Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise
Discentes: Lilian Campos Pires
Marina Curado Valsechi
Células e tecidos
Sistema Imune:
Reações antígenoanticorpo
Reações químicas
Histologia
Química
Imunologia
Imunohisto
química
Conjugação de distintos marcadores, com moléculas de
imunoglobulina, que com auxílio de um substrato específico localiza
o antígeno tecidual
Conjunto de métodos de detecção
de antígenos em corte histológico
Processo de fixação
Detecção de estruturas bioquímicas;
Localização de antígenos em células utilizando anticorpos específicos;
Produto da reação é visível ao microscópio;
Antígeno: qualquer substância que sob condições
apropriadas é capaz de estimular a formação de anticorpos.
Anticorpo: proteína que é formada em resposta à
exposição de um antígeno e reage especificamente com
esse formando imunocomplexos.
Epítopo
Determinante antigênico,
o sítio exato de ligação
do anticorpo na molécula
do antígeno
Sítio de Ligação ao antígeno
Monoclonal
Único clone de célula
produtora de anticorpos
Possuem sítios de ligação
ao antígeno idênticos
Policlonal
Múltiplos clones de célula
produtora de anticorpos
Possuem diversas
especificidade antigênicas
Mecanismo Básico
Reconhecimento do antígeno pelo anticorpo
Substâncias são utilizadas para “tingirem” essa ligação
Métodos utilizados para marcar anticorpos:
Conjugação com composto fluorescente;
Conjugação com uma substância que não se deixa
atravessar pela luz e que dispensa elétrons (ouro ou prata);
Conjugação com uma enzima;
Peroxidase
Px + H2O2
Px. H2O2 + doador de elétrons
(cromogênico)
Molécula colorida + Px + H2O
Cromógeno, mas o mais utilizado é o diaminobenzidina (DAB):
Específico para Peroxidase;
Origina um precipitado marrom, visível ao microscópio óptico;
Carcinoma ductal
Direto
Indireto
Anticorpo primário é
marcado diretamente por
uma enzima
Anticorpo primário serve
como antígeno para o
anticorpo secundário
Anticorpo marcado
Anticorpo
Primário
Anticorpo
secundário
1. Método da Peroxidase-Antiperoxidase
Complexo Peroxidase-antiperoxidase: estáveis e sensíveis
Evitar a perda da peroxidase durante as
lavagens com a solução tampão
Anticorpo secundário
Complexo PAP
Produto final
com DAB é
acastanhado
Sistema PAP contém anticorpos de alta afinidade para peroxidase
Aumento da eficiência
1. Método da Peroxidase-Antiperoxidase
2. Método Avidina-Biotina
Biotina
Conjugada a anticorpo e enzimas
Complexo ABC
Anticorpo
secundários
Biotina
Ligações entre o tecido ligados anticorpos primários
e um complexo avidina-biotina-peroxidase
2. Método Avidina-Biotina
3. Método Streptavidina-Biotina
Anticorpo secudário biotinilado
Streptavidina
conjugada com
peroxidase
Anticorpo
primário
Um anticorpo primário associado com múltiplas moléculas de peroxidase.
Grande razão enzima-anticorpo
Aumento de sensibilidade
3. Método Streptavidina-Biotina
Procedimentos de imunohistoquímica:
Secções de parafina
Esfregaço
Suspensões celulares
1. Coleta e fixação do material
Fixação
Formol
Preservar a morfologia e imunorreatividade;
Características de
um fixador
Prevenir o deslocamento do antígeno
durante as etapas que seguem a fixação;
Não interferir com as reações subseqüentes
na localização do antígeno;
Soluções fixadoras
Aldeídicas
Pontes Covalentes
Formaldeído 4-10%
Paraformaldeído 4%
PLP Periodato-lisinaformaldeído
Glutaraldeído
Alcóolicas
Coagulação de
Proteínas
Carnoy 70% etanol
20%
clorofórmio
10% ac. acético
Metacarn
70%
metanol
20%
clorofórmio 10% ac.
acético glacial
Com adição de
Metais Pesados
Zinco: antígenos de
membrana
Mercúrio-B5:
intracelulares
Ig
2. Corte e Identificação do Material
Cassete
Corte
Identificação
3. Desidratação
Pouco efeito na imunorreatividade da maioria dos antígenos.
1ª : álcool 70%
2ª : álcool 80 %
3ª : álcool 95 %
4ª : álcool absoluto (3X)
4. Clarificação
Xilol (2X)
5. Inclusão
Parafina (2X)
Não se deve ultrapassar a temperatura de 60°C quando da
inclusão em parafina.
6. Corte histológico
Secagem na estufa
60°C por 24h
Desparafinização
Xilol I
Xilol II
Etanol absoluto
Etanol 95%
Etanol 70%
Bloqueio da
peroxidase endógena
Recuperação
Antigênica
Peróxido de hidrogênio
3%
Solução de tripsina
0,1% por 10 minutos à
37ºC em câmara úmida
Lavar as lâminas em
água
corrente
e
destilada e, em seguida,
com
solução
salina
tamponada (PBS) com
pH de 7,4 à 7,6 por 30
minutos
Lavar as laminas em
água
corrente
e
destilada
e,
em
seguida, com solução
salina
tamponada
(PBS)
Bloqueio da Peroxidase Endógena
Pode ocorrer interferências pela ação de enzimas endógenas;
Ligação inespecífica de anticorpos com as proteínas do tecido;
Principais causas de coloração de
fundo sem especificidade e
indesejável em imunohistoquímica.
Necessárias reações para bloqueio destas moléculas.
Recuperação Antigênica
Falhas nesse procedimento podem acarretar na total ausência
de coloração específica.
Solução Tampão (Citrato)
aquecida: 95°-99°C
30-40 min
Lâminas resfriarem
Incubação com anticorpo
Aplicação do Ac. Primário (1h à 37°C)
Aplicação do Ac. Secundário
Biotinilado (30 min à 37°C)
Aplicação do Reagente
Peroxidase (20min à 37°C)
Pinga o cromógeno, DAB, na lâmina
Contra-coloração
Hematoxilina
Álcool 95%
Álcool Absoluto
Xilol
Monta as Lâminas
Receptor de Estrogênio
Marcação nuclear
Oncoproteína c-erbB-2
Marcação de membrana
GFPA
Marcação citoplasmática
E-caderina
É uma proteína que confere aderência às células e é de grande
importância na diferenciação epitelial.
É um potente supressor de invasão nos tumores mamários e a
perda da sua expressão tem relação com um prognóstico ruim
Expressão de E-caderina na
membrana e citoplasma
Expressão de E-caderina em
carcinoma mamário
Marcadores de proliferação celular
Ki-67
PCNA
Presente nas fases G1, S, G2
e mitose;
Proteína
cromatina;
Correlação
metástase;
associada
positiva
Maior síntese na Fase S;
à
Proteína associada ao reparo
de DNA;
com
Célula está em processo
ativo de divisão celular ou em
processo de reparo do DNA;;
Mostra células em replicação;
Quanto maior a proliferação,
mais agressiva é a lesão;
Ki-67
PCNA
Marcadores de proliferação celular
Anticorpos para camada basal mioepitelial em tumor de mama
Actina de musculo liso
Citoqueratinas 5-6
Como considerar positivo e como relatar o resultado???
Ausência ou menos de 10% de imunopositividade na membrana citoplasmática
das células tumorais:
= 0 = Negativo
Imunopositividade fraca em parte da membrana citoplasmática em mais de
10% das células tumorais:
= 1+ = Negativo
Imunopositividade fraca a moderada em toda a membrana citoplasmática em
mais de 10% das células tumorais:
= 2+ = Fracamente positivo
Imunopositividade intensa em toda a membrana citoplasmática em mais de
10% das células tumorais:
= 3+ = Fortemente positivo
Oncoproteína c-erbB-2
Receptor para o fator de
crescimento epitelial (EGF-R).
A
B
A. 1+
Negativo
B. 2+
Positivo
C. 3+
Positivo
C
0
+1
Câncer de mama
+2
+3
Imunohistoquímica e Câncer
“O Câncer é, em essência, uma
doença genética”.
Kenneth W. Kinzler e Bert Vogelstein
Imunohistoquímica e Câncer
Carcinógeno
Luz solar
Célula
Normal
Radiação
Derivados de petróleo
Corantes e conservantes
Hormônios
Fumo
Poluição
Lesão ao
DNA
Vírus, etc...
X
Reparo e apoptose
ineficientes
Mutações
adicionais
Apoptose
Imunohistoquímica e Câncer
Câncer
Imunohistoquímica e Câncer
Células tumorais
benignas crescem
localmente e não têm
capacidade invasiva
Mutação
inativa
supressor
de tumor
Proliferação
celular
Células tumorais agressivas
invadem tecidos vizinhos, caem
na corrente sanguínea e
colonizam diferentes sítios
Mutação
inativa
genes do
reparo
Proto-oncogene
Oncogene
Mais mutações
Mais instabilidade
genética
Metástases
Imunohistoquímica e Câncer
Aplicações em câncer
 Diagnóstico de tumores indiferenciados;
 Diagnóstico diferencial entre tumores e estados
reacionais a inflamações;
 Determinação de fatores preditivos de neoplasias;
 Determinação de fatores prognósticos de neoplasias;
 Determinação de sítio primário de metástases;
 Determinação de subtipos de leucemias e linfomas.
Imunohistoquímica e Câncer
Imunohistoquímica no diagnóstico de câncer de pulmão
Câncer de
pulmão
Carcinoma
neuroendócrino
Baixo grau
Cromogranina no
citoplasma
Carcinoma de
células
escamosas
Carcinoma de
grandes células
adenocarcinoma
Alto grau
 CK5 CK6 de alto peso
 Negativos para
Sinaptofisina no
citoplasma
molecular 34βE12
p65
 CK5 CK6
 Positivos
 Citoqueratinas de
CK5 CK6
baixo peso molecular
CK7
35βH11
SP-A
Imunohistoquímica e Câncer
Imunohistoquímica no prognóstico de câncer de pulmão
p53
Adenocarcinoma
c-erbB-1
VEGF
Carcinoma de células escamosas
Expressão relacionada com
pior prognóstico
Carcinoma não-pequenas células
C-erbB-2 Adenocarcinoma
Expressão relacionada com
prognóstico favorável
Imunohistoquímica e Câncer
Adenocarcinoma –
citoqueratinas de alto e baixo
peso molecular
Adenocarcinoma –
citoqueratina CK7
Tumor carcinóide
Imunohistoquímica e Câncer
Adenocarcinoma primário
Origem mesenquimal
Imunohistoquímica e Câncer
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DOS MARCADORES PCNA,
Ki67 E P53 EM CARCINOMAS EPIDERMÓIDES DO TRATO
AERODIGESTIVO SUPERIOR
Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões — Vol. 27 – no 5 — 327
Parâmetros usados para classificar este tipo de tumor
são muito subjetivos e os tumores apresentam
comportamento muito heterogêneo
Necessidade de se
encontrar novos
procedimentos capazes de
melhor classificar este tipo
tumoral
IHQ para os genes
PCNA, Ki67 e P53
Imunohistoquímica e Câncer
OBJETIVO
Correlacionar a expressão
IHQ dos marcadores de proliferação
PCNA e Ki67 e de supressão tumoral P53, com parâmetros
prognósticos clínicos e patológicos em carcinomas
epidermóides
do trato aerodigestivo superior.
Imunohistoquímica e Câncer
MÉTODO
Controles positivos
Controles negativos
Lâminas sem anticorpo
Carcinoma de mama
Ki67 e P53
Adenocarcinoma gástrico
PCNA
Pesquisador único
Periferia do tumor
200 células
núcleos positivos
Grupo como um todo
Correlação de Pearson
Grupo A –laringe e hipofaringe
Grupo B – cavidade oral e orofaringe
Imunohistoquímica e Câncer
RESULTADOS
Ki67
PCNA
Expressão em todos os tumores
Expressão em todos os tumores
5,5% a 95% dos núcleos positivos
10,5% a 98% dos núcleos positivos
46,5% Total
66,5% Total
58,5 % Grupo A
69% Grupo A
35% Grupo B
64% Grupo B
P53
Expressão em 44 tumores (86.27%)
0,5% a 96,5% dos núcleos positivos
36,5% Total
37% Grupo A
35,5% Grupo B
Imunohistoquímica e Câncer
CONCLUSÃO
A determinação imunohistoquímica do Ki67 e
PCNA pode subsidiar as informações prognósticas do TNM
(AJCC) e do grau de malignidade histológico, como eficientes
indicadores de proliferação celular nestes tipos de tumores.
Imunohistoquímica e Câncer
Impacto prognóstico da expressão imuno-histoquímica
do BRCA1 nos carcinomas mamários esporádicos
J Bras Patol Med Lab • v. 41 • n. 3 • p. 197-203 • junho 2005
Imunohistoquímica e Câncer
BRCA1
 Gene supressor tumoral
 Participa da regulação do ciclo celular nas células da glândula mamária
 Mutações nesse gene levam a defeito no reparo do DNA e instabilidade
genética
Pacientes com mutações no BRCA1
• Menor tempo de sobrevida livre de doença
• Perfil fenotípico característico
Carcinoma pouco diferenciado
Alta taxa de proliferação
Imunohistoquímica e Câncer
OBJETIVO
Analisar a expressão
IHQ do BRCA1 em carcinomas
mamários esporádicos e comparar os resultados obtidos
com dados clínicos e histopatológicos de importância prognóstica,
incluindo a expressão de receptores hormonais,
p53, c-erbB-2 e Ki67.
Imunohistoquímica e Câncer
MATERIAL E MÉTODO
Grau I bem diferenciado (34)
 Amostras – Carcinomas
ductais invasivos
Grau II moderadamente diferenciado (39)
Grau III pouco diferenciado (29)
Sem qualquer outro tratamento adjuvante
Sem história familiar
 Método avidina-biotina-peroxidase
 BRCA1, P53, c-erbB2, Ki67
Imunohistoquímica e Câncer
RESULTADOS
BRCA1
Epitélio normal - somente nuclear
Carcinomas - nuclear e citoplasmática
Expressão maior nos tumores bem diferenciados
Imunohistoquímica e Câncer
Imunohistoquímica e Câncer
 51% dos carcinomas
baixa expressão do BRCA1
• Alto grau histológico
• Alta taxa proliferativa
alta expressão do Ki67
• Negativos para receptores de estrógeno e progesterona
• Positivos para c-erbB2
• Menor sobrevida global
• Menor tempo livre de doença ( metástases e recidiva)
A baixa expressão do BRCA1 está associada a ocorrência de metástases
Papel na progressão tumoral do carcinoma esporádico
Imunohistoquímica e Câncer
CONCLUSÃO
A IHQ do BRCA1 pode representar um método de
identificação deste gene que pode ser considerado um
marcador útil na identificação de mulheres portadoras
de carcinoma esporádico de mau prognóstico e alto
risco de recorrência precoce.
Imunohistoquímica e Câncer
CONCLUSÃO
A baixa imunoexpressão desta proteína nesses tumores e a
sua correlação com fatores de mau prognóstico indicam
que o grau de expressão deste gene pode desempenhar
importante papel na tumorigênese mamária
Versos negros (mas nem tanto...)
Carlos Drummond de Andrade
“ Ao levantar, muito cuidado, amigo.
Não ponha os pés no chão. Corre perigo
Se há nylon no tapete: ele dá câncer.
Pise somente no ar, mas com cautela.
Uma pesquisa nos revela
Esta triste verdade: o ar dá câncer.
À hora do café, não seja pato,
Pois tanto açúcar como ciclamato
E xícara e colher, sorry: dão câncer.
O banho de chuveiro? Não tomá-lo.
O de imersão, também. Sinto informa-lo
Do despacho londrino: água dá câncer.
Não se vista, meu caro ou minha cara
Um cientista famoso eis que declara:
Na roupa, qualquer roupa, dorme o câncer...”
OBRIGADA !!