VALIDAÇÃO DE MÉTODO ALTERNATIVO PARA PESQUISA
DE COLIFORMES TOTAIS E Escherichia coli NA ÁGUA
Karina TEIXEIRA PONTELO
Marta M Gontijo de AGUIAR
RESUMO: :A utilização de “kits” no controle microbiológico da água é uma alternativa prática, pois elimina etapas de preparação e esterilização de meios de
cultura no laboratório de microbiologia. Entretanto, antes de sua implantação na rotina, deve-se analisar a adequabilidade dos testes presentes no mercado.
Assim, o objetivo deste trabalho foi validar o kit COLItest® para detecção de coliformes totais e E.coli na água. Para tanto foram avaliados os parâmetros de
validação de métodos qualitativos: repetibilidade, precisão intermediária, robustez, limite de detecção e especificidade. O Kit COLItest® atendeu a todos os
requisitos avaliados. Portanto, o método pode ser considerado validado.
PALAVRAS-CHAVE: Análise microbiológica da água. Coliformes totais. Escherichia coli. Validação de métodos microbiológicos alternativos.
INTRODUÇÃO
público em condições apropriadas para o consumo humano. No
A água é uma matéria-prima amplamente utilizada na fabri-
Brasil, a qualidade da água potável é regulamentada pela Portaria
cação de produtos farmacêuticos, de biotecnologia, correlatos e
nº 2914 de 2011, que estabelece os procedimentos e responsa-
cosméticos, sendo de grande relevância para indústria farmacêu-
bilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água
tica. A qualidade da água necessária para as diferentes etapas de
para consumo humano, seu padrão de potabilidade, e dá outras
produção vai depender do uso pretendido, levando-se em consi-
providências (ALVES, 2002; BRASIL, 2011).
deração a natureza, a utilização do produto final e a etapa em que
ela será utilizada (PINTO et al., 2010).
As fontes e os reservatórios de água potável estão sujeitos
a contaminações físicas, químicas e microbiológicas. Assim,
Assim, a água pode ser classificada em diferentes tipos que
para assegurar a baixa contaminação microbiana, uma das
devem atender a padrões e limites de qualidade. A água potável
medidas tomadas é a adição de um agente antimicrobiano à
é utilizada para o abastecimento dos sistemas de tratamento de
água potável, sendo o mais utilizado o cloro. Entretanto, falhas
água, a partir dela são obtidos os outros diferentes tipos de água
nas tubulações ou falta de limpeza nos reservatórios podem
como: a água purificada e a água para injetáveis (Figura 1). Quadro
fazer com que a concentração do cloro adicionada não seja
1 lista os principais tipos de água utilizados na indústria farmacêuti-
efetiva. Portanto, a indústria farmacêutica deve realizar testes
ca, suas características, parâmetros e exemplos de utilização (PIN-
periódicos para confirmar se a água potável atende aos parâ-
TO et al., 2010; SEBRAI, 2010; FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010).
metros exigidos (BRASIL, 2010; PINTO et al., 2010; THE UNI-
A água potável geralmente é fornecida por abastecimento
246 | PÓS EM REVISTA
TED STATES PHARMACOPEIA, 2011).
Deve-se reconhecer que não há um método único que seja
que indiquem a contaminação da água. Esses indicadores estão
capaz de detectar todos os contaminantes microbianos poten-
presentes em quantidade superior à dos microrganismos pato-
ciais de um sistema de água, sendo praticamente impossível
gênicos e indicam o grau de contaminação da água (AGUIAR,
investigar a presença de cada microrganismo patogênico que
2006; CARMO et al., 2008; THE UNITED STATES PHARMACO-
possa ser transmitido pela água. Adicionalmente, muitos micror-
PEIA, 2011). Neste contexto, a Portaria 2914 de 2011 determina
ganismos estão presentes em pequena quantidade e de forma
a pesquisa dos seguintes microrganismos indicadores: colifor-
descontínua. Desta forma, o usual é escolher microrganismos
mes totais, Escherichia coli (Quadro 2).
Os coliformes totais englobam um grupo de microrganismos
sais biliares ou tensoativos, além de fermentarem a lactose, com
bacilos Gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos,
produção de ácido. Esse grupo é constituído, principalmente,
oxidase negativos, capazes de desenvolverem em presença de
pelos gêneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e EnterobacPÓS EM REVISTA l 247
ter. A presença destes microrganismos é utilizada para avaliar a
partir dos tubos positivos de EC. A Escherichia coli produz a
eficiência do tratamento e a integridade do sistema de distribui-
enzima β-glucoronidase, capaz de hidrolisar o substrato MUG
ção de água (BRASIL, 2004; WORLD HEALTH ORGANIZATION,
(4-methylumbelipheril-b-D-glucuronide) presente no EC-MUG,
2005; PINTO et al., 2010).
liberando 4-metilubeliferona. Esta substância, quando exposta
Os coliformes termotolerantes são um subgrupo das bacté-
a radiação ultravioleta (365 nm), exibe fluorescência azulada
rias do grupo coliforme totais que fermentam a lactose também
(BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL, 2002; STANDARD
a 44,5 ± 0,2 C em 24 horas. A principal representante desse
METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WAS-
subgrupo é a Escherichia coli, uma bactéria de origem exclu-
TEWATER, 2005).
○
sivamente fecal. Também pertencem a esta classe de bactérias
A maior desvantagem das técnicas convencionais é o tem-
algumas espécies de Klebsiella, Enterobacter, e Citrobacter
po exigido, sendo desejável reduzir o tempo da análise da água
(BRASIL, 2004; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2005).
potável. Portanto, durante os últimos anos diferentes técnicas
A pesquisa de coliformes pode ser realizada por diferen-
têm sido desenvolvidas (PINTO et al.; 2010).
tes técnicas convencionais, sendo o Standard Methods for the
Dentre os métodos alternativos desenvolvidos para pesqui-
Examination of Water and Wasterwater a literatura oficial para
sa de coliformes na água tem-se o COLItest®, que é composto
análise microbiológica da água potável no Brasil (PINTO et al.,
por um substrato cromogênico e fluorogênico para detecção
2010; BRASIL, 2011). Dentre as técnicas convencionais pode-se
simultânea de coliformes totais e Escherichia coli, possuindo
citar: filtração por membrana e fermentação em tubos múltiplos,
em sua formulação substâncias, nutrientes e MUG que, devida-
sendo esta última a mais utilizada. A técnica de tubos múltiplos,
mente balanceados, inibem o crescimento de bactérias Gram-
para esta análise, é realizada em três fases: fase presuntiva, fase
-positivas, favorecendo o crescimento de bactérias do grupo co-
de confirmação e fase completa (STANDARD METHODS FOR
liforme e facilitando a identificação de Escherichia coli através
THE EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER, 2005).
da fluorescência e do teste de indol após incubação a 37ºC por
A primeira fase (presuntiva) utiliza como meio de cultura o
18-48 horas (, 2011).
caldo lauriltriptose e, baseia-se nas características deste grupo
A utilização de métodos alternativos pela indústria farmacêu-
de bactérias em produzir ácido e gás a partir da fermentação da
tica é permitida, desde que, estes tenham sua eficiência com-
lactose. Nesta fase, presumi-se que os micro-organismos que
provada. Adicionalmente, vários critérios devem ser avaliados na
cresceram em presença do tensoativo e que produzem gás a
escolha de um método, para monitoramento de microrganismos
partir da lactose sejam coliformes. Entretanto, como não há ou-
em um sistema de água farmacêutica, incluindo a sensibilidade
tras informações, é necessária a fase de confirmação termotole-
do método, período de incubação, custo e complexidade meto-
rantes (KONEMAN et al. 2001; STANDARD METHODS FOR THE
dológica. Após ter sido adequadamente selecionado, deve-se
EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER, 2005).
validar o novo método alternativo de modo a garantir que tenha
A fase de confirmação, para coliformes totais, é realizada inoculando uma alíquota de cada tubo positivo da fase presuntiva
sensibilidade e correlação com o teste oficial (BRASIL, 2003;
THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2011).
em caldo bile verde brilhante. Neste meio, os sais biliares têm a
Para a validação de um método é inicialmente necessária a
função de inibir o crescimento de bactérias não entéricas e o ver-
identificação do tipo de análise a ser realizada: quantitativa ou
de brilhante de inibir o crescimento de bactérias Gram-positivas,
qualitativa. No caso da análise de pesquisa de coliformes totais
sendo novamente observada a fermentação da lactose com pro-
e termotolerantes na água, esta é classificada como uma aná-
dução de gás (KONEMAN et al. 2001; STANDARD METHODS
lise qualitativa, visto que o resultado deverá ser expresso como
FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER, 2005).
presença ou ausência.
Para confirmação da presença de coliformes termotoleran-
Para que um método analítico qualitativo, não descrito em
tes é utilizado o caldo EC, que também contém como agente
farmacopéias ou formulários oficiais, seja considerado validado
restritivo os sais biliares, sendo esta fase realizada pela inocu-
é necessário que sejam avaliados os parâmetros relacionados
lação de cada tubo positivo da fase presuntiva, os tubos são
no Quadro 3. Em caso de grande mudança, como variação
incubados a 44,5º C por 24 h (KONEMAN et al. 2001; STAN-
de fornecedores e alterações na composição das amostras ou
DARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND
meios de cultura, a revalidação pode ser necessária para ade-
WASTEWATER, 2005).
quação do método (BRASIL, 2010).
Na fase completa, a presença de Escherichia coli na água
pode ser investigada utilizando o meio de cultura EC-MUG, a
248 | PÓS EM REVISTA
QUADRO 3: Parâmetros para validação de métodos microbiológicos a serem avaliados em ensaios qualitativos.
A especificidade de um ensaio microbiológico avalia a sua
sença de coliformes totais e E. coli na água.
capacidade em detectar a espécie microbiana de referência.
Esse estudo se baseia na promoção de crescimento, para de-
MATERIAIS E MÉTODOS
monstrar a presença ou ausência de microrganismos e deve
assegurar que a presença de corpos estranhos no sistema de
ensaio, não interfira no resultado final do teste (THE UNITED
STATES PHARMACOPEIA, 2011).
2.1 MATERIAIS
Microrganismos: Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027).
A precisão representa o grau de repetibilidade entre os resultados de análises individuais, quando o procedimento é aplicado
múltiplas vezes numa mesma amostra homogênea, em condições idênticas de ensaio. Engloba também a precisão intermediá-
Meios de cultura: Caldo EC (Difco); Caldo Lauril Sulfato de
Sódio (Oxoid)
Reagentes: COLItest® (LKP diagnósticos); reagente de kovac (Merck); água purificada estéril; solução salina pura estéril.
ria, definida como a resistência intrínseca às influências exercidas
Equipamentos: Espectrofotômetro UV-visível (Shimadzu),
pelas variáveis operacionais e ambientais sobre os resultados do
estufa de cultura (Jouan), agitador de tubos (Fanem), autoclave
ensaio (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2011).
(Phonix), lâmpada ultra-violeta 365 nm (Handheld Blacklight Re-
O limite de detecção é o menor número de micro-organis-
quires 4X AA Batteries).
mos que se pode detectar a partir do método, dentro de uma
determinada condição experimental, mas não necessariamente
2.2MÉTODOS:
quantificado (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2011).
Já a robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Os critérios de aceitação devem ser adaptados
2.2.1 AMOSTRA UTILIZADA PARA VALIDAÇÃO DO MÉTODO:
Para validação do método foram utilizadas amostras de
água purificada estéril.
ao tipo de técnica (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2011).
Assim, este trabalho teve como objetivo a validação do método analítico alternativo COLItest para determinação da pre®
2.2.2 PREPARAÇÃO DOS INÓCULOS
A preparação do inóculo foi realizada partir da cultura de
PÓS EM REVISTA l 249
trabalho, recém-preparada de cada micro-organismo a ser ava-
tecção e especificidade, conforme diretrizes da The United Sta-
liado. Através de uma alça de repique os micro-organimos foram
tes Pharmacopeia (2011).
transferidos para solução salina estéril para obtenção de uma
A repetibilidade do teste foi avaliada através da análise de
suspensão de micro-organismos na concentração de 1 x 108
três amostras de água purificada estéril, contaminadas com E.
UFC/mL. Após a padronização do inóculo foram realizadas dilui-
coli, em concentrações baixa, média e alta (5, 50 e 500) UFC
ções seriadas, cujo fator de diluição foi 10 e realizada a conta-
por 100mL de amostra. O teste foi realizado em triplicata. A pre-
gem em placas, para determinar a densidade microbiana obtida
cisão intermediária foi analisada através da repetição dos proce-
em cada diluição. Obteve-se um padrão da concentração utili-
dimentos descritos para repetibilidade em dias diferentes com
zada para contaminar as amostras de água a serem analisadas.
analistas diferentes.
A robustez do método foi avaliada através da variação de
2.2.3 ANÁLISE DE PRESENÇA DE COLIFORMES TOTAIS E
três parâmetros, para isso foram realizados três ensaios: no pri-
TERMOTOLERANTES DE ACORDO COM O MÉTODO OFICIAL
meiro houve a variação do volume da amostra (± 5 mL), no se-
Foram transferidos 10 mL de água para 10 tubos contendo
gundo houve a variação da temperatura de incubação (± 2 ○C)
10 mL de caldo lauril sulfato de sódio. Bactérias do grupo dos
e no terceiro houve a variação do tempo de incubação (± 2 h).
coliformes causam turvação no meio e ou formação de gás,
Estes ensaios foram utilizados para avaliar a resistência do teste
detectado em tubos de Duhran, após 24-48 horas de incubação
as pequenas e deliberadas variações na rotina laboratorial.
a 35º C. Após o período de incubação foram transferidos dos
O limite de detecção do método foi avaliado através da con-
tubos positivos amostras, através da alça de repique, para tubos
taminação de amostras de água purificada estéril com concen-
contendo 10 mL de caldo EC. Estes foram incubados a 44,5ºC,
trações baixas de E. coli (0,05; 0,5 e 5 UFC/100 mL), em triplica-
durante 24 horas, a presença de coliformes termotolerantes leva
ta. Para avaliação do limite de detecção do método alternativo
a turvação do caldo EC com formação de gás, detectado em
foi realizado em paralelo o mesmo ensaio com o método oficial,
tubos de Duhran (STANDARD METHODS FOR THE EXAMINA-
afim de comparar os resultados obtidos. Para que o método al-
TION OF WATER AND WASTEWATER, 2005).
ternativo seja considerado adequado este deve ser equivalente
ao oficial, dentro do limite de confiança de 95%, utilizando para
2.2.4 PRESENÇA DE COLIFORMES TOTAIS E E. COLI DE ACORDO
esta análise a Tabela de Número mais Provável (NMP).
A especificidade do método alternativo foi avaliada através
COM O MÉTODO ALTERNATIVO
Transferir para o frasco do COLItest 100 mL da amostra de
da capacidade do mesmo para diferenciar um micro-organismo
água. Adicionar o meio de cultura COLItest e homogeneizar até
que pertence ao grupo dos coliformes e um que não pertence
sua dissolução completa. Incubar o frasco em estufa bacterioló-
a este grupo. Duas amostras de água purificada estéril foram
gica por 18-48 horas a 37 C. A partir de 18 horas pode-se inter-
contaminadas uma com E. coli e a outra com P.aeruginosa, res-
pretar os resultados dos frascos positivos, devendo-se aguardar
pectivamente, na concentração de 100UFC/100mL. Como con-
até 48h de incubação para os frascos negativos. O teste será ne-
trole negativo para este teste foi utilizada uma amostra de água
gativo (ausência de coliformes) quando não houver alteração na
purificada estéril, sem contaminação.
®
®
○
coloração (mantêm-se púrpura) após o período de incubação e
positivo se houver a mudança da coloração púrpura para a ama-
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
rela. No caso de resultado positivo deve-se verificar a presença
Os métodos alternativos qualitativos são uma importante
de E. coli através da transferência de 5 mL, do frasco positivo,
ferramenta para detecção de microrganismos patogênicos e po-
para um tubo de ensaio. O tubo de ensaio deve ser exposto a luz
dem facilitar a prática na rotina laboratorial, entretanto os mes-
ultra-violeta (365 nm), o ensaio será considerado positivo para E.
mos devem ser validados. Para validação do método alternativo
coli se houver formação de fluorescência azul. Após a leitura da
COLItest® para análise de coliformes totais e termotolerantes na
fluorescência, adicionar no mesmo tubo 0,2 mL do revelador de
água foi utilizado como referência os parâmetros estabelecidos
Indol. O teste será considerado positivo (presença de E.coli) se
pela Farmacopéia Americana em seu método geral <1223>
houver formação de anel vermelho.
(THE UNITED SATATES PHARMACOPEIA, 2011), já que a Brasil
(2003) e a Farmacopéia Brasileira (2010) não contemplam a va-
2.2.5 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ALTERNATIVO
lidação de métodos alternativos microbiológicos.
Para validação do método foram avaliados os parâmetros
Para avaliação da precisão do método foram avaliados os
de repetibilidade, precisão intermediária, robustez, limite de de-
parâmetros de repetibilidade e precisão intermediária, o método
250 | PÓS EM REVISTA
alternativo mostrou-se capaz de detectar tanto a presença de
ções de E coli (0,05; 0,5 e 5 UFC/100 mL). Os resultados mos-
coliformes totais quanto E. coli nas três concentrações avaliadas
traram que o COLItest® apresentou alteração da cor púrpura
(baixa, média e alta). Nos dois dias diferentes nos quais o ensaio
para amarelo, em três tubos na concentração de 5UFC/100mL,
foi realizado, todos os tubos avaliados apresentaram mudança
dois tubos da concentração 0,5UFC/100mL e não apresentou
de coloração (lilás para o amarelo), confirmando a presença de
alteração na concentração de 0,05UFC/100mL. Este ensaio foi
coliformes totais. Os tubos apresentaram também a presença de
realizado em paralelo com o método oficial, para comparação
fluorescência, quando expostos à luz ultravioleta, assim como a
dos resultados. Para o método oficial, obteve-se turvação com
formação de anel vermelho para o teste de indol, confirmando a
formação de gás em apenas dois tubos da concentração de
presença de E. coli. Assim, o método apresentou repetibilidade
5UFC/100mL. Embora os número de tubos positivos sejam
e precisão intermediária nestas condições, indicando a precisão
diferentes nos os dois métodos, os resultados encontram-se
dos resultados em todo intervalo do ensaio avaliado.
dentro do limite máximo e mínino do número mais provável
Quando avaliada a robustez do método os resultados de-
(NMP) (Tabela 1 e Tabela 2), representando a equivalência do
monstram a resistência do teste em todas as variações testadas,
método oficial e do COLItest® para detecção de coliformes to-
assim o método mostrou-se capaz de detectar a presença de
tais e E. coli na água.
coliformes totais e E. coli, mesmo quando o volume ou a temperatura ou o tempo de incubação sofreram pequenas variações.
Para avaliação do limite de detecção as amostras de água
purificada estéril foram contaminadas com baixas concentra-
Tabela 1: Resultados das análises do limite de detecção
do método alternativo (COLItest®)
Tabela 2: Resultados das análises do limite de detecção
do método oficial
A especificidade do teste foi demonstrada através da ca-
purificada estéril sem contaminação). O grupo contaminado
pacidade do mesmo em diferenciar um microrganismo perten-
com E. coli apresentou coloração amarela e fluorescência, vis-
cente à classe dos coliformes (E. coli) na água de outro micro-
to que este microrganismo pertence ao grupo dos coliformes to-
-organismo, que possa estar presente e que não pertença a este
tais e é capaz de produzir β-glucoronidase, enzima que hidrolisa
grupo (P. aeruginosa). Os tubos contaminados com P. aerugi-
o MUG presente no COLItest®, resultando em 4-metilubeliferona,
nosa, permaneceram com a cor púrpura e não apresentaram
substância que, quando em exposta à luz ultravioleta, produz flu-
fluorescência, o que era desejado já que este microrganismo
orescência (BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL, 2002;
não pertence ao grupo dos coliformes totais. Este mesmo com-
STANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER
portamento foi observado também para o grupo controle (água
AND WASTEWATER, 2005).
PÓS EM REVISTA l 251
4 CONCLUSÃO
Os resultados do presente trabalho demonstraram que
o método alternativo COLItest® atende aos parâmetros de
validação para análises microbiológicas qualitativas especificados pela Farmacopéia Americana (THE UNITED STATES
Association (A.W.W.A.), Water Environment Federation (W.E.F.), 2005.
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