UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI
MESTRADO EM PRODUÇÃO VEGETAL
ADELMO MARTINS RODRIGUES
OCORRÊNCIA, DISTRIBUIÇÃO E DIAGNOSE DE VIROSES
ASSOCIADAS À CULTURA DA MELANCIA NO ESTADO DO
TOCANTINS.
GURUPI - TO
AGOSTO DE 2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI
MESTRADO EM PRODUÇÃO VEGETAL
ADELMO MARTINS RODRIGUES
Engenheiro Agrônomo
OCORRÊNCIA, DISTRIBUIÇÃO E DIAGNOSE DE VIROSES
ASSOCIADAS À CULTURA DA MELANCIA NO ESTADO DO
TOCANTINS.
Projeto de Dissertação apresentado ao Programa
de Pós-Graduação em Produção Vegetal da
Universidade Federal do Tocantins no Campus
Universitário de Gurupi, como parte das
exigências do Regimento do Programa.
Orientador: Dsc. Raimundo Wagner de Souza
Aguiar
GURUPI-TO
AGOSTO DE 2011
Dissertação de Mestrado realizada junto ao Programa de Pós-Graduação
em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins sob orientação do
professor e pesquisador Dr. Raimundo Wagner de Sousa Aguiar e co-orientação
do professor e pesquisador Dr. Tatsuya Nagata da Universidade de Brasília.
Apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq).
Banca examinadora:
_______________________________________________
Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar (Orientador)
Universidade Federal do Tocantins (UFT)
_______________________________________________
Dr. Tatsuya Nagata
Universidade de Brasília (UnB)
_______________________________________________
Dr. Ildon Rodrigues do Nascimento
Universidade Federal do Tocantins (UFT)
_______________________________________________
Dr. Rodrigo Robeiro Fidelis
Universidade Federal do Tocantins (UFT)
GURUPI-TO
AGOSTO DE 2011
“Nós existimos em primeiro lugar, para as pessoas queridas de cujo bem-estar e
sorrisos dependem a sua e a nossa felicidade, depois, para todos os seres, nossos
semelhantes, que não conhecemos pessoalmente, mas os quais estão ligados pelos
laços de simpatia e fraternidade humana”
Albert Einstein.
Ao meu pequenino João Pedrico.
DEDICO
i
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros Agradecimentos...
Aos meus pais, Ademar e Linda, que sempre uniram esforços em prol da minha
formação acadêmica e souberam dar força e incentivo nos momentos que mais precisei,
sempre compreendendo minhas ausências, e também pacientes em ouvir todas as
lamentações nos momentos de estresse e ansiedade, confortando-me sempre com
palavras de incentivo.
Aos meus irmãos Ademar Segundo e Alércia que sempre estiveram do meu
lado incentivando-me e apoiando-me.
A pessoinha de Sâmela Taisa, que me suporta por vários anos, sempre
compreendendo minhas ausências, e junto com minha família ouvindo minhas
lamentações, me agüentando nos momentos de estresse, me surpreendendo sempre com
palavras de incentivo. Ha..., não poderia deixar de comentar as inúmeras cobranças
pelos mais variados motivos.
A todos meus amigos, que foram capazes de compreender as minhas ausências e
compartilhar muitos momentos felizes.
Ao PhD. Tatsuya Nagata, Mirtes Freitas, Renato Rezende, pelos
ensinamentos e conselhos preciosos, incentivo, auxílio e presteza. A vocês toda minha
consideração e admiração.
Ao Laboratório de Virologia Vegetal da Universidade de Brasília e a
EMBRAPA-CNPH pelo espaço cedido para o desenvolvimento de alguns experimentos
A todos os funcionários do laboratório de Entomologia, em especial, Douglas,
Suetônio e Mariela.
A todos os colegas que me acompanharam durante o mestrado, em especial,
Márcio Akio e Marielle Peres, pela amizade e apoio durante todo o curso.
Aos professores do curo de Pós-Graduação em Produção Vegetal, pelos
ensinamentos, em especial ao. Dsc. Raimundo Wagner, que vem me acompanhando
desde a graduação, me orientando e abrindo minha mente para os mais diversos temas.
A todos que de alguma forma contribuíram para o êxito deste trabalho, minha
sincera gratidão.
ii
SUMÁRIO
Dedicatória..............................................................................................................................i
Agradecimento.......................................................................................................................ii
RESUMO..............................................................................................................................iii
ABSTRACT..........................................................................................................................iv
1. CAPITULO I: INTRODUÇÃO GERAL..........................................................................10
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................11
2.1 Cultura da Melancia.............................................................................................11
2.2 Características da planta......................................................................................11
2.3 Melancia no mundo...............................................................................................12
2.4 Melancia no Brasil.................................................................................................13
2.5 Problemas fitossanitários......................................................................................13
2.5.1 Aspectos gerais dos vírus.....................................................................13
2.5.2 Aspectos da família Potyviridae e Gênero Potyvírus........................14
2.5.3 Aspectos da família Bunyaviridae e Gênero Tospovírus..................21
2.6 Principais viroses Associadas a cultura da melancia.........................................24
2.6.1 PRSV-W................................................................................................24
2.6.2 ZYMV...................................................................................................25
2.6.3 WMV.....................................................................................................25
2.6.4 CMV......................................................................................................26
2.6.5 ZLCV....................................................................................................27
2.7 Identificação das viroses.......................................................................................27
2.7.1 Testes sorológicos.................................................................................27
2.7.1.1 Testes de ELISA.......................................................................27
2.7.1.1.1 DAS-ELISA............................................................28
2.7.1.1.2 ELISA-Indireto......................................................28
2.7.1.1.3 Dot-ELISA..............................................................29
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS…............…………………………………..……30
CAPITULO II: Distribuição e diagnose de vírus associados a cultura da melancia no
estado do Tocantins.
RESUMO.....................................................................................................................51
Distribution and diagnosis of viruses associated with watermelon crop in the state of
Tocantins.
ABSTRACT.................................................................................................................52
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................53
2. MATERIAL e MÉTODOS..............................................................................................54
2.1 Obtenção das Plantas e Inoculação............................................................................54
2.2 Identificação Sorológica dos Isolados........................................................................55
2.3 Análise Sintomatológica das Viroses.........................................................................57
2.4 Análise Estatística.......................................................................................................57
3. RESULTADOS..................................................................................................................57
4. DISCUSSÃO......................................................................................................................61
5. CONCLUSÃO...................................................................................................................63
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................64
CAPITULO III: Identificação de Viroses Associadas à Cultura da Melancia por meio de
RT-PCR do tipo multiplex.
RESUMO ....................................................................................................................68
Identification of Virus Associated with Culture of Watermelon in the State of Tocantins
through the techniques of multiplex RT-PCR.
ABSTRACT.................................................................................................................69
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................70
2. MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................................71
2.1. Vírus ...........................................................................................................................71
2.2. Extração de RNA Total.............................................................................................72
2.3. Confecção de cDNA...................................................................................................72
2.4. Reação de RT-PCR do tipo monoplex.....................................................................73
2.5. Otimização para Reação de RT-PCR do tipo Duplex e Triplex............................73
2.6. Análise do RT- PCR em gel de agarose...................................................................73
2.7. Análise das Seqüências e oligonucleotídeos.............................................................74
3. RESULTADOS..................................................................................................................74
4. DISCUSSÃO......................................................................................................................81
5. CONCLUSÃO ..................................................................................................................84
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................85
RESUMO
Perdas econômicas são relatadas em cucurbitáceas, estas, quase sempre estão
associadas à infecção por vírus. Além da redução direta na produtividade da planta, as viroses
podem reduzir o aspecto morfológico do fruto, depreciando seu valor comercial. Os vírus que
infectam a cultura da melancia no Brasil são de difícil diagnóstico visual, todos produzem
sintomas foliares semelhantes, podendo ocorrer em infecções simples ou mistas. O objetivo
deste trabalho foi identificar as viroses associadas a cultura de melancia nas regiões
produtoras do estado do Tocantins. A identificação dessas viroses foi realizada pelo método
sorológico Dot-Elisa com anticorpos específicos, seguida pelo método de RT-PCR do tipo
multiplex para os Potyvirus: Watermelon mosaic virus type- 2 (WMV-2); Papaya ringspot
virus tipo Watermelon (PRSV-W); Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) e Cucumber
mosaic virus (CMV); e o Tospovirus: Zucchini Lethal chlorosis virus (ZLCV). Foram
coletadas 752 amostras de plantas com sintomas de vírus em todas as regiões produtoras de
melancia. Entre a ocorrência das viroses por região observou-se que PRSV-W foi
predominante em 31% das amostras obtidas em Formoso do Araguaia e menos de 30% foram
positivas para WMV, ZLCV, CMV e ZYMV. Nas amostras obtidas no município da Lagoa
da Confusão houve predominância de WMV com 26,4%, seguido por PRSV-W e ZLCV com
22% e 8,1%, respectivamente. O vírus PRSV-W apresentou 12,5% de infecção nas amostras
na região de Gurupi, seguido de ZLCV (12%) e ZYMV (10,4%) e WMV com 12%, não
diferindo estatisticamente entre si, apenas CMV com 11,2% de amostras infectadas se
mostrou em outro grupo. No município de Porto Nacional foram identificados CMV (14,7%),
ZLCV (13,8%) e PRSV-W (10,3%), sendo ZYMV e WMV encontrados em um subgrupo
com 8,4% e 9,2% de infeção, respectivamente. As infecções mistas de maior ocorrência foram
entre PRSV-W+WMV, PRSV-W+ZLCV e ZLCV+WMV, num total de 142 amostras. Os
produtos amplificados foram de 644 pb (CMV), 535 pb (WMV-2), 398 pb (PRSV-W), 244 pb
(ZLCV) e 214pb (ZYMV). As detecções múltiplas de vírus desenvolvidas neste trabalho
podem reduzir o custo e trabalho na detecção e diferenciação dos vírus. Os oligonucleotídeos
desenvolvidos permitem a rápida detecção e diferenciação isolada de PRSV-W, WMV,
ZYMV, CMV e ZLCV presentes nos cultivos de melancia no estado do Tocantins. De modo
geral, estes resultados permitem subsídios para o programa de melhoramento de resistência a
viroses na cultura da melancia no estado do Tocantins, considerando os cinco tipos de vírus
identificados e sua distribuição espacial por região.
iii
ABSTRACT
Economic losses are reported in cucurbits, they almost always are associated with virus
infection. In addition to the direct reduction in plant productivity, the viruses can reduce the
morphological aspect of the fruit, and depreciate its commercial value. Viruses that infect the
watermelon crop in Brazil are difficult to diagnose visual, all produce similar symptoms in
leaves and may occur in single or mixed infections. The objective of this work was to identify
the viruses associated with the culture of watermelon production areas of the state of
Tocantins. The identification of these viruses was performed by serological Dot-ELISA with
specific antibodies, followed by multiplex RT-PCR for Potyvirus: Watermelon mosaic virus
(WMV); Papaya ringspot virus type-W (PRSV- W), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)
and Cucumber mosaic virus (CMV), and the Tospovirus: Zucchini Lethal chlorosis virus
(ZLCV). We collected 752 samples of plants with symptoms of virus in all producing regions
of watermelon. Between the occurrence of viruses by region showed that PRSV-W was
predominant in 31% of the samples obtained in Formoso do Araguaia and less than 30% were
positive for WMV, ZLCV, CMV and ZYMV. The samples obtained in the region of Lagoa da
Confusão WMV was predominated with 26.4% followed by PRSV-W and ZLCV with 22%
and 8.1% respectively. The virus PRSV-W showed 12.5% of the samples in the region of
Gurupi, followed by ZLCV (12%) and ZYMV (10.4%) and WMV with 12%, not statistically
different from each other, only CMV with 11,2% of infected samples was shown in another
group. In the region of Porto Nacional CMV were identified (14.7%), ZLCV (13.8%) and
PRSV-W (10.3%), ZYMV and WMV was found in a subgroup with 8.4% and 9.2 % of
infection, respectively. Mixed infections occurred more frequently between PRSV-W +
WMV, PRSV-W + ZLCV and ZLCV + WMV, a total of 142 samples. The amplified products
were 644 bp (CMV), 535 bp (WMV-2), 398 bp (PRSV-W), 244 bp (ZLCV) and 214pb
(ZYMV). The multiple detections of viruses developed in this work can reduce the cost and
work in the detection and differentiation of the virus. The oligonucleotides designed to allow
rapid detection and differentiation isolated from PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV and ZLCV
present in watermelon crops in the state of Tocantins. Overall, these results allow subsidies
for the breeding program for resistance to viruses in watermelon crop in the state of
Tocantins, considering the five virus types identified and their spatial distribution by region.
iv
CAPITULO I: 1. INTRODUÇÃO GERAL
A melancia [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai], pertence à família das
cucurbitáceas, é constituída de aproximadamente 118 gêneros e 825 espécies. Tem como
centro de origem o continente africano, onde sua forma selvagem é encontrada em muitos
locais de clima tropical e subtropical. É uma planta anual, de crescimento rasteiro, com
ramificações que podem chegar a 5 m de comprimento, sendo cultivada em vários países
(DOORENBOS & KASSAM, 1994).
Segundo a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO) a
produção mundial de frutas em 2008 foi de cerca 705,9 milhões de toneladas. Deste total o
Brasil produziu cerca de 41 milhões de toneladas, apresentanto 5,8% da produção mundial.
Em 2010 a produção de melancia foi estimada em 98,4 milhões de toneladas, que corresponde
a 13,9% do total de frutos produzidos, ficando atrás apenas da cultura da banana (FAO, 2008).
No Brasil, a melancia é considerada a quarta olerícola em volume produzido, sendo
superada em produção apenas pelo tomate, batata e cebola (FAO, 2008). É uma cultura
cultivada em quase todos os estados brasileiros, com destaque para os estados do Rio Grande
do Sul (28,5%), Bahia (12%), Goiás (9,8%), São Paulo (7,6%); Tocantins (6,9%), Rio Grande
do Norte (4,8%) e Pernambuco (4,5%) (IBGE, 2008). Em 2010 a área cultivada com melancia
no Tocantins foi de 6,8 mil hectares, com produção de 174 mil toneladas, gerando uma receita
de R$ 42 milhões, gerando cerca 1.853 empregos diretos (SEAGRO, 2011). Sua produção é
quase que totalmente destinada ao consumo interno, além de ser uma atividade agrícola
rentável, o cultivo da melancia tem grande importância social, tendo muita necessidade de
mão-de-obra na realização das diversas práticas culturais (LOPES, 1991; SANTOS et al.,
2005).
A cultura da melancia, assim como a maioria das culturas, pode ser acometida por
dezenas de patógenos, que causam os mais diversos sintomas. Além das doenças bióticas,
existem as abióticas, que também podem causar destruição total da cultura, caso não sejam
adotadas medidas preventivas (YUKI et al., 2000; SANTOS et al., 2005). Os genótipos de
melancia utilizados nos cultivos, com algumas exceções, foram desenvolvidos para condições
diferentes daquelas existentes no Brasil e enfrentam sérios problemas com a ocorrência de
pragas e doenças, em particular as viroses ocasionadas por vírus do gênero Potyvirus
(SILVEIRA et al., 2005). A ocorrência de viroses em curcubitáceas cultivadas é dinâmica,
10
podendo variar em função da espécie de vírus e suas estirpes, da população e migração dos
vetores, das espécies e cultivares vegetais cultivadas e das condições climáticas (LIMA &
VIEIRA, 1992; MOURA et al., 2001).
A ocorrência de viroses é o principal problema no cultivo da melancia em condições
tropicais, assim como na maioria das curcubitáceas. As viroses de importância econômica
para a cultura da melancia são os potyvirus: Papaya ringspot virus – Strain w (PRSV-W)
(ALBUQUERQUE et al., 1972), Zucchini yellow mosaic vírus (ZYMV) (CANER et al.,
1992; VEGA et al., 1992; VEJA, REZENDE & YUKI, 1995), Watermelon mosaic virus – 2
(WMV-2) (SÁ & KITAJIMA, 1991) e o tospovirus Zucchini lethal chlorotics virus (ZLCV).
As plantas acometidas com viroses apresentam baixa qualidade de frutos (LIMA;
FERNANDES & MENDES, 1980; PAVAN; CARVALHO & FERNANDES, 1989; YUKI,
1990; LIMA & VIEIRA, 1992). A ocorrência de PRSV-W e ZYMV têm predominado na
cultura da melancia nos principais Estados produtores (YUKI et al., 2000).
O objetivo geral deste trabalho foi identificar a distribuição, ocorrência e confeccionar
um kit de identificação rápida através de RT-PCR para os vírus presentes na cultura da
melancia no Estado do Tocantins.
2.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Cultura da Melancia
2.2 Características da planta
A melancia é classificada taxonomicamente como pertencente ao Reino Vegetal,
Divisão Magnoliophyta (Spermatophyta), Subdivisão Angiospermae, Classe Magnoliopsida
(ou Campanulales), Subclasse Dilleniidae (ou Dicotiledonae), Superordem Violanae, Ordem
Violales
(Cucurbitales),
Família
Cucurbitaceae,
Subfamília
Cucurbitoideae,
Tribo
Benincaseae, Subtribo Benincasinae, Gênero Citrullus (ALMEIDA, 2003; SILVA, 2005).
A planta é herbácea de ciclo anual, com crescimento rasteiro, com ramas alcançcando
5 a 6 m. O caule é fino, angular, provido de pêlos e gavinhas ramificadas. O sistema radicular
é extenso e mais profundo do que o das demais curcubitáceas, com a maioria das raízes entre
50 a 60 cm de profundidade. O florescimento é monóico, todavia menos de 5% são
andromonóicas (FONTES, 2005). O fruto é globular ou alongado (FILGUEIRA, 2003), as
sementes são de cor cinza a preto imersas no tecido placental, principal parte comestível do
11
fruto, de coloração vermelha devido à presença de licopeno ou amarelada devido à presença
de carotenos e xantofilas (FONTES, 2005).
Embora todas as espécies de Citrullus Schrad Ex Eckl & Zeyh sejam consideradas
originárias da África, a origem exata da melancia cultivada não é bem definida. Uma hipótese
é que seja derivada de C. colocynthis (L.) Schrad, espécie perene e endêmica do referido
continente. Outra hipótese é de que tenha sido originada a partir da domesticação dentro de
populações silvestres de C. lanatus var. citroides (Bailey) Mansf., comum na África Central,
onde é cultivada a mais de 5000 anos e sua forma selvagem é encontrada em muitos locais de
clima tropical e subtropical (TESSARIOLI NETO & GROPPO, 1992). Uma terceira hipótese
ainda é que a introdução da cultura no país ocorreu no século XVII por escravos africanos,
principalmente das tribos Sudanesa e Banto. Vale salientar que as amostras africanas
encontraram excelentes condições climáticas para o seu desenvolvimento e que as mesmas
entraram no Brasil desde o Rio de Janeiro até o Maranhão e, em seguida, avançou para o
interior do nordeste brasileiro à medida que o mesmo ia sendo ocupado (SALDANHA, 1989;
CASTELLANNE & CORTEZ, 1995).
Cultivada pelos egípcios há cerca de 2.000 anos a.c., dada à diversidade de formas
silvestres, é mais aceito, atualmente, que o gênero Citrullus seja de origem africana. A cultura
foi introduzida na China no século X. Por volta do século X o seu cultivo era documentado na
Córdoba árabe e no século XIII já era cultivada em diversas regiões da Europa. A cultura foi
introduzida na América no século XVI, cujo período coincide com a escravatura (FONTES,
2005).
2.3 Melancia no mundo
A família Cucurbitaceae possui aproximadamente 118 gêneros e 825 espécies, a
maioria possui alto valor econômico e nutricional, além da importância social devido à
geração de empregos que proporciona (BEZERRA JÚNIOR, 2007). A melancia é uma das
olerícolas mais apreciadas em todo o mundo, suas propriedades refrescantes e diuréticas,
associadas ao sabor agradável e ao baixo teor calórico, fazem da fruta uma excelente
alternativa para o consumo diário (TRENTIN et al., 2008). É a principal cucurbitácea
cultivada no mundo (GUNER & WEHNER, 2008). Com produção mundial estimada em 98,4
milhões de toneladas, sendo os principais produtores a China, Turquia, Irã, Brasil, Estados
Unidos, Egito e Rússia (FAO, 2010).
12
Atualmente, a melancia é uma das principais frutas em volume de produção mundial e
também está entre as dez principais hortífrutícolas mais exportadas, com 1,7 milhões de
toneladas por ano. Entre os maiores importadores de melancia está os Estados Unidos,
Canadá, Alemanha, Polônia e França, que importam mais de 49% das importações mundial.
Entre os países exportadores, o México é o principal exportador, seguido pela Espanha e
Hungria (ARAÚJO, 2009).
2.4 Melancia no Brasil
A melancia ocupa o terceiro lugar em produção e em área plantada no Brasil, com
1.719.392 toneladas e uma área cultivada de 81.281 hectares, sendo superada em volume de
produção pela laranja e banana com 18.313.717 e 6.583.564 toneladas, respectivamente. As
principais regiões produtoras em 2006 foram: Sul (34,77%), Nordeste (28,80%) e Norte
(13,65%). Nesse mesmo ano, os estados de maior produção na região Nordeste foram: Bahia,
Rio Grande do Norte e Pernambuco (IBGE, 2008). O Tocantins alcançou o segundo lugar na
produção nacional, chegando a colher 174 mil toneladas, seno o maior produtor da região
norte (SEAGRO, 2011).
A melancia tem-se destacado como uma das principais espécies olerícolas cultivadas
no País, mas, apesar de sua importância, ainda são escassos os trabalhos com essa olerícola,
haja vista que poucos esforços têm sido dedicados ao estudo de fatores condicionantes de seu
rendimento e qualidade (FIGUEIREDO et al., 2009). O Tocantins está efetivando tentativas
de exportação, mas essas experiências estão esbarrando em um alto custo com transporte
(AGRIANUAL, 2007).
2.5 Problemas Fitossanitários
2.5.1 Aspectos Gerais dos Vírus
Os vírus são nucleoproteínas que têm capacidade de causar doenças. Replicam-se em
células vivas, sendo parasitas celulares obrigatórios. Induzem as células do hospedeiro a
realizar sua replicação (AGRIOS, 1997). Causam danos pela interferência na maquinaria
celular durante seu processo de replicação, diminuindo a síntese protéica essenciais para o
desenvolvimento normal da planta. A replicação de uma partícula viral consiste basicamente
de quatro etapas distintas: a penetração na célula hospedeira, a liberação ou desnudamento do
13
ácido nucléico, a síntese de ácido nucléico e proteínas virais, e a maturação ou acoplamento
desses dois componentes, dando origem a uma nova partícula viral (BEDENDO, 1995).
Os genomas virais são compostos por RNA ou DNA, de fita dupla ou simples,
dependendo do vírus. Não possuem membrana plasmática, citoplasma com ribossomos e
enzimas necessárias para a síntese de proteína e produção de energia. Os genes virais
codificam a informação para a produção de enzimas envolvidas na replicação do ácido
nucléico e na síntese de proteínas.
A disseminação de virose em plantas está associada a fatores bióticos e abióticos, que
influenciam diretamente na população dos vetores (MOURA, 2003; SANTOS et al., 2005).
Desse modo, a incidência de viroses em curcubitáceas cultivadas é dinâmica, podendo variar
em função da espécie de vírus e suas estirpes, do reservatório do vírus, da população e
migração dos vetores, das espécies e cultivares vegetais cultivadas e das condições climáticas
(MOURA et al., 2001). Desse modo, alem da redução direta na produção da planta, o vírus
reduz o tamanho e aspecto morfológico do fruto, depreciando completamente seu valor
comercial.
2.5.2 Aspectos da família Potyviridae e Gênero Potyvírus
A família Potyviridae está organizada em seis gêneros (Bymovírus, Ipomovírus,
Macluravírus, Potyvírus, Rymovírus e Tritimovírus), que se diferem na organização, números
de componentes de seu genoma e na espécie de inseto vetor (BERGER et al., 2005).
Constituindo a maior e mais importante família de virus de plantas, com cerca de 20% dos
vírus descritos (FAUQUET et al., 2005). O gênero potyvírus, com 111 espécies descritas, é o
que forma o grupo mais numeroso de fitovírus. Coletivamente, em razão de seu grande
número, os potyvírus formam o gênero mais importante do ponto de vista econômico. Alguns
Potyvirus são igualmente importantes, como por exemplo, o vírus do mosaico comum do
feijoeiro (Bean common mosaic virus – BCMV), vírus do mosaico da alface (Lettuce mosaic
virus – LMV), o vírus do empedramento da ameixa (Plum pox virus – PPV), o vírus da
mancha anelar do mamoeiro (Papaya ringspot vírus – PRSV) e o mosaico amarelo da
abobrinha-de-moita (Zucchini yellow mosaic virus – ZYMV). Essas espécies infectam uma
grande variedade de culturas agrícolas, incluindo leguminosas, solanáceas, gramíneas entre
outras (ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999).
14
O gênero potyvírus, cujos insetos vetores são afídeos, agrupa vírus cujo genoma é
composto de uma única molécula de RNA de fita simples, senso positivo, com
aproximadamente 10.000 nucleotídeos. O RNA viral produz uma proteína codificada pelo
próprio vírus conhecida como proteína de origem viral (Viral protein Genome-linked, VPg),
ligada covalentemente „a extremidade 5‟ e uma cauda poli-A ligada a extremidade 3‟ do RNA
que está envolvida na proteção contra exonucleases, codificada pelo próprio vírus (BERGER
et al., 2005). A região 3‟ não-traduzível (3‟NTR) apresenta uma variabilidade de seqüência e
tamanho (variando de 163 a 475 nucleotídeos) (SHUKLA et al., 1994). A seqüência da 3‟
NTR é importante para o reconhecimento do RNA viral pelo complexo replicativo, contendo
elementos em cis essenciais para a replicação (HALDEMAN-CAHILL, DAROS &
CARRINGTON, 1998; ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999; HULL, 2002). O genoma
é envolvido pelo capsídeo, de formato alongado e flexuoso, constituído por aproximadamente
2.200 cópias de uma proteína capsidial com massa molecular em torno de 34 kDa (SHUKLA
et al., 1991).
Os genomas de diversos potyvírus já foram totalmente seqüenciados. Em todos os
potyvírus seqüenciados até então, o genoma é localizado entre duas regiões não-traduzidas (5‟
NTR e 3‟ NTR), com capacidade para codificar uma proteína com aproximadamente 350 kDa
(ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999). Esta proteína é processada através de enzimas
(proteinases) contidas na própria poliproteína (P1, HC-Pro e NIa), surgindo daí as proteínas
necessárias para a infecção viral (Figura1) (CARRINGTON et al., 1989; PRUSS et al., 1997;
SHUKLA et al., 1994; HULL, 2002).
15
Figura 1. Representação esquemática da organização do genoma de um
potyvírus. O RNA viral possui uma proteína viral (VPg) ligada à sua extremidade 5‟ e
uma cauda poli A em sua extremidade 3‟. A única fase aberta de leitura dá origem a
uma poliproteína que sofre autoproteólise gerando diferentes intermediários e,
finalmente, 8 proteínas virais (P1, HC-Pro, p3, CI,6k2, NIa, NIb e CP). Adaptado de
Shukla et al. (1994).
As proteínas produzidas in vivo a partir do RNA de um Potyvirus, observa-se doze
proteínas, cuja soma dos pesos moleculares ultrapassa 600 kDa. A quantidade relativa de cada
uma dessas proteínas varia ao longo do tempo. Uma análise mais detalhada das proteínas
virais revela que, na verdade, a ORF é traduzida como uma única proteína, que sofre autoproteólise, gerando cada uma das proteínas virais (ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM,
1999).
A maioria das proteínas virais tem pelo menos uma função estabelecida (Tabela 1). Na
verdade, muitas dessas proteínas têm mais de uma função. Sendo as proteínas P1, HC-Pro
(Helper Component-Proteinase), P3, CI, 6K2, VPg-Pro (NIa) NIb de inclusão nuclear estão
envolvidas na replicação do RNA. A estratégia de replicação e expressão gênica dos
Potyvirus é extremamente danosa a célula hospedeira, implicando em um grande dreno de
metabólitos para produção das proteínas virais, que são na prática desperdiçados pelo vírus.
As infecções por Potyvirus são freqüentemente severas, com sintomas características de
mosaico e deformações foliares no hospedeiro (ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999).
16
Tabela 1. Funções associadas às regiões não traduzídas e à proteínas dos potyvírus.
Reproduzido de Krause-Sakate, 2001 e atualizado por Hasan, H., 2004.
Proteínas
ou Região
5'NTR
P1
HC-Pro
P3 e PIPO
CL
6k1 e 6K2
NIa (ProVPg)
NIb
CP
3'NTR
Funções
Referências
Promotor da tradução
Promotor da replicação do RNA viral
Competitividade e adaptação viral
Local de início do encapsidamento
Carrington & Freed, 1990
Carrington & Freed, 1990
Simón-Buela, Guo & García, 1997
Wu & Shaw, 1998
Verchot, Koonin & Carrington,
Protease
1991
Fator acessório para a replicação do genoma viral
Verchot & Carrington, 1995
Transmissão por afídeos
Thornbury et al., 1985
Protease
Carrington, Freed & Sanders, 1989
Cronin et al., 1995; Yelina et al.,
Movimento à longa distância
2002
Fator acessório para a replicação do genoma viral
Kasschau & Carrington, 1998
Cronin et al., 1995; Rojas et
Movimento célula-a-célula
al.,1997; Kasschau, Cronin &
Carrington, 1997
Transmissão por semente
Johansen et al., 1996
Anandalakshmi et al., 1998;
Brigneti et al., 1998; Kasschau &
Inibição da resposta de defesa da planta
Carrington, 1998; Mallory et al.,
2001; Lakatos et al., 2006
Sinergismo viral
Pruss et al., 1997
Determinante de sintomatologia
Sáenz et al., 2001
Klein et al., 1994; Chung et al.,
2008; Wei et al., 2010; Wen &
Fator auxiliar para replicação do genoma viral
Hajimorad, 2010.
Replicação (Helicase, ATPase)
Laín et al., 1991
Determinante de sintomatologia
Chu et al., 1997
Movimento célula-a-célula
Carrington, Jensen & Shaad, 1998
Restrepo-Hartwig & Carrington,
Manter o complexo de replicação ancorado à membrana
1994; Schaad, Jensen & Carrington,
plasmática
1997
Replicação viral
Mérits et al., 2002
Protease (Pro)
Carrington & Dougherty, 1987
Iniciador para a replicação do RNA viral (Vpg)
Schaad et al., 1996
RNA polymerase dependente de RNA
Hong & Hunt, 1996
Allison, Johnston & Dougherty,
Encapsidação do genoma
1986; Varrelmann & Maiss, 2000
Transmissão por afídeos
Atreya, Atreya & Pirone, 1991
Dolja et al., 1995; Fedorkin et al.,
Movimento célula-a-célula
2001
Movimento a longa distância
Dolja et al., 1994; Dolja et al., 1995
Mahajan, Dolja & Carrington,
Replicação
1996;
Determinante de sintomatologia
Haldeman-Cahill et al., 1998
Mahajan, Dolja & Carrington,
Promotor de replicação do RNA viral
1996; Haldeman-Cahill et al., 1998
Determinante de sintomatologia
Rodriguez-Cerezo & Shaw, 1991
Fator acessório à replicação
Mahajan, Dolja & Carrington, 1996
17
Uma característica marcante de proteínas produzidas por Potyvirus é sua natureza
multifuncional com formação de inclusãoes citoplásticas cilíndricas (CI) as quais se
desenvolvem durante a infecção viral nas células vegetais infectadas (Figura 2)
(EDWARDON, 1966). Estas inclusões são de agregados estáveis da proteína CL produzidas
pelo próprio vírus durante a infecção (HULL et al., 2002; FAUQUET et al., 2005). As
proteínas possuem funções, sendo que algumas têm até quatro funções definidas. A proteína
HC-Pro, por exemplo, é um produto gênico bastante estudado, à qual já foi atribuído o maior
numero de funções. Ela catalisa a proteólise de seu terminal carboxílico, separando-se da
proteína P3 (CARRINGTON; FREED & OH, 1990). Está envolvida na clivagem de
poliproteínas, na transmissão por afídeos (RACCAH; HUET & BLANC, 2001), em processos
relacionados com a replicação do RNA viral (LEGRAVE et al., 1996) no movimento célulaa-célula (ROJAS et al., 1997) e a longa distância (CRONIN et al., 1995; YELINA et al.,
2002), no processo de inibição sobre o mecanismo de defesa da planta, baseado no
silenciamento gênico pós-transcricional (KASSCHAU; CRONIN & CARRINGTON, 1997;
MALLORY et al., 2001; LAKATOS et al., 2006) . Para tanto, HC-Pro deve interagir com
diversas outras proteínas virais juntamente com o hospedeiro. Por exemplo, para a
transmissão por afídeos, existem evidências diretas de interação com a capa protéica. Para a
replicação viral, devem existir interações com várias proteínas, entre elas: CI, VPg-Pro e NIb
(ZERBINI JÚNIOR & ZAMBOLIM, 1999).
18
Figura 2. Corte transversal mostrando as alterações morfológicas da proteína de
inclusão citoplasmática em uma infecção viral, formando estrutiras espirais. A seta
indica vírions presentes nas proximidades destas inclusões (LUCINDA et al., 2008).
Segundo o último relatório do ICTV (International Comitte of Taxonomic of Virus),
os critérios de demarcação de espécies para o gênero Potyvirus estão baseados na seqüência
do genoma, na gama de hospedeiros, na patogenicidade e citopatologia, no modo de
transmissão e propriedade antigênicas. Considera-se, no entanto, que o método mais eficiente
para a classificação seja a comparação da seqüência de aminoácidos da poliproteína e proteína
capsidal na ausência da seqüência de nucleotídeos de todo o genoma (BERGER et al., 2005).
A seqüência de nucleotídeos da 3‟NTR também pode ser utilizada na classificação (ADAMS
et al., 2005). De um modo geral, espécies distintas apresentam identidade de até 53% para as
seqüências de aminoácidos da CP, enquanto estirpes de um mesmo vírus apresentam de 83 a
99% de identidade. Para que duas espécies sejam consideradas distintas, a seqüência de
aminoácidos da proteína capsidal deve ser inferior a 80%, já para a seqüência de nucleotídeos
de todo o genoma, espécies distintas apresentam identidade inferior a 85%(ADAMS et al.,
2005).
19
Os Potyvirus são transmitidos, de maneira não persistente, não circulativa, causado por
diversas espécies de afídeos (pulgões), em especial pelos vetores Aphis gossypii (Glover) e
Myzus persicae (Sulzer) (Figura 3) (KUROZAWA & PAVAN, 1997; ZAMBOLIM &
ZERBINI JÚNIOR, 2000; ZAMBOLIM & ZAMBOLIM, 2002). Usualmente, o inseto é
capaz de permanecer virulífero por um curto período de tempo. Ao migrar para uma planta
sadia e realizar nova picada de prova, a transmissão é efetivada. Os vírus não-persistentes não
se multiplicam no inseto vetor e não são transmitidos para sua progênie (COSTA, 2002;
HULL, 2002).
Figura 3. Transmissão do tipo não persistente de Potyvirus em um inseto vetor
mediada pela proteína Help component (HC-Pro) que interage com uma proteína
capsidial (CP) do capsídeo do virion e com um sítio de ligação do estilete do inseto.
Reproduzido de James & Bryce, 2006.
Cerca de 15 gêneros e 24 espécies de fitovírus sao transmitidos por afídeos e tem sua
relação vírus-vetor do tipo não persistente e não circulativa (PURCIFULL, EDWARDSON &
HIEBERT 1984; CARRINGTON et al. 2006). Entre os vetores mais eficientes estão Aphis
gossypii (Glover) e o Myzus persicae (Sulzer) (GALLO et al., 2002). A dificuldade de
20
controle dessa doença por meio do combate aos insetos vetores ou através de práticas
culturais que minimizem a incidência do vírus, fazem com que, outras alternativas de controle
sejam buscadas (YUKI, 1990; SUMMERS et al., 1995).
1.2.3. Aspectos da família Bunyaviridae e Gênero Tospovírus
O gênero Tospovirus (família Bunyaviridae) apresenta uma ampla distribuição
mundial, podendo infectar mais de 1050 espécies de plantas em 92 famílias botânicas
(FAUQUET et al., 2005, PETERS, 1998). Por um longo tempo, o gênero foi considerado
monotípico, consistindo apenas de TSWV. No entanto, a descoberta de um segundo
tospovírus, Impatiens necrotic spot virus (INSV) (LAW & MOYER, 1990), foi seguido pela
descrição de um número crescente de tospovírus em diferentes partes do mundo. Dentro da
moderna taxonomia de vírus, várias espécies de tospovírus têm sido propostas (PRINS &
GOLDBACH, 1998).
21
Tabela 2. Distribuição geográfica das espécies de tospovírus conhecidos em diferentes
continentes. Reproduzido de Pappu, Jones & Jain (2009).
África Ásia
GRSV CaCV
INSV CSNV
IYSV CCSV
TSWV GBNVa
INSV
IYSV
MYSV
PBNVa
PSMV
PYSV
TSWV
TYRVa
TZSV
WBNV
WSMoV
Australia
CaCV
INSV
IYSV
TSWV
Europa
CSNV
INSV
IYSV
PoRSV
TSWV
America do Norte
INSV
IYSV
MSMV
TSWV
America do Sul e Caribe
CSNV
GRSV
INSV
IYSV
PCFV
TCSV
TSWV
ZLCV
Capsicum chlorosis virus (CaCV); Calla lily chlorotic spot virus (CCSV); Chrysanthemum stem necrosis virus
(CSNV); Groundnut ringspot virus (GRSV); Groundnut bud necrosis virus (GBNV); Impatiens necrotic spot
virus (INSV); Iris yellow spot virus (IYSV); Melon severe mosaic virus (MSMV); Melon yellowspot virus
(MYSV); Peanut chlorotic fanspot virus (PCFV); Polygonum ringspot virus (PoRSV); Physalis silver mottle
virus (PSMV); Peanut yellow spot virus (PYSV); Tomato chlorotic spot virus (TCSV); Tomato spotted wilt virus
(TSWV); Tomato yellow fruit ring virus (TYFRV); Tomato zonate spot virus (TZSV); Watermelon bud necrosis
virus (WBNV); Watermelon silver mottle virus (WSMV) e Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV).
a
Tomato fruit yellow ring virus (TFYRV) é considerado como um isolado do vírus Tomato
yellow ring virus (TYRV). Groundnut bud necrosis virus (GBNV) é também conhecido como
Peanut bud necrosis virus (PBNV).
* Dois potenciais novos tospovírus australianos ainda estao sendo caracterizados, de uma
orquídea e outro de Bossiaea eriocarpa não estão incluídos na lista acima.
No Brasil, já foram relatadas além de Tomato spotted wilt virus (TSWV) as espécies
Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV), Chrysanthemum
stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Iris yellow spot virus
(IYSV) (REZENDE et al., 1996; BEZERRA et al., 1999).
Na natureza, os tospovírus são transmitidos por tripes (ULLMAN, SHERWOOD &
GERMAN, 1997; WHITFIELD, ULLMAN & GERMAN, 2005; LEBAS & OCHOACORONA, 2007; PAPPU, 2008; TSOMPANA & MOYER, 2008), que desempenham um
papel crítico na sua epidemiologia. Apresentam um considerável grau de diversidade
biológica. Descritores para essa diversidade incluem variantes dos sintomas, patogenicidade e
variantes na virulência (QIU et al., 1998; MANDAL et al., 2006), as diferenças na
especificidade de tripes e transmissibilidade (ULLMAN SHERWOOD & GERMAN, 1997;
22
WHITFIELD, ULLMAN & GERMAN, 2005), e capacidade de quebrar a resistência da
planta hospedeira (ROGGERO, MASENGA & TAVELLA, 2002;. MARGARIA, CIUFFO,
& TURINA, 2004; CIUFFO et al., 2005; PERSLEY, THOMAS, & SHARMAN, 2006).
O ciclo de vida dos Tospovirus é composto pelas seguintes fases: ovo, primeiro ínstar
e segundo ínstar, pré-pulpa, pupa e inseto adulto. Os adultos que se alimentam em plantas
infectadas com tospovirus não se tornam virulíferos. A aquisição viral somente acontece em
estádios larvais e a transmissão só é observada no final do estádio de segundo ínstar, mas é
realizada com maior freqüência pelos adultos virulíferos (MORTIZ, KUMM & MOUND,
2004). A infecção é apresentada de maneira sistêmica, circulativa e propagativa em muitas
plantas cultivadas. No entanto, outros tospovírus, como CaCV e o IYSV, apresentam
dificuldades de se moverem sistemicamente e tendem a permanecer localizadas (JONES &
SHARMAN, 2005; SMITH, JONES & WYLIE, 2006). São transmissíveis mecanicamente
com graus variados de dificuldade, porém, não existe evidência de transmissão por semente.
Estudos mostraram que o vírus foi encontrado na casca de semente de amendoim (hypogeae
de Arachis), mas não no embrião (PAPPU et al., 1997).
Os tospovírus causam perdas significativas no rendimento e qualidade dos produtos
vegetais de leguminosas e culturas ornamentais em muitas partes do mundo (MUMFORD,
BARKER, & WOOD, 1996; PAPPU, 1997; PEARCE, 2005; PERSLEY, THOMAS, &
SHARMAN, 2006). Infecção nas fases iniciais de crescimento das culturas muitas vezes
resulta em uma diminuição substancial no estande de plantas levando a perdas de rendimento
considerável,
infecção em fases posteriores ainda pode causar perdas significativas no
rendimento e qualidade dos produtos (CULBREATH, TODD & BROWN, 2003). Plantas de
pimenta e tomate quando infectadas com Tospovirus diminuem o rendimento dos frutos,
desenvolvendo marcas visíveis na superfície, tornando-se inviáveis para o comercio
(LATHAM & JONES, 1996, 1997).
Estudos na America do sul demonstraram que ZLCV é transmissível apenas por
Frankliniella zucchini, e não por Thrips tabaci (REZENDE et al., 1997). Várias revisões e
boletins informativos de extensão em diferentes aspectos de tospovírus e vetores tripes têm
sido publicados nos últimos anos (MOUND, 2001; ADKINS, & BAKER, 2005; JONES,
2004, 2005; WHITFIELD, ULLMAN, & GERMAN, 2005;. BROWN et al., 2005.;
PERSLEY, THOMAS & SHARMAN, 2006; LEBAS & OCHOA-CORONA, de 2007;
PAPPU, 2008; TSOMPANA & MOYER, 2008).
23
Jones (2005) proporcionou uma abrangente relato histórico da maior diversidade de
Tospovírus em diferentes partes do mundo. Esta revisão apresenta um resumo do status atual
da epidemia de Tospovírus em várias culturas em diferentes continentes (África, Ásia,
Europa, América do Norte e Central, América do Sul), e uma visão geral dos progressos feitos
no entendimento de sua epidemiologia, visando assim desenvolver uma melhor gestão de
programas para reduzir o seu impacto.
2.6 Principais viroses associadas a cultura da melancia
A cultura da melancia pode ser infectada por patógenos, que causam os mais diversos
sintomas. Além das doenças bióticas, existem as abióticas, que também podem causar
destruição total da cultura, caso não sejam adotadas medidas preventivas (SANTOS et al.,
2005). Poucos são os dados disponíveis sobre a incidência desses vírus nas regiões produtoras
de melancia no Brasil, porém os dados existentes mostram a predominância dos Potyvirus.
2.6.1 Papaya ringspot virus – Strain Watermelon (PRSV-W)
Há evidencias que o PRSV se originou na região da Índia subcontinental. Este vírus é
classificado em duas estirpes, a estirpe papaya e a estirpe watermelon, que possuem vírions
que não podem ser diferenciados por testes sorológicos, mas que diferem quanto às espécies
que infectam melão e melancia, respectivamente (BATESON et al., 2002; FAUQUET et al.,
2005). Encontra-se distribuído na Américas do Sul, América Central, Estados Unidos,
México, Oriente médio, Austrália, China, França, Alemanha, Índia, África do Sul e Itália
(PURCIFUL et al., 1996).
A estirpe W, Watermelon (PRSV-W) infecta sistematicamente espécies da família
cucurbitaceae, constituindo fator de importância econômica para estas culturas no Brasil
(BONILHA, 2007). O PRSV-W é muito comum em países tropicais e subtropicais, sendo
considerado como limitante para diversas cucurbitáceas, principalmente quando a infecção
ocorre no início do ciclo (ZAMBOLIM & DUSI, 1995; LUIS-ARTEAGA et al., 1998).
Segundo Giampan & Rezende (2001), PRSV-W predomina nas principais espécies de
cucurbitáceas cultivadas no Estado de São Paulo. Segundo Yuki et al. (2000), este é o
principal vírus também nos Estados do Pará, Rio Grande do Norte, Mato Grosso, Minas
Gerais, Ceará e Distrito Federal. No Brasil, espécies selvagens de cucurbitáceas ocorrem
24
quase que em todas as regiões e durante praticamente todas as épocas, podendo desta maneira
servir de hospedeiro para o vírus. (YUKI et al., 2000).
2.6.2 Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)
O ZYMV foi isolado pela primeira vez na Itália em 1973, descrito em 1981, e então
identificado em todos os continentes em menos de uma década. Economicamente é um dos
mais importantes vírus de cucurbitáceas. Uma imensa variabilidade biológica tem sido
observada entre os isolados ZYMV, sobre a gama de hospedeiros, sintomatologia e
transmissibilidade. A sobrevivência do ZYMV em áreas onde cucurbitáceas não são
cultivadas ao longo do ano continua a ser elucidado, porque poucos hospedeiros naturais
foram identificados até agora. O controle parcial de ZYMV pode ser conseguido através da
limitação de transmissão do vírus por pulgões, através de práticas culturais. No entanto, a alta
variabilidade biológica do ZYMV justifica uma avaliação cuidadosa da implantação de
estratégias de controle genético, a fim de aumentar a sua durabilidade (DESBIEZ & LECOQ,
1997).
Considerado um importante patógeno de plantas dos últimos 20 anos, o ZYMV tem
sido relatado em vários países além do Brasil: Argélia, Austrália, Egito, França, Alemanha,
Israel, Itália, Japão, Jordânia, Líbano, Marrocos, Espanha, Formosa, Turquia, Reino Unido,
EUA e Cingapura (BÜCHEN-OSMOND & PURCIFUL, 1996; WONG; CHONG; CHONG,
1994). Pode ser encontrado principalmente nas espécies de cucurbitáceas, incluindo as
principais espécies cultivadas e há relatos de infecção de algumas outras espécies de famílias
de dicotiledôneas (MAHGOUB et al., 1997). Causam sintomas do tipo mosaico nas diferentes
espécies de cucurbitáceas. Induz mal formação foliar, deformação e escurecimento dos frutos
(LISA & LECOQ, 1984; PROVVIDENTI et al., 1984; NAMETH et al., 1985; LECOQ,
LEMAIRE & WIPF-SCHEIBEL, 1991).
2.6.3 Watermelon mosaic virus (WMV)
O WMV possui ampla gama de hospedeiras, com 178 espécies de plantas dentro de 27
famílias, incluindo cucurbitáceas e algumas espécies de leguminosas, malváceas,
quenopodiáceas e ornamentais (SHUKLA et al., 1994). Plantas infectadas com WMV exibem
sintomas de mosqueado, mosaico, bolhosidades e deformações do limbo foliar. A qualidade e
a quantidade de produção dos frutos podem ser reduzidas (OLIVEIRA et al., 2000). A
25
disseminação do vírus no campo é realizada com muita eficiência por mais de 38 espécies de
afídeos em 19 gêneros de maneira não-persistente, sendo seus principais vetores Myzus
persicae Sulzer, 1776 e Aphis spp. (FAUQUET et al., 2005).
O controle químico dos insetos
vetores não apresenta resultados satisfatórios no combate a doença. Conseqüentemente, a
forma de controle mais eficiente para WMV-2 consiste em desenvolver cultivares resistentes,
mediante introdução de genes capazes de conferir resistência em cultivares comerciais
suscetíveis.
2.6.4 Cucumber mosaic virus (CMV)
O CMV foi descrito pela primeira vez por Doolittle em 1916, pertence ao gênero
Cucumovirus, apresenta distribuição cosmopolita e diferentes graus de virulência (DIAS,
2004). Pode ser transmitido na natureza por várias espécies de afídios, apresentando com estes
uma relação do tipo não persistente (BRIOSO, 1986). Os isolados de CMV podem ser
classificados em dois subgrupos, CMV I e CMV II por métodos biológicos, sorológicos e
moleculares, de acordo com características moleculares e hospedeiros diferenciais que
infectam (PALUKAITIS et al., 1992). De modo geral o CMV-I, mais termotolerante,
predomina em regiões tropicais e subtropicais e o CMV-II é mais prevalente em regiões
temperadas (BOARI, 1998). As partículas virais são isométricas, com 28 a 30 nm de
diâmetro, contendo ssRNA tripartido (VAN REGENMORTEL et al., 2000).
Ocorre em cucurbitáceas, principalmente, em regiões temperadas, onde a doença é
mais severa. No Brasil não possui grande importância devido a sua baixa ocorrência em
regiões produtoras. Todas as cucurbitáceas são suscetíveis ao vírus (VIANA et al., 2001).
Apresenta uma ampla gama de hospedeiros incluindo muitas espécies daninhas e plantas
cultivadas (EMBRAPA, 2007). Em hortaliças, na maioria das vezes, a transmissão do CMV
isoladamente é mais eficiente do que em mistura com outros vírus, tanto através de aquisição
simultânea como seqüencial. O vírus possui um amplo círculo de hospedeiros e é transmitido
mecanicamente por sementes e por afídeos. Mais de 60 espécies de afídeos transmitem o
CMV de maneira não persistente, destacando-se as espécies Myzus persicae e Macrosiphum
euphorbiae (VIANA et al., 2001).
26
2.6.5 Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV)
É causado pelo vírus da clorose letal da abobrinha, classificado na família
Bunyaviridade no gênero Tospovirus. O ZLCV é transmitido em condições naturais por uma
nova espécie de tripes descrita no Brasil e denominada de Frankliniella zucchini. É importante
salientar que a relação vetor/vírus é do tipo circulativa-propagativa e, portanto, multiplica-se
no inseto vetor. Esse vírus tem sido encontrado, nos últimos anos, com alta freqüência em
plantios de diferentes espécies de cucurbitáceas, estando em alguns casos, associado a severos
danos na produção (REZENDE et al., 1997; YUKI et al., 2000; STANGARLIN et al., 2001;
GIANPAN, 2003; EMBRAPA, 2007). Os sintomas causados pelo ZLCV começam com uma
coloração verde clara em todas as folhas. Em seguida, as folhas mais novas tornam-se
cloróticas, com bordos encurvados para cima. As folhas são mais espessas do que aquelas de
plantas sadias. Algumas folhas basais mostram necroses sistêmicas. Plantas infectadas
definham e morrem em pouco tempo, especialmente quando a infecção ocorre antes do
florescimento. Após o florescimento exibem quase os mesmos sintomas, mas não morrem,
porém tornam-se atrofiadas e têm sua produção drasticamente reduzida (REZENDE et al.,
1996).
2.7.1 Identificação das Viroses
2.7.1.1 Testes ELISA
Embora numerosas variantes de testes ELISA tenham sido experimentadas e
publicadas por diversos autores (CLARK e ADAMS, 1977; FIELD et al., 1980;
ZANZINGER & TAVANTZIS, 1982a e 1982b; CONVERSE e MARTIN, 1990;
ARAMBURU et al., 1991; FOX, 1993; GARNSEY e CAMBRA, 1993), existem duas
técnicas base em que se apoiam todas as outras (CONVERSE e MARTIN, 1990):
 Técnicas diretas - O marcador enzimático encontra-se diretamente ligado ao
anticorpo usado para detectar o antígeno em questão, dos quais os mais
comuns são o DAS-ELISA (double antibody sandwish) e o dot-ELISA ou
DIBA.
 Técnicas indiretas - Neste caso, a enzima é acoplada não ao anticorpo usado na
detecção do antígeno, mas a um segundo anticorpo, específico para o primeiro.
Destas técnicas, sobressaem o ID-ELISA (ELISA indireto) e o ID-DIBA.
27
Enquanto muitos testes serológicos dependem da avaliação de um precipitado
antígeno-anticorpo, nos testes ELISA ocorre uma alteração de cor, que pode ser lida
eletronicamente com um espectrofotômetro ou, mais grosseiramente, avaliada a olho nú
(FOX, 1993).
2.7.1.1.1 DAS-ELISA
Esta é a forma mais simples dos testes ELISA usada na detecção de fitopatógenos,
desde a sua descrição por Clark e Adams (1977). Trata-se de um teste direto, que tem como
fase sólida placas de poliestireno com 96 alvéolos.
A placa é inicialmente revestida com anticorpos específicos para o antígeno a detectar,
sendo posteriormente adicionada a amostra a testar. Os antígenos específicos para os
anticorpos ligam-se a eles e todas as moléculas não específicas são removidas por lavagem.
Ao antígeno assim ligado, é adicionada uma solução de anticorpos conjugados com enzima,
sendo esta associação detectada pela adição de um substrato (CONVERSE & MARTIN,
1990; GARNSEY & CAMBRA, 1993).
2.7.1.1.2 ELISA-indireto
Este teste coincide em quase todas as fases com o DAS-ELISA. E ntretanto, nesta
técnica, após a colocação do antígeno segue-se a adição do anticorpo específico para o
antígeno e só posteriormente é adicionada a enzima conjugada a um anticorpo específico para
aquele anticorpo intermédio (anticorpos de uma espécie são antígenos quando injetados num
animal de outra espécie). Por exemplo, as imunoglobulinas do coelho podem ser injetadas
num outro animal, como a cabra, para criar anticorpos cabra anti-coelho (GAR - goat antirabbit). Estes anticorpos são úteis na detecção de anticorpos de coelhos, que por sua vez são
preparados para detectar o antígeno (CONVERSE & MARTIN, 1990; GARNSEY &
CAMBRAS, 1993).
Esta técnica, embora envolva uma fase adicional, é mais sensível, e permite também o
uso de conjugados anticorpo-enzima comercialmente preparados, evitando-se desta forma a
necessidade de preparação de um conjugado específico para cada antígeno (GARNSEY &
CAMBRAS, 1993).
28
2.7.1.1.3 Dot-ELISA
Durante muitos anos, os testes ELISA em placas alveoladas foram o método de
escolha na detecção de vírus, pelas suas inúmeras características. No entanto, as reações
usadas em placas alveoladas podem ser transpostas para membranas com algumas vantagens
(FOX, 1993).
Trabalhos realizados por Powell (1987a e 1987b) demonstraram a elevada fiabilidade
das técnicas DIBA, assim como a sua maior rapidez e acessibilidade em relação ao preço
relativo dos materiais. Hsu (1996), por sua vez, demonstrou, em testes realizados com TSWV
(Tomato spotted wilt virus), uma sensibilidade destes testes oito vezes superior à dos ELISA
em placa.
Uma grande desvantagem em relação aos testes em placas alveoladas deve-se ao fato
de os resultados serem mais dificilmente quantificados, razão pela qual os DIBA são usados
particularmente no diagnóstico de rotina para detecção de positivos vs negativos (POWELL,
1987a).
Relativamente ao suporte físico destes testes, e embora a bibliografia se refira com
maior freqüência ao uso de membranas de nitrocelulose, Hammond e Jordan (1990) defendem
que membranas de nylon, também usadas com a mesma finalidade, apresentam maior
capacidade de ligação às proteínas, assim como maior resistência ao manuseamento.
Estas técnicas, também designadas por “dot-blot immunoassay” ou dot-ELISA,
seguem o mesmo princípio dos testes em placas de poliestireno. No entanto, a enzima ao
reagir com o substrato solúvel, forma um produto colorido insolúvel que precipita no local da
reação, indicando assim quais das amostras contêm o antígeno em causa (HAMMOND &
JORDAN, 1990). Os protocolos para estas técnicas encontram-se descritos por Powell
(1987b), Serwood, Sanborn & keyser (1987) e Hu et al.(1991).
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50
CAPITULO II: Distribuição e diagnose de vírus associados a cultura da
melancia no Estado do Tocantins.
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo fazer um levantamento sobre a distribuição e efetuar a
diagnose dos vírus associados a cultura de melancia nas regiões produtoras do Estado do
Tocantins. Foram coletadas 752 amostras de plantas com sintomas de vírus em todas as
regiões produtoras de melancia. A identificação foi realizada pelo método sorológico de DotElisa com anticorpos policlonais para PRSV-W, ZYMV, CMV, WMV e ZLCV. Entre a
ocorrência das viroses por região observou-se que PRSV-W foi predominante em 31% das
amostras obtidas em Formoso do Araguaia, diferindo estatisticamente pelo teste de Tukey dos
demais vírus, e menos de 30% foram positivas para WMV, ZLCV, CMV e ZYMV. Nas
amostras obtidas no município da Lagoa da Confusão houve predominância de WMV com
26,4%, seguido por PRSV-W e ZLCV com 22% e 8,1%, respectivamente. O vírus PRSV-W
apresentou 12,5% de infecção nas amostras na região de Gurupi, seguido de ZLCV (12%) e
ZYMV (10,4%) e WMV com 12%, não diferindo estatisticamente entre si, apenas CMV com
11,2% de amostras infectadas se mostrou em outro grupo. No município de Porto Nacional
foram identificados CMV (14,7%), ZLCV (13,8%) e PRSV-W (10,3%), sendo ZYMV e
WMV encontrados em um subgrupo com 8,4% e 9,2% de infeção, respectivamente. As
infecções mistas de maior ocorrência foram entre PRSV-W+WMV, PRSV-W+ZLCV e
ZLCV+WMV, num total de 142 amostras. De modo geral, estes resultados permitem
subsídios para o programa de melhoramento de resistência a viroses na cultura da melancia no
estado do Tocantins, considerando os cinco tipos de vírus identificados e sua distribuição
espacial por região.
Palavras chaves: Citrullus lanatus, diagnose, viroses, Dot-Elisa.
51
Distribution and diagnosis of viruses asociated with watermelon crop in the
state of Tocantins.
ABSTRACT
This study aimed to survey on the distribution and makes the diagnosis of virus associated
with culture of watermelon production areas of the state of Tocantins. We collected 752
samples of plants with symptoms of virus in all producing regions of watermelon. The
identification was made by serologic method of Dot-ELISA with polyclonal antibodies to
PRSV-W, ZYMV, CMV, WMV and ZLCV. Between the occurrences of viruses by region
showed that PRSV-W was predominant in 31% of the samples obtained in Formoso do
Araguaia, differing by the Tukey test of other viruses, and less than 30% were positive for
WMV, ZLCV, CMV and ZYMV. The samples obtained in the municipality of Lagoa da
Confusão WMV was predominated with 26.4% followed by PRSV-W and ZLCV with 22%
and 8.1%, respectively. The virus PRSV-W infection showed 12.5% of the samples in the
region of Gurupi, followed by ZLCV (12%) and ZYMV (10.4%) and WMV with 12%, not
statistically different from each other, with only 11, 2% of CMV infected samples was shown
in another group. In the municipality of Porto Nacional CMV were identified (14.7%), ZLCV
(13.8%) and PRSV-W (10.3%), ZYMV and WMV was found in a subgroup with 8.4% and
9.2 % of infection, respectively. Mixed infections occurred more frequently between PRSVW + WMV, PRSV-W + ZLCV and WMV + ZLCV, a total of 142 samples. Overall, these
results allow subsides for the breeding program for resistance to viruses in watermelon crop in
the state of Tocantins, considering the five virus types identified and their spatial distribution
by region.
Keywords: Citrullus lanatus, diagnosis, viruses, Dot-Elisa.
52
1. INTRODUÇÃO
A melancia (Citanatus lanatus) é infectada por diversas espécies de vírus da família
Potyviridae afentando diretamente seu desenvolvimento vegetativo e reprodutivo,
ocasionando perdas significativas em diversas regiões produtoras do Brasil. Dentre os tipos de
potyvirus que infectam a cultura está o vírus da mancha anelar do mamoeiro - estirpe
melancia “PRSV-W” (Papaya ringspot vírus- Strain watermelon) (REZENDE & PACHECO,
1997; OLIVEIRA et al.; 2000; MOURA et al.; 2001), mosaico amarelo da abobrinha
“ZYMV” (Zucchini yellow mosaic virus) (VEGA et al. 1995; OLIVEIRA et al.; 2000;
MOURA et al.; 2001), mosaico do pepino “CMV” (Cucumber mosaic virus) (EIRAS,
COLARICCIO & CHAVES, 2001), mosaico da melancia “WMV” (Watermelon mosaic
virus), (SÁ & KITAJIMA, 1991; OLIVEIRA et al.; 2000) e um tospovirus conhecido como
Clorose letal da abobrinha de moita “ZLCV” (Zucchini Lethal chlorosis virus) (GIAMPAN,
REZENDE & PIEDADE, 2009). Sendo os potyvirus transmitidos de maneira não persistente
pelo afídeo e o tospovirus de maneira semi-persitente pelo inseto vetor tripes (VEGA et al.,
1992).
As perdas econômicas ocasionadas por vírus variam em função do tipo de vírus
presente e do tipo de infecção (simples ou mista) na cultura. No Brasil, existem diferentes
tipos de vírus predominantes nas regiões produtoras de cucurbitáceas, sendo a dispersão
associada a populações de insetos vetores (MOURA, 2003; SANTOS et al., 2005). A
incidência de viroses é dinâmica, podendo variar em função da espécie do vírus, seus
hospedeiros, da migração e espécies dos vetores (MOURA et al., 2001). Desse modo, além
da redução direta na produção, os vírus influenciam diretamente no aspecto morfológico do
fruto, depreciando o seu valor comercial.
A área cultivada de melancia no Estado do Tocantins em 2010 foi de 6,8 mil hectares,
com produção de 174 mil toneladas de frutos, obtendo uma receita de 42 milhões de reais
(SEAGRO, 2011). Estudos sobre a ocorrência e os tipos de vírus nas principais regiões
produtoras são incipientes, pela grande importância econômica e social da cultura no Estado.
A identificação dos principais vírus no sistema de cultivo de melancia proporcionará suporte
para futuros estudos de melhoramento genético da melancia, visando obtenção de cultivares
resistentes aos vírus, além do estabelecimento de manejo integrado de viroses nas regiões
produtoras. Para isso faz-se necessário o levantamento dos principais vírus presentes nos
sistema de cultivo de melancia no Estado do Tocantins.
53
O presente trabalho teve como objetivo a identificação sorológica e distribuição
parcial dos vírus presentes nos campos de produção de melancia no Estado do Tocantins.
2. MATERIAL e MÉTODOS
Este trabalho foi desenvolvido com isolados de quatro regiões produtoras de melancia
do Estado do Tocantins (Gurupi, Formoso do Araguaia, Porto Nacional e Lagoa da
Confusão), cultivados com melancia. A identificação dos vírus foi realizada no Laboratório de
Manejo Integrado de Pragas do Campus Universitário de Gurupi – Universidade Federal do
Tocantins (UFT), de Janeiro de 2009 a Janeiro de 2011.
2.1. Obtenção das plantas e inoculação
Foram obtidas 752 amostras de plantas de melancia com sintomas de viroses. Sendo
265 amostras do município de Formoso do Araguaia, 232 da Lagoa da Confusão, 150 de
Gurupi e 105 de Porto Nacional. Todas as amostras foram inoculadas e mantidas em plantas
de Cucurbita pepo, Nicotina benthamiana e Datura stramonium. A inoculação, foi realizada
de acordo com Nascimento et al. (2011) com adição do tampão de fosfato potássio (K2HPO4)
0,01 M, pH 7,0 e 0,1 % de sulfito de sódio (Na2SO3), por fricção da suspensão viral sobre as
folhas cotiledonares, previamente polvilhadas com o abrasivo Carbureto de silício
(carborundum), 400 mesh. Após, retirou-se, via lavagem, o excesso de abrasivo. Para cada
espécie de vírus fram realizadas duas inoculações, sendo a segunda realizada três dias após a
primeira (Figura 1).
54
Figura 1. Mapa do Estado de Tocantins indicando as quatro principais regiões produtoras
onde foram coletadas amostras de melancia com sintoma de viroses. Os números no mapa
representam: 1-Região de Porto Nacional; 2-Região de Lagoa da Confusão; 3-Região de
Formoso do Araguaia; 4-Região de Gurupi.
2.2. Identificação sorológica dos isolados
A identificação dos vírus presentes foi realizada pelo teste sorológico de Dot-ELISA
ou DIBA, com anti-soros específicos para os vírus WMV-2, CMV, ZYMV, PRSV-W e
ZLCV. As amostras foram maceradas e preparadas de acordo com os procedimentos
realizados por Banttari & Goodwin (1985) na proporção de 1g de folha para 1000µl de
tampão ½ PBS (NaH2PO4H2O, 0,08M; K2HPO4, 0,02M; NaCl, 1,40M; KCl, 0,02M; pH 7,4).
Posteriormente foram pipetados 4µl da solução e distribuídos em membrana de nitrocelulose.
Contudo os controles positivos e negativos. Em seguida a membrana ficou a temperatura
ambiente por 30 minutos para secar. O bloqueio foi realizado com uma solução de ½ PBS
acrescido de 3% de leite em pó “Molico®”, deixando a membrana em agitação por 3 horas a
60 RPM. As membranas foram colocadas em meio contendo anti-soros policlonais
específicos para CMV, PRSV-W, WMV-2, ZYMV e ZLCV, cedidos gentilmente pela Dra.
55
Mirtes Freitas Lima (EMBRAPA-CNPH). O conjugado geral utilizado “Goat anti-rabbit IgG
Alkaline Phosphatase Conjugate, SIGMA” foi diluído na proporção de 1:30.000µl de ½ PBS.
Para revelação foram utilizadas pastilhas de BCIP/NBT (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl
phosphate/Nitro blue tetrazolium) SIGMA FAST™, de acordo com o protocolo do fabricante.
Todos os resultados obtidos das amostras foram comparados com as plantas controle (Plantas
sadias e com sintomas dos respectivos vírus).
Figura 2. Identificação de WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV em ensaios de DotElisa utilizando anticorpos policlonais. Sendo 1A, 1B, 1C, 1D e 1E extrato de plantas sadias.
Plantas controle positivos WMV-2 (2A), ZYMV (2B), PRSV-W (2C), CMV (2D) e ZLCV
(2E), respectivamente. WMV-2 (3A), ZYMV (3B), PRSV-W (3C), CMV (3D) e ZLCV (3E),
respectivamente, coletadas nas regiões produtoras do estado do Tocantins.
2.3. Análise sintomatológica das viroses
A determinação dos tipos de sintomas apresentado pelos víruss coletadas nos campus
de produção de melancia cv. Crimson sweet, foi realizada em casa de vegetação presente no
Campus Universitário de Gurupi. As inoculações mecânicas foram realizadas na fase
cotiledonar, sendo a primeira no estádio de quatro folhas definitivas e a segunda inoculação
após três dias da primeira inoculação, na presença de solução tampão fosfato monobásico
dibásico 0,01 M, pH 7,0 e sulfito de sódio. Após a inoculação, as plantas foram mantidas em
casa de vegetação até o aparecimento dos sintomas das viroses devidamente identificadas no
item anterior. Os sintomas apresentados pelas respectivas infecções virais foi determinado de
acordo com o sistema de classificação de severidade utilizado por Oliveira et al. (2000), onde
existiam: folhas sem sintomas; poucas folhas com leve mosaico nos bordos; maioria das
56
folhas com mosaico; poucas bolhas; maioria das folhas com mosaico; muitas bolhas e/ou
folhas com leves deformações e mosaico intenso e folhas com deformações severas. Toda a
sintomatologia apresentada pelos vírus em infecções simples e mistas foram avaliadas e
tabuladas com as respectivas características.
2.4. Analise estatística
A ocorrência dos vírus representativas de cada região produtora de melancia do estado
do Tocantins foi realizada através de contagem de amostras positivas realizada pelo teste
sorológico de Dot-Elisa, sendo determinadas pela formula %V= (PS – PN) /T x 100, Sendo
que, %V = porcentagem de vírus por região, PS= Planta com sintomas, PN= Plantas sem
sintomas, T= total de plantas por regiões produtoras. Todos dados de porcentagem foram
obtidos utilizado o programa SIGMA PLOT.
3. RESULTADOS
Em Formoso do Araguaia verificou-se a predominância do PRSV-W, sendo
representativo em 31% das amostras, diferindo estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade dos demais vírus, e menos de 30% foram positivas para WMV, ZLCV, CMV e
ZYMV com 10,7%, 9,4% e 4,5%, 4,5%, respectivamente. (Figura 3A). Nas amostras obtidas
no município da Lagoa da Confusão houve predominância de WMV com 26,4%, seguido por
PRSV-W e ZLCV com 22% e 8,1%, respectivamente, os quais diferiram estatisticamente de
ZYMV e CMV pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, não apresentando infecções
(Figura 3B). O vírus PRSV-W apresentou 12,5% de infecção das amostras na região de
Gurupi, seguido de ZLCV (12%) e ZYMV (10,4%) e WMV com 12%, não diferindo
estatisticamente entre si, apenas CMV com 11,2% de amostras com infecção se mostrou em
outro grupo (Figura 3C). No município de Porto Nacional foram identificados CMV (14,7%),
ZLCV (13,8%) e PRSV-W (10,3%), sendo ZYMV e WMV encontrados em um subgrupo
com 8,4% e 9,2% de infeção, respectivamente (Figura 3D).
A ocorrência de plantas sem infecção foi constatada em todas as regiões, em Formoso
do Araguaia foi observado 27 plantas, representando um total de 18,3%, para região de Lagoa
da Confusão 19 plantas sem infecção diferindo significativamente dos grupos infecciosos com
30,5%, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, em Gurupi o grupo de 14 plantas sem
57
infecção representou 25,8%, apresentando-se como um grupo superior aos demais de acordo
com o teste de Tukey e Porto Nacional foram observadas 11 plantas se infecção,
representando um total de 10,1%, constituindo um subgrupo (Figura 3).
A
C
B
D
Figura 3. Ocorrência de vírus em plantas de melancia de quatro regiões produtoras do Estado
do Tocantins, sendo elas: A – Formoso do Araguaia, B – Lagoa da Confusão, C– Gurupi e D
– Porto Nacional e PRSV – W (Papaya ringspot virus – Strain watermelon), ZYMV
(Zucchini yellow mosaic vírus), ZLCV (Zucchini lethal chlorosis virus), WMV (Watermelon
mosaic virus) e CMV (Cucumber mosaic vírus).
A ocorrência de infecção mista foi mais expressiva em Porto Nacional, apresentando
um total de 51 amostras positivas, representando o maior grupo de infecção mista por planta,
com 33,4% de acordo com o teste de Tukey a 5% de probabilidade, seguido pelas regiões de
Formoso do Araguaia com 49 amostras representando 21,4% e Gurupi com 19 amostras
representando um total de 16,1% (Figura 3 e Tabela 1). As associações entre os vírus mais
expressivas ocorreram entre PRSV-W+WMV e PRSV-W+ZLCV, apresentando 31 e 26
amostras positivas para o teste sorológico.
58
Tabela 1. Número de infecções mistas com as respectivas associações virais encontradas nas regiões
produtoras de melancia nos municípios de Formoso do Araguaia, Lagoa da Confusão, Gurupi e Porto
Nacional.
Número de Infecções Mistas
Regiões Produtoras
Média PR+ZY PR+ZL PR+C PR+W ZY+ZL ZY+C ZY+W ZL+C ZL+W C+W
Formoso do Araguaia
49
4
8
6
8
3
1
3
5
7
4
Lagoa da confusão
23
-
9
-
10
-
-
-
-
4
-
Gurupi
19
1
4
2
6
-
-
3
-
2
1
Porto Nacional
51
4
5
11
7
2
1
2
6
7
6
TOTAL
142
9
26
19
31
5
2
7
11
20
11
* PR= PRSV-W, ZY= ZYMV, ZL= ZLCV, C= CMV, W= WMV.
*Média de 3 avaliações entre os anos de 2009 e 2011.
Os sintomas das plantas infectadas diferiram em função dos vírus e suas associações
(Tabela 2). Os sintomas observados nas infecções por vírus variaram desde mosaico leve,
subdesenvolvimento das plantas, estreitamento foliar e enrolamento foliar à mosaico severo,
bolhosidade, bolhas franzidas, cordão de sapato e deformação foliar, chegando a necroses
(Tabela 2 e Figura 4). Além disso, foram observadas alterações na formação e no
desenvolvimento dos frutos, redução no peso e alteração na coloração de frutos obtidos de
plantas cometidas com vírus (Figura 4).
59
Tabela 2. Sintomas observados em plantas de melancia com Papaya ringspot vírus – Strain
watermelon (PRSV-W), Watermelon mosaic virus (WMV), Zucchini yellow mosaic virus
(ZYMV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) e Cucumber mosaic virus (CMV) em
infecções isoladas ou em infecção mista.
Vírus/Infecções Mistas
Sintomatologia*
CMV
M, Sd, Et, Ef
ZYMV
M, Bl
WMV
M, Bf, Et, Cs, Df
PRSV-W
M, Et, Bl, Ef, Es
ZLCV
M, Sd, Df, Ne
PRSV-W+ZYMV
M, Bl, Ef, Sd
PRSV-W+ZLCV
M, Sd, Ne, Es, Et
PRSV-W+CMV
M, Sd
PRSV-W+WMV
M, Bl, Df, Ne
ZYMV+ZLCV
M, Df, Bl, Ne
ZYMV+CMV
M, Df, Et
ZYMV+WMV
M, Df , Bl, Et
ZLCV+CMV
M, Sd, Df, Ef
ZLCV+WMV
M, Bl, Sd, Df, Ne
CMV+WMV
M, Bl, Sd, Et, Es
Planta Sadia
S/S
* Bf: bordas franzidas; Bl: bolhosidade; Es: esporão; Et: estreitamento foliar; Cs: cordão de
sapato; Df: deformação foliar; Ef: enrolamento foliar; Ne: Necrose; M: mosaico; Sd:
subdesenvolvimento; S/S: sem sintomas.
60
Figura 4. Sintomas de infecção viral ocorridos em amostras de plantas de melancia obtidas nas
principais regiões produtoras no estado do Tocantins. Sendo: A- folhas com sintomas de mosaico e
anéis cloróticos; B- folhas com sintomas de bolhosidade, deformação foliar, um leve mosaico nas
partes baixeiras e subdesenvolvimento; C- folhas com leves sintomas de mosaico, deformação foliar e
bordas franzidas D- Folhas com sintomas de mosaico severo, bolhosidade, enrolamento foliar, bordas
franzidas, deformação foliar seguido de necrose; E- Fruto de melancia sadia; F- Fruto de melancia
com sintomas de inanição; G- Fruto de melancia com sintomas de inanição e deformação da casca; HFruto de melancia com sintomas de inanição, deformação do formato e pontuações cloróticas.
4. DISCUSSÃO
O PRSV-W é o vírus predominante nas regiões produtoras de melancia do Estado do
Tocantins, no entanto, observa-se a presença de WMV, ZYMV, PRSV-W, CMV e ZLCV
entre as amostras obtidas em menor ocorrência. A variação da ocorrência de viroses em
diferentes regiões produtoras de cucurbitáceas no Brasil é altamente diferenciada conforme
descrito na literatura. Os vírus PRSV-W, ZLCV, ZYMV, CMV e SqMV teve ocorrência
predominantes em todas as amostras de melancia do Mato Grosso do Sul (STANGARLIN,
DIAS & REZENDE, 2000; STANGARLIN et al., 2001). No estado do Maranhão, a
predominância foi do PRSV-W em campos de produção de cucurbitáceas, seguido por WMV,
CMV, SqMV e ZYMV, respectivamente (MOURA et al., 2001). Segundo YUKI et al. (2000)
no Estado de São Paulo o PRSV-W foi predominante, seguido por ZYMV, ZLCV, CMV e
WMV, respectivamente.
61
Conforme observado neste trabalho, existe uma alta ocorrência de infecções mistas
entre PRSV-W e WMV, sendo menos expressivo para ZYMV+ZLCV e ZLCV+CMV. A
infecções mistas em condições naturais, podem estar associadas aos diversos tipos de vírus
encontrados, neste caso, os menos favorecidos foram ZYMV, CMV e ZLCV (Tabela 1). De
modo geral, casos de mudança no tipo de vírus tem sido freqüentemente encontrada e
associada a infecções mistas, indicando um papel ecológico importante na manutenção das
virose nos sistema de cultivo (SANCHEZ-CAMPOS et al., 1999; DAVINO et al., 2006;
GOMEZ et al., 2009). Diferenças na interação entre vírus já foram relatados em condições
laboratoriais e de campo. Isso ocorre provavelmente devido as condições fisiológicas ou na
concentração do vírus (GAL-ON & SHIBOLETH, 2006).
A identificação correta dos vírus presentes nas regiões produtoras de melancia no
Estado do Tocantins, permite a compreensão dos vírus e o desenvolvimento de estratégias de
controle das viroses, especialmente para o desenvolviemnto de plantas resistentes as víroses.
Estudos recentes mostram que os vírus de RNA possuem altas taxas de evolução e adaptação
(GIBBS et al., 2010). Por exemplo, ZYMV foi relacionado com WMV, sendo estimado ter
evoluído muito rapidamente deste vírus, uma vez mostrado ter um ancestral comum. Embora
ZYMV tenha sido identificado pela primeira em 1970, este vírus tornou-se rapidamente uma
epidemia mundial (DESBIEZ & LECOQ, 1997; SIMMONS, HOLMES & STEPHENSON,
2008).
O estudo das viroses permitirão a identificação de possíveis mutações e
recombinações ocorridas entre os vírus dominantes nos cultivos de curcubitáceas, onde se
encontra os eventos principais de variabilidade nos vírus de RNA, enquanto a deriva genética
e seleção são importantes na evolução dos vírus (GARCIA-ARENAL & FRAILE, 2003).
Outro fator importante está na identificação de novos vírus, onde muitas vezes por meio de
atividades humanas, são introduzidos em regiões isentas de certas estirpes ( NAGATA et al.,
2007).
Várias alterações de vírus têm sido relatados nos últimos anos, incluindo vírus sendo
transmitidos de forma não persistente (AMAKU et al., 2010), transmitidos mecanicamente
(GOMEZ et al., 2009). Begomovírus transmitido por mosca branca (DAVINO et al., 2006;
GARCÍA-ANDRÉS et al., 2007). Conforme observado desde o ano 2000 para WMV no
sudeste da França (DESBIEZ et al., 2009) é um exemplo adicional onde a introdução viral
passa a ser bem adaptadas ao ambiente e rapidamente os vírus existentes são substituídos por
aqueles introduzidos (SAX & BROWN, 2008; FABRE et al., 2010).
62
Vários parâmetros podem ser atribuidos para a rápida mudança das espécies de vírus
de uma determinada região. A eficiência na transmissão pelo inseto vetor aumentando a
propagação do vírus. Um exemplo disto é o caso de TYLCD “Tomato yellow leaf curl virus”
que foi substituído pelo TYLCV-S “Tomato yellow leaf curl Sardinia virus” em poucos anos
no sul da Espanha, provavelmente devido à sua melhor transmissão pelos biótipos locais do
vetor Bemisia tabaci, e sua capacidade de infectar feijão (Phaseolus vulgaris) constituindo
uma importante fonte potencial de inóculo para culturas de tomate (SANCHEZ-CAMPOS et
al., 1999).
A diferença na ocorrência de PRSV-W, ZYMV, WMV, CMV e ZLCV podem estarem
associadas às hospedeiras alternativas, que pode favorecer um determinado tipo de vírus. A
seletividade da planta hospedeira esta na capacidade do vírus replicar e translocar pelos
plasmodemos (ZAMBOLIM & ZAMBOLIM, 2002). De fato, o hospedeiro têm sido relatado
como um processo importante na manutenção viral, na transmissão vetorial e/ou
multiplicação de vírus, que depende da adaptação ao hospedeiro, e de suas interações com o
inseto vetor (MARTIN & ELENA, 2009).
Estes resultados sugerem que existem uma competição direta entre os vírus PRSV-W,
ZYMV, WMV, CMV e ZLCV, tanto em infecção simples como em infecções mistas,
podendo estar favorecendo a predominância de PRSV-W, possivelmente por apresentar
melhor adequação nas infecções mistas. Isto é significativo, uma vez que infecções mistas são
muito freqüentes em campos após o plantio (FABRE et al., 2010). Desta forma, este estudo
permitiu identificar a distribuição dos vírus PRSV-W, ZYMV, WMV, CMV e ZLCV nas
regiões produtoras de melancia no Estado do Tocantins. Tais informações poderão, por
exemplo, ajudar no estudo do melhoramento genético para a obtenção de cultivares
comerciais de melancia resistentes ou tolerantesas viroses identificadas, a fim de garatir a
produtividade da melancia no Estado do Tocantins.
5.
CONCLUSÃO
O vírus PRSV-W foi predominante nas regiões produtoras de melancia no Estado do
Tocantins, onde também foram encontrados ZYMV, WMV, CMV e ZLCV.
A ocorrência de infecção mista foi predominante para PRSV-W+WMV e PRSVW+ZLCV, porém infecções do tipo ZYMV+ZLCV e ZLCV+CMV foram menos expressivas
nas amostras analisadas.
63
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p.516-520, 2000.
67
CAPITULO III: Identificação de viroses associadas à cultura da
melancia por meio de RT-PCR do tipo multiplex.
RESUMO
Potyvírus e tospovírus infectam naturalmente melancia, podendo ocorrer em infecções mistas,
dificultando o diagnostico em multiplas infecções. O trabalho teve objetivo de identificar e
diferenciar WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV pelo método de RT-PCR multiplex.
Os oligonucleotídeos confeccionados para detectar e diferenciar os vírus WMV-2, PRSV-W,
ZYMV, CMV e ZLCV foram obtidos a partir das regiões conservadas dos genomas dos vírus,
permitindo assim a amplificação das regiões conservadas em reação de RT-PCR, a partir dos
cDNA obtidos. Os produtos amplificados foram de 644 pb (CMV), 535 pb (WMV-2), 398 pb
(PRSV-W), 244 pb (ZLCV) e 214pb (ZYMV). Nas reações do tipo duplex as combinações
dos oligonucleotideos foi possível diferenciar os vírus WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e
ZLCV. Em todas as reações os oligonucleotidicos utilizados não apresentaram amplificações
inespecíficas.
Para reações tipo triplex obteve-se somente a amplificação de 535 pb
correspondente ao vírus WMV-2, isto pode estar relacionado com a otimização da reação de
PCR, a competição e/ou sobreposição entre os oligonucleotídeos na detecção dos vírus em
estudos. As detecções múltiplas de vírus desenvolvidas neste trabalho podem reduzir o custo e
trabalho na detecção e diferenciação dos vírus. Os oligonucleotídeos desenvolvidos permitem
a rápida detecção e diferenciação isolada de PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV e ZLCV
presentes nos cultivos de melancia no estado do Tocantins.
Palavra chave: Melancia, RT-PCR, potyvírus, tospovírus.
68
Identification of Viruses Associated with the Watermelon crops by
multiplex RT-PCR.
ABSTRACT
Watermelon infecting naturally potyvirus and tospovirus can occur in mixed infections,
difficulting the diagnosis of multiple infections. Thus, this study was to identify and
differentiate WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV and ZLCV by multiplex RT-PCR. The
oligonucleotides prepared to detect and differentiate viruses WMV-2, PRSV-W, ZYMV,
CMV and ZLCV were obtained from the conserved regions of the genomes of viruses,
allowing the amplification of conserved regions in RT-PCR reaction from the cDNA
obtained. The amplified products were 644 bp (CMV), 535 bp (WMV-2), 398 bp (PRSV-W),
244 bp (ZLCV) and 214pb (ZYMV). In the reactions of the type combinations of the duplex
oligonucleotides was possible to differentiate viruses WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV and
ZLCV. In all reactions the oligonucleotides used did not show nonspecific amplifications. For
triplex type reactions were obtained only the amplification of 535 bp corresponding to WMV2 virus, this may be related to the optimization of the PCR reaction, competition and / or
overlap between the oligonucleotides in the detection of viruses in studies. The multiple
detections of viruses developed in this work can reduce the cost and work in the detection and
differentiation of viruses. The oligonucleotides designed to allow rapid detection and
differentiation isolated from PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV and ZLCV presnet in
watermelon crops in the state of Tocantins.
Keywords: Watermelon, RT-PCR, Potyvirus, Tospovirus.
69
1. INTRODUÇÃO
As viroses são consideradas umas das principais causas de perdas na cultura da
melancia, podendo reduzir substancialmente a produtividade, tanto quantitativa como
qualitativamente. Os vírus da família potyvírus e tospovírus possuem RNA simples, com
genoma de aproximadamente de 10 kb (VAN POELWIDJK, 1993; LUCINDA, 2010). O
RNA dos potyvírus produzem uma proteína codificada pelo próprio vírus conhecida como
VPg (Viral protein Genome-linked), ligada covalentemente à extremidade 5‟ e uma cauda
poli-A ligada a extremidade 3‟ do RNA que está envolvida na proteção do RNA contra
exonucleases da célula hospedeira (BERGER et al., 2005). O genoma destes vírus são
envolvidos por capsídeos, de formato alongado e flexuoso, constituído por aproximadamente
2.200 cópias de uma proteína capsidial com massa molecular em torno de 34 kDa (SHUKLA
et al., 1991).
Estes vírus apresentam ampla distribuição mundial, cosntituindo problemas sérios para
a produção de curcubitáceas em diversos sistemas de cultivos. As infecções podem ocorrer de
forma simples ou mistas (PAPPU, JONES & JAIN, 2009; LUCINDA, 2010). Como forma de
controle, o uso de variedades resistentes é o método mais eficiente, mesmo com o uso
rotineiro de medidas preventivas de controle, a ocorrências de surtos viróticos sempre é uma
problemáticas nas lavouras de melancia (DIVER, KUEPPER & BORN, 1999; BETTIOL et
al., 2004). A sintomatologia das infecções virais são muito parecidas e de difícil diagnóstico,
além disso, infecções mistas apresentam sintomas diferenciados, aliando outros problemas na
identificação dos vírus presentes em infecções naturais (WILSON, 2001).
Os vírus que infectam cucurbitáceas são de difícil diagnóstico, principalmente
potyvírus como Watermelon mosaic virus (WMV), Papaya ringspot virus – strain
Watermelon (PRSV-W), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), Cucumber mosaic virus
(CMV) e o tospovírus Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV), todos produzindo sintomas de
mosaico nas folhas quando encontrados em infecções simples. Estes vírus são geralmente
diferenciados por testes sorológicos do tipo ELISA “enzyme-linked immunosorbent assay”,
embora os anticorpos sejam dirigidos contra a região central conservada do CP, eles podem
apresentar reações cruzadas (SHUKLA et al., 1989).
Procedimentos que permitem a detecção simultânea e/ou identificação de diferentes
vírus são desejáveis para o diagnóstico de rotina na identificação dos vírus de cucurbitáceas,
pois requerem menos tempo, trabalho e custos. Vários sistemas multiplex foram
70
desenvolvidos para a detecção de múltiplos vírus (POZO & TENORIO, 1999; NIE & SINGH,
2000; VARGA & JAMES, 2005; ROY et al., 2005; HASSAN, MYRTA & POLAK, 2006;
RIGOTTI & GUGERLI, 2007; ELIZAQUÍVEL & AZNAR, 2008; WEI T. et al., 2009; XIE
Y. et al., 2009; SHUM & PAUL, 2009; JAROSOVA & KUNDU, 2010; WINTERMANTEL
& HLADKY, 2010; BAI, SHI & NAGARAJA, 2010; KUWABARA et al., 2010; SENAPIN
et al., 2010). O diagnóstico baseado em transcriptitase reversa de reação em cadeia polimerase
(RT-PCR), tem permitido a vantagem de analisar a variação genética nos genomas dos vírus
(WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV), essas características são alvo de diferenciação e
identificação dos vírus mesmo em infecções cruzadas. Conforme resultados descritos na
literatura, a identificação de vírus utilizando RT-PCR com primers específicos tem sido
amplamente utilizada para detectar vírus associados a diferentes culturas de importância
enconomica no mundo (NIE & SINGH, 2000; BOONHAM et al., 2002; VARGA & JAMES,
2005; HASSAN, MYRTA & POLAK, 2006; AGINDOTAN, SHIEL & BERGER, 2007;
RIGOTTI & GUGERLI, 2007; ELIZAQUÍVEL & AZNAR, 2008; XIE Y. et al., 2009;
JAROSOVA & KUNDU, 2010; WINTERMANTEL & HLADKY, 2010; KUWABARA et
al., 2010).
O trabalho tem o objetivo efetuar a identificação simples e múltipla pelo método de
RT-PCR des fitoviroses associadas à cultura da melancia no Estado do Tocantins.
2. MATERIAL e MÉTODOS
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Manejo Integrado de Pragas do
Campus Universitário de Gurupi – Universidade Federal do Tocantins (UFT), de Janeiro de
2009 a Janeiro de 2011.
2.1. Vírus
Os vírus Papaya ringspot virus – strain Watermelon (PRSV-W), Zucchini yellow
mosaic virus (ZYMV), Watermelon mosaic virus (WMV), Cucumber mosaic virus (CMV),
Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) foram obtidos juntamente a Embrapa CNPH e
Universidade de Brasília (UnB), cedidos gentilmente pela Dra Mirtes Lima e Dr. Tatsuya
Nagata. Todos os vírus foram mantidos em casa de vegetação em Cucurbita pepo, Nicotina
benthamiana e Datura stramonion por inoculação mecânica, com adição do tampão de fosfato
71
potássio (K2HPO4) 0,01 M, pH 7,0 e 0,1 % de sulfito de sódio (Na2SO3), por fricção
suspensão viral sobre as folhas cotiledonares, previamente polvilhadas com pó abrasivo
Carbureto de silício (carborundum), 400 mesh. Para cada espécie de vírus foram realizadas
duas inoculações, sendo a segunda realizada três dias após a primeira.
2.2. Extração de RNA total
A extração do RNA total de folhas das plantas de melancia com sintomas dos vírus
PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV e ZLCV foi realizada utilizando-se o produto Plant RNA
Purification Reagent (Invitrogen life technologies, USA), de acordo com o protocolo do
fabricante. Foram macerados 100 mg de tecido em nitrogênio líquido e transferidos para tubos
de microcentrífuga, juntamente com 500 μL do reagente gelado (4° C) e homogeneizados em
vórtex. Em seguida, os tubos foram deixados à temperatura ambiente por cinco minutos. Após
esse período, o material foi submetido à centrifugação por dois minutos, à temperatura
ambiente, com velocidade de 12.000 RPM, e o sobrenadante foi transferido para um novo
tubo. Na seqüência foram adicionados 300 μL de clorofórmio e os tubos foram submetidos à
inversão por 5 minutos. Para separar as fases, as amostras foram submetidas à centrifugação
de 12.000 RPM, durante dez minutos, à temperatura de 4° C, e a fase aquosa superior foi
transferida para um novo tubo. Em seguida, foi adicionado um volume equivalente à fase
aquosa de isopropanol gelado e homogeinizados em vórtex, durante cinco segundos. As
amostras foram mantidas à temperatura ambiente por dez minutos e posteriormente submetida
à centrifugação por dez minutos a 4° C e 12.000 RPM. O sobrenadante foi descartado, e o
pellet foi lavado com 1 mL de etanol 75% gelado e os tubos foram submetidos à
centrifugação por 1 minuto à temperatura ambiente (12.000 RPM). O líquido residual foi
pipetado e o RNA foi ressuspendido em 20 μL de água Milli-Q autoclavada. As amostras
foram armazenadas a -20° C e utilizadas na confecção do cDNA.
2.3. Confecção do cDNA
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir do RNA total extraído das
folhas das plantas infectadas com os vírus em estudos, nos procedimentos descritos no item
anterior. Na confecção do cDNA foi realizada os seguintes procedimentos, inicialmente 3µl
de suspensão de RNA total, diluído em água “Milli-Q” previamente tratada com 0,1% de
dietil pirocarbonato (DEPC), foram misturados com 1µl do oligonucleotídeo randômico
72
(NNNNNNN) (20mM). Posteriormente, foram adicionados 1µl de dNTP‟s (10mM) e 12µl de
água “Milli-Q” tratada com DEPC. Essa solução foi aquecida a 65ºC por 5 minutos e mantida
imersa em gelo por 3 minutos. Em seguida foram adicionados 5µl do tampão 5X de enzima
transcriptase reversa, 2µl de ditiotreitol (DTT) 0,1M e 200 unidades da enzima M-MLV
(Invitrogem), e incubada a 37ºC por 50 minutos, após foi inativada a enzimas a 70ºC por 15
minutos e mantida a 4 oC. O cDNA sintetizado foi utilizado em uma reação de PCR,
separadamente para cada fragmento do genoma a ser amplificado.
2.4. Reação de RT-PCR do tipo monoplex
A partir da confecção do cDNA foram realizadas reações de PCR, utilizando os
oligonucletídeos desenvolvidos para detecção dos vírus (PRSV-W, WMV-2, ZYMV, CMV e
ZLCV). Além do cDNA, foram utilizados 0.4 µM de cada oligonucleotídeos específicos para
cada vírus (Tabela 1), 10 µM de cada dNTP, 2,5 μL de tampão de Taq DNA polimerase,
2mM MgCl2 e 1U de Taq polimerase (Invitrogen) em um volume total de 25 μL.
A
amplificação dos fragmentos para a detecção dos vírus foi realizada de acordo com os
seguintes passos: 94 oC/5 min em seguida por 35 ciclos em 95 oC/30 s, 52 oC/1,30 s, 72 oC/4
min e a extensão final de 72oC/8 min. Os oligonucleotídeos PRSV-W, WMV-2, ZYMV,
CMV e ZLCV anelam-se na região 5' do genoma de cada vírus (figura 1).
2.5. Otimização para reação de RT-PCR do tipo duplex e triplex
Algumas modificações foram realizadas a fim de aperfeiçoar a amplificação para a
reação de RT-PCR de dois e três vírus simultâneos. A quantidade de cDNA foi alterada para
0,8µl, foram utilizados 0,5 µM de cada oligonucleotídeos específicos para cada vírus, 2,0µl na
concentração de 2,5 µM de cada dNTP, 1,0µl na concentração de 50mM de MgCl2, em um
volume total de 25 μL.
2.6. Análise do RT- PCR em gel de agarose
Foram retirados 5µl da reação de RT-PCR ou PCR para análise em gel de agarose a
1% em tampão TBE (0,1 M de ácido bórico, 0,02 mM EDTA pH 8,3). Utilizou-se o marcador
1kb Ladder da Invitrogen. O gel foi corado em uma solução de Brometo de Etídio (0,1 μL/
mL) a eletroforese a 80V., e assim, visualizado em transiluminador de luz UV( Molecular
Imange LPIX-Locus Biotecnologia®).
73
2.7. Análise das seqüências e oligonucleotídeos
Foram obtidas seqüencias correspondente aos genomas dos vírus PRSV-W, WMV,
ZYMV, CMV e ZLCV depositadas no GenBank e mantindas pelo National Center for
Biotechnology Information (NCBI), para confecções dos oligonucleotídeos específicos para
cada um dos vírus (Tabela 2). As seqüências foram alinhadas utilizando as facilidades do
programa de alinhamento multiplo de seqüencias CLUSTAL W (HIGGINS & SHARP, 1988
e 1989). A partir do alinhamento verificou-se as regiões conservadas em cada genoma dos
vírus em estudo. A partir destas observações foi possível determinar as regiões dos genomas a
ser amplificadas pelos oligonucleotídeos desenvolvidos para cada um dos vírus (Figura 1). A
partir da determinação das seqüências dos oligonucleotídeos verificou-se a uniformidade da
temperatura de anelamento nas reações de PCR.
3. RESULTADOS
As seqüências utilizadas na confecção dos oligonucleotídeos foram obtidas a partir das
regiões conservadas daz seqüências de WMV, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV, depositadas
GenBank, e posteriormente foram confeccionados as seqüências dos oligonucleotídeos
específicos para os vírus em estudos (Tabela 1). Além disso, verificaram-se as regiões
conservadas do genoma que melhor permitia a diferenciação entre os vírus, de acordo com os
fragmentos a serem amplificados em reações de RT-PCR. As regiões dos genomas mais
conservadas para desenvolver os oligonucleotideos dos vírus PRSV-W, ZYMV e WMV
corresponde a região da capa protéica (Figura 1).
74
Tabela 1. Listas de acessos das seqüências utilizadas na confecção dos oligonucletotídeos
utilizados nas reações de RT-PCR para identificação de WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e
ZLCV.
Vírus
WMV
Referência das seqüências
Número de
acessos
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2004.
NC006262
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2004.
AY437609
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660588
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660584
Ali, A.; Natsuaki, T. & Okuda, S., 2006.
AB218280
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660579
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660590
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660578
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660589
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660582
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660587
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660580
Wu, Y. F. et al., (submetido em 2006).
DQ399708
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660586
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660583
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660581
Desbiez, C. & Lecoq, H., 2008.
EU660585
Choi, S. et al., 2007.
AB369278
Liao, Y. C. et al., (submetido em 2005).
DQ340771
Sohn, S. et al., 2007.
AB369277
Liao, Y. C. et al., (submetido em 2005).
DQ340770
Liao, Y. C. et al., (submetido em 2005).
DQ340769
Liu, F. L. et al., (submetido em 2001) e Wang, J. J. & Yeh, S.
D (Submetido em 2002).
AY027810
X97251
Wang, J. J. & Yeh, S. D, 1997.
Chen, K. C. et al., (submetido em 2008).
75
EU882728
PRSV-W
Charoensilp, G. et al., (submetido em 2002).
AY162218
Lu, Y. W. et al., 2008.
EF183499
Attasart, P. et al., 2002.
AY010722
Wang, J. J.; Bau, H. & Yeh, S., 1994.
NC_001785
Wang, J. J.; Bau, H. & Yeh, S., 1994.
X67673
Guan, P. et al., (submetido em 2007).
EU126128
Noa-Carrazana, J. C.; Gonzalez-de-Leon, D. & Silva-Rosales,
L., 2007.
Inoue-Nagata, A. K. et al., 2007.
DQ374153
Inoue-Nagata, A. K. et al., 2007.
DQ374152
Mangrauthia, S. K.; Parameswari, B.; Jain, R. K. & Praveen,
S., 2008.
Parameswari, B.; Mangrauthia, S. K.; Praveen, S. & Jain, R.
K., 2007.
EU475877
EF017707
Lopez, C.; Aramburu, J.; Galipienso, L. & Nuez, F., 2007.
AM183116
Roossinck, M. J.; Zhang, L. & Hellwald, K. H., 1999.
AF127977
Owen, J. et al., 1990.
NC001440
Owen, J. et al., 1990.
D10538.
Owen, J. et al., 1990.
D10539
Sulistyowati, E. et al., (submetido em 2003).
Hayakawa, T.; Mizukami, M.; Nakajima, M. & Suzuki, M.,
1989.
CMV
AY231130
AJ585522
D00385
AF103991
Saitoh, H. et al., 1997.
Mahinghara, B. K.; Hallan, V. & Zaidi, A. A. (submetido em
2004).
AJ831578
Takanami, Y. et al., (submetido em 1997).
AB006813
Chen, Y. K.; Goldbach, R. & Prins, M., 2002.
AJ304399
Kwon, S. W.; Kim, M. S.; Choi, H. S. & Kim, K. H., 2005.
AY279000
Kwon, S. W.; Kim, M. S.; Choi, H. S. & Kim, K. H., 2005.
AY278999
Choi, S. et al., 2007.
AB369279
Kwon, S. W.; Kim, M. S.; Choi, H. S. & Kim, K. H., 2005.
AY278998
Gal-On, A. et al., 1990.
EF062583
76
ZYMV
Gal-On, A. et al., 1990.
EF062582
Desbiez, C. et al., 2003.
AY188994
Glasa, M. & Pittnerova, S., 2006.
DQ124239
Wang, W. Q. et al., 2006.
AB188116
Wang, W. Q. et al., 2006.
AB188115
Lin, S. S.; Hou, R. F. & Yeh, S. D., 2001.
AF127929
Lin, S. S.; Hou, R. F. & Yeh, S. D., 2001.
NC003224
Lee, K. C. & Wong, S. M. (submetido em 2001).
AF014811
Bezerra, I. C. et al. (submetido em 1998).
AF067069
Haan, P. de; Wagemakers, L.; Peters, D. & Goldbach, R., 1989
ZLCV
e 1990.
D00645
Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados nas reações de RT-PCR para detecção do
tospovirus (ZLCV) e dos potyvirus (WMV, ZYMV, CMV, PRSV-W).
Primer
Forward (Senso)
Reverse (Anti-senso)
Tamanho
esperado (Pb)
Temperatura de
anelamento (ºC)
PRSV
5'TGGGTTATGATGGATGGGGA3'
5'ATACCCAGGAGAGAGTGCAT3'
398
55,5 - 55,1
ZYMV
5'CATACATGCCGAGGTATGGTTT3'
5'GTGTGCCGTTCAGTGTCTT3'
214
55,0 - 55,6
WMV
5'TTRTTGTTGAATGCTGTCCT3'
5'GCTGCACAAATTGCCTCAG3'
535
52,6 - 55,1
CMV
5'ACTNTTAACCACCCAACCTT3'
5'TTAGCCGTAAGCTGGATGGA3'
644
53,6 - 55,8
ZLCV
5'GAGTTTCACTGTAATGTTCCATAGC3
'
5'AGYTTTGAGATGATCAGTGTTGT3'
244
53,9 - 52,5
*Nucleotídeos em posições degeneradas são representados por uma única letra do código. R =
A e G, Y= C e T; B = C, G e T, D = A, G e T, N = G, A, C e T.
Os oligonucleotídeos desenvolvidos para a diferenciação rápida de WMV, PRSV-W,
ZYMV, CMV e ZLCV, foram desenhados com iniciadores degenerados e universais. E
embora a seqüência dos oligonucleotídeos tenha tamanhos variados para cada vírus
analisados, que permite analisar a detecção e diferenciação dos vírus (Tabela 2 e Figura 1 e
2). A análise dos oligonucleotídeos foi necessária para eliminar e/ou minimizar as
amplificações não-específicas que podem ocorrer em amplificações com duplos e triplos
cDNA‟s. Conforme os resultados obtidos, todos os oligonucletídeos apresentaram
amplificação de fragmentos específicos para o vírus que foram desenvolvidos.
77
Figura 1. Representação esquemática da organização genômica de um Potyvirus,
mostrando suas proteínas. Os números abaixo do genoma indicam o início de cada região,
adaptado de Lucinda et al., 2010.
Figura 2. Posição e direção dos oligonucleotídicos usados para identificação e detecção de
PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV e ZLCV por RT-PCR e tamanho esperado dos fragmentos
amplificados (bp) correspondentes a região do genoma a ser amplificado.
Os oligonucletídeos desenhados para identificação de PRSV-W foi confirmado, com o
produto específico amplificado de aproximadamente 398 pb (Figura 3), idêntico ao previsto
durante o desenvolvimento do primer. Além do mais, diferiu dos demais produtos
amplificados de WMV, ZYMV, CMV e ZLVC, confirmando a alta especificidade para
78
PRSV-W. Enquanto os primers desenhados para CMV e WMV apresentaram amplificações
de produtos idênticos a região do genoma analisados com 644 e 535pb, respectivamente,
sendo específicos para detecção e diferenciação dos vírus correspondentes (Figura 3).
Figura 3. Reação de RT-PCR com oligonucleotídeos desenvolvidos para detecção e
diferenciação dos vírus PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV. A figura de gel de agarose
a 0,8% mostra: M. Marcador molecular de 1Kb Ladder; 1.CMV; 2.WMV; 3.PRSV-W;
4.ZLCV; 5.ZYMV.
Os oligonucleotídeos desenvolvidos para identificação de ZYMV e ZLCV
apresentaram os fragmentos esperados (Figura 3). No entanto, não permitiu diferenciar os
produtos amplificados em gel de agarose 0,8%. Neste caso, os oligonucleotídeos
desenvolvidos apresentaram especificidade para os vírus
ZYMV e ZLCV, mas não
permitiram uma diferenciação dos produtos amplificados na reação de RT-PCR (214 e 244
pb), Não possibilitando a detecção e diferenciação entre os vírus quando visualisados juntos
(Figura 4, nº 4 e 5). Desta forma, observa-se que os oligonucleotídeos desenvolvidos para
CMV, WMV e PRSV-W foram melhores na detecção e diferenciação dos vírus em gel de
agarose 0,8% (Figura 4, nº 1, 2 e 3).
79
Na reação de RT-PCR utilizando combinações duplas (duplex) de oligonucleotídeos
para detecção e diferenciação dos vírus em estudos, houve aplicação dos fragmentos
esperados para todas as combinações utilizadas (Figura 4). PRSV-W e WMV-2 apresentaram
a aplificação dos fragmentos de tamanho esperado, ficando bem distinto a detecção e a
diferenciação dos vírus. O mesmo foi observado para a combinação dos oligonucleotídeos de
WMV + ZYMV, PRSV-W + WMV, ZLCV + WMV, CMV + PRSV-W, CMV + ZYMV e
PRSV-W com ZLCV, sendo possível a identificação e diferenciação. Os oligonucleotídeos
desenhados para detecção de ZYMV e ZLCV não permitiram uma diferenciação dos produtos
amplificados em reação de duplex, devido a proximidade do número de pares de bases dos
mesmos (Figura 4, nº 1, 3, 4 e 6 ).
Figura 4. Reação de RT-PCR com oligonucleotídeos desenvolvidos para detecção e
diferenciação dos vírus PRSV-W, ZYMV, WMV-2, CMV e ZLCV em reação duplex e
triplex. A figura mostra um gel de agarose a 0,8%, onde: M. Marcador molecular de 1Kb
Ladder; 1. WMV + ZLCV; 2. WMV + PRSV-W; 3.WMV + ZYMV; 4.PRSV-W + ZYMV;
5.CMV + PRSV-W; 6.PRSV-W + ZLCV; 7.WMV + ZYMV + PRSV-W; 8. WMV + CMV +
ZLCV e 9. WMV- + CMV + PRSV-W.
80
Nas reações realizadas de Triplex, ou seja, na combinação de três pares de
oligonucleotídeos em reação direta de RT-PCR houve aplificação somente do WMV-2
(Figura 4, nº 7, 8 e 9). Neste caso, verifica-se a necessidade de realizar uma melhor
otimização da reação de RT-PCR para triplex. O fato da amplificação dos oligonucletídeos
relacionados a WMV-2 podem estar associadas a competição e sobreposição entre os
oligonucleotídeos, diminuindo assim a possibilidade de amplificação dos fragmentos
esperados para detecção dos vírus em estudos.
4. DISCUSSÃO
A cultura da melancia é acometida por um complexo viral que influência diretamente
sua produtividade. Vários destes patogenos possui seus genomas completo ou parcialmente
seqüênciados e estão disponíveis no GenBank. Os vírus WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e
ZLCV são comumente encontrados infectando cucurbitáceas em diferentes áreas de cultivos
(YUKI et al., 2000; STANGARLIN, DIAS & REZENDE, 2000; STANGARLIN et al., 2001;
MOURA et al., 2001). A ocorrência simultânea dessas viroses dificulta a identificação por
meio da sintomatologia, principalmente em infecções multiplas de ocorrência natural
(FABRE et al., 2005).
O desenvolvimento de um oligonucleotídeos para a detecção e diferenciação eficaz de
WMV-2, PRSV-W, ZYMV, CMV e ZLCV, torna-se viável devido a ocorrência natural destes
vírus em infecções multiplas. A amplificação específica de vírus alvo é dependente dos
oligonucleotídeos desenvolvidos para as regiões do genoma analisadas (PAYAN et al., 2007).
As seqüências genômicas são diversas, portanto, oligonucleotídeos devem ser projetados para
reconhecer as regiões conservadas de cada vírus durante as reações do tipo duplex, triplex e
multiplex, permitindo assim, a detecção simultânea dos vírus (AUSUBEL, 1995; FAYADANDRÉ, 2010). Os oligonucleotídeos utilizados neste estudo têm o potencial de detectar e
diferenciar todos os vírus alvos que atacam a cultura da melancia no estado do Tocantins.
Os resultados revelaram que os oligonucleotídeos utilizados foram capazes de detectar
e diferenciar os vírus pelos produtos amplificados durante o RT-PCR tipo duplex. Para os
vírus ZYMV e ZLCV não foi possível uma identificação visual, devido ao tamanho dos
fragmentos serem muito proximos uns dos outros (214 e 244pb), respectivamente. Isso pode
ter ocorrido devido a escolha das regiões conservadas dos genomas apresentarem
81
aproximadamente o mesmo tamanho. Os fragmentos de PRSV-W, ZYMV, CMV, WMV-2 e
ZLCV poderiam ser melhor amplificados, otimizando-se as concentrações do primers.
Nas reações de RT-PCR do tipo Triplex, houve somente a amplificação de WMV-2. A
interação entre o par de iniciadores WMV-2 e outros pares de oligonucleotídeos
correspondentes para os demais vírus não apresentaram amplificação dos fragmentos
esperados. A falta de amplificação dos fragmentos de DNA esperados para os vírus na reação
de Triplex pode esta associado a falta de otimização das reações de RT-PCR do tipo Triplex.
A concentração de oligonucleotídeos, dNTP‟s, Clorteto de magnésio, entre outros produtos na
reação de RT-PCR podem influenciar na reação e nos produtos a ser amplificados, logo,
existe a necessidade de uma otimização usando concentrações mais oportunas dos resgentes
citados acima para uma melhor amplificação dos oligonucleotídeos (KARSAI et al., 2002;
AREZI et al., 2003).
Inúmeras otimizações já foram realizadas pela variação metódica de cada parâmetro de
teste em condições normais de RT-PCR do tipo Multiplex sendo descritas por Henegariu et al.
(1997), Lekanne Deprez et al. (2002) e Arezi et al. (2003). Estas condições incluíram vários
“hot-start” de enzimas como DNA polimerase, Taq DNA polimerase Platinum® (alta
fidelidade), DNA polimerase Platinum da Invitrogen, e DNA polimerase iTaqTM da BioRad
(Mississauga, Ontario).
Também foram avaliados por Karsai et al. (2002) tampões como PCR Karsai, Tampão
de PCR 10X de alta fidelidade da Invitrogen, Tampão de amplificação 10X da Invitrogen, e
Tampão de PCR 10X iTaqTM da BioRad. Concentrações de oligonucleotídeos em ambos os
passos de RT; concentração de cDNA na reação de PCR (diluições de 1:3, 1:4, 1:5 e 1:6 em
H2O estéril duplamente destilada); MgCl2 contra MgSO4; e duas etapas de PCR (desnaturação
a 95 ºC por 15s à 3 min, com extensão a 55-60 ºC durante 10-60 s) versus três etapas PCR
(desnaturação a 95 ºC por 15s à 3 min, anelamento a 55-60 ºC durante 20-30s, e extensão a 72
ºC durante 20-30s). Onde os melhores resultados foram obtidos a uma temperatura de
anelamento de 55 ºC com 35 ciclos.
Estudos mostraram que em reações de PCR do tipo multiplex, as concentrações de
dNTP‟s e magnésio podem ser aceitáveis quando nenhum componente é excessivamente
concentrado. Além disso, baixas concentrações de dNTP (50 M) pode reduzir o rendimento
dos produtos amplificados, enquanto altas concentrações pode inibir a amplificação,
possivelmente devido a o seqüestro de íons de magnésio (HENEGARIU et al., 1997),
impedindo que ele seja utilizado pela Taq polimerase (INNIS & GELFAND, 1990).
82
Geralmente é conveniente aumentar MgCl2 em uma reação como os níveis de dNTP‟s
são aumentadas para evitar seqüestro de íons Mg2+. No entanto, aumentar as concentrações de
MgCl2 tende a diminui a especificidade de uma reação. Conseqüentemente, as concentrações
de MgCl2 equilibradas, podem influenciar na concentração padrão de dNTP‟s e do tampão da
Taq polymerase. Para facilidade de operação, reações de multiplex que contém 200mM de
dNTP‟s e 1,5 µM MgCl2, foram eficazes na amplificação dos produtos desejados e sem
amplificação de seqüências não-alvos (WINTERMANTEL & HLADKY, 2010).
Diversos estudos de multiplex foram desenvolvidos para identificação e diferenciação
simultânea de fitoviroses em citrus Badnavirus [Citrus yellow mosaic virus (CYMV)],
Capillovirus [Citrus tatter leaf virus (CTLV)], Closterovirus [Citrus tristeza virus (CTV)],
Ilarvirus [Citrus leaf rugose virus (CLRV), Citrus variegation virus (CVV)], Mandarivirus
[Indian citrus ringspot virus (ICRSV)] e Ophiovirus [Citrus psorosis virus (CPsV)].
(MINAFRA & HADIDI, 1994; NEMICHOV et al., 1995; SINGH et al., 1996; JACOBI et al.,
1998; GRIECO & GALLITELLI, 1999; RUSSO et al., 1999; JAMES, 1999; SAADE et al.,
2000; SHARMAN et al., 2000; BERTOLINI et al., 2001; ITO, IEKI & OZAKI, 2002;
MENZEL et al., 2002; RAGOZZINO, FAGGIOLI & BARBA, 2004; ROY et al., 2005).
Diferentes reações de Multiplex RT-PCR foram desenvolvidos
para identificar
potyvírus como para PYV (Potato virus Y ) em batata e Sugarcane mosaic virus (SCMV),
Sorghum mosaic virus (SrMV) e Sugarcane streak mosaic virus (SCSMV) em cana de açucar
(RIGOTTI & GUGERLI, 2007, SEIFERS et al., 2000; SCHENCK, 2001; XU et al., 2005;
CHATENET et al., 2005; GEMECHU et al., 2006; AHMAD et al., 2006; VISWANATHAN
et al., 2008). Além de potyvírus as reações de multiplex foram eficientes na diferenciação de
tospovirus
como descrito por Tsuda et al. (1994), Kawano et al. (1999) e Matsuura et al.
(2002) para Tomato spotted wilt virus (TSWV), Watermelon silver mottle virus (WSMoV) em
melancia e espinafre da New Zealand (IWAKI et al., 1984; TABA et al., 2000); Melon yellow
spot virus (MYSV) em melão e abobora (MUMFORD, BARKER & WOOD, 1996; KATO,
HANADA &KAMEYA-IWAKI, 1999; TAKEUCHI et al., 2001; CHU et al., 2001; NICHOL
et al., 2005).
A detecção de vírus por técnicas rápidas e confiáveis ainda é uma das tarefas mais
exigentes em virologia vegetal. O panorama atual da cultura da melancia no Brasil e no
mundo revela a necessidade de medidas preventivas de controle. O desenvolvimento de uma
metodologia de indexação eficiente, sensível e rápida, permitiria a pronta identificação de
plantas infectadas com estirpes virais já existentes no território nacional. Conseqüentemente,
83
tal medida diminuiria a possibilidade de perdas na produtividade da cultura da melancia em
função de infecção viral simples ou mistas.
5. CONCLUSÃO
Os oligonucleotídeos desenvolvidos neste trabalho permitem a rápida detecção e
diferenciação isolada de PRSV-W, WMV, ZYMV, CMV e ZLCV presentes nos cultivos de
melancia no estado do Tocantins.
A especificidade dos oligonucleotídeos permite desenvolver estudos epidemiológicos,
de distribuições espacial e temporal dos vírus em estudo.
84
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