Haemophilus
Corynebacterium
Mycobacterium
Haemophilus spp.
Bacilos Gram negativos pleomórficos oxidase positivos
Família Pasteurellaceae
• Principais espécies de importância clínica:
– H. influenzae
– H. parainfluenzae
– H. ducreyi
Características
•
•
•
•
•
“Amantes do sangue”
Bacilos Gram negativos pleomórficos (Cocobacilos)
Oxidase positivo
Anaeróbios facultativos
Crescimento ótimo:
– 5 a 7% de CO2
– 35-37º C
– 24 a 48 horas (H. ducreyi – 7 dias)
• Requerimento nutricional fastidioso
– Formação de colônias satélites
Infecções em Humanos
• Menos complicadas
– Conjuntivite
– Sinusite
– Otite média
• Invasivas
– Pneumonia
– Meningite
• H. influenzae tipo b (2 meses a 3 anos de idade)
– Cancro mole ou cancróide
• H. ducreyi (úlceras perigenitais e perianais)
Fatores de Virulência
• Polissacarídeo capsular
– 6 sorotipos (a, b, c, d, e, f)
• Pili
– Aderência a células da mucosa humana
• Protease IgA1
– Inativa IgA presente na orofaringe
• Produção de hemocinina
– Inibe crescimento bacteriano da flora normal
Coleta e Transporte
• Espécimes clínicos:
–
–
–
–
–
–
–
–
Líquido cefalorraquidiano (líquor / LCR)
Sangue
Escarro
Aspirado traqueal
Lavado brônquico
Amostras uretrais
Swab de úlceras genitais
Secreção ocular
Diagnóstico - Gram
• Bastonetes Gram negativos pequenos e pleomórficos (cocobacilos)
Diplococos Gram Positivos Streptococcus pneumoniae
Cocobacilos Gram Negativos Pequenos Haemophilus influenzae
Diagnóstico - Prova da Oxidase
• Pesquisa presença da enzima Citocromo Oxidase
• Colocar bactéria em papel filtro
• Adicionar uma gota do reativo da oxidase
• Positivo Desenvolvimento de cor azul escuro ou roxo
Negativo
Positivo
Diagnóstico - Cultura
• Necessário fatores de crescimento presente em hemácias
• FATOR X
– Derivado da hemina (encontrado em quantidade no sangue)
– Substância termoestável
– Necessário para a síntese das enzimas respiratórias que contém
ferro: citocromo oxidase, catalase, peroxidase
• FATOR V
– É a coenzima NAD (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo)
– Substância termolábil
– Produzida pelo Staphylococcus aureus
• Satelitismo
Meios de Isolamento Primário
• Ágar sangue – 5% de sangue
– Sangue de carneiro não recomendado (inativa fator V)
– Sangue de cavalo ou coelho
– Utilizar apenas se na presença de S. aureus
• Ágar chocolate – 5% de sangue aquecido a 80º C
– Lisa as hemácias e libera o fator X
– Inativa a enzima do sangue de carneiro
– Pode inativar o fator V (termolábil)
• IsoVitaleX
Prova do Satelitismo
•
•
•
•
Prova realizada em AS
Produção de Fator V por bactérias (S. aureus)
Prova de identificação presuntiva para o gênero
Colônias pequenas ao redor das colônias de S. aureus
Prova do Satelitismo
Placa 1 – Ágar Sangue
Placa 2 – Ágar Muller Hinton
Placa 1
Placa 2
Uso dos
Fatores
Situação 1
+ (junto da estria)
+
V
Situação 2
+ (junto da estria)
-
XeV
Situação 3
+ (fora da estria)
-
X
Tiras de Papel Filtro
Requerimento do Fator V
Requerimento do Fator X
x
v
x
Requerimento dos Fatores X e V
x
v
v
Características Diferenciais das
Espécies de Haemophilus
Requerimento de Fator
X
V
Catalase
H. influenzae
+
+
+
H. parainfluenzae
-
+
+
H. ducreyi
+
-
-
Tratamento
• H. influenzae são susceptíveis in vitro
– Ampicilina
– Amoxacilina
– Cefaosporinas, tetraciclinas, aminoglicosídeos e
sulfonamidas
• Algumas cepas produzem beta lactamase
– Resistência à ampicilina
Corynebacterium spp.
Bacilos Gram positivos com extremidades arredondadas e arrumados
como letras chinesas
Características
• Catalase positivo e são imóveis
• Bastonetes Gram positivos com extremidades
arredondadas arrumados em letras chinesas
–
–
–
–
Bastonetes pequenos
Grânulos de acúmulo de substâncias
A bactéria não é corada uniformemente no Gram
Coloração Albert-Laybourn (coloração metacromática: corpo
esverdeado e extremidades marrons)
• Várias espécies fazem parte da flora normal
• Principal espécie de importância médica:
– Corynebacterium diphtheriae
Difteria
• Doença infecto-contagiosa de curto período de
incubação
• Faringite exsudativa envolvendo palato e úvula
• Membrana muco-purulenta que pode envolver laringe
e traquéia
• Virulência provocada por exotoxina – Toxina Diftérica
– Ação da infecção da bactéria por fago
• A toxina diftérica tem ação sistêmica, atingindo
sistema cardíaco, respiratório e sistema nervoso
central
Corynebacterium diphtheriae
• Coleta e transporte
– Material do trato respiratório
• Nasofaringe e orofaringe
– Coletar a amostra das bordas da pseudomembrana utilizando um Swab
– A bactéria pode ser preservada e
transportada com segurança em meios de
transporte até 24 horas
Diagnóstico – Exame Direto
• Gram
• Coloração de Albert-Laybourn
–
–
–
–
–
–
–
Fixar o esfregaço pelo calor
Cobrir o esfregaço com corante de Albert-Laybourn - 3 minutos
Lavar rapidamente com água corrente
Cobrir o esfregaço com o Lugol - 2 minutos
Lavar rapidamente com água corrente
Secar à temperatura ambiente ou em estufa à 35 – 37ºC;
Proceder a microscopia em objetiva de 100X
Diagnóstico - Cultura
• Semear o swab em toda a superfície dos seguintes
meios
– AS – Ágar Sangue
•
•
•
•
Meio não seletivo
Não permite diferenciar Corynebacterium spp. de outras espécies
Crescimento sem hemólise
Usado como diagnóstico de exclusão (beta hemolítico: S. pyogenes)
– ACT – Ágar Chocolate Telurito de Potássio
• Meio seletivo de favorecimento para o Corynebacterium spp.
• Diferenciação de biotipos (gravis, intermedium e mitis)
– Loeffler
• Ágar com soro de cavalo coagulado
• Deixar o sawb depositado na parte inclinada
• Meio de enriquecimento 2 a 4 horas a 35º C
– Gram e Albert-Laybourn
– Subcultivo em ACT (18 a 24 horas a 35º C)
Diagnóstico – Produção de Toxina
• ELEK
– Teste de imunodifusão
– Meio ágar protease peptona (meio transparente)
– Ao preparar o meio acrescenta-se um tira de papel
filtro embebida com anticorpo antitoxina diftérica
– Amostra inoculada e incubada a 35º C 24-48 hrs
– Resultado positivo: formação de linha de precipitação
formando ângulo de 45º
– Incluir sempre controle positivo e negativo
Diagnóstico – Produção de Toxina
• ELEK
Papel Filtro embebido em Antitoxina
Cepa
produtora de
toxina diftérica
Cepa não
produtora de
toxina diftérica
Mycobacterium spp.
Bacilos finos não corados pelo Gram, aeróbios, resistentes à ação de
ácidos e bases
Mycobacterium
• Família Mycobacteriaceae
• Principais espécies
– Mycobacterium tuberculosis (BK - Bacilo de Koch)
– Mycobacterium bovis
– Mycobacterium leprae
Tuberculose
• É uma das doenças que mais mata no mundo
• Estimativa de que 1/3 da população esteja infectada
• A transmissão é feita através do ar, de pessoa para
pessoa (espirro, tosse, risada, etc.)
• Afeta principalmente os pulmões, mas pode afetar
outros órgãos
Diagnóstico - Cuidados
• Cuidado no manuseio de amostras no laboratório alto risco de contaminação principalmente por
aerossóis
• Altamente recomendado uso de máscaras de
barreira
• Quando se deseja fazer apenas baciloscopia, sem
cultura, pode-se adicionar hipoclorito na amostra. O
BK continua inviável, mas é visualizado na
baciloscopia
Diagnóstico
• Espécimes clínicos:
–
–
–
–
–
–
–
Escarro
Swab de nasofaringe
Sangue
Líquor
Lavado brônquico
Lavado gástrico
Material de biópsia
• Coleta do escarro:
– Colher de preferência no início da manhã
– Fazer higiene bucal e fazer 4 a 10 inspirações profundas
Diagnóstico – Exame Direto
• Coloração de Ziehl Neelsen (Baciloscopia)
–
–
–
–
–
–
–
Cobrir lâmina com Fucsina Fenicada
Aquecer até emissão de vapores (3 a 4 vezes por 5’)
Lavar rapidamente em água corrente
Descorar com álcool-ácido
Lavar rapidamente com água corrente
Cobrir a lâmina com Azul de metileno por 30-60’’
Lavar rapidamente com água corrente e esperar secar
Diagnóstico – Exame Direto
• Resultado semiquantitativo (percorrer 100 campos)
Lâmina
Resultado Reportado
BK não visualizado
Ausência de BAAR na amostra examinada
1 a 9 BK em 100 campos
Positivo +
1 a 9 BK em 10 campos
Positivo ++
1 a 9 BK por campo
Positivo +++
> 9 BK por campo
Positivo ++++
Diagnóstico - Cultura
• Espécime clínico (escarro) contaminado com flora normal
– Método de PETROFF
• O escarro é misturado ao NaOH 1N e depois de dez minutos o material é
centrifugado por 20 minutos. O sedimento é neutralizado com solução de
HCl 1N com indicador. Só então a amostra é inoculada no meio de LJ.
– Método do Lauril Sulfato de Sódio
• Meio de cultura Lowenstein-Jensen (LJ)
–
–
–
–
Meio em tubo à base de ovo coagulado
Geralmente inocula em 2 tubos
35º C, por até 45 dias, leitura feita semanalmente
Nas primeiras 24 horas deixar o tubo deitado e a tampa frouxa
Diagnóstico - Cultura
• Resultado de crescimento semiquantitativo
Resultado
Interpretação
Ausência de colônias
Não houve crescimento bacteriano depois de 45 dias
(+)
Crescimento de 1 a 20 colônias em cada tubo
+
Crescimento de 20 a 100 colônias em cada tubo
++
Crescimento de mais de 100 colônias em cada tubo
Diagnóstico - Cultura
• Característica da colônia:
– Tamanho médio a grande, semelhante a couve-flor, rugosa,
bordas irregulares, coloração creme
– Fazer baciloscopia da colônia
• Identificação do M. tuberculosis
– Prova da Niacina e Redução de Nitrato a Nitrito POSITIVO
Diagnóstico Não Bacteriológico
• PPD (Derivado de Proteína Purificado) ou Teste de Mantoux
• Injeção intradérmica de tuberculina
• Não tem importância diagnóstica
• Resultado positivo indica que houve contato com o bacilo,
mas não indica doença ativa
• Teste utilizado para fins de controle epidemiológico e
profilaxia em contactantes de pacientes com tuberculose
• Reação Positiva
– Formação de endurecimento (infiltrado celular)
Diagnóstico Não Bacteriológico
• A leitura do resultado é feita de 48-72
horas após aplicação do teste
• Possíveis resultado:
–
0 – 4 mm = Não reator Indivíduo não infectado pelo
M. tuberculosis ou com hipersensibilidade reduzida.
– 5 – 9 mm = Reator fraco Indivíduo vacinado com BCG
ou infectado por M. tuberculosis ou outras micobactérias.
– ≥ 10 mm = Reator forte indivíduo infectado pelo M.
tuberculosis,(doente ou não) e indivíduos vacinados com
BCG nos últimos dois anos.