MG
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
AVALIAÇÃO DO INFILTRADO DE CÉLULAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO
NO ESTROMA DO COLO UTERINO DE PACIENTES COM NEOPLASIA
INTRA-EPITELIAL CERVICAL GRAU II – III APÓS TRATAMENTO COM
INTERFERON ALFA-2B INTRALESIONAL
Dissertação apresentada ao curso de pós-graduação
em Patologia, área de concentração Patologia
Clínica, da Universidade Federal do Triângulo
Mineiro, como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Eddie Fernando Cândido
Murta
Co-Orientadora: Prof.a Dr.ª Márcia Antoniazi
Michelin
Uberaba - MG
Junho/2011
Dedicatória
A Deus e a Jesus Cristo:
Por sempre estarem presentes em minha vida e na minha jornada, me amparando em
todos os momentos, e possibilitando que mais um dos meus sonhos fosse concretizado;
Aos meus pais:
Antunino A. Machado e Erli S. Alves, por terem me proporcionado todas as condições
possíveis para os meus estudos e por terem acreditado em mim; a vocês meu muito
obrigada;
Aos meus irmãos:
Por todo carinho, ajuda e incentivo; saibam que vocês contribuíram muito com esta
conquista;
Às minhas lindas sobrinhas:
Tamiê e Maitê, pela alegria de tê-las por perto; obrigada por fazerem parte da minha
vida;
À minha querida avó:
Izolda S. Alves, pelo exemplo de vida, pela fé e por toda dedicação;
Ao meu namorado:
Pelo amor, compreensão, carinho, paciência e constantes estímulos e incentivos para que
este trabalho se realizasse;
Ao meu orientador:
Eddie Fernando C. Murta, pela oportunidade, apoio e confiança depositada em mim.
Obrigada por proporcionar esta alegria na minha trajetória pessoal e profissional.
iii
Agradecimentos
Agradeço à Universidade Federal do Triângulo Mineiro, pelo estímulo a pesquisa
e por acreditar que o conhecimento transforma toda uma sociedade e realiza sonhos.
Ao Prof. Dr. Eddie Fernando Cândido Murta, pela orientação e pelo exemplo de
dedicação a pesquisa.
À Prof.ª Dr.ª Márcia Antoniazi Michelin, pela co-orientação e pela inestimável
contribuição ao meu aprendizado.
À Prof.ª Dr.ª Sheila Jorge Adad, pela disposição e boa vontade em me auxiliar
neste trabalho e pelos ensinamentos transmitidos.
À Dr.ª Renata Margarida Etchebere, que se dispôs do seu tempo para enriquecer
este trabalho, sendo sua contribuição inestimável.
A todos os professores do curso de Pós-graduação em Patologia, pela contribuição
ao ensino.
Aos Doutores, Cléber Sérgio da Silva, Marília de Carvalho Mardegan e Paulo José
Maluf, pela grandiosa contribuição das suas teses de mestrado e doutorado juntamente à
disciplina de Ginecologia e Obstetrícia, para com a continuidade deste trabalho.
Aos técnicos de laboratório Eliângela de Castro Côbo, pelo apoio técnico na
realização dos testes de imunohistoquímica e principalmente pela amizade e carinho; e
Celso Tadeu Barbosa dos Santos, pelo auxílio fornecido no Instituo de Pesquisa em
Oncologia (IPON).
Às funcionárias da citologia Heloísa Helena Vieira, Nilva Aparecida da Silva
Aveiro, Zelma Rocha Camargos Pereira e Dóris Lima Dayrell de Carvalho pela amizade,
auxílio jamais negado e agradável convivência.
A todos os funcionários e residentes do departamento de Patologia Cirúrgica da
UFTM, em especial, Juliano, Daniela e Alexandre, pelo auxílio e amizade.
À secretária da disciplina de Ginecologia e Obstetrícia, Andréa Carneiro
Bevilaqua Pinheiro, pelo auxílio sempre de imediato.
Às secretárias da pós-graduação Nelma Aparecida Ferreira Salgado e Denise
Teresinha Cardoso, pela atenção e colaboração.
Á funcionária do departamento de prontuários Luciana Teixeira Fantini, pela
atenção e boa vontade.
Agradeço aos amigos da Pós-graduação em Patologia: Ariana Borges, Bethânea
Peghini, Cláudia Mendonça, Bruna França, Nelson Ranieri, Marisa de Carvalho, Daniela
Misson, Tânia de Oliveira, Jéssica Líver, Juliana Machado e Marcos Vinícius pela
amizade, auxílio e respeito.
v
Às pacientes, por tornarem possível a realização deste trabalho, contribuindo
diretamente pelo avanço da pesquisa, meu respeito e agradecimento.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal e Ensino Superior (CAPES),
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Financiadora de Estudos
e Projetos (FINEP) e Fundação de Ensino e Pesquisa de Uberaba (FUNEPU), pelo apoio
financeiro.
E a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.
vi
Sumário
1. Introdução..................................................................................................................... 20
1.1 - Papiloma Vírus Humano (HPV).......................................................................21
1.2 - Câncer de Colo Uterino e Lesões Precursoras..................................................22
1.3 - Relação entre HPV e Câncer de Colo de Útero................................................23
1.4 - Resposta Imune e Câncer..................................................................................24
1.5 - Imunidade do Sistema Reprodutor Feminino....................................................26
1.6 - Citocinas...........................................................................................................28
1.7 - Imunoterapia com Interferons – IFN................................................................30
2. Justificativa....................................................................................................................35
3. Hipótese..........................................................................................................................37
4. Objetivos.........................................................................................................................39
4.1 - Objetivo Geral..................................................................................................40
4.2 - Objetivos Específicos.......................................................................................40
5. Material e Métodos........................................................................................................41
5.1 – Material............................................................................................................42
5.1.1 - Pacientes............................................................................................42
5.1.2 - Aspectos Éticos.................................................................................43
5.2 – Métodos...........................................................................................................43
5.2.1 - Colposcopia e Anátomo Patológico..................................................43
5.2.2 - Aplicação do Interferon....................................................................44
5.2.3 - Método Imuno-histoquímico.............................................................45
5.2.4 - Técnica Imuno-histoquímica.............................................................46
5.2.5 - Critério de Análise............................................................................47
5.2.6 – Análise Estatística ...........................................................................48
6. Resultados.......................................................................................................................49
viii
7. Discussão.........................................................................................................................73
8. Conclusões......................................................................................................................91
9. Referências Bibliográficas............................................................................................93
10.
Resumo..................................................................................................................107
11.
Abstract.................................................................................................................110
Anexos
Anexo A - Parecer consubstanciado aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Anexo B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Anexo C - Distribuição das pacientes segundo a contagem de células
ix
Lista de Figuras
Prancha 1. Imagens colposcópicas das lesões antes do tratamento e após o seu término.
Prancha 2. Cortes histológicos de paciente que obteve boa resposta ao tratamento
(paciente 4). A. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica
mostrando células positivas com marcação CD3+ coradas em marrom (aumento de 400
vezes): A1 – Antes do tratamento, A2 – Após o tratamento. B. Corte histológico corado
através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD4+
coradas em marrom (aumento de 400 vezes): B1 – Antes do tratamento, B2 – Após o
tratamento. C. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica
mostrando células positivas com marcação CD8+ coradas em marrom (aumento de 400
vezes): C1 – Antes do tratamento, C2 – Após o tratamento. D. Corte histológico corado
através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação para
CD16+ coradas em marrom (aumento de 400 vezes): D1 – Antes do tratamento, D2 – Após
o tratamento.
Prancha 3. Cortes histológicos de paciente que obteve boa resposta ao tratamento
(paciente 4). E. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica
mostrando células positivas com marcação CD20+ coradas em marrom (aumento de 400
vezes): E1 – Antes do tratamento, E2 – Após o tratamento. F. Corte histológico corado
através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação
CD68+ coradas em marrom (aumento de 400 vezes): F1 – Antes do tratamento, F2 – Após
o tratamento. G. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica
mostrando células positivas com marcação iNOS coradas em marrom (aumento de 400
vezes): G1 – Antes do tratamento, G2 – Após o tratamento. H. Corte histológico corado
através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação
Perforina coradas em marrom (aumento de 400 vezes): H1 – Antes do tratamento, H2 –
Após o tratamento.
Prancha 4. Cortes histológicos de paciente que obteve falha terapêutica (paciente 10). A.
Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células
positivas com marcação CD3+ coradas em marrom (aumento de 400 vezes): A1 – Antes do
tratamento, A2 – Após o tratamento. B. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD4+ coradas em marrom
(aumento de 400 vezes): B1 – Antes do tratamento, B2 – Após o tratamento. C. Corte
xi
histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas
com marcação CD8+ coradas em marrom (aumento de 400 vezes): C1 – Antes do
tratamento, C2 – Após o tratamento. D. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação para CD16+ coradas em
marrom (aumento de 400 vezes): D1 – Antes do tratamento, D2 – Após o tratamento.
Prancha 5. Cortes histológicos de paciente que obteve falha terapêutica (paciente 10). E.
Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células
positivas com marcação CD20+ coradas em marrom (aumento de 400 vezes): E1 – Antes
do tratamento, E2 – Após o tratamento. F. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD68+ coradas em marrom
(aumento de 400 vezes): F1 – Antes do tratamento, F2 – Após o tratamento. G. Corte
histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas
com marcação iNOS coradas em marrom (aumento de 400 vezes): G1 – Antes do
tratamento, G2 – Após o tratamento. H. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação Perforina coradas em
marrom (aumento de 400 vezes): H1 – Antes do tratamento, H2 – Após o tratamento.
Prancha 6. A, B, C e D. Cortes histológicos de tecido corados através da técnica de
imunohistoquímica, mostrando células positivas coradas em marrom (B, C e D), ilustrando
o escore de Georgiannos (GEORGIANNOS et al, 2003) 0, 1, 2 e 3, respectivamente
(aumento de 400 vezes).
Figura 1. Indução, Produção e Ação do IFN Tipo I.
xii
Lista de Tabelas e Gráficos
Tabela 1. Transformações imunológicas no estroma durante a carcinogênese ...................28
Tabela 2. Anticorpos utilizados, classes, diluições, marca e marcação proposta.................45
Tabela 3. Diagnóstico final e inicial por biópsia de todas as pacientes e conduta tomada em
cada caso, após o término do tratamento...............................................................................50
Tabela 4. Idade da sexarca, número de gravidezes e estilo de vida de cada paciente..........51
Tabela 5. Distribuição de CD3, CD4. CD8, CD16, CD20, CD68, iNOS, Perforina no
estroma cervical de pacientes com NIC II/III tratadas com interferon [n (%)]....................53
Tabela 6. Distribuição de CD3, CD4. CD8, CD16, CD20, CD68, iNOS, Perforina no
estroma cervical de pacientes com NIC II/III tratadas com interferon que obtiveram boa
resposta ao tratamento [n (%)].............................................................................................56
Tabela 7. Distribuição de CD3, CD4. CD8, CD16, CD20, CD68, iNOS, Perforina no
estroma cervical de pacientes com NIC II/III tratadas com interferon que obtiveram má
resposta ao tratamento [n (%)].............................................................................................58
Tabela 8. Distribuição de CD3, CD4. CD8, CD16, CD20, CD68, iNOS, Perforina no
estroma cervical de pacientes com NIC II/III anterior ao tratamento com interferon, que
obtiveram boa e má resposta ao tratamento [n (%)].............................................................61
Tabela 9. Distribuição de CD3, CD4. CD8, CD16, CD20, CD68, iNOS, Perforina no
estroma cervical de pacientes com NIC II/III após o tratamento com interferon, que
obtiveram boa e má resposta ao tratamento [n (%)].............................................................63
Gráfico 1. Distribuição proporcional (Forte/Fraca) de linfócitos T e perforina, em
percentagem, antes e após o tratamento com IFN................................................................54
xiv
Gráfico 2. Distribuição proporcional (Forte/Fraca) de células NK, linfócitos B,
macrófagos e iNOS, em percentagem, antes e após o tratamento com IFN........................55
Gráfico 3. Distribuição proporcional (Forte/Fraca) de linfócitos T e perforina, em
percentagem, antes e após o tratamento com IFN em pacientes que obtiveram boa
resposta.................................................................................................................................57
Gráfico 4. Distribuição proporcional (Forte/Fraca) de células NK, linfócitos B,
macrófagos e iNOS, em percentagem, antes e após o tratamento com IFN em pacientes que
obtiveram boa resposta ........................................................................................................57
Gráfico 5. Distribuição proporcional (Forte/Fraca) de linfócitos T e perforina, em
percentagem, antes e após o tratamento com IFN em pacientes que obtiveram má
resposta.................................................................................................................................59
Gráfico 6. Distribuição proporcional (Forte/Fraca) de células NK, linfócitos B,
macrófagos e iNOS, em percentagem, antes e após o tratamento com IFN em pacientes que
obtiveram má resposta..........................................................................................................60
Gráfico 7. Distribuição proporcional (Forte/Fraca) de linfócitos T e perforina, em
percentagem, em pacientes que obtiveram boa e má resposta, ambas antes do tratamento
com IFN................................................................................................................................62
Gráfico 8. Distribuição proporcional (Forte/Fraca) de células NK, linfócitos B,
macrófagos e iNOS, em percentagem, em pacientes que obtiveram boa e má resposta,
ambas antes do tratamento com IFN....................................................................................62
Gráfico 9. Distribuição proporcional (Forte/Fraca) de linfócitos T e perforina, em
percentagem, em pacientes que obtiveram boa e má resposta, ambas após o tratamento com
IFN........................................................................................................................................64
xv
Gráfico 10. Distribuição proporcional (Forte/Fraca) de células NK, linfócitos B,
macrófagos e iNOS, em percentagem, em pacientes que obtiveram boa e má resposta,
ambas após o tratamento com IFN.......................................................................................65
xvi
Lista de Abreviaturas
APCs - Células Apresentadoras de Antígenos
CD - Cluster Diferentiation
cm - Centímetro
CTL - Linfócito T citotóxico
DAB – Diaminobenzidine-tetrahidrocloridro
DNA - Ácido desoxirribonucléico
E – Early
EDTA: Ácido etileno diamino tetracético
et al: e colaboradores
HIV: Vírus da imunodeficiência humana
HPV: Papiloma Vírus Humano
HSIL: Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau
IFN: Interferon
IFNAR1: Receptor de Interferon tipo 1
IFNAR2: Receptor de Interferon tipo 2
IL: Interleucina
INCA: Instituto Nacional de Câncer
iNKRs: Receptores inibidores de células natural killer
iNOS: Enzima óxido nítrico sintase induzida
IPON: Instituto de Pesquisa em Oncologia
ISGF3: Fator genético 3 estimulador de IFN
ISRE: Elemento responsável pela estimulação do interferon
JAK: Janus-quinases
KB: Kilobases
L: Late
xvii
LAK cells: Células natural killer ativadas por linfocinas
LCR: locus control region
LSIL: Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau
MHC: Complexo de Histocompatibilidade Principal
mL – Mililitro
mRNA - Ácido ribonucleico mensageiro
n: Número
NIC I: Neoplasia intra-epitelial cervical grau I
NIC II: Neoplasia intra-epitelial cervical grau II
NIC III: Neoplasia intra-epitelial cervical grau III
NIC: Neoplasia intra-epitelial cervical
NK: Célula Natural Killer
NO: Óxido nítrico
NOS: Óxido nítrico sintase
Overnight: Durante a noite
p53: Proteína 53
PBS: Solução salina tamponada com fosfato
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
Ph: Potencial hidrogeniônico
PMNs: leucócitos polimorfonucleares
RR: Risco relativo
RT-PCR: Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa
Stats: transdutor de sinal e ativador da família de transcrição
TCR: receptor de células T
TGF-β: Fator de Crescimento Transformante-β
xviii
Th: Linfócito T helper
Treg: Células T reguladoras
TIL - Linfócitos infiltração tumoral
TNF-α: Fator de Necrose Tumoral α
TYK: Enzima tirosina - quinase
U: Unidade universal
%: Porcento
°C: Grau Celsius
2´,5´OAS: 2´5´ Oligoadenilato sintetase
α: Alfa
β: Beta
γ: Gama
κ: Kappa
ω: Ômega
λ: Lambda
xix
Introdução
21
1
1. Introdução
2
3
1.1 Papiloma Vírus Humano (HPV)
4
5
O HPV é um DNA vírus de dupla fita, com aproximadamente 8000 pares de bases,
6
pertencente à família Papovaviridae, que é transmitido pela relação sexual com parceiro
7
portador ou através de fômites, infectando a pele ou a mucosa adotando uma forma de
8
verrugas (BAFVERSTEDT, 1967; DE VILLIERS et al., 2004). É uma das causas mais
9
comuns de doenças sexualmente transmissíveis e continua a ser um tema bastante atual e
10
importante, pois as taxas de infecção não param de aumentar. Em uma pesquisa realizada
11
por FERENCZY et al. (1990) verificou-se que em 17% dos casos, independentemente do
12
tipo viral, foi detectado DNA do HPV na roupa íntima das pacientes com verrugas genitais.
13
Na década de 80, através da técnica de biologia molecular foi descoberto que havia
14
mais de 60 subtipos diferentes de HPV e que alguns desses tipos tinham natureza
15
oncogênica, e atualmente Stanley (2008) já descreve 130 tipos de HPV, dos quais 25
16
aproximadamente infectam a região ano genital feminina. Baseado em sua associação com
17
câncer de colo de útero e lesões precursoras os HPVs podem ser agrupados em HPVs de
18
alto risco (16,18,31,33,34,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68 e 70) e HPVs de baixo risco
19
(6,11,42,43 e 44) (BURD, 2003).
20
Os vírus do HPV possuem como material genético uma dupla fita de DNA de
21
aproximadamente 8KB, com três regiões principais. A primeira contendo genes LCR que
22
regulam a expressão dos genes virais; a segunda região dos genes E (E1-E7) que controlam
23
o ciclo de vida do vírus, e a terceira cujos genes (L1 e L2) codificam proteínas do capsídio.
24
Os genes mais estudados são o E6 e o E7 presente no subtipo 16, que é o mais prevalente
25
(DeVILLIERS et al., 2004).
22
1
Este vírus de cadeia dupla é responsável pelos condilomas genitais e lesões epiteliais
2
proliferativas. A maioria desses tipos manifesta lesões epiteliais benignas (condilomas).
3
Entretanto, alguns tipos específicos (16 e 18) têm uma tendência a provocar Neoplasias
4
Intra-epiteliais Cervicais (NIC) e representam papel essencial na gênese do câncer genital
5
feminino. A incidência de HPV é maior em indivíduos imunodeprimidos por conta de
6
transplantes, uso de corticosteróides, rádio ou quimioterapia, bem como nos pacientes
7
HIV-soropositivos (BELSITO et al., 1982; CHOPRA & TYRING, 1997; SOUTHERN &
8
HERRINGTON, 1998).
9
10
1.2 Câncer de Colo Uterino e Lesões Precursoras
11
12
O segundo tipo de câncer mais comum no Brasil em mulheres é o câncer de colo de
13
útero (INCA, 2010), e nos outros países em desenvolvimento é muitas vezes o câncer mais
14
comum entre as mulheres e podem chegar até 25% de todos os tipos de cânceres do sexo
15
feminino (HARRO et al., 2001). Durante as últimas décadas a prevalência de NIC de alto
16
grau tem aumentado nos países subdesenvolvidos. Atualmente, a incidência de NIC de alto
17
grau tem alcançado proporções significativas sendo que a maioria desses casos afeta
18
mulheres em idade reprodutiva, muitas das quais ainda não haviam completado suas
19
famílias, provocando assim um impacto social.
20
A evolução das neoplasias intra-epiteliais pré-malignas e pré-invasivas pode levar ao
21
desenvolvimento dos carcinomas do colo uterino e, conseqüentemente, do câncer de colo
22
uterino, pois esta está intimamente associada à infecção pelo HPV.
23
A NIC é subdividida em graus 1, 2 e 3 correspondendo respectivamente à displasia
24
leve, moderada e grave (RICHART, 1968). A NIC I é a displasia confinada ao terço
25
inferior do epitélio; a NIC II é a displasia que afeta os dois terços inferiores do epitélio, e a
23
1
NIC III é uma lesão intra-epitelial escamosa na qual as alterações de maturação e as
2
anomalias nucleares afetam mais de dois terços da espessura do epitélio. Para adaptar o
3
sistema de classificação citológica de BETHESDA recomendou-se que as lesões
4
relacionadas com HPV e NIC I seriam incluídos em uma mesma categoria denominada
5
lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau (LSIL) e a displasia moderada e acentuada,
6
NIC II e NIC III, englobariam as lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau (HSIL)
7
(KURMAN, 1994). Utilizam-se as expressões LSIL e HSIL para referir-se ao espectro de
8
lesões
9
(WASHINGTON, 2004).
intra-epiteliais
escamosas,
classificadas
de
outro
modo
como
NIC
10
A identificação da NIC é realizada através do exame microscópico das células cervicais
11
em um esfregaço citológico corado pela técnica de Papanicolaou e sua confirmação é
12
realizada pelo estudo anatomopatológico, classificando-a.
13
A gestação e o parto não influenciam a história natural de NIC. Não se tem apresentado
14
progressão histológica da NIC até o câncer invasivo durante a gravidez (LAPOLLA et al.,
15
1988; PAJTLER et al., 1990). A presença de NIC, independentemente do grau, não
16
constitui uma contra-indicação para o parto normal por via vaginal.
17
18
1.3 Relação entre HPV e Câncer de Colo de Útero
19
20
MEISELS & FORTIN (1976) analisando exames de Papanicolaou de portadoras de
21
displasias cervicais, descreveram células escamosas aumentadas, multinucleação,
22
hipercromasia, halos perinucleares e anfofilia, e as chamou de coilócitos. Dois anos após,
23
detectaram partículas virais em lesões cervicais que apresentavam atipia coilocitótica
24
(MEISELS et al., 1979). Contudo, mesmo MEISELS et al (1979) e HILLS & LAVERTY
25
(1979) detectando a presença de partículas virais agregadas à cromatina nuclear em lesões
24
1
cervicais que apresentavam atipia coilocitótica, somente esta análise morfológica não
2
permitia um diagnóstico seguro da infecção pelo HPV e outros testes confirmatórios eram
3
desejáveis. A GISSMANN & ZÜR HAUSEN (1980) couberam, através de biologia
4
molecular, isolar e caracterizar os primeiros tipos de HPV em NIC (HPV tipo 6).
5
As características da NIC de baixo e alto grau e sua relação com o HPV têm diferenças
6
nos perfis epidemiológicos. O número de parceiros sexuais durante a vida se relacionou
7
com um maior risco relativo (RR) em caso de NIC de baixo e alto grau (HARRIS et al.,
8
1980; CUZICK et al., 1990; BRISSON et al., 1994). Em caso de hábito tabagístico e uso
9
de anticoncepcionais orais, demonstra uma relação com NIC de alto grau. A presença de
10
DNA de HPV 16 se relaciona significativamente com NIC de alto grau (BRISSON et al.,
11
1994).
12
As técnicas de biologia molecular aprimoraram o conhecimento sobre o perfil
13
epidemiológico da infecção por HPV e permitiram seqüenciar o DNA-HPV, bem como
14
reconhecer os diferentes subtipos do vírus (KOUTSKY et al., 1988). Atualmente, a PCR é
15
considerada o método mais sensível para a detecção da infecção pelo HPV, uma vez que a
16
hibridização in situ é limitada pelo número de cópias de HPV (ZEHBE et al., 1996;
17
MERKELBACH - BRUSE et al., 1999). Os estudos por meio de técnicas de biologia
18
molecular têm sugerido que, apesar de uma citologia normal, 40% das mulheres jovens
19
sexualmente ativas possuem o DNA de HPV e que sua prevalência diminui com a idade
20
(LEY et al., 1991; BAUER et al., 1991-1993; MELKERT et al., 1993).
21
22
1.4 Resposta Imune e Câncer
23
24
Os tumores expressam antígenos que são reconhecidos pelo sistema imune, mas a
25
maioria dos tumores é fracamente imunogênica e as respostas imunes com freqüência não
25
1
previnem o crescimento de tumores. A principal razão para o interesse em uma abordagem
2
imunológica é que as terapias atuais contra o câncer se baseiam em medicamentos que
3
destroem as células que se dividem ou bloqueiam a divisão celular, e esses tratamentos têm
4
efeitos graves nas células normais em proliferação dos pacientes com câncer. Como
5
conseqüência, o tratamento contra cânceres causa morbidade e mortalidade significativas.
6
Respostas imunes contra tumores podem ser específicas para antígenos tumorais e não irão
7
causar danos à maior parte das células normais. Assim, a imunoterapia tem o potencial de
8
ser o tratamento mais específico para tumores que pode ser elaborado. Avanços na
9
compreensão do sistema imune e na definição de antígenos em células tumorais têm
10
motivado muitas novas estratégias (ABBAS, LICHTMAN & PILLAI, 2008).
11
O sistema imunológico tem um importante papel na prevenção de tumores, pois ele
12
pode especificamente identificar e eliminar as células tumorais, com base na sua expressão
13
de tumor-antígenos específicos ou moléculas induzidas por estresse celular. Este processo
14
é denominado vigilância imunológica, onde o sistema imunológico identifica e elimina
15
células cancerosas e/ou pré-cancerosas antes que elas possam causar danos (SWANN &
16
SMYTH, 2007). DUNN e colaboradores (2002) acreditam que o sistema imunológico pode
17
proteger alguns patógenos assim como células tumorais, propiciando o desenvolvimento de
18
infecções e tumores.
19
A imunidade celular mediada por células T tem um importante papel na erradicação
20
das células infectadas pelo HPV. Falhas na indução ou manutenção da resposta das células
21
T podem levar à infecção persistente e ao desenvolvimento de neoplasias malignas
22
(STIEPCICH, 2000). Os linfócitos T CD4 auxiliam na resposta imune promovendo a
23
secreção de citocinas e mediadores que ativam células da resposta imune, tais como os
24
macrófagos e linfócitos B. Os linfócitos T CD8 promovem a morte de células infectadas ou
25
tumorais, por meio da ação dos seus grânulos tóxicos (TERR & STITES, 1992).
26
1
No interior dos grânulos linfocitários, a perforina permanece armazenada na forma de
2
monômeros e quando é liberada dos grânulos na fenda sináptica, os monômeros entram em
3
contato com altas concentrações de cálcio extracelulares e sofrem polimerização (KAGI et
4
al., 1994; LOWIN et al., 1994). Esta polimerização ocorre preferencialmente na membrana
5
plasmática da célula alvo, onde a perforina polimerizada forma um poro de 5 a 20nm
6
(SAUER et al., 1991). Quando um número suficiente destes canais é reunido, a célula se
7
torna incapaz de eliminar íons e água, o que determina a morte celular.
8
Vários estudos descrevem como o HPV interage com o sistema imune (STANLEY,
9
2001) e como o vírus inativa a resposta imune adaptativa (TINDLE, 2002). Há diminuição
10
na expressão das moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MCH) de
11
classe I e das cadeias dos receptores de células T (TCRs), prejudicando a apresentação dos
12
antígenos às células T. Desta forma diminui o reconhecimento imunológico dos linfócitos
13
CD8+ do hospedeiro às células infectadas pelo HPV. Além disso, o vírus não tem uma fase
14
de disseminação sanguínea, não causa lise dos queratinócitos e, portanto não induz uma
15
resposta inflamatória e a produção e liberação do vírus ocorre nas células escamosas
16
diferenciadas que estão distantes das células imunocompetentes e citocinas na submucosa
17
(STANLEY, 2001; STERN et al., 2000; KONYA & DILLNER, 2001).
18
19
1.5 Imunidade do Sistema Reprodutor Feminino
20
21
A imunologia tumoral é uma promissora área de investigação em câncer e atualmente,
22
está presente na terapia médica (KOHLBERGER & GITSCH, 2001). Respostas imune
23
tumor-específica são observadas em pacientes com câncer, visto que na massa tumoral
24
estão presentes infiltrados com linfócitos T citotóxicos (CTLs) e células Natural Killer
25
(NK). Padrões alterados de moléculas do complexo de histocompatibilidade principal
27
1
(MHC) classe I e II são observadas na superfície de células tumorais (CLERICI et al.,
2
1998; JANEWAY & TRAVERS, 1997) .
3
A primeira linha de defesa, a resposta inata, se origina no estroma, mas também está
4
presente no epitélio ou próximo deste (UTHAISANGSOOK et al., 2002). Esta resistência
5
não específica ocorre quando agentes patogênicos apresentam mecanismos de evasão do
6
sistema imunológico, evitando uma resposta imune do tipo adaptativo (específica). A
7
resposta imune inata é mediada por diversos mecanismos, incluindo a indução de
8
interferon (IFN), ativação de macrófagos e células NK podendo levar à ativação de uma
9
resposta específica.
10
A parte alta do trato genital feminino tem tanto uma resposta imune inata
11
(ROBERTSON, 1998) quanto adquirida (AGRAWAL et al., 2008), que o mantém em um
12
estado predominantemente asséptico. No início da doença cervical, as células infectadas
13
pelo HPV necessitam escapar do sistema imunológico.
14
Durante a progressão da doença há diminuição das citocinas do tipo Th1 e citocinas do
15
tipo Th3/Treg tornam-se predominantes (ALCOCER-GONZALEZ et al., 2006). Além
16
disso, pacientes com NIC apresentaram redução na expressão de receptores para IFN-α
17
com relação ao tecido normal. Baixos níveis de cópias IFN-γ mRNA são vistos em
18
biópsias tumorais e relacionadas com prognóstico (TARTOUR et al., 1998) .
19
LEE et al. (2004) demonstraram que mulheres com diagnóstico de HSIL apresentaram
20
diminuição acentuada na produção de citocinas do perfil Th1, sugerindo que também pode
21
ter ocorrido um comprometimento na função citolítica das células T CD8+.
22
Em resumo, a infecção pelo vírus HPV induz respostas imunes inata e adquirida no
23
estroma do hospedeiro. Esta defesa imunológica é delicada, equilibrada e nem sempre é
24
possível prevê-la. O tratamento clínico é principalmente determinado pelo risco, evolução
25
e prognóstico. Dados são demonstrados na tabela II.
28
1
Tabela 1 - Transformações imunológicas no estroma durante a carcinogênese.
Infecção HPV
Inflamação/infecção
Fatores de risco para
resistente
carcinogênese
Aumento
Diminuição CD4+
Progressão NIC
Prognóstico câncer
invasivo
Diminuição
CTL ou células TIL
macrófagos
CD8+
Células NK
Aumento células NK
Diminuição
Aumento CD3
CD4+
Aumento iNKRs
Diminuição IL-10
Perda
Aumento IFN
Diminuição IFN
progressiva
Aumento IL-1
Diminuição citocinas tipo 1
citocinas tipo 1
Diminuição citocinas tipo2
Baixa atividade IFN
de
MHC I prejudicado
2
3
Células do câncer cervical podem promover a expressão de receptores inibidores de
4
células natural killer (iNKRs) via IL-15 e, possivelmente, por mecanismo mediado por
5
TGF-β e pela anulação citotóxica antitumoral dos TILs (linfócitos infiltração tumoral)
6
(SHEU et al., 2005) . A compreensão dos mecanismos do sistema imunológico, a definição
7
de antígenos em células tumorais e seus respectivos escapes são de fundamental
8
importância na concepção de novas estratégias terapêuticas.
9
10
1.6 Citocinas
11
12
As citocinas são glicoproteínas secretadas por células não imunes e principalmente por
13
células imunes. Hoje, sabe-se que vários tipos celulares têm a capacidade de sintetizar e
14
liberar essas proteínas. Estes mediadores são responsáveis pelas respostas biológicas de
29
1
células imunes e estão envolvidos no crescimento, na motilidade, na diferenciação e
2
principalmente na função desempenhada pela célula (EAD, 2008).
3
As respostas imunes são mediadas pela liberação de diferentes citocinas. Estas,
4
secretadas por linfócitos T CD4+ foram originalmente classificadas em padrão T helper 1
5
(Th1), T helper 2 (Th2), T helper 3 (Th3) ou T regulatório (Treg) e recentemente
6
descobriu-se uma nova população, que é o tipo T helper 17 (Th17). As citocinas mais
7
importantes do padrão Th1 são IL-2, IL-12, IFN-γ e TNF-α que são responsáveis por ativar
8
a resposta imune celular. O padrão Th2, como por exemplo, IL-4, IL-10 e TGF-β estão
9
diretamente relacionadas na ativação da resposta imune humoral. Já o tipo Treg é
10
caracterizado pela presença de IL-10 e TGF-β que podem suprimir a resposta imunológica
11
indiretamente, pela diminuição da expressão de co-estimuladores nas APCs, ou
12
diretamente nas células T. Este padrão parece estar envolvido na indução de tolerância. As
13
células do perfil Th17 secretam IL-17 (IL-17a e IL-17f), além de também secretarem IL-
14
10, IL-21 e IL-22. Elas são responsáveis ou participam, na indução de muitas reações
15
inflamatórias ricas em neutrófilos. Assim, as células do perfil Th17 podem ser importantes
16
mediadores de dano tecidual em doenças inflamatórias imunomediadas (ZHU & PAUL,
17
2008; ABBAS, LICHTMAN & PILLAI, 2008).
18
Os subconjuntos mais bem definidos de células T efetoras da linhagem auxiliar CD4+
19
são as células Th1 e Th2. As células Th1 podem mediar respostas imunes contra patógenos
20
intracelulares (MOSMANN & COFFMAN, 1989; PAUL & SEDER, 1994). Nos seres
21
humanos, desempenham um papel particularmente importante na resistência a infecções
22
por micobactérias. A principal citocina produzida é o IFN- γ, sendo esta a citocina de
23
identificação do perfil de células Th1. O IFN- γ ativa macrófagos e IL-2 que estimula o
24
crescimento de células T antígeno-específico, resultando em doença mais branda ou cura
25
(ABBAS, LICHTMAN & PILLAI, 2008; ZHU & PAUL, 2008).
30
1
As células Th2 medeiam a defesa contra parasitas extracelulares, incluindo helmintos
2
(MOSMANN & COFFMAN, 1989; PAUL & SEDER, 1994; ABBAS, LICHTMAN &
3
PILLAI, 2008; ZHU & PAUL, 2008). As células Th2 produzem: IL-4, IL-5, IL-9, IL-10,
4
IL-13, IL-25, sendo que a IL-4 e IL-5 são as citocinas que definem o perfil de células Th2
5
(ZHU & PAUL, 2008; ABBAS, LICHTMAN & PILLAI, 2008). A IL-4 estimula a
6
produção de IgE e ambas, IL-4 e IL-10 estimulam células B e inibem ativação de
7
macrófago, resultando em infecção progressiva (SIELING & MODLIN, 1994).
8
A regressão da infecção pelo HPV tem sido associada a uma resposta imunológica
9
mediada por citocinas de padrão Th1 e o desenvolvimento do NIC parece ser mediado por
10
citocinas de padrão Th2 (MICHELIN & MURTA, 2008). A inflamação, que desempenha
11
um papel central na imunidade inata, é estimulada por citocinas, como a IL-1 e o TNF-α,
12
que são sintetizados por queratinócitos após uma agressão por infecção viral (ANSEL et
13
al., 1990). Essas citocinas estimulam mudanças na aderência das moléculas e
14
permeabilidade capilar, bem como a liberação de outras citocinas (KYO et al., 1994). A
15
inflamação aguda leva à eliminação da infecção e reparo tecidual, e é responsável por
16
desencadear a imunidade adquirida. Alterações nos perfis Th1 e Th2 de citocinas foram
17
demonstradas em humanos com doenças neoplásicas (SHARMA et al., 2007). Além disso,
18
a inflamação crônica, que ocorre em caso de persistência da infecção, tem sido considerada
19
um fator de risco que pode acionar a carcinogênese (GONDA & WANG, 2009).
20
21
1.7 Imunoterapia com Interferons – IFN
22
23
Os interferons foram descobertos e isolados por ISAAC & LINDENMANN em 1957 e
24
desde então vários estudos com estas citocinas foram realizados, tanto in-vitro quanto em
25
animais, demonstrando a eficácia do interferon contra tumores. Assim, nas duas últimas
31
1
décadas, o tratamento das neoplasias cervicais intra-epiteliais com interferon tem sido
2
bastante discutido, estudado e analisado (BYRNE et al., 1986; DI ROMA et al., 2001;
3
DUNHAM, 1990; FRAZER et al., 1999; FROST et al., 1990; MICHELETTI et al., 1992;
4
MURTA & TAVARES, 2004; ROTOLA et al., 1995; SCHIFFMAN, 1995; SIKORSKI &
5
ZRUBEK, 2003).
6
Interferon é um grupo de citocinas que tem importantes atividades antivirais,
7
antiangiogênicas, antitumoral e imunomoduladoras no sistema imune e são classificados
8
em IFN tipo I, IFN tipo II e IFN tipo III. Ambos os tipos de IFN inibem a expressão de
9
mRNA a partir das proteínas E6 e E7 em células imortalizadas pelo HPV
10
(WOODWORTH et al., 1993; JOHNSON et al., 1999; KHAN et al., 1993; PEREA et al.,
11
1995; FONTAINE et al., 2001; NAWA et al., 1990).
12
O IFN tipo I consiste do IFN-α, IFN-β, IFN-ω e IFN-κ; tipo II consiste do IFN-γ como
13
único representante e o tipo III é representado pelos IFNs λ1, λ2 e λ3 (referidos
14
respectivamente como IL-29, IL-28A e IL-28B) (NOMELINI et al., 2007; ANK et al.,
15
2006; UZÉ & MONNERON, 2007). Entretanto os mais importantes e estudados são IFN-
16
α, IFN-β e IFN-γ.
17
O tipo I que inclui o IFN-α e β são produzidos pelos leucócitos (fagócitos
18
mononucleares), células epiteliais e fibroblastos, e contribuem para a primeira linha de
19
defesa antiviral, inibindo a proliferação e induzindo apoptose das células infectadas por
20
vírus (DE MARCO et al., 1999). O INF tipo II que inclui o IFN-γ é induzido por linfócito
21
T CD4 (Th1), sendo produzido principalmente por células T CD8 ativadas estimuladas por
22
antígenos estranhos e células Natural Killer (TAKAOKA et al., 2006).
23
Todos os interferons tipo I se ligam a receptores IFN tipo I e IFN-γ se liga a receptores
24
IFN tipo II (STARK et al., 1998). Os receptores de interferons (IFNRs) podem ser
25
divididos em dois tipos: IFNR1 e IFNR2, e ambos são capazes de mediar os efeitos
32
1
biológicos dos IFNs (UZÉ et al., 1992). Estes receptores também são encontrados em
2
células de origem hematopoiética (NOMELINI et al., 2007).
3
O receptor do IFN tipo I (α/β) é membro da família classe II dos receptores de
4
citocinas, são formados por duas subunidades compostas por cadeias polipeptídicas
5
denominadas IFNAR1 e IFNAR2. IFNAR1 é uma glicoproteína de 557 aminoácidos e
6
IFNAR2 existe em três formas distintas, IFNAR-2a (forma curta), IFNAR-2b (forma
7
solúvel) e IFNAR-2c (forma longa) contendo 515 aminoácidos e age como o principal
8
receptor funcional para IFN. Os IFNs tipo II são constituídos por duas subunidades:
9
IFNGR1 e IFNGR2 (CHIEUX, 1999; NOVICK et al., 1994).
10
Os IFNs tipo I (α/β) se ligam ao mesmo receptor, composto de duas subunidades
11
IFNAR1 e IFNAR2 (SCHRODER et al., 2004). Os receptores de IFN tipo I estão
12
associados à enzima tirosina - quinase (TYK) que são fosforiladas em outras tirosina-
13
quinases, Janus-quinases (JAK), que por sua vez fosforilam Stat 1 e Stat 2 (MURRAY,
14
2007). Essas Stats (transdutor de sinal e ativador da família de transcrição) recrutadas,
15
formam o complexo denominado fator genético 3 estimulador de IFN (ISGF3), que é
16
direcionado ao núcleo e induz a transcrição dos genes portadores do elemento responsável
17
pela estimulação do IFN (ISRE) (SCHINDLER & PLUMLEE, 2008).
18
33
1
2
Figura 1. Indução, Produção e Ação do IFN Tipo I
3
4
Com os grandes avanços tecnológicos, os mecanismos de ação para IFN tornaram-se
5
mais fáceis de visualizar. Os efeitos antitumor resultam de uma ação direta sobre a
6
proliferação ou composição antigênica das células tumorais, ou a partir do efeito de
7
modulação em populações de células imunes efetoras com células tumorais específicas
8
(KUFE et al., 2003). O IFN pode induzir a apoptose, ativando a cascata de caspases
9
(MUSCAT et al., 2006; SAIDI et al., 2006). A apoptose induzida por IFN-α foi associada
10
à ativação de caspases 1, 2, 3, 8 e 9 (THYRELL et al., 2002).
11
A imunoterapia tem como objetivos induzir a ativação da resposta imune, resgatando a
12
sua natural eficiência, detendo a multiplicação das células malignas, erradicando tumores
13
de forma seletiva sem provocar lesões ao paciente. Já se encontra no mercado a vacina
14
contra certos tipos de HPV, que pode contribuir para a diminuição da frequência do câncer
15
de colo uterino, porém, não se deve associar esta vacina à prevenção deste câncer e sim a
34
1
proteção contra alguns tipos de HPV de baixo e alto risco (MURTA, 2007). Recentemente
2
têm-se utilizado a imunoterapia com IFN em lesões intra-epiteliais cervicais e invasoras do
3
colo uterino, com resultados promissores (MURTA & TAVARES-MURTA, 2004;
4
FERRANTINI, CAPONE & BELARDELLI, 2008).
5
Murta e colaborador (2004) demonstraram a eficiência do IFN com bons resultados,
6
obtendo resposta completa no tratamento com uma paciente com carcinoma vaginal
7
invasivo usando IFNα-2b intralesional, com remissão total da lesão observada por meio de
8
colposcopia e citologia; a paciente engravidou 3 anos após o tratamento sem qualquer sinal
9
de recidiva durante o seu acompanhamento. Outro caso foi de uma paciente com neoplasia
10
intra-epitelial na vulva, vagina e colo uterino com a utilização do mesmo IFN utilizado
11
anteriormente, concluindo-se que a lesão foi reduzida em todos os sítios e, no caso do colo
12
uterino, apresentou remissão completa da doença (SLOTMAN et al., 1988).
13
Os IFNs também são utilizados no tratamento de pacientes com HPV, porém alguns
14
indivíduos ainda respondem parcialmente ao tratamento visto que, pacientes com baixos
15
níveis de proteína E7 respondem melhor ao tratamento (ARANY et al., 1995).
16
Em um trabalho realizado pelo grupo de estudos do IPON – UFTM demonstrou-se que
17
o IFN é um citocina bastante eficaz no tratamento de NIC II e NICIII, sendo que 62,5%
18
das pacientes obtiveram resposta ao tratamento, ou seja, houve o desaparecimento
19
completo da lesão de alto grau confirmado em estudo histológico (MARDEGAN, 2008).
Justificativa
36
1
2. Justificativa
2
3
O Interferon é um grupo de citocinas que tem importantes funções no sistema imune e
4
vários estudos com estas citocinas foram realizados, tanto in-vitro quanto em animais,
5
demonstrando a eficácia do interferon contra tumores. Assim, nas duas últimas décadas, o
6
tratamento das neoplasias cervicais intra-epiteliais com interferon tem sido bastante
7
discutido, estudado e analisado. Desta forma, a principal finalidade do tratamento com
8
interferon intralesional da NIC, é ser uma opção terapêutica de pacientes em idade fértil
9
por não alterar a anatomia do colo uterino. O tratamento cirúrgico pode levar a alterações
10
do colo uterino, que é um fator de complicações durante a gestação.
11
Sabe-se também que existe a participação de vários mediadores e moléculas no
12
processo de defesa contra o câncer de colo uterino, pois o sistema imunológico tem um
13
importante papel na prevenção de tumores, denominado vigilância imunológica. Portanto,
14
conhecer a intensidade e os diferentes infiltrados locais de células imunes é fundamental
15
para entender os mecanismos envolvidos nos tumores cervicais, pois, pelos nossos
16
conhecimentos não há estudo de relação entre resposta imune local antes e após tratamento
17
com interferon.
Hipótese
38
1
3. Hipótese
2
3
Nos fragmentos coletados por biópsias de pacientes com neoplasia intra-epitelial
4
cervical após tratamento com interferon e que tiveram má resposta ao tratamento, estará
5
presente um maior infiltrado de linfócitos T CD3, observando uma resposta imune contra o
6
tumor ou o tumor em desenvolvimento, por este respectivo mediador.
Objetivos
40
1
4. Objetivos
2
3
4.1 Objetivo Geral
4
5
O presente trabalho tem por objetivo estudar, através do estudo imuhistoquímico,
6
fragmentos coletados por biópsias de pacientes com neoplasia intra-epitelial cervical antes
7
e após tratamento com interferon, o infiltrado de células imunes.
8
9
4.2 Objetivos Específicos
10
11
12
Com o objetivo de avaliarmos as biópsias coletadas das pacientes com neoplasia intraepitelial cervical submetidas ao tratamento com interferon, iremos investigar:
13
14
15
1. Qual o infiltrado de células imunes será predominante nas amostras das pacientes antes
e após tratamento com IFN; utilizando a técnica de imunohistoquímica.
16
2. Verificar a presença de linfócitos T (CD3+, CD4+, CD8+, Perforina), linfócitos B
17
(CD20), NK (CD16), macrófagos (CD68) e a presença de células que expressam a
18
enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS)
19
imunohistoquímica.
nas amostras utilizando a
Material e Métodos
42
1
5. Material e Métodos
2
3
5.1 Material
4
5
5.1.1 Pacientes
6
7
O grupo de estudo foi composto de 13 pacientes com idade entre 23 e 50 anos com
8
diagnóstico de Neoplasia Intra-epitelial Cervical graus II e III submetidas ao tratamento
9
com interferon. De cada paciente foi obtida informações sobre idade, hábitos e condições
10
de vida (tabagismo, uso de drogas terapêuticas, número de parceiros), métodos
11
contraceptivos usados, história de doenças sexualmente transmissíveis e uso de terapia de
12
reposição hormonal. Todos os procedimentos realizados obedeceram aos critérios
13
propostos pelo Comitê de Ética. O estudo realizado foi prospectivo transversal com a
14
participação do Ambulatório Maria da Glória da Universidade Federal do Triângulo
15
Mineiro, das Disciplinas de Ginecologia e Obstetrícia e Patologia, do departamento de
16
Patologia Cirúrgica e do Instituto de Pesquisa em Oncologia (IPON).
17
Os critérios para inclusão foram: ausência de sangramento durante o exame; lesão
18
maior que 1cm²; colposcopia satisfatória; não utilização de antibióticos orais, fungicidas ou
19
cremes vaginais durante os 30 dias anteriores; não utilização de antiinflamatórios ou
20
imunodepressores 15 dias antes do início do tratamento até o término do mesmo; nenhuma
21
atividade sexual por pelo menos dois dias antes do dia da coleta das amostras; e nenhuma
22
história prévia de tratamento para NIC.
23
Os critérios para exclusão foram: pacientes portadoras de doenças imunodepressoras,
24
cardiopatias graves ou com alteração da função hepática ou renal; gestantes; relato de
25
intolerabilidade ao interferon; pacientes cujo uso de antiinflamatórios ou imunodepressores
43
1
não poderiam ser suspensos durante o tratamento com interferon e ausência de lesão
2
visível à colposcopia ou lesão muito pequena (inferior a 1 cm²).
3
4
5.1.2 Aspectos Éticos
5
6
Respeitando todos os aspectos éticos em pesquisa que envolve diretamente seres
7
humanos e com o intuito de garantir o bem-estar destas pacientes, este trabalho foi enviado
8
ao Comitê de Ética da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, sendo aprovado pelo
9
mesmo (Anexo A). Além disso, foi obtido o consentimento livre e esclarecido, por escrito,
10
de cada paciente ou de seus familiares (Anexo B).
11
12
5.2 Métodos
13
14
5.2.1 Colposcopia e Anátomo Patológico
15
16
As pacientes selecionadas de acordo com os critérios descritos anteriormente foram
17
encaminhadas pelo ambulatório de Colposcopia da Universidade Federal do Triângulo
18
Mineiro (UFTM) e já tinham biópsia positiva para lesão de alto grau.
19
As pacientes com alterações no exame colposcópico foram submetidas, mediante
20
consentimento livre e esclarecido, a coleta da biópsia do estroma cervical. O critério para a
21
realização da primeira biópsia foram os achados colposcópicos mais alterados; e para a
22
segunda, o mesmo local da primeira biópsia (pacientes com boa resposta) ou achados
23
colposcópicos alterados (pacientes com má resposta).
44
1
Antes da primeira e da última aplicação, as pacientes foram submetidas a exame
2
colposcópico e tiveram as imagens fotografadas através de videocolposcópico (Programa
3
“Software” Vídeo Diagnose ®).
4
Foi realizado estudo anátomo-patológico dos fragmentos de biópsia de colo uterino
5
embebidos em parafina, pelo Serviço de Patologia Cirúrgica do Hospital Escola – UFTM,
6
sendo que todos os dados clínicos, laboratoriais e histológicos foram arquivados em banco
7
de dados específico para o estudo.
8
9
5.2.2 Aplicação do Interferon
10
11
Foi usado neste trabalho o Interferon alfa-2b humano recombinante 3.000.000 U
R-
12
(Blauferon B
Blausiegel). A caixa da medicação é composta de um frasco-ampola com
13
pó liófilo acompanhado de ampola com diluente de 1,0 ml, acondicionada em geladeira à
14
temperatura 4°C.
15
As aplicações foram realizadas utilizando seringa de 1,0 ml e agulha 13 x 0,45 três
16
vezes por semana em dias alternados (segundas, quartas e sextas-feiras), por 6 semanas
17
consecutivas, perfazendo um total de 18 aplicações, sendo que em cada aplicação era
18
administrada a dose de 3.000.000 U .
19
A exposição do colo uterino foi realizada através da introdução de espéculo vaginal
20
com antissepsia do colo e paredes vaginais com gaze embebida em polvidine tópico
21
usando, para isso, pinça de Cherron. Procedia-se então à aplicação da medicação. Em
22
lesões múltiplas ou ocupando mais de um quadrante do colo, as aplicações foram feitas
23
alternadamente em cada lesão (no caso de lesões isoladas) ou em cada quadrante (no caso
24
de lesões contínuas).
25
45
1
5.2.3 Método Imuno-histoquímico
2
3
Neste estudo utilizamos os anticorpos CD3, CD8, CD4, CD20, CD68, CD16, perforina
4
e a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) para caracterizar infiltrados de células
5
imunes no estroma cervical de biópsias de pacientes com neoplasia intra-epitelial cervical
6
graus II e III tratatadas com interferon. Realizamos cortes histológicos com 4μm de
7
espessura, em lâminas silanizadas ATPS (Silano), Sigma® A3648, e estes corados
8
empregando-se a técnica de imuno-histoquímica (Técnica de Polímeros). A tabela 2 mostra
9
os anticorpos utilizados, seus clones, diluição utilizada, marca e células marcadas.
10
11
Tabela 2 - Anticorpos utilizados, classes, diluições, marca e marcação proposta.
Anticorpo
Clone
Diluição
Marca
Marcação
CD3
Policlonal
1:3.200
Dako
PAN Linfócito T
CD4
Monoclonal
1:300
DBS
Linfócito T
auxiliar
CD8
Monoclonal
1:200
Novo Castra
Linfócito T
citotóxico
CD16
Monoclonal
1:50
Santa Cruz
Natural Killer
CD20
Monoclonal
1:6.000
Novo Castra
PAN Linfócito B
CD68
Monoclonal
1:3.000
Dako
Macrófago
NOS
Policlonal
1:500
Santa Cruz
Enzima NOS
Induzida
Perforina
Policlonal
1:100
Santa Cruz
Linfócito T e
Natural Killer
12
46
1
5.2.4 Técnica Imuno-histoquímica
2
3
4
A resposta inflamatória local foi verificada através da técnica de imuno-histoquímica
nas amostras emblocadas em parafina, através da Técnica de Polímeros.
5
As lâminas contendo cortes histológicos com 4μm de espessura permaneceram na
6
estufa a 56ºC por um período de 24 horas, em seguida foram desparafinizadas em 3 banhos
7
de xilol, permanecendo cerca de 5 minutos em cada, e hidratadas em 3 banhos de álcool
8
absoluto e 1 banho de álcool a 80%, cerca de 10 segundos em cada.
9
Posteriormente as lâminas permaneceram em um banho de solução salina tamponada, o
10
phosat busser saline (PBS) – pH 7,2, durante 5 minutos para hidratação. Logo depois, o
11
excesso de tampão foi removido e a borda do corte secada, cuidadosamente, com papel
12
absorvente. As lâminas foram colocadas em uma bandeja, onde foi adicionada água
13
oxigenada a 3% sobre cada corte, durante 10 minutos, para que houvesse bloqueio da
14
peroxidase endógena. Novamente procedeu-se a lavagem em PBS.
15
A seguir foi realizada a recuperação dos antígenos utilizando a panela Pascal Dako ®;
16
foram adicionados na cuba 45 mL do tampão (TRIS/EDTA – CD4 pH 9,0 e Citrato pH 6,0
17
para os demais anticorpos), com tempo de fervura de três minutos e mais trinta minutos em
18
repouso para baixar a pressão e temperatura da panela. Após essa etapa as lâminas foram
19
novamente lavadas em 3 banhos de 5 minutos no tampão PBS e incubadas com seus
20
respectivos anticorpos primários em torno de 18 horas, em câmara úmida com temperatura
21
de 3 a 4ºC.
22
23
Os anticorpos primários foram diluídos em soro de albumina bovina (Sigma®) de
acordo com as indicações presentes em suas especificações.
24
Após a incubação overnight, as lâminas foram colocadas em temperatura ambiente, em
25
torno de 15 minutos, lavadas em PBS e secadas como anteriormente. O reagente pós-
47
1
primário (Técnica de polímeros - Novolink - Novocastra®) foi adicionado em cada lâmina,
2
permanecendo por 30 minutos à temperatura ambiente, em câmara úmida. Em seguida
3
foram feitas 3 lavagens de 5 minutos cada uma em PBS e secaram-se como anteriormente.
4
Logo depois, o reagente Polímero (Técnica de polímeros - Novolink - Novocastra®) foi
5
adicionado permanecendo por 30 minutos nas mesmas condições acima.
6
Após 3 lavagens em PBS, por 5 minutos em cada uma, as lâminas foram reveladas,
7
através da adição de uma solução cromógena (Liquid DAB, DAKO®, Carpinteria, CA) por
8
5 minutos; em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente e contra-coradas em
9
Hematoxilina de Harris por 2 segundos.
10
Finalmente as lâminas foram imersas em 3 banhos de álcool absoluto por cerca de 10
11
segundos cada um para retirada do excesso de água, 1 banho de xilol fenicado para retirada
12
do excesso de álcool e 3 banhos de xilol, por 5 minutos cada um para tornar as lâminas
13
brilhantes e transparentes (diafanização) e, a seguir, foram adicionadas lamínulas com
14
entellan.
15
16
5.2.5 Critério de Análise
17
18
Através da técnica de imuno-histoquímica foram avaliados os linfócitos T, linfócitos B,
19
células Natural Killer, macrófagos e a presença de células que expressam a iNOS presentes
20
no estroma cervical de biópsias de pacientes com NIC II e III. Inicialmente as células
21
foram observadas em pequeno aumento (100 vezes) para avaliarmos a distribuição geral, e
22
em seguida, examinada em detalhes (aumento de 400 vezes) no estroma subjacente abaixo
23
da lesão de NIC II ou NIC III (biópsias anteriormente ao tratamento) ou NIC I, NIC II,
24
NIC III ou infecção pelo HPV (biópsias posteriormente ao tratamento) para obtermos a
25
pontuação final.
48
1
2
Para a contagem das células linfóides utilizamos o critério de pontuações descrito por
GEORGIANNOS et al., 2003, que gradua a quantidade de células inflamatórias em:
3
4
0 - ausência de células inflamatórias;
5
1 - raras células inflamatórias;
6
2 - moderado número de células inflamatórias;
7
3 - numerosas células inflamatórias.
8
9
5.2.6 Análise Estatística
10
11
A análise de todos os casos foi realizada por dois observadores independentes. A
12
concordância entre os dois observadores foi calculada utilizando o coeficiente de Kappa
13
(ARANGO, 2001). O coeficiente de Kappa para os 8 marcadores foi de 0,80 (concordância
14
forte). O resultado final foi obtido após avaliação conjunta dos casos discordantes,
15
mostrando um valor único por consenso.
16
17
Para fins estatísticos, consideramos como marcação fraca as pontuações 0 e 1 e como
marcação forte as pontuações 2 e 3.
18
As proporções foram comparadas por meio do teste exato de Fisher. Os resultados
19
foram considerados significativos quando a probabilidade de rejeição da hipótese de
20
nulidade foi menor que 5% (p < 0,05). Os gráficos foram construídos através da utilização
21
do Programa GRAPHPAD PRISM versão 5.0.
Resultados
50
1
6. Resultados
2
3
4
Participaram deste trabalho 13 pacientes com idade mínima de 23 anos e máxima de
50, com média de 33,9 anos.
5
No diagnóstico inicial 53.85% (n=7) das pacientes eram NIC II (1,2,5,6,7,8 e 13) e
6
46.15% (n=6) eram NIC III (3,4,9,10,11 e 12). Deste total 46.15% (n=6) tiveram boa
7
resposta ao tratamento com IFNα-2b e 53.85% (n=7) tiveram falha terapêutica.
8
O diagnóstico inicial e final de todas as pacientes tratadas com IFN α -2b, bem como a
9
idade (anos), a resposta clínica ao tratamento e a conduta tomada em cada caso estão
10
presentes na tabela 3.
11
12
Tabela 3 – Diagnóstico final e inicial por biópsia de todas as pacientes e conduta tomada em
13
cada caso, após o término do tratamento.
14
Paciente
Idade
(anos)
Diagnóstico
Inicial
Diagnóstico
Final
1
30
NIC II
2
3
4
50
23
36
NIC II
NIC III
NIC III
5
23
NIC II
6
28
NIC II
7
8
9
10
11
12
13
31
25
38
45
30
48
34
NIC II
NIC II
NIC III
NIC III
NIC III
NIC III
NIC II
Infecção
HPV
NIC I
NIC I
Infecção
HPV
Infecção
HPV
Infecção
HPV
NIC II
NIC III
NIC II
NIC III
NIC II
NIC III
NIC II
Resposta/Falha Conduta
Terapêutica
pelo Resposta
Seguimento
Resposta
Resposta
pelo Resposta
Seguimento
Seguimento
Seguimento
pelo Resposta
Seguimento
pelo Resposta
Seguimento
Falha
Falha
Falha
Falha
Falha
Falha
Falha
Conização
Conização
Conização
Conização
Conização
Conização
Conização
51
1
Quanto aos hábitos e condições de vida questionados no protocolo inicial (idade da
2
sexarca, paridade e tabagismo) constatou-se que 53,85% (n=7) eram multíparas (3 ou mais
3
partos) e tabagistas sendo a idade média da sexarca de 17,4 anos (mínima de 13 e máxima
4
de 33 anos). Das pacientes que tiveram falha terapêutia 66,6% eram multíparas e 85,7%
5
(n=6) eram fumantes, e das pacientes que tiveram boa resposta 57,14% não eram
6
multíparas e 83.3% não eram fumantes. Os dados estão presentes na tabela 4.
7
8
Tabela 4 – Idade da sexarca, número de gravidezes e estilo de vida de cada paciente.
Paciente
9
10
Idade
Número
Estilo de
da
de
Vida
Sexarca
gravidezes
(Tabagismo)
1
17
4
não - fumante
2
17
3
não - fumante
3
15
0
não - fumante
4
19
7
fumante
5
13
4
não - fumante
6
17
0
não - fumante
7
15
1
fumante
8
14
4
fumante
9
17
3
fumante
10
15
5
fumante
11
15
1
fumante
12
19
2
fumante
13
33
0
não - fumante
52
1
Prancha 1: Imagens colposcópicas das lesões antes do tratamento e após o seu término
2
(MARDEGAN, 2008; RAMOS, 2010).
3
4
5
Paciente 4 - Antes do Tratamento
Paciente 4 - Após o Tratamento (resposta)
6
7
Paciente 9 - Antes do Tratamento
Paciente 9 - Após o Tratamento (falha)
8
9
No Anexo C estão descritos, individualmente, a quantificação dos linfócitos T (CD3+,
10
CD4+, CD8+, Perforina), linfócitos B (CD20), NK (CD16), macrófagos (CD68) e a
11
presença de células que expressam a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) das
12
pacientes segundo o diagnóstico histológico.
13
14
A Tabela 5 mostra a distribuição da quantificação intensa e fraca dos linfócitos T
15
(CD3+, CD4+, CD8+, Perforina), linfócitos B (CD20), NK (CD16), macrófagos (CD68) e
53
1
a presença de células que expressam a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) antes
2
e após o tratamento com IFN α-2b em relação ao diagnóstico histológico.
3
4
Tabela 5 – Distribuição de CD3, CD4. CD8, CD16, CD20, CD68, iNOS, Perforina no
5
estroma cervical de pacientes com NIC II/III tratadas com interferon [n (%)]. A
6
apresentação está demonstrada através da marcação imunohistoquímica forte (2 e 3)/fraco
7
(0 e 1). N total =13 exceto antes do tratamento com n=12.
Antes
Após
Valor de p
Tratamento
Tratamento
(Teste Exato de
n (%)
n (%)
Fisher)
CD3+
9/3 (75/25)
11/2 (84.6/15.4)
0,6447
CD4+
1/11 (8.3/91.6)
1/12 (7.7/92.3)
1,00
CD8+
10/2 (83.3/16.6)
11/2 (84.6/15.4)
1,00
CD16+
0/12 (0/100)
0/13 (0/100)
1,00
CD20+
3/9 (25/75)
2/11 (15.4/84.6)
0,6447
CD68+
0/12 (0/100)
1/12 (7.7/92.3)
1,00
iNOS
3/9 (25/75)
0/13 (0/100)
0,0957
Perforina
0/12 (0/100)
0/13 (0/100)
1,00
8
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (antes do
9
tratamento em relação após o tratamento)
10
11
12
Não se observa nesta tabela diferença estatisticamente significante entre o grupo
anterior e posterior ao tratamento com IFNα-2b.
13
O Gráfico 1 mostra a distribuição proporcional (Forte/Fraca) de linfócitos T e
14
perforina, em percentagem, antes e após o tratamento com IFN, marcados pela
54
1
imunohistoquímica de acordo com protocolo de GEORGIANNOS et al. (2003), segundo
2
diagnóstico histológico.
3
4
5
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (antes
6
do tratamento em relação após o tratamento)
7
8
O Gráfico 2 mostra a distribuição proporcional (Forte/Fraca) de células NK, linfócitos
9
B, macrófagos e iNOS, em percentagem, antes e após o tratamento com IFN, marcados
10
pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de GEORGIANNOS et al. (2003),
11
segundo diagnóstico histológico.
12
55
1
2
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (antes do
3
tratamento em relação após o tratamento)
4
5
A Tabela 6 mostra a distribuição da quantificação intensa e fraca dos linfócitos T
6
(CD3+, CD4+, CD8+, Perforina), linfócitos B (CD20), NK (CD16), macrófagos (CD68) e
7
a presença de células que expressam a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nas
8
pacientes com boa resposta, antes e após o tratamento com IFN α-2b, em relação ao
9
diagnóstico histológico.
10
11
Tabela 6 – Distribuição de CD3, CD4. CD8, CD16, CD20, CD68, iNOS, Perforina no
12
estroma cervical de pacientes com NIC II/III tratadas com interferon que obtiveram boa
13
resposta ao tratamento [n (%)]. A apresentação está demonstrada através da marcação
14
imunohistoquímica forte (2 e 3)/fraco (0 e 1). N total=6.
15
16
17
18
56
Boa Resposta
Boa Resposta
Valor de p
(antes trat.)
(após trat.)
(Teste Exato de
n (%)
n (%)
Fisher)
CD3+
4/2 (66.6/33.3)
4/2 (66.6/33.3)
1,00
CD4+
1/5 (16.6/83.3)
0/6 (0/100)
1,00
CD8+
5/1 (83.3/16.6)
4/2 (66.6/33.3)
1,00
CD16+
0/6 (0/100)
0/6 (0/100)
1,00
CD20+
1/5 (16.6/83.3)
0/6 (0/100)
1,00
CD68+
0/6 (0/100)
0/6 (0/100)
1,00
iNOS
1/5 (16.6/83.3)
0/6 (0/100)
1,00
Perforina
0/6 (0/100)
0/6 (0/100)
1,00
1
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Boa resposta antes
2
do tratamento em relação após o tratamento)
3
4
5
Não se observa nesta tabela diferença estatisticamente significante entre o grupo que
obteve boa resposta, anterior e posterior ao tratamento com IFNα-2b.
6
7
O Gráfico 3 mostra a distribuição proporcional (Forte/Fraca) de linfócitos T e
8
perforina, em percentagem, antes e após o tratamento com IFN em pacientes que
9
obtiveram boa resposta, marcados pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de
10
GEORGIANNOS et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
57
1
2
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Boa
3
Resposta - antes do tratamento em relação após o tratamento)
4
5
O Gráfico 4 mostra a distribuição proporcional (Forte/Fraca) de células NK, linfócitos
6
B, macrófagos e iNOS, em percentagem, antes e após o tratamento com IFN em pacientes
7
que obtiveram boa resposta, marcados pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de
8
GEORGIANNOS et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
9
10
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Boa
11
Resposta - antes do tratamento em relação após o tratamento)
58
1
A Tabela 7 mostra a distribuição da quantificação intensa e fraca dos linfócitos T
2
(CD3+, CD4+, CD8+, Perforina), linfócitos B (CD20), NK (CD16), macrófagos (CD68) e
3
a presença de células que expressam a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nas
4
pacientes com má resposta, antes e após o tratamento com IFN α-2b, em relação ao
5
diagnóstico histológico.
6
7
Tabela 7 – Distribuição de CD3, CD4. CD8, CD16, CD20, CD68, iNOS, Perforina no
8
estroma cervical de pacientes com NIC II/III tratadas com interferon que obtiveram má
9
resposta ao tratamento [n (%)]. A apresentação está demonstrada através da marcação
10
imunohistoquímica forte (2 e 3)/fraco (0 e 1). N total=7 exceto antes do tratamento com
11
n=6.
Má Resposta
Má Resposta
Valor de p
(antes trat.)
(após trat.)
(Teste Exato de
n (%)
n (%)
Fisher)
0,4615
CD3+
5/1 (83.3/16.6)
7/0 (100/0)
CD4+
0/6 (0/100)
1/6 (14.3/85.7)
CD8+
5/1(83.3/16.6)
7/0 (100/0)
0,4615
CD16+
0/6 (0/100)
0/7 (0/100)
1,00
CD20+
2/4 (33.3/66.6)
2/5 (28.6/71.4)
1,00
CD68+
0/6 (0/100)
1/6 (14.3/85.7)
1,00
iNOS
2/4 (33.3/66.6)
0/7 (0/100)
0,1923
Perforina
0/6 (0/100)
0/7 (0/100)
1,00
1,00
12
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Má resposta antes do
13
tratamento em relação após o tratamento)
14
59
1
2
Não se observa nesta tabela diferença estatisticamente significante entre o grupo que
obteve má resposta, anterior e posterior ao tratamento com IFNα-2b.
3
4
O Gráfico 5 mostra a distribuição proporcional (Forte/Fraca) de linfócitos T e
5
perforina, em percentagem, antes e após o tratamento com IFN em pacientes que
6
obtiveram má resposta, marcados pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de
7
GEORGIANNOS et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
8
9
10
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Má
Resposta - antes do tratamento em relação após o tratamento)
11
12
O Gráfico 6 mostra a distribuição proporcional (Forte/Fraca) de células NK, linfócitos
13
B, macrófagos e iNOS, em percentagem, antes e após o tratamento com IFN em pacientes
14
que obtiveram má resposta, marcados pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de
15
GEORGIANNOS et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
60
1
2
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Má
3
Resposta - antes do tratamento em relação após o tratamento)
4
5
A Tabela 8 mostra a distribuição da quantificação intensa e fraca dos linfócitos T
6
(CD3+, CD4+, CD8+, Perforina), linfócitos B (CD20), NK (CD16), macrófagos (CD68) e
7
a presença de células que expressam a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nas
8
pacientes com boa e má resposta antes do tratamento com IFN α-2b, em relação ao
9
diagnóstico histológico.
10
11
Tabela 8 – Distribuição de CD3, CD4. CD8, CD16, CD20, CD68, iNOS, Perforina no
12
estroma cervical de pacientes com NIC II/III anterior ao tratamento com interferon, que
13
obtiveram boa e má resposta ao tratamento [n (%)]. A apresentação está demonstrada
14
através da marcação imunohistoquímica forte (2 e 3)/fraco (0 e 1). N total=6.
15
16
17
18
61
Boa Resposta
Má Resposta
Valor de p
(antes trat.)
(antes trat.)
(Teste Exato de
n (%)
n (%)
Fisher)
CD3+
4/2 (66.6/33.3)
5/1 (83.3/16.6)
0,99
CD4+
1/5 (16.6/83.3)
0/6 (0/100)
0,99
CD8+
5/1 (83.3/16.6)
5/1(83.3/16.6)
0,99
CD16+
0/6 (0/100)
0/6 (0/100)
1,00
CD20+
1/5 (16.6/83.3)
2/4 (33.3/66.6)
0,99
CD68+
0/6 (0/100)
0/6 (0/100)
1,00
iNOS
1/5 (16.6/83.3)
2/4 (33.3/66.6)
0,99
Perforina
0/6 (0/100)
0/6 (0/100)
1,00
1
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Boa resposta antes do
2
tratamento em relação má resposta antes do tratamento)
3
4
5
Não se observa nesta tabela diferença estatisticamente significante entre o grupo que
obteve boa resposta e o que obteve má resposta, anterior ao tratamento com IFNα-2b.
6
7
O Gráfico 7 mostra a distribuição proporcional (Forte/Fraca) de linfócitos T e
8
perforina, em percentagem, em pacientes que obtiveram boa e má resposta, ambas antes do
9
tratamento com IFN, marcados pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de
10
GEORGIANNOS et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
62
1
2
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Boa e Má
3
Resposta - antes do tratamento)
4
5
O Gráfico 8 mostra a distribuição proporcional (Forte/Fraca) de células NK, linfócitos
6
B, macrófagos e iNOS, em percentagem, em pacientes que obtiveram boa e má resposta,
7
ambas antes do tratamento com IFN, marcados pela imunohistoquímica de acordo com
8
protocolo de GEORGIANNOS et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
9
10
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Boa e Má
11
Resposta - antes do tratamento)
63
1
A Tabela 9 mostra a distribuição da quantificação intensa e fraca dos linfócitos T
2
(CD3+, CD4+, CD8+, Perforina), linfócitos B (CD20), NK (CD16), macrófagos (CD68) e
3
a presença de células que expressam a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nas
4
pacientes com boa e má resposta após o tratamento com IFN α-2b, em relação ao
5
diagnóstico histológico.
6
7
Tabela 9 – Distribuição de CD3, CD4. CD8, CD16, CD20, CD68, iNOS, Perforina no
8
estroma cervical de pacientes com NIC II/III após o tratamento com interferon, que
9
obtiveram boa e má resposta ao tratamento [n (%)]. A apresentação está demonstrada
10
através da marcação imunohistoquímica forte (2 e 3)/fraco (0 e 1). N total=7 exceto após o
11
tratamento, nas pacientes com boa resposta, com n=6.
Boa Resposta
Má Resposta
Valor de p
(após trat.)
(após trat.)
(Teste Exato de
n (%)
n (%)
Fisher)
CD3+
4/2 (66.6/33.3)
7/0 (100/0)
0,19
CD4+
0/6 (0/100)
1/6 (14.3/85.7)
0,99
CD8+
4/2 (66.6/33.3)
7/0 (100/0)
0,19
CD16+
0/6 (0/100)
0/7 (0/100)
1,00
CD20+
0/6 (0/100)
2/5 (28.6/71.4)
0,46
CD68+
0/6 (0/100)
1/6 (14.3/85.7)
0,99
iNOS
0/6 (0/100)
0/7 (0/100)
1,00
Perforina
0/6 (0/100)
0/7 (0/100)
1,00
12
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Boa resposta após do
13
tratamento em relação má resposta após do tratamento)
14
64
1
2
Não se observa nesta tabela diferença estatisticamente significante entre o grupo que
obteve boa resposta e o que obteve má resposta, posterior ao tratamento com IFNα-2b.
3
4
O Gráfico 9 mostra a distribuição proporcional (Forte/Fraca) de linfócitos T e
5
perforina, em percentagem, em pacientes que obtiveram boa e má resposta, ambas após o
6
tratamento com IFN, marcados pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de
7
GEORGIANNOS et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
8
9
10
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Boa e Má
Resposta - após o tratamento)
11
12
O Gráfico 10 mostra a distribuição proporcional (Forte/Fraca) de células NK, linfócitos
13
B, macrófagos e iNOS, em percentagem, em pacientes que obtiveram boa e má resposta,
14
ambas após o tratamento com IFN, marcados pela imunohistoquímica de acordo com
15
protocolo de GEORGIANNOS et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
65
1
2
Fisher: Resultados não significativos com P>0,05 (Boa e Má
3
Resposta - após o tratamento)
4
5
Prancha 2. Cortes histológicos de paciente que obteve boa resposta ao tratamento
6
(paciente 4). A. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica
7
mostrando células positivas com marcação CD3+ coradas em marrom (aumento de 400
8
vezes): A1 – Antes do tratamento, A2 – Após o tratamento. B. Corte histológico corado
9
através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD4+
10
coradas em marrom (aumento de 400 vezes): B1 – Antes do tratamento, B2 – Após o
11
tratamento. C. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica
12
mostrando células positivas com marcação CD8+ coradas em marrom (aumento de 400
13
vezes): C1 – Antes do tratamento, C2 – Após o tratamento. D. Corte histológico corado
14
através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação para
15
CD16+ coradas em marrom (aumento de 400 vezes): D1 – Antes do tratamento, D2 – Após
16
o tratamento.
17
66
1
Prancha 3. Cortes histológicos de paciente que obteve boa resposta ao tratamento
2
(paciente 4). E. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica
3
mostrando células positivas com marcação CD20+ coradas em marrom (aumento de 400
4
vezes): E1 – Antes do tratamento, E2 – Após o tratamento. F. Corte histológico corado
5
através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação
6
CD68+ coradas em marrom (aumento de 400 vezes): F1 – Antes do tratamento, F2 – Após
7
o tratamento. G. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica
8
mostrando células positivas com marcação iNOS coradas em marrom (aumento de 400
9
vezes): G1 – Antes do tratamento, G2 – Após o tratamento. H. Corte histológico corado
10
através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação
11
Perforina coradas em marrom (aumento de 400 vezes): H1 – Antes do tratamento, H2 –
12
Após o tratamento.
13
14
15
16
17
18
19
20
67
1
2
A1
A2
3
4
B1
B2
5
6
C1
C2
7
8
D1
D2
68
1
2
E1
E2
3
4
F1
F2
5
6
G1
G2
7
8
H1
H2
69
1
Prancha 4. Cortes histológicos de paciente que obteve falha terapêutica (paciente 10). A.
2
Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células
3
positivas com marcação CD3+ coradas em marrom (aumento de 400 vezes): A1 – Antes do
4
tratamento, A2 – Após o tratamento. B. Corte histológico corado através da técnica de
5
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD4+ coradas em marrom
6
(aumento de 400 vezes): B1 – Antes do tratamento, B2 – Após o tratamento. C. Corte
7
histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas
8
com marcação CD8+ coradas em marrom (aumento de 400 vezes): C1 – Antes do
9
tratamento, C2 – Após o tratamento. D. Corte histológico corado através da técnica de
10
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação para CD16+ coradas em
11
marrom (aumento de 400 vezes): D1 – Antes do tratamento, D2 – Após o tratamento.
12
13
Prancha 5. Cortes histológicos de paciente que obteve falha terapêutica (paciente 10). E.
14
Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células
15
positivas com marcação CD20+ coradas em marrom (aumento de 400 vezes): E1 – Antes
16
do tratamento, E2 – Após o tratamento. F. Corte histológico corado através da técnica de
17
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD68+ coradas em marrom
18
(aumento de 400 vezes): F1 – Antes do tratamento, F2 – Após o tratamento. G. Corte
19
histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas
20
com marcação iNOS coradas em marrom (aumento de 400 vezes): G1 – Antes do
21
tratamento, G2 – Após o tratamento. H. Corte histológico corado através da técnica de
22
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação Perforina coradas em
23
marrom (aumento de 400 vezes): H1 – Antes do tratamento, H2 – Após o tratamento.
70
1
2
A1
A2
3
4
B1
B2
5
6
C1
C2
7
8
D1
D2
71
1
2
E1
E2
3
4
F1
F2
5
6
G1
G2
7
8
H1
H2
72
1
Prancha 6. A, B, C e D. Cortes histológicos de tecido corados através da técnica de
2
imunohistoquímica, mostrando células positivas coradas em marrom (B, C e D), ilustrando
3
o escore de Georgiannos (GEORGIANNOS et al., 2003) 0, 1, 2 e 3, respectivamente
4
(aumento de 400 vezes).
5
6
7
A
B
8
9
10
C
D
Discussão
74
1
7. Discussão
2
3
Com valores aproximados de 500 mil casos novos por ano em todo o mundo e 230 mil
4
óbitos, o câncer cervical é o segundo mais comum entre as mulheres só perdendo, portanto,
5
para o câncer de mama que ocupa a primeira posição (INCA, 2010).
6
Para o ano de 2010 a estimativa do número de novos casos de câncer do colo do útero
7
para o Brasil foi de 18.430, com risco estimado de 18 casos a cada 100 mil mulheres. O
8
câncer do colo do útero é o mais incidente na região Norte (23/100.000). Nas regiões
9
Centro-Oeste (20/100.000) e Nordeste (18/100.000) ocupam a segunda posição e, nas
10
regiões Sul (21/100.000) e Sudeste (16/100.000), a terceira posição (INCA, 2010). Em
11
Minas Gerais, a taxa estimada para o câncer cervical, para o ano de 2010, foi de 12,93
12
casos para cada 100 mil mulheres (INCA, 2010), sendo a estimativa mais baixa de todo o
13
país. Esses números poderiam ser menores, visto que o câncer de colo uterino é uma
14
doença que pode ser evitada através da detecção e tratamento das lesões pré-neoplásicas.
15
Dados da literatura demonstram que a resposta imune sistêmica e local tem um
16
importante papel na progressão da NIC. Há evidências de que a imunidade local é mais
17
importante e eficiente que a sistêmica, para controlar a infecção pelo HPV e o
18
desenvolvimento das NICs. Sendo que pacientes com deficiência de imunidade celular
19
apresentam freqüência aumentada para o desenvolvimento de lesões cervicais (PETRY et
20
al., 1994; ELLERBROCK et al., 2000).
21
A multiparidade, sexarca precoce e o tabagismo são considerados fatores de risco para
22
o desenvolvimento do câncer de colo uterino (CASTELLSAGUÉ & MUÑOZ, 2003;
23
AULT, 2006). MURTA (1999) através de um estudo retrospectivo onde analisou a
24
paridade e a sexarca de 362 casos de câncer de colo uterino invasivos, entre o período de
25
1978 e 1995, concluiu que a multiparidade está relacionada com o câncer invasivo de colo
75
1
uterino. Apesar de, atualmente, a paridade estar diminuindo, e que a maioria destas
2
mulheres teve a sexarca aos 18 anos, independente do período estudado.
3
Neste trabalho, todos esses fatores foram observados: 53,85% eram multíparas (3 ou
4
mais partos) e tabagistas, e a idade média de sexarca foi de 17,4 anos (mínima de 13 e
5
máxima de 33 anos). Das pacientes que tiveram falha terapêutica 66,6% eram multíparas e
6
85,7% eram fumantes, e das pacientes que tiveram boa resposta 57,14% não eram
7
multíparas e 83.3% não eram fumantes.
8
Desde o início dos anos 80, vários estudos têm utilizado o interferon no tratamento do
9
câncer ginecológico com respostas variadas (BORDEN et al., 2007; NOMELINI, et al.,
10
2007), sendo a maioria dos trabalhos realizados nesta década. As ações do interferon, tais
11
como antiproliferativa e imunorreguladora, são hoje, o centro de interesse da maioria dos
12
investigadores. Nos estudos com IFN-α a remissão das NICs variam de 30 a 80% dos casos
13
(CHOO et al., 1986; DUNHAM et al., 1990; STELLATO, 1992) porém, BYRNE et al.
14
(1986) usando gel de interferon α topicamente em NICs e FROST et al. (1990) aplicando
15
interferon alfa-2b intralesional obtiveram resultados semelhantes ao placebo. DUNHAM et
16
al. (1990) em um estudo com 14 pacientes com NIC, sendo destas 7 controle e 7 tratadas
17
duas vezes por semana durante um mês com injeções intralessionais de IFN alfa-2b,
18
observou uma melhora de 6 das 7 pacientes do grupo de estudo, com duas curas completas.
19
Somente 3 pacientes do grupo controle mostrou melhora, mas não houve cura completa de
20
nenhum caso; a coilocitose, célula característica da infecção pelo HPV, desapareceu em
21
todos os casos tratados com o IFN – alfa. Ambos os grupos foram monitorados por
22
colposcopia, esfregaços cervicais e biópsias para histologia.
23
Murta e Tavares (2004) demonstraram a eficiência do interferon com bons resultados,
24
obtendo resposta completa no tratamento com uma paciente com carcinoma vaginal
25
invasivo usando IFNα-2b intralesional, com remissão total da lesão observada por meio de
76
1
colposcopia e citologia; a paciente engravidou 3 anos após o tratamento sem qualquer sinal
2
de recidiva durante o seu acompanhamento. Outro caso foi de uma paciente com neoplasia
3
intra-epitelial na vulva, vagina e colo uterino com a utilização do mesmo interferon
4
utilizado anteriormente, concluindo-se que a lesão foi reduzida em todos os sítios e, no
5
caso do colo uterino, apresentou remissão completa da doença (SLOTMAN et al., 1988).
6
Os interferons também são utilizados no tratamento de pacientes com HPV, porém
7
alguns indivíduos ainda respondem parcialmente ao tratamento visto que, pacientes com
8
baixos níveis de proteína E7 respondem melhor ao tratamento (ARANY et al., 1995). A
9
proteína E6 do HPV-16 é direcionada contra a proteína supressora de tumor (p53)
10
formando um complexo e causando sua degradação (WERNESS et al., 1990), a habilidade
11
da E6 em mediar essa degradação é muito importante, considerando que a p53 é
12
responsável pela apoptose e prevenção da proliferação de células anormais (ASHCROFT
13
et al., 1997) e sua falta assegura a sobrevivência de células anormais e infectadas,
14
permitindo que o vírus escape da resposta antiviral normal (RONCO et al., 1998;
15
HISCOTT et al., 1999). ARANY & TYRING (1996) analisaram a resposta imune local de
16
pacientes com HPV tratadas com IFN. As biópsias de pacientes que não responderam bem
17
ao tratamento com IFN houve níveis acentuadamente baixos de células de Langerhans,
18
levando a diminuição da expressão de MHCII e, portanto diminuindo a atração de células
19
T CD4. Houve também queda na expressão de MHCI com diminuição dos níveis de
20
células T CD8. Já analisando biópsias de pacientes que responderam bem ao tratamento
21
verificaram células NK e macrófagos (CD16) e células T CD4 ativados havendo um
22
recrutamento dessas células T contra as células infectadas pelo HPV, ocorrendo, portanto
23
uma resposta imune celular.
24
Observamos neste trabalho através do grupo de estudo (n= 13) que 46,15% das
25
pacientes apresentaram boa resposta ao tratamento com desaparecimento da lesão de alto
77
1
grau, enquanto que 53,85% das pacientes tiveram falha terapêutica, ou seja, o diagnóstico
2
inicial e final foi observado HSIL.
3
Vários trabalhos nos últimos anos foram realizados pelo grupo de estudos do Instituto
4
de Pesquisa em Oncologia (IPON – UFTM) demonstrando que o interferon é um citocina
5
bastante eficaz no tratamento de NIC II e NICIII (HSIL). TIRONE, 2009 avaliou por RT-
6
PCR a expressão do RNAm do IFN-α, dos receptores de Interferon alfa (IFNAR1 e
7
IFNAR2) e a expressão de um dos elementos responsivos pelo estímulo de interferon
8
(ISRE) presente nas regiões dos genes induzidos pelo IFN-α; através da expressão do
9
RNAm da enzima 2´5´ Oligoadenilato sintetase (2´,5´OAS) em biópsias de pacientes com
10
NIC I, II e III, concluindo que as amostras de NIC apresentavam o DNA do HPV em 50%
11
(14/28) das pacientes, apresentando uma baixa expressão do RNA mensageiro do receptor
12
de interferon subunidade 1 e 2. A expressão simultânea das duas subunidades dos
13
receptores foi encontrada apenas no grupo controle e não houve diferença significativa da
14
expressão do RNA mensageiro do IFN-α e da enzima 2´5´OAS entre os grupos controle e
15
NIC.
16
O IFN-α interage com os receptores de interferon alfa (IFNAR 1 e 2) que são expressos
17
em vários tipos de células do organismo incluindo células tumorais e do sistema imune,
18
sendo fundamentais para a resposta clínica. MARDEGAN, 2008 utilizando IFNα-2b
19
intralesional, verificou que 62,5% das pacientes tratadas com esta citocina obtiveram
20
resposta ao tratamento, ou seja, houve o desaparecimento completo da lesão de alto grau
21
confirmado em estudo histológico; já a concentração de IL-6 e TNF-α na secreção vaginal,
22
durante o tratamento foi bem mais elevada no grupo de pacientes que apresentaram falha
23
terapêutica quando comparado com o grupo que obteve resposta, sendo estas citocinas
24
avaliadas pela citometria de fluxo. A média de concentração de IL-6 e TNF-α foi
25
significativamente maior na sexta aplicação do grupo que apresentou falha terapêutica
78
1
quando comparado com o grupo que obteve resposta na mesma aplicação, além do que
2
comparando-se a carga viral, antes do tratamento e após o término do mesmo, através da
3
técnica de captura híbrida, observou-se uma queda significativa da mesma no grupo das
4
pacientes que obtiveram boa resposta ao tratamento. Já RAMOS, 2010 utilizando o mesmo
5
tipo de interferon, porém em grupo maior de pacientes, obteve resposta clínica satisfatória
6
em 60% das pacientes com NIC de alto grau, sendo que a resposta imune Th1 (IFN-γ,
7
TNF-α, IL-2) esteve relacionada com a diminuição do grau da NIC após o tratamento com
8
IFNα-2b nas pacientes com boa resposta, havendo também uma diminuição significativa
9
na carga viral do HPV de alto risco nas pacientes que responderam ao tratamento, sendo
10
esta carga avaliada pela técnica de captura híbrida. Observou-se também, através da
11
técnica de PCR e posteriormente eletroforese, que as pacientes com falha terapêutica
12
tiveram expressão concomitante de IL-12/TGF-β2 e IL-4/TGF-β3, sugerindo que a
13
resposta imune Th3 pode ter modulado a resposta imune Th1 e Th2 durante o tratamento
14
com IFN e por isso houve falha terapêutica. A expressão de TGF-β, após o tratamento com
15
IFN α-2b nas pacientes com falha terapêutica, sugere um papel imunomodulador desta
16
citocina inibindo a resposta protetora Th1. MISSON, 2010 através da avaliação da
17
quantificação de citocinas no soro de pacientes com NIC de alto grau tratadas com IFNα-
18
2b intralesional observou que 50% tiveram resposta terapêutica e 50% falha terapêutica,
19
sendo que das que tiveram resposta terapêutica apenas 16,6% eram tabagistas e das que
20
tiveram falha terapêutica 66,6% eram tabagistas, associando desta forma o uso do tabaco a
21
indução da falha ao tratamento; ao passo que, no grupo de pacientes com sucesso
22
terapêutico houve aumento significativo de citocinas do perfil Th1 que estimularam a
23
queda das citocinas do perfil Treg. A análise das citocinas, feitas por ELISA, evidenciou
24
que a média da concentração da IL-12 no soro das pacientes que apresentaram sucesso
25
terapêutico mostrou-se significativamente bem elevada no décimo segundo dia de
79
1
aplicação do IFNα-2b apresentando diferença estatística quando comparadas com as
2
pacientes que tiveram falha terapêutica. Já a concentração de IL-10 e TGF-β apresentou
3
queda significativa a partir deste mesmo dia nas pacientes que obtiveram sucesso
4
terapêutico, mostrando que o aumento da citocina do perfil Th1 estimulou a queda das
5
citocinas do perfil Th3. No total foram 18 aplicações do IFNα-2b intralesional em dias
6
alternados. É importante ressaltar que quanto mais estados de diferenciação de células T
7
CD4 são descobertos, mais a sua flexibilidade também está sendo reconhecida.
8
Componentes que regulam a estabilidade das células T e plasticidade podem ser divididos
9
em quatro categorias: as condições, o circuito, clonalidade e cromatina. Condições, tanto
10
de citocinas e co-estimulação, são os principais fatores de diferenciação, mas também
11
afetam a estabilidade. Circuito, ou seja, a rede de interações entre fatores de transcrição,
12
afeta a estabilidade, diferenciação e plasticidade. A questão da clonalidade das células T
13
deve ser considerada quanto à diferenciação das células T. Finalmente, as modificações da
14
cromatina associadas aos genes ativos ou reprimidos podem controlar o fenótipo e, como
15
reconheceu, mais recentemente, a sua plasticidade (MURPHY & STOCKINGER, 2010).
16
GIANINI et al. (1998), usando imunohistoquímica verificaram a presença da IL-12 em
17
SIL e IL-10 na zona de transformação e biópsias SIL. Ambas as células produtoras dessas
18
citocinas foram localizadas no estroma. Além disso, neste estudo observaram que a região
19
do colo do útero que é mais sensível para o desenvolvimento da lesão, a zona de
20
transformação, foi associada com maiores níveis médios dos imunossupressores IL-10 e
21
TGF-β1. Já KOBAYASHI et al. (2004) caracterizaram o microambiente imunológico local
22
na HSIL verificando um aumento nos níveis de células do sistema imune, tanto da
23
imunidade inata como da adquirida (células T e B, macrófagos e NK), além da produção
24
de IFN-γ por linfócitos T CD4/CD8 e NK indicando assim a ativação dessas células no
25
sistema imunológico. Houve também a presença de TGF-β e IL-10 indicando que a HSIL
80
1
está associada a um aglomerado de células imunes que produzem uma mistura de citocinas
2
pró-inflamatórias e regulatórias.
3
Observa-se através desses estudos que a resposta imune é delicada e complexa, onde
4
muito ainda deve ser compreendido entre as interações celulares, citocinas e seus
5
receptores para poder atingir o sucesso terapêutico. Porém, avanços como estes na
6
compreensão do sistema imune e na definição de imunoterapias específicas têm motivado
7
muitas novas estratégias através de mecanismos envolvidos na imunidade mediada por
8
citocinas como o IFN.
9
Febre, cefaléia, mialgia e astenia foram efeitos colaterais observados em 100% das
R-
10
pacientes durante o tratamento com Blauferon B
Blausiegel, sendo esses efeitos
11
abordados em outros trabalhos (MAHER et al., 2007; STELLATO, 1992). Efeitos
12
colaterais como diarréia, náusea, erupção cutânea, eritema, mielodepressão, cardiopatia e
13
alteração no sistema nervoso central não foram observados em nenhum caso.
14
Trabalhos avaliando o infiltrado de células imunes no estroma cervical de pacientes
15
com neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau, antes e após tratamento com IFN α-2b
16
intralesional, não existem na literatura. Também não há nenhum estudo da relação entre
17
resposta imune local antes e após tratamento com interferon, independente do tipo de
18
tumor. Portanto, conhecer a intensidade e os diferentes infiltrados locais de células imunes
19
é fundamental para entender os mecanismos envolvidos nos tumores cervicais, pois, pelos
20
nossos conhecimentos não há estudo de relação entre resposta imune local antes e após
21
tratamento com interferon.
22
A presença de células imunocompetentes tem estado associada com a melhora do
23
prognóstico. Muitos tumores e suas metástases são circundados por infiltrados de
24
leucócitos incluindo linfócitos T e B, células NK e macrófagos, observando uma resposta
81
1
imune contra o tumor ou o tumor em desenvolvimento, por estes respectivos mediadores
2
(BETHWAITE et al., 1996).
3
Demonstramos nesse estudo a existência de linfócitos T CD3+ e CD8+, com ausência
4
de marcação fraca 0 pelo critério de Georgiannos, que representa ausência total destas
5
células, em todas as pacientes, independentes se tiveram boa ou má resposta ao tratamento
6
ou se foi anterior ou posterior ao tratamento. Observamos também que 100% das pacientes
7
com má resposta após o tratamento apresentaram marcação forte para CD3+ e CD8+,
8
enquanto que as pacientes com boa resposta após o tratamento apresentaram marcação
9
forte em 66,66% dos casos para os mesmos marcadores (com p=0,19).
10
Sugerimos em nossa hipótese que haveria infiltrados imunes de linfócitos CD3+ nas
11
biópsias analisadas das pacientes com má resposta posteriormente ao tratamento com IFN
12
alfa, com números significativos, porém, provavelmente pelo “n” restrito não foi possível
13
confirmar tal hipótese. Apesar de presentes em grande número nas lesões de alto grau NIC
14
II ou III (lesões posteriores ao tratamento), estes linfócitos T CD3+ e CD8+ falham em
15
impedir a progressão da NIC. Talvez haja alguma falha na sua ativação, na produção de
16
citocinas ou até mesmo esse infiltrado possa não estar relacionado a uma resposta
17
específica ao tumor. Há também os vários mecanismos de escapes pelos quais os tumores
18
se beneficiam devido ao seu microambiente como: falência de células efetoras, perda das
19
moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), expressão de genes anti-
20
apoptóticos, produção de fatores supressores, disfunção e supressão de linfócitos T por
21
células imunes reguladoras; desta forma o sistema imune não reconhece os antígenos
22
tumorais como não próprios e não os destroem (DANERI-NAVARRO et al., 2005).
23
Portanto, existe infiltrado de células T com marcação forte em mulheres com HSIL após o
24
tratamento, que obtiveram má resposta, nada podendo ser afirmado em relação à
82
1
capacidade citotóxica desses linfócitos, principalmente pela negatividade da perforina, que
2
é uma proteína citolítica presente nos linfócitos T citotóxicos e células NK.
3
Recentemente concluiu-se que há fortes indícios relacionando a presença de linfócitos
4
T (CD3) em neoplasia intra-epitelial cervical grau III (NIC III) de pacientes recidivos que
5
realizaram o procedimento de conização, onde através da técnica de imunohistoquímica e
6
pelo critério de Georgiannos, 100% das mulheres com NIC III recidivo apresentaram alto
7
grau de linfócitos CD3 na contagem de células (MALUF et al., 2008). SILVA et al.
8
(2010), analisando 60 cortes histológicos (20 controle, 20 NIC III e 20 carcinoma invasor)
9
através da técnica de imunohistoquímica e pelo critério de Georgiannos, identificou
10
infiltrado inflamatório de linfócitos T CD3+ e CD8+ em todos os casos do grupo controle,
11
NIC III e carcinoma invasor, sendo sempre maior nos últimos, nada podendo ser afirmado
12
em relação à capacidade citotóxica desses linfócitos. Demonstramos nesse estudo
13
marcação fraca para perforina em todos os casos, independente da resposta clínica, o que
14
pode ser a confirmação para a inatividade destes linfócitos. A perforina está presente em
15
células T e NK, onde através da formação de poros na célula alvo possibilita a entrada de
16
enzimas tóxicas (granzimas) em células cancerígenas ou que foram infectadas por algum
17
vírus; ou torna a célula incapaz de eliminar íons e água, o que causa sua morte. Cientistas
18
australianos observaram pela primeira vez a descrição da estrutura molecular e o
19
funcionamento desta proteína que é capaz de destruir células cancerígenas de seu interior;
20
estudo que permitirá avançar no tratamento contra o câncer (LAW et al., 2010).
21
Demonstramos neste estudo que em pacientes com HSIL houve maior proporção de
22
infiltrado celular intenso de linfócitos T CD3+ do que de linfócitos B CD20+. Estes dados
23
também foram confirmados por SILVA et al. (2010). As lesões neoplásicas do colo uterino
24
se associam fortemente à infecção pelo HPV e há claras evidências de que a resposta
25
imune celular desenvolve o principal papel no controle e curso da infecção pelo HPV. Esta
83
1
resposta varia de acordo com o grau da lesão e o potencial oncogênico do HPV
2
(RIETHMULL ER & SEILLES, 2000).
3
Encontramos nesse estudo expressão da enzima iNOS no estroma cervical das biópsias
4
das pacientes com HSIL, em 20% do total das 25 biópsias, sendo que desses 20%, 80%
5
foram registrados anteriormente ao tratamento, independente da resposta ao tratamento,
6
concluindo que a resposta imune mediada por esta enzima está deficiente nestas pacientes
7
e que a ação do IFN parece estar envolvida na ausência de expressão desta enzima após o
8
tratamento, sendo o menor “p” encontrado em nossos resultados (0,09), mesmo esse não
9
sendo significativo provavelmente pelo “n”. Desta forma o IFN pode estar envolvido na
10
supressão da produção do NO por células tumorais. O NO foi avaliado por FERNANDES
11
e colaboradores (2007) confirmando sua liberação por células tumorais, assim como outros
12
mediadores circulantes solúveis. O NO pode interferir na capacidade inicial de migração
13
dos neutrófilos prejudicando a resposta imune. Os neutrófilos podem apresentar atividade
14
antitumoral e sua migração é de grande importância para a resposta inflamatória. O NO é
15
um mensageiro biológico sintetizado pelo aminoácido L-arginina pela ação da enzima
16
sintase de óxido nítrico (NOS). NOS é induzida em macrófagos, células endoteliais e
17
outros tipos celulares após estimulação por lipopolissacarídeo (LPS) ou citocinas como
18
interferon (IFN)-γ, fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina (IL)-1β. O NO, nessas
19
condições, tem sua liberação prolongada e é produzido em maiores concentrações
20
(MONCADA et al., 1991). O NO pode apresentar um duplo papel no desenvolvimento
21
tumoral. Evidências sugerem que ele é citotóxico e citostático contra microrganismos e
22
células malignas. Mas a produção de NO por células neoplásicas promove a angiogênese,
23
essencial ao crescimento e manutenção do tumor, podendo aumentar seu comportamento
24
metastático. NO é uma molécula sinalizadora biológica, mas quando produzida por longo
84
1
período de tempo, seu excesso poderia levar a mutações e ao câncer (OHSIMA et al.,
2
1994).
3
Também encontramos nesse estudo expressão de macrófagos (CD68+) no estroma
4
cervical das biópsias das pacientes com HSIL, em 56% do total das 25 biópsias, sendo
5
distribuídos igualmente antes e após tratamento, independente da resposta ao tratamento.
6
Um importante componente da resposta imune inata consiste nas células fagocíticas.
7
ZUR HAUSEN (1986) tem descrito um sistema de sobrevivência intracelular nas infecções
8
persistentes por HPV. A hipótese é que o câncer cervical resulta de uma deficiência no
9
controle celular da expressão dos genes do HPV, e que o controle normal é mediado por
10
fatores liberados por macrófagos. Vários estudos descrevem que macrófagos estão
11
aumentados em infecções por HPV ou NIC (AL-SALEH et al., 1998) e no carcinoma
12
cervical (DAVIDSON et al., 1997) e que estas células estão presentes em ambos, epitélio e
13
estroma, sendo capazes de fagocitar células transformadas por HPV-16.
14
Em um estudo com noventa e quatro biópsias de tecido cervical com lesão intra-
15
epitelial escamosa de alto grau (HSIL), foram examinados para a presença de células de
16
Langerhans e subpopulações de macrófagos do estroma através da técnica de
17
imunohistoquímica, sendo que a HSIL e tecidos metaplásicos foram significativamente
18
associados com a depleção de células Langerhans intra-epiteliais quando comparado com o
19
epitélio normal. Em contrapartida, houve um aumento significativo de macrófagos do
20
estroma em biópsias HSIL em comparação com colo normal (MOLLER et al., 1992). As
21
células T e NK produzem o IFN γ, uma citocina que ativa os macrófagos colaborando,
22
assim, com a reatividade antitumoral. Os macrófagos ativados são eficazes na destruição
23
de células tumorais in vitro; o CD68 é um dos marcadores de macrófagos mais usado
24
sendo bastante sensível (ALVES et al., 1999).
85
1
No caso das células NK (CD16+) e perforina (Perforin) obtivemos em 96% dos casos
2
ausência destes infiltrados e nos 4% restantes marcação fraca 1, baseada no critério de
3
Georgiannos, que representa a presença rara destas células. Contrariamente ao nosso
4
trabalho, a linhagem de células NK foi encontrada no estroma de NIC (TAY et al., 1987).
5
A lise de células infectadas com HPV, pelas células NK é deficiente em pacientes que tem
6
lesões pré-cancerosas ou câncer induzido pelo vírus, segundo MALEJCZYK et al. (1989).
7
Estes dados indicam que a infecção por HPV poderia ser controlada por resposta eficiente
8
das células NK, que são linfócitos capazes de destruir células tumorais sem uma
9
sensibilização anterior.
10
Estudos prévios da população linfocitária infiltrando a cérvix displásica tem usado
11
imunohistoquímica e tem demonstrado significantes infiltrados T citotóxicos (CD3+
12
CD8+), auxiliares (CD4+) e linfócitos B (CD20+) no estroma abaixo da lesão (BELL et
13
al., 1995). Porém, nosso trabalho avaliou estes infiltrados em células imunes no estroma
14
cervical de pacientes com neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau, antes e após
15
tratamento com IFN α-2b intralesional, demonstrando a existências destas células imunes,
16
entretanto sendo números não significativos ao compararmos antes e após o tratamento e
17
também ao dividirmos os grupos em boa e má resposta. O mesmo ocorreu com a expressão
18
da enzina iNOS, macrófagos (CD68+), células NK (CD16+) e perforina (Perforin).
19
Por haver vários critérios de inclusão e exclusão das pacientes, que foram citados na
20
metodologia deste trabalho, houve certa dificuldade na seleção das pacientes, sendo, assim
21
o nosso “n” restrito. Acreditamos que se este número alcançasse proporções maiores, mais
22
avaliações poderiam ser feitas em relação à resposta imune frente ao tratamento com IFN-
23
α2b.
24
Avaliamos neste trabalho, os infiltrados de células imunes através das biópsias que
25
foram coletadas antes da primeira aplicação com IFN-α2b intralesional e após a última
86
1
aplicação (18ª), ou seja, verificamos as células antes e após o tratamento; pode ser que
2
estas células atuem durante o mesmo, porém a biópsia foi realizada no final e elas podem
3
não estar mais presentes. MISSON (2010), analisando praticamente este mesmo grupo de
4
pacientes, a nível sistêmico, verificou o aumento do perfil das citocinas do perfil Th1
5
estimulando a queda das citocinas do perfil Treg, nas pacientes com boa resposta no 12º
6
dia de aplicação e não ao final do tratamento. O mesmo ocorreu com os trabalhos de
7
MARDEGAN (2008) e RAMOS (2010), que avaliaram o nível de citocinas à nível
8
sistêmico durante todo o tratamento. Nosso trabalho, por avaliar a intensidade e os
9
diferentes infiltrados localmente, através da coleta de biópsias, se torna restrito quanto às
10
avaliações periódicas, pois causaria vários incômodos à paciente envolvida nesta
11
imunoterapia.
12
Em nosso estudo, portanto, o tratamento com IFN-α2b intralesional nas pacientes com
13
HSIL, não modificou o infiltrado peritumoral. Provavelmente o mecanismo de ação do IFN
14
não influencia o achado de células peritumorais após o tratamento, independente da
15
resposta clínica. Pode ser que com a diminuição da carga viral do HPV nas pacientes com
16
boa resposta clínica ou através da ação de mecanismos diretos do IFN, como a apoptose
17
sobre as células neoplásicas, estejam induzindo a regressão.
18
MARDEGAN, 2008 e RAMOS, 2010 analisaram a carga viral deste mesmo grupo de
19
pacientes por nós estudado, porém com um número menor (8 e 10 pacientes
20
respectivamente), antes do tratamento com IFN alfa 2B intralesional e após o término do
21
mesmo, através da técnica de captura híbrida, observando uma queda significativa na carga
22
viral do HPV de alto risco nas pacientes que responderam ao tratamento, o que não foi
23
observado no grupo que apresentou falha terapêutica. Desta forma a ação antiviral do IFN
24
alfa pode estar relacionada à regressão da lesão. Outros estudos também demonstram um
87
1
aumento da carga viral do HPV de acordo com a progressão da NIC (WOODMAN et al.,
2
2007; SWAN et al., 1999).
3
A maioria dos tecidos sofre um constante processo de renovação celular graças ao
4
equilíbrio entre proliferação e morte das células, caracterizada por um processo ativo de
5
alterações morfológicas e bioquímicas, a apoptose. A apoptose é também um mecanismo
6
de defesa, que é ativado sempre que ocorre uma invasão por agentes patogênicos, ou ainda
7
quando o DNA for lesado. A compreensão dos mecanismos e das alterações nos
8
componentes das vias apoptóticas e sua correlação com a ocorrência do câncer são
9
importantes para o desenvolvimento de novas terapias e métodos de prevenção do câncer
10
(GRIVICICH et al., 2007).
11
As células malignas geralmente apresentam defeitos de morte celular programada e
12
apoptose. O IFN pode agir para induzir a apoptose, e o mecanismo para isso consiste em
13
ativar a cascata das caspases (ASHKENAZI & DIXIT, 1998; EARNSHAW et al., 1999;
14
BARTON et al., 2005; MUSCAT et al., 2006; SAIDI et al., 2006). A apoptose induzida
15
por IFN-α foi associada com a ativação das caspases 1,2,3,8 e 9 (THYRELL et al., 2002).
16
Os iniciadores da cascata das caspases são 8 e 9, e o principal efetor é a caspase 3
17
(THORNBERRY & LAZEBNIK, 1998). Entre os diversos substratos das caspases pode-se
18
citar a mdm-2 (murine double minute), uma proteína que se liga à p53, mantendo-a no
19
citoplasma. Ao ser clivada pelas caspases, essa proteína libera a p53 que se transloca para
20
o núcleo, ativando a transcrição de genes pró-apoptóticos como o Bax (SCHULER, 2003).
21
O IFN alfa induz a uma apoptose caspase-dependente que está associado com a ativação do
22
Bax, sendo esta ativada e translocada para a mitocôndria, diante este processo (THYRELL,
23
2004; PANARETAKIS, 2003).
24
A imunomodulação e a inibição da angiogênese são mecanismos indiretos antitumorais
25
mediados por apoptose. No que se refere à imunomodulação, IFNs podem ter efeitos
88
1
antitumorais através do aumento das células T citotóxicas, células Natural Killer e células
2
dendríticas. A inibição da angiogênese pode resultar na apoptose de células endoteliais.
3
Esse fator é importante na gênese do tumor e inibição da formação de metástases
4
(LINDNER, 2002). O objetivo de um método de Imunoterapia ideal é a destruição
5
completa de todas as células neoplásicas, sem prejudicar as células normais em divisão,
6
porém estudos adicionais ainda são necessários para alcançar plena compreensão do
7
mecanismo de ação do IFN. Isso é de fundamental importância para descobrir novas
8
estratégias sobre o tratamento do câncer, isoladamente ou em associação com outras
9
estratégias terapêuticas, como a cirurgia e a quimioterapia (NOMELINI et al., 2007).
10
A demonstração de que a apoptose é um mecanismo inato de defesa antineoplásica e
11
que vários agentes quimioterápicos agem através da indução desse tipo de morte celular
12
levou a uma intensa investigação dos mecanismos moleculares da apoptose e sua aplicação
13
no tratamento do câncer (NICHOLSON, 2000). Portanto, apesar da enorme variabilidade
14
do câncer, evidências demonstram que a resistência a apoptose é uma das características
15
mais marcantes da maioria dos tumores malignos (OKADA & MAK, 2004). De fato, a
16
análise do processo de tumorigênese revela que a capacidade de resistir à morte pode ser
17
adquirida por diferentes mecanismos e acontecer em vários momentos do desenvolvimento
18
tumoral. Entre estes, a resistência à morte por apoptose em células que escapam do
19
controle do crescimento e da diferenciação normais exercidos por fatores solúveis ou até
20
aquela induzida por lesões no DNA (ZORNIG et al., 2001). A apoptose na prática clínica é
21
alvo para um potencial uso terapêutico da morte celular programada ou para a
22
compreensão dos mecanismos de resistência à radioterapia e à quimioterapia
23
(NICHOLSON, 2000; DEBATIN, 2004).
24
O interferon alfa tem sido utilizado no tratamento de vários tipos de câncer há quase 30
25
anos, mas o (s) mecanismo (s) responsável por sua ação antitumoral permanece
89
1
desconhecido. Uma variedade de respostas celulares, incluindo a inibição do crescimento
2
celular, a imonumodulação, ação antiviral e a indução de apoptose são induzidas por IFNs.
3
A indução de apoptose e ação antiviral por esta citocina tem sido as propostas de maior
4
importância para ambos os seus efeitos antitumorais.
5
A indução de apoptose por IFN-α é um mecanismo de atividade antitumoral altamente
6
atraente, e que pode também desempenhar um papel na “limpeza” de células infectadas por
7
vírus. IFN-α pode realmente induzir a apoptose em algumas linhagens celulares
8
transformadas, bem como em células tumorais (SANGFELT et al., 1997; CAI & JONES,
9
1998; DAI & KRANTZ, 1999; THYRELL et al., 2002). Além disso, em mieloma, bem
10
como em linhagens de células de glioma, o tratamento em longo prazo com o IFN-α tem
11
sido sugerido para sensibilizar as células a apoptose induzida por FAS (SPETS et al., 1998;
12
ROTH et al., 1998). Além disso, o FAS ligante (FASL)/FAS receptor (FASR) podem
13
mediar efeitos do IFN-α2 em tumores sólidos (BUECHNER et al., 1997). De fato, após
14
injeção de IFN-α2 em tumores sólidos, FASR e apoptose foram induzidos, e os tumores
15
regrediram.
16
Os detalhes moleculares da indução de apoptose por IFN-α ainda permanece obscura,
17
mas foi demonstrado que envolve a ativação de caspases e da via mitocondrial, por
18
exemplo, a via c do citocromo (cit c) e perda de liberação do potencial de membrana
19
mitocondrial (PMM) (THYRELL et al., 2002).
20
PANARETAKIS et al. demonstraram, que a apoptose induzida por IFN-α ocorre
21
juntamente com a ativação da pró-apoptótica Bcl-2, relacionada as proteínas Bak e Bax.
22
Na verdade eles descobriram que o IFN-α induz a ativação dos dois membros pró-
23
apoptóticos da família Bcl-2, Bak e Bax e mostraram que células apoptóticas tinham altos
24
níveis de Bak ativado, e que a maioria das células apoptóticas também cotinham um alto
25
nível de Bax na sua conformação ativa, sugerindo seu envolvimento direto de morte celular
90
1
induzida por IFN-α. No entanto, a ativação da Bak ocorre no início da resposta apoptótica,
2
antes liberação cit c e a perda PMM, considerando que a ativação da Bax é posterior a
3
esses eventos (PANARETAKIS et al., 2003).
4
Um gene supressor de tumor especificamente ativado após um estresse genotóxico é a
5
p53. TAKAOKA et al. demostraram que a transcrição do gene p53 é induzida por IFN-α/β,
6
acompanhada por um aumento no nível da proteína p53. Nestas condições experimentais
7
de indução do gene p53 pelo IFN-α/β, esse contribuiu para a supressão do tumor e
8
impulsionou respostas da p53 frente a sinais de stresse (TAKAOKA et al., 2003).
9
A compreensão dos mecanismos moleculares que regulam a transdução de sinal
10
mediada por IFN-α, dos mecanismos de escape ativadas em células do câncer e
11
mecanismos de resistência do tumor frente ao IFN-α são de grande utilidade para a
12
concepção de novas estratégias terapêuticas baseadas na utilização de IFN-α, tendo em
13
vista ampliar os efeitos terapêuticos dessa citocina.
Conclusões
92
8. Conclusões
1. O tratamento das NICs graus II e III com Interferon alfa-2b intralesional
apresentou boa resposta clínica em 46,15% das pacientes;
2. Todas as pacientes com NIC II ou NIC III demonstraram nesse estudo a
existência de linfócitos T CD3+ e CD8+, no entanto, após o tratamento 100% dos casos
com má resposta tinham CD3+ com marcação forte;
3. O tratamento com IFN-α2b intralesional nas pacientes com HSIL, não modificou
o infiltrado peritumoral. Provavelmente o mecanismo de ação do IFN não influencia o
achado de células peritumorais após o tratamento, independente da resposta clínica.
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Resumo
108
10. Resumo
Introdução: A infecção pelo papilomavírus humano (HPV) induz respostas imunes
inata e adquirida no estroma do colo uterino, sendo esta defesa imunológica delicada,
equilibrada e nem sempre é possível prevê-la. Devido à quebra imunológica que causa o
vírus HPV, a erradicação de células infectadas não ocorre, podendo levar ao
desenvolvimento de lesões intra-epiteliais e invasivas. Avanços na compreensão do
sistema imune e na definição de antígenos em células tumorais têm levado a muitas novas
estratégias de tratamento. Recentemente, a imunoterapia com interferon (IFN) no
tratamento da neoplasia intra-epitelial cervical grau II e III (NIC II e NIC III) tem sido
bastante utilizado.
Objetivos: Caracterizar o infiltrado de células imunes no estroma do colo uterino
obtidos pela coleta de biópsias de pacientes com diagnóstico de NIC II ou III que foram
tratadas através da imunoterapia com IFN utilizando a técnica de imunohistoquímica para
linfócitos T (CD3,CD4,CD8), B (CD20), macrófagos (CD68), óxido nítrico sintase
induzida (iNOS), células natural killer (CD16) e perforina (PERFORIN).
Metodologia: Nosso grupo de estudo consiste de 13 pacientes com média de idade de
33,9 anos que foram diagnosticadas com NIC II ou NIC III que foram submetidas ao
tratamento com IFN intralesional (3.000.00 U). Duas biópsias foram coletadas de cada
paciente, um após o diagnóstico de NIC II ou III e um após o tratamento com IFN. As
lâminas foram examinadas por microscopia de luz comum com objetiva 400x por
imunohistoquímica. A análise estatística foi feita pelo software GraphPad Prism 5.0 pelo
teste exato de Fisher.
109
Resultados: Quanto à resposta ao tratamento, 46.15% das pacientes apresentaram boa
resposta ao tratamento e 53.85% falha terapêutica. Não houve variação estatisticamente
significativa antes e após o tratamento entre as células estudadas.
Discussão e Conclusão: O perfil das células estudadas em pacientes com NIC II ou III
manteve-se, independentemente do tratamento com IFN e do grau da lesão. Todas as
pacientes com NIC II ou NIC III demonstraram nesse estudo a existência de linfócitos T
CD3+ e CD8+, independentes se tiveram boa ou má resposta ao tratamento ou se foi
anterior ou posterior ao tratamento. Em pacientes com HSIL houve maior proporção de
infiltrado celular intenso de linfócitos T CD3+ do que de linfócitos B CD20+. O
tratamento não modificou o infiltrado peritumoral. Provavelmente o mecanismo de ação do
INF não influencia o achado de células peritumorais após o tratamento, independente da
resposta clínica. O sucesso terapêutico do tratamento pode ser pela diminuição da carga
viral do HPV nas pacientes com boa resposta, ou por mecanismos diretos de IFN em
células neoplásicas através da indução de apoptose por meio de regressão.
Palavras-chave: papilomavírus humano; neoplasia intra-epitelial cervical; imunoterapia,
interferon, apoptose.
Abstract
111
11. Abstract
Introduction: Infection by human papillomavirus (HPV) induces innate and acquired
immune responses in the uterine cervical stroma, which are a delicate, balanced and
generally unpredictable immunological defense. Due to the immunological breaks that
HPV virus causes, eradication of infected cells does not occur, potentially leading to
development of intraepithelial and invasive lesions. Advances in our understanding of the
immune system and in the definition of antigens on tumor cells have led to many new
treatment strategies. As a result, immunotherapy has the potential to be the most specific
treatment for tumors, and one that requires elaboration. Recently, immunotherapy with
interferon (IFN) for the treatment of cervical intraepithelial neoplasia grade II and III (CIN
II and CIN III) has been used.
Objectives: Characterize the immune cells infiltrated uterine cervical stroma obtained
from biopsies collected from patients diagnosed with CIN II or III that were treated with
IFN immunotherapy using the technique of immunohistochemistry for T (CD3,CD4,CD8),
B lymphocytes (CD20), macrophages (CD68), inducible nitric oxide synthase (iNOS),
natural killer cell (CD16) and perforin (PERFORIN).
Methodology: Our study group consisted of 13 patients with an age group of 33.9
years old who were diagnosed with CIN II or III and subjected to treatment with intralesional IFN (3.000.000 U). Two biopsies were collected from each patient, one after the
diagnosis of CIN II or III and one after therapy with IFN. The slides were examined by
common light microscopy with 400x ocular by immunohistochemistry. The statistical
analysis was made by the 5.0 GraphPad Prism software by Fisher's exact test.
112
Results: As to the answer to the treatment, 46.15% of the patients presented good
response to the treatment and 53.85% therapy failure. There was no statistically significant
variation before and after treatment between the cells studied.
Discussion and Conclusion: The profile of the studied cells from patients with CIN II
or III remained, regardless of treatment with IFN and from lesion degree. All patients with
CIN II or CIN III in this study demonstrated the existence of T lymphocytes CD3+ and
CD8+, independent if they had good or poor response to treatment or whether it was before
or after the treatment. In patients with HSIL there were more intense cellular infiltrate of
CD3+ T lymphocytes than B lymphocytes CD20+. The treatment did not modify the
peritumoral infiltrate. Probably the mechanism of action of IFN does not influence the
finding of peritumoral cells after treatment, regardless of clinical response. Therapeutic
success of treatment may be by decreasing the viral load of HPV in patients with good
response, or by direct mechanisms for IFN in cancer cells by inducing apoptosis through
regression.
Keywords: human papillomavirus; cervical intraepithelial neoplasia; immunotherapy,
interferon, apoptosis.
Anexos
114
Anexo A - Parecer consubstanciado aprovado pelo CEP (folha 1/3)
115
Anexo A: Parecer consubstanciado aprovado pelo CEP (folha 2/3)
116
Anexo A: Parecer consubstanciado aprovado pelo CEP (folha 3/3)
117
Anexo B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (folha 1/2)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você tem um tipo de doença denominada neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) de alto
grau e está sendo convidada a participar do estudo “Avaliação da resposta imunológica e
clínica de pacientes com Neoplasia Intra-epitelial Cervical de alto grau tratadas com
Interferon alfa-2b intralesional”. Os avanços na área de saúde ocorrem através de estudos
como este, por isso sua participação é importante. O objetivo do estudo é:
• Tratar esta doença com uma medicação denominada interferon alfa-2b que será
administrada dentro da lesão no colo do útero com auxílio de uma seringa e agulha.
• Será avaliada a resposta ao tratamento (por exemplo, se houve melhora ou não da
lesão) e se analisará a importância do sistema de defesa durante o tratamento.
E caso você participe, será necessário coletar material para o estudo que estamos
propondo, alem dos que já são normalmente coletados para os exames de rotina. É também
importante saber que:
• A medicação será aplicada 3 vezes por semana em dias alternados por 6 semanas
(total de 18 aplicações);
• É de suma importância o comparecimento nos dias das aplicações para não
prejudicar o tratamento;
• Você deverá usar método anticonceptivo durante o tratamento, pois a medicação
pode acarretar vários danos para o bebê em caso de gestação no curso do
tratamento.
• Esta medicação pode levar a alterações em algumas substâncias presentes no
organismo como desidrogenase lática, hemoglobina, leucócitos, plaquetas e
fosfatase alcalina, por isso essas substâncias serão dosadas durante o tratamento.
Para dosagem é necessário a coleta de sangue que será realizada no laboratório do
Hospital Escola;
• A medicação pode ocasionar alguns efeitos colaterais como: Febre, calafrios, mal
esta geral, mialgia, diminuição do apetite, diminuição dos leucócitos e das
plaquetas.
• No caso de não ocorrer melhora da doença ou mesmo se houver apenas melhora
parcial você será prontamente encaminhada para tratamento cirúrgico
complementar.
Você poderá ter todas as informações que quiser e poderá não participar da
pesquisa ou retirar seu consentimento a qualquer momento sem prejuízo no seu
atendimento. Pela sua participação no estudo, você não receberá qualquer valor em
dinheiro, mas terá a garantia de que todas as despesas necessárias para a realização da
pesquisa não serão de sua responsabilidade. Seu nome não aparecerá em qualquer
momento do estudo, pois você será identificada com um número.
118
Anexo B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (folha 2/2)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO
Eu,
_______________________________________________,
li
e/ou
ouvi
o
esclarecimento acima e compreendi para que serve o estudo e qual procedimento a que
serei submetido. A explicação que recebi esclarece os riscos e benefícios do estudo. Eu
entendi que sou livre para interromper minha participação a qualquer momento, sem
justificar minha decisão e que isso não afetará meu tratamento. Sei que meu nome não será
divulgado, que não terei despesas e não receberei dinheiro para participar do estudo. Eu
concordo em participar do estudo.
Uberaba,......./......./......
________________________________ ____________________
Assinatura do voluntário ou seu Documento de identidade
Representante legal
___________________________________
Assinatura do pesquisador Responsável
___________________________________
Assinatura do pesquisador Orientador
Prof. Dr. Eddie Fernando Cândido Murta
Telefone de contato dos pesquisadores: 3318-5326/3318-5565
Em caso de dúvida em relação a este documento, você pode entrar em contato com o
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, pelo telefone
3318-5854.
119
Anexo C – Distribuição das pacientes segundo a contagem de células antes e após tratamento
(folha 1/2)
Paciente
CD3
2
1
3
1
1
2
2
2
3
3
2
3
3
4
1
4
3
5
1
5
1
6
3
6
3
7
3
7
3
8
2
8
*
9
2
9
2
10
3
10
3
11
3
11
1
12
2
12
2
13
2
13
* sem material suficiente
CD4
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
2
*
0
0
0
0
0
0
1
1
0
CD8
2
2
2
2
3
2
3
1
2
1
1
3
2
2
2
2
*
2
2
2
3
3
1
2
2
2
CD16
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
*
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CD20
1
0
1
0
3
0
1
0
0
0
0
1
2
1
1
0
*
0
0
3
2
1
0
0
1
2
CD68
1
1
0
1
0
1
0
0
1
1
1
1
1
0
1
0
*
0
0
0
0
0
1
0
1
2
iNOS
0
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
*
0
1
0
0
1
0
0
2
0
Perforina
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
*
0
0
0
0
0
0
0
0
0
120
Anexo C – Distribuição das pacientes segundo a contagem de células antes e após tratamento
(folha 2/2)
Paciente CD3
CD4
Forte
Fraca
1
Forte
Fraca
1
Fraca
Fraca
2
Forte
Fraca
2
Forte
Forte
3
Forte
Fraca
3
Forte
Fraca
4
Fraca
Fraca
4
Forte
Fraca
5
Fraca
Fraca
5
Fraca
Fraca
6
Forte
Fraca
6
Forte
Fraca
7
Forte
Fraca
7
Forte
Fraca
8
Forte
Forte
8
*
*
9
Forte
Fraca
9
Forte
Fraca
10
Forte
Fraca
10
Forte
Fraca
11
Forte
Fraca
11
Fraca
Fraca
12
Forte
Fraca
12
Forte
Fraca
13
Forte
Fraca
13
* sem material suficiente
CD8
Forte
Forte
Forte
Forte
Forte
Forte
Forte
Fraca
Forte
Fraca
Fraca
Forte
Forte
Forte
Forte
Forte
*
Forte
Forte
Forte
Forte
Forte
Fraca
Forte
Forte
Forte
CD16
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
*
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
CD20
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Forte
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Forte
Fraca
Fraca
Fraca
*
Fraca
Fraca
Forte
Forte
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Forte
CD68
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
*
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Forte
INOS
Fraca
Fraca
Forte
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Forte
Fraca
Fraca
Fraca
*
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Forte
Fraca
Perforina
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
*
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
Fraca
121