54º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
Bahia Othon Palace Hotel • Salvador • BA • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Otimização da STNPCR para detecção do
alvo IS6110 do genoma do Mycobacterium
tuberculosis em amostras de urina e
sangue humanos
Costa-Lima, JF; Montenegro, LML; Montenegro, RA; Melo, FL; Lima, JFA; Schindler, HC
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ. Departamento de Imunologia
Palavras-chave: PCR, genoma do M, tuberculosis, detecção de DNA, sangue, urina
A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) permite a síntese enzimática in vitro de seqüências específicas de DNA
através do uso de dois oligonucleotídeos que hibridizam fitas opostas. Este método está sendo proposto como diagnóstico
laboratorial alternativo para tuberculose pulmonar e extrapulmonar, apresentando a vantagem de ser específica, sensível
e rápida. Com detecção, teoricamente em 24h e sensibilidade de até uma cópia de DNA alvo em uma única célula
micobacteriana. A Single Tube Nested-PCR (STNPCR) é um método que utiliza dois pares de oligonucleotídeos em
duas reações consecutivas, sem abertura dos tubos. Os oligonucleotídeos internos foram previamente fixados no interior
da tampa do microtubo e os oligonucleotídeos externos adicionados aos reagentes para a 1ª reação de amplificação. É
utilizada nos casos em que se requer alta sensibilidade e especificidade. O alvo molecular utilizado foi à seqüência de
inserção IS6110, específica do complexo Mycobacterium tuberculosis. Foram realizados testes de especificidade com DNA
genômico extraído de cepa de referência de M. tuberculosis (H37Rv), outras cepas de micobactérias e DNA humano.
Para determinar o limite de detecção da técnica, foram realizadas curvas de diluição seriadas, fator 10, utilizando DNA
genômico purificado de M. tuberculosis (H37Rv), o DNA genômico diluído em amostras de sangue e urina coletados
de humanos sadios e também diluições seriadas, fator 10, de bacilos crescidos em meio Lowestein-Jensen, a partir do
tubo 1 da escala de McFarland. As amostras de urina foram processadas pelo método de Petroff e todas as amostras
foram submetidas à extração do DNA genômico para análise pela técnica. A 1ª reação de amplificação da STNPCR
foi realizada a 92ºC por 1 minuto, 57ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto durante 15 ciclos e a 2ª reação foi a
92ºC por 1 minuto, 57ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto durante 45 ciclos. No término da 1ª amplificação,
os tubos foram retirados do termociclador e os microtubos homogeneizados, para que os oligonucleotídeos internos
participassem da 2ª reação. Os amplicons produzidos foram de 409pb e 316pb, nas 1ª e 2ª reações, respectivamente.
A técnica foi capaz de detectar apenas DNA de cepa do complexo Mycobacterium tuberculosis. A menor quantidade
detectada pela técnica de STNPCR foi de 0.0001fg, 1000fg, 0.01fg de DNA, utilizando DNA genômico purificado,
DNA diluído em amostras de sangue e urina, respectivamente. Foi detectada a quantidade de até 3x102bactérias/ml em
sangue e urina pela STNPCR. A técnica demonstrou ser específica, sensível e rápida nos experimentos preliminares,
necessitando ser avaliada em amostras clínicas de pacientes com tuberculose confirmada pelos métodos convencionais
utilizadas para a confirmação da doença e em indivíduos sem tuberculose.
Apoio financeiro: CPqAM/FIOCRUZ, PDTIS/FIOCRUZ, ICOHRTA, FACEPE.
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