EasyPrep DNA Mini II
Código
EP-14-13151
Quantidade
:
50 preparações
Volume de amostra
:
até 25mg de tecido fresco ou congelado
Tempo de procedimento
:
30 - 60 minutos
Volume de eluição
: 50 – 200μl
Rendimento
:
até 50μg de DNA
Temperatura de armazenamento
:
ver armazenamento
Descrição
EasyPrep DNA Mini II é uma excelente ferramenta que oferece uma extração de DNA rápida e econômica de tecido animal. Existem
alguns protocolos especiais para extração de tecidos fixados, bactérias, leveduras, sangue seco (a partir de cartão de coleta, papel
filtro), dente e polpa dentária. Primeiramente, as células são lisadas e as proteínas são degradadas com o uso de sais caotrópicos e
proteinase K, então o DNA é adsorvido em uma membrana de sílica; o DNA é lavado e depois eluido em um tampão ou ddH 2O.
Comparados a outros procedimentos, este kit diminui o tempo para em torno de 1 hora (tempo de lise depende do tipo de tecido). O
tamanho do DNA purificado é até 50kb (predominantemente 20 - 30kb). O DNA extraído tem alta performance em PCR e pode ser
usado diretamente em aplicações downstream.
Características
- Alta Pureza: purificação de alta qualidade e completa remoção de contaminantes e inibidores, confiança nas aplicações downstream;
- Rapidez: 30 a 60 minutos;
- Segurança: elimina o uso de fenol e clorofórmio, minimizando a exposição à estes compostos e o descarte de materiais perigosos.
Componentes do Kit
Tampão de Lise 1
15ml
Tampão de Lise 2
15ml
Tampão de Lavagem 1*
22ml
Tampão de Lavagem 2**
10ml
Tampão de Eluição
15ml
Proteinase K ***
11mg
Colunas
50 peças
Tubos de Eluição (1,5ml)
50 peças
Tubos de Coleta (2ml)
Micropistilo
100 peças
50 peças
* Adicionar 8ml de etanol (96~100%) ao Tampão de Lavagem 1 quando abrir pela primeira vez.
** Adicionar 40ml de etanol (96~100%) ao Tampão de Lavagem 2 quando abrir pela primeira vez.
*** Adicionar 1.1ml de ddH2O estéril em cada tubo de proteinase K para fazer um solução estoque de 10mg/ml.
Equipamentos e reagentes não fornecidos
- Etanol (96 ~100%)
- Pipetas e ponteiras (recomenda-se o uso de ponteiras com filtro)
- Luvas descartáveis
- Microcentrífuga
- Vórtex
- Banho maria ou banho seco
- Microtubos (amostra inicial)
- Zimolase, liticase, tampão sorbitol, solução de lisozima para protocolos especiais
Notas Importantes
1. Os tampões fornecidos neste kit contém substâncias irritantes. Usar luvas e avental ao manipular estes tampões;
2. Adicionar 1.1ml de ddH2O estéril em cada tubo de proteinase K para fazer um solução estoque de 10mg/ml. Misture em vórtex e
certifique-se que a proteinase K foi completamente dissolvida. Armazenar à 4°C;
3. Adicionar 8ml de etanol (96~100%) ao tampão de lavagem 1 quando abrir pela primeira vez;
4. Adicionar 40ml de etanol (96~100%) ao tampão de lavagem 2 quando abrir pela primeira vez.
5. Pré-aqueça dois banhos-maria ou dois banhos secos um à 60°C e outro à 70ºC antes de iniciar o processo;
6. Em todas as etapas, a centrifugação é realizada a velocidade máxima (14.000 rpm ou 10.000 x g) em uma microcentrífuga;
7. Espere que a amostra fique a temperatura ambiente.
Resumo do Protocolo
Protocolo Geral
Por favor, leia as notas importantes antes de iniciar as etapas seguintes. Para outras amostras de tecido, procure o protocolo referente
em ''protocolos especiais''.
1. Para amostras frescas: corte até 25mg da amostra do tecido e coloque em um microtubo (não fornecido). Use o micropistilo para
macerar o tecido em pequenos pedaços, ou macere o tecido com o uso de nitrogênio líquido até um fino pó.
Para amostras congeladas: pese até 25mg da amostra do tecido e macere em nitrogênio líquido, transfira o pó para um microtubo.
- Se o tecido conter muitas células, não deve ser usado mais que 10mg.
2. Adicione 200μl do Tampão de Lise 1 e homogenize a amostra com o micropistilo
3. Adicione 20μl de Proteinase K (10mg/ml) e misture bem em vórtex.
4. Incube a 60°C até que o tecido se dissolva completamente (normalmente 1 hora, dependendo do tipo de tecido). Misture em vórtex
a cada 10-15 minutos durante a incubação.
5. Centrifugue brevemente o tubo para remover as gotas formadas na tampa.
6. (Opcional) Se for necessário amostra livre de RNA, adicione 4μl de Rnase A (100mg/ml) e incube 2 minutos em temperatura
ambiente.
7. Adicione 200μl de Tampão de Lise 2 e misture bem em vórtex. Incube a 70°C por 10 minutos.
8. Centrifugue brevemente o tubo para remover as gotas formadas na tampa.
- Se houver presença de material insolúvel, centrifugue a velocidade máxima por 2 minutos e transfira o sobrenadante para um novo
tubo (não fornecido).
9. Adicione 200μl de etanol (96~100%) e misture bem em vórtex.
10. Centrifugue brevemente o tubo para remover as gotas formadas na tampa.
11. Coloque uma coluna em um tubo de coleta e transfira a mistura (incluindo o precipitado) cuidadosamente para a coluna.
Centrifugue por 1 minuto e descarte o filtrado. Coloque a coluna em um novo tubo de coleta.
12. Adicione 500μl do Tampão de Lavagem 1 (com etanol adicionado) na coluna e centrifugue por 1 minuto e em seguida, descarte o
filtrado.
- Certifique-se que etanol foi adicionado ao Tampão de Lavagem 1.
13. Adicione 750μl do Tampão de Lavagem 2 (com etanol adicionado) na coluna e centrifugue por 1 minuto e em seguida, descarte o
filtrado.
- Certifique-se que etanol foi adicionado ao Tampão de Lavagem 2 .
14. Centrifugue por mais 3 minutos para secar a coluna.
Etapa Importante! Esta etapa irá evitar que o líquido residual iniba as reações enzimáticas subsequentes.
15. Transfira a coluna seca para um tubo de eluição. Adicione 50-200μl de Tampão de Eluição ou ddH2O (pH 7.5 – 8.5) no centro da
membrana e incube a membrana na vertical por 3 minutos a temperatura ambiente.
Etapa importante! Para um eluição eficaz, certifique-se que o Tampão de Eluição foi colocado no centro da membrana e absorvido
completamente.
- O volume padrão para eluição é 200μl . Se o tecido conter número baixo de células, reduza o volume de eluição (50-150μl) para
aumentar a concentração de DNA.
16. Centrifugue por 2 minutos para eluir o DNA.
17. Armazene a 4°C ou -20°.
Protocolos Especiais
Para Bactéria
1. Cultura de bactérias
- Transfira 1ml da cultura para um microtubo (não fornecido).
- Centrifugue à velocidade máxima por 2 minutos e descarte completamente o sobrenadante.
- Siga o protocolo geral a partir da etapa 2.
2. Bactérias em fluidos biológicos
- Recupere as bactérias centrifugando à 7.500 rpm (5.000 x g) por 10 minutos.
- Siga o protocolo geral a partir da etapa 2.
3. Bactérias em swabs de secreção nasal, de faringe, olhos, etc
- Mergulhe o swab em 2ml de PBS a temperatura ambiente por 2-3 horas.
- Recupere as bactérias centrifugando à 7.500 rpm (5.000 x g) por 10 minutos.
- Siga o protocolo geral a partir da etapa 2.
4. Bactérias gram positivas
Dica: pré-aqueça dois banhos-maria ou banhos secos um à 60°C e outro à 95ºC antes de iniciar o processo;
- Transfira 1ml da cultura para um microtubo (não fornecido).
- Recupere as bactérias centrifugando a máxima velocidade por 2 minutos e descarte completamente o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet em 200μl de solução de lisozima (lisozima 20mg/ml, Tris-HCl 20mM, pH 8.0, EDTA 2mM, Triton 1,2%).
- Incube a 37°C por 30 minutos.
- (Opcional) se for necessário amostra livre de RNA, adicione 4μl de Rnase A (100mg/ml) e incube 2 minutos a temperatura ambiente.
- Adicione 20μl de Proteinase K e 200μl de Tampão de Lise 2. Misture bem em vórtex.
- Incube por 30 minutos a 60°C e depois 15 minutos a 95°.
- Siga o protocolo geral a partir da etapa 8.
Para Tecidos Fixados
1. Tecidos embebidos em parafina
- Corte até 25mg do tecido e coloque em um microtubo (não fornecido)
- Adicione 1ml de xilol, misture bem e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Centrifugue a velocidade máxima por 5
minutos. Remova o sobrenadante por pipetagem. Adicione 1ml de etanol (96~100%) ao tecido desparafinizado e misture em vórtex.
- Centrifugue por 5 minutos a velocidade máxima e remova o sobrenadante pro pipetagem,
- Adicione 1 ml de etanol (96~100%) ao tecido desparafinizado e misture gentilmente em vórtex.
- Centrifugue por 5 minutos a velocidade máxima e remova o sobrenadante por pipetagem.
- Incube a 37°C por 10 minutos para evaporar o etanol residual.
- Macere o tecido com a ajuda do micropistilo ou nitrogênio líquido e siga o protocolo geral a partir da etapa 2.
2. Tecidos fixados em formol
- Lave 25mg da amostra de tecido 2 vezes com 1ml de PBS para remover o formol.
- Macere a amostra com o micropistilo ou nitrogênio líquido e siga o protocolo geral a partir da etapa 2.
Para Levedura
- Transfira 3ml da fase logarítmica (OD600=10) da cultura de levedura para um microtubo (não fornecido).
- Recupere as células de levedura centrifugando a 7.500rpm (5.000 xg) por 10 minutos e descarte completamente o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet em 600μl de tampão sorbitol (sorbitol 1M, EDTA 100mM, β-mercaptoetanol 14mM). Adicione 200U de zimolase
ou liticase e incube 30 minutos a 30°C.
- Centrifugue a 7.500rpm (5.000 xg) por 5 minutos. Remova o sobrenandate por pipetagem.
- Siga o protocolo geral a partir da etapa 2.
Sangue Seco
Dica: pré-aqueça três banhos-maria ou banhos secos, um à 85°C, um à 60ºC e outro à 70ºC antes de iniciar o processo;
- Corte o cartão de coleta ou papel de filtro com a mancha de sangue e coloque em um microtubo (não fornecido).
- Adicione 200μl do tampão de lise 1 e incube 10 minutos a 85°C.
- Centrifugue brevemente para remover as gotas da tampa.
- Adicione 20μl de Proteinase K e misture bem em vórtex.
- Incube por 1 hora a 60°C e misture em vórtex a cada 10-15 minutos.
- Siga o protocolo geral a partir da etapa 5.
Dente e Polpa Dentária
- Pese até 25mg da amostra e macere até a formação de um pó fino.
- Transfira o pó para um microtubo (não fornecido).
- Siga o protocolo geral a partir da etapa 2.
Resolução de Problemas
Possíveis razões / solução
Problema: Baixo rendimento
1. Baixa concentração de células na amostra.
- Concentre o volume da amostra para uma nova extração.
2. Lise insuficiente devido ação reduzida da Proteinase K.
- Repita a extração com uma nova amostra. Utilize uma solução nova ou bem conservada de Proteinase K.
3. Lise insuficiente devido pouco tempo de ação do Tampão de Lise 2.
- Repita a extração com uma nova amostra. Adicione o Tampão de Lise 2 e imediatamente misture bem em vórtex.
4. Lise insuficiente devido tempo de incubação
- Repita a extração com uma nova amostra . Aumente o tempo de incubação e certifique-se que não há nenhuma partícula residual.
5. Não foi adicionado etanol ao lisado antes de transferí-lo para a membrana.
- Repita a extração com uma nova amostra.
6. Etanol não foi adicionado ao tampão de lavagem assim que aberto; o volume ou porcentagem de etanol não estava correto antes
de adicioná-lo ao tampão de lavagem.
- Certifique-se que o etanol está na concentração correta e repita a extração com uma nova amostra.
7. Eluição de DNA não eficiente.
- Certifique-se que o pH do tampão de eluição ou da ddH2O está entre 7.5 – 8.5.
- Após adicionar o Tampão de Eluição ou ddH2O, deixar a coluna na vertical por 5 minutos antes da centrifugação.
Problema: Resíduos escuros na membrana mesmo após lavagem
1. Lise insuficiente devido ação reduzida da proteinase K.
- Repita a extração com uma nova amostra. Utilize uma solução nova ou bem conservada de Proteinase K.
- Não adicione Proteinase K diretamente ao Tampão de Lise 2.
2. Lise insuficiente devido pouco tempo de ação do Tampão de Lise 2.
- Repita a extração com uma nova amostra. Adicione o Tampão de Lise 2 e imediatamente misture bem em vórtex.
3. Lise insuficiente devido tempo de incubação
- Repita a extração com uma nova amostra . Aumente o tempo de incubação e certifique-se que não há nenhuma partícula residual.
4. Não foi adicionado etanol ao lisado antes de transferí-lo para a membrana.
- Repita a extração com uma nova amostra.
5. Etanol não foi adicionado ao tampão de lavagem assim que aberto; o volume ou porcentagem de etanol não estava correto antes
de adicioná-lo ao tampão de lavagem.
- Certifique-se que o etanol está na concentração correta e repita a extração com uma nova amostra.
Problema: A coluna está obstruída
1. O lisado contém resíduos insolúveis como, papel, osso, cabelo.
- Remova os resíduos antes da centrifugação.
2. Amostra está muito viscosa.
- Reduza o volume da amostra.
3. Atividade insuficiente da Proteinase K.
- Repita a extração com uma nova amostra. Use uma solução nova ou bem conservada de proteinase K.
- Não adicione Proteinase K diretamente ao Tampão de Lise 2.
Problema: Baixa qualidade do DNA extraído (Razão A260/A280 baixa)
1. Lise insuficiente devido ação reduzida da Proteinase K.
- Repita a extração com uma nova amostra. Use uma solução nova ou bem conservada de Proteinase K.
- Não adicione Proteinase K diretamente no tampão de lise 2.
2. Lise insuficiente devido pouco tempo de ação do Tampão de Lise 2.
- Repita a extração com uma nova amostra. Adicione o Tampão de Lise 2 e imediatamente misture bem em vórtex.
3. Lise insuficiente devido tempo de incubação
- Repita a extração com uma nova amostra . Aumente o tempo de incubação e certifique-se que não há nenhuma partícula residual.
4. Não foi adicionado etanol ao lisado antes de transferí-lo para a membrana.
- Repita a extração com uma nova amostra.
5. Etanol não foi adicionado ao Tampão de Lavagem assim que aberto; o volume ou porcentagem de etanol não estava correto antes
de adicioná-lo ao Tampão de Lavagem.
- Certifique-se que o etanol está na concentração correta e repita a extração com uma nova amostra.
6. DNA contaminado.
-Não molhar a borda da coluna durante o procedimento.
Problema: Baixa qualidade do DNA extraído (Razão A260/A280 alta)
1. RNA residual no DNA eluído.
- Siga a etapa 6 do protocolo geral para remover o RNA.
2. Tampão de Lise 2 adicionado a amostra antes da adição de RNase A
- Certifique-se que a RNase A foi adicionada a amostra antes da adição do Tampão de Lise 2 quando estiver usando a etapa opcional.
Problema: DNA degradado
1. Amostra muito antiga.
- Sempre utilize amostra fresca ou bem estocada.
2. Tampão para eletroforese contaminado com DNase
- Use tampão novo para eletroforese.
3. Tecido embebido em parafina
- Normalmente o DNA extraído de tecido embebido em parafina está degradado. Pode ser utilizado em reações de PCR mas não é
recomendado para Southern blotting e análise de restrição.
Armazenamento
A temperatura ideal de armazenamento da Proteinase K é de 2-8°C. A solução estoque de proteinase K é estável por 2 meses quando
armazenada à 2-8°C. O armazenamento à -20°C prolonga a validade, porém deve-se evitar congelamentos e descongelamentos
repetidos.
Os demais componentes podem ser armazenados à temperatura ambiente (20 – 25ºC) em local seco, protegidos da luz solar e
umidade.
Lote e validade
O lote e validade encontram-se impressos no rótulo do produto
Fabricado por:
Favorgen Biotech Corp.
Favorgen Biotech - Áustria
Reg. MS: 10039370001 – Responsável Técnica: Talita Iacovella
Rev. 07/2013