AVALIAÇÃO DO FATOR DE VIRULÊNCIA PROTEINASE EM ISOLADOS
DE CANDIDÚRIA
Leiziani Gnatkowski Martins (PAIC/F.A), Aline de Cristo Soares Alves, Flávia
Kelly Tobaldini, João Frederico Musial, Dr. Marcos Ereno Auler (Orientador),
e-mail: [email protected]
Universidade Estadual do Centro-Oeste/Departamento de
Farmácia/Guarapuava, PR.
Ciências da saúde - Farmácia
Palavras-chave: Candida spp, virulência, proteinase.
Resumo
As Infecções do trato urinário correspondem à infecção mais comum
no ambiente hospitalar e a maioria são causadas por Candida spp. Entre os
diversos fatores de virulência de C. albicans, a produção de proteinase
exerce um importante papel na patogênese da candidíase. A liberação de
enzimas como a proteinase pelas células leveduriformes no meio, facilita o
poder invasor do microrganismo e interfere no metabolismo celular do
hospedeiro podendo conduzir à morte celular. O objetivo do nosso trabalho
foi determinar a taxonomia e avaliar a produção de proteinases de 44 cepas
de Candida spp e 2 cepas de Trichosporon obtidos de amostras de urina do
laboratório de análises clínicas do Hospital Santa Tereza de
Guarapuava/PR. A espécie mais isolada foi Candida albicans seguida de
Candida glabrata e Candida tropicalis. Em relação à produção de proteinase
todas as espécies apresentaram atividade fortemente positiva, cuja maior
atividade observada foi da espécie C. albicans com valores de Pz entre 0,28
a 0,47, seguida da C. tropicalis (0,37 a 0,40), C. glabrata (0,35 a 0,5) e por
último as 2 amostras de Trichosporon (0,5). Esses valores de proteinase
obtidos comprovam o alto fator de virulência que contribui para a
patogenicidade dessas espécies.
Introdução
Leveduras do gênero Candida têm grande importância pela alta freqüência
com que colonizam e infectam o hospedeiro humano. Estes
microorganismos comensais tornam-se patogênicos caso ocorram
alterações nos mecanismos de defesa do hospedeiro ou o comprometimento
de barreiras anatômicas secundariamente a queimadura ou procedimentos
médicos invasivos1.
Infecções por Candida respondem por 80% de todas as infecções fúngicas
documentadas no ambiente hospitalar, incluindo infecções de corrente
sanguínea, do trato urinário e do sítio cirúrgico. Em especial, as infecções
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urinárias têm apresentado aumento, nos últimos 20 anos, o que desponta
como um importante problema de saúde pública. Estudos apontam que a
prevalência de infecções do trato urinário passou de 0.9/1000 para 2.0/1000
pacientes2. Candidúria é rara em pacientes saudáveis, mas relativamente
freqüente em pacientes hospitalizados. Infecções do trato urinário
representam a infecção mais comum dentre as nosocomiais, tratando-se de
10 -15% das infecções ocorridas na UTI (Unidade de Tratamento Intensivo)
e são causadas por Candida spp3. A maioria das infecções é adquirida por
via endógena, sendo seu maior reservatório o trato gastrointestinal que se
apresenta colonizado por Candida spp em até 80% da população normal4.
A infecção por Candida spp normalmente está associada a fatores
predisponentes como: idade avançada, sexo feminino, diabetes mellitus,
anomalias de vias urinárias, complicações renais, câncer, uso prévio de
antibióticos, imunossupressores, corticóides, sondagem vesical, cirurgia nos
últimos dois meses, nefrostomia, pacientes em unidade de tratamento
intensivo – UTI5.
Em relação aos aspectos epidemiológicos, a identificação de leveduras em
nível de espécie é etapa fundamental para a monitorização das taxas de
infecção bem como para identificação precoce dos possíveis surtos de
infecções por Candida1.
Entre os diversos fatores de virulência de C. albicans, a produção de
proteinase tem sido amplamente estudada, exercendo importante papel na
patogênese da candidíase, sendo atribuída a vários genes sua expressão
que são os chamados SAPs6. A liberação de enzimas como a proteinase
pelas células leveduriformes no meio, facilita o poder invasor do
microrganismo e interfere no metabolismo celular do hospedeiro podendo
conduzir à morte celular7. O presente trabalho teve por objetivo determinar a
prevalência das espécies de Candida e a atividade enzimática da proteinase
como um dos fatores de virulência de amostras coletadas do Hospital Santa
Tereza de Guarapuava/PR.
Materiais e métodos
Durante junho de 2009 a junho de 2010 amostras de urina obtidas do laboratório de análises clínicas do Hospital Santa Tereza de Guarapuava/PR, foram coletadas e semeadas em meio de ágar sabouraud dextrose e incubados a 37°C. As leveduras isoladas foram estudadas quanto às suas características macroscópicas, microscópicas, reprodutivas e fisiológicas, de acordo
com os métodos preconizados por KURTZMAN & FELL 8. As cepas isoladas
foram identificadas através do tubo germinativo, microcultivo em ágar fubá e
auxanograma.
O meio base para evidenciação da produção de proteinase foi preparado de acordo com RÜCHEL et al.9, meio A (Yeast carbon base 4,68g, albumina bovina fração V 0,8g, provit 1ml, e água destilada 40ml) e meio B (ágar
7,2g e água destilada 360ml). O meio A foi esterilizado por filtração em
membrana Millipore de 0,22µm e o meio B esterilizado em autoclave a
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120°C por 15 minutos. Aguardado o resfriamento do meio B estéril a 50°C,
adicionou-se o meio A e após homogeneização foi feita a distribuição em
placas de pétri estéreis em volume de 33 ml/placa.
As amostras a serem analisadas foram cultivadas por 24 horas em
ágar sabourand dextrose e em seguida repicadas com alça de platina em
pontos eqüidistantes no meio de ágar-proteinase e no centro o controle positivo ATCC 90028. As placas contendo quatro inóculos de diferentes cultivos
permaneceram incubadas a 37º C, durante 8 dias. A presença da enzima foi
observada pela formação de um halo opaco ao redor da colônia e a atividade enzimática medida segundo PRICE et al 10 pelo Pz, obtido dividindo-se o
diâmetro da colônia (dc) pelo diâmetro da colônia mais a zona de precipitação (dcp) ou seja, Pz=dc/dcp. Sendo que Pz=1,0 significa que a amostra não
apresenta atividade, Pz>0,64 e <1 atividade considerada positiva e Pz≤0,63
atividade fortemente positiva, ou seja, quanto menor o Pz maior a atividade
enzimática.
Resultados e Discussão
Durante o período de coleta das amostras foram isolados 44 leveduras do
gênero Candida, além de 2 levedura do gênero Trichosporon. As espécies
isoladas foram: Candida albicans 47,8% (22/46), Candida glabrata 39,1%
(18/46), Candida tropicalis 8,7% (4/46), Trichosporon asahii 2,2% (1/46) e
Trichosporon cutaneum 2,2% (1/46). De acordo com os resultados obtidos
houve uma grande quantidade de Candida glabrata isolada, fato que difere
da literatura. Guler et al.11 encontrou apenas 11,76% de C. glabrata em 51
isolados, e SILVA et al.12, obteve em 100 amostras de Candida spp 11% de
C. glabrata. O elevado percentual dessa espécie pode estar relacionado com
o clima frio da região.
Em relação à pesquisa de atividade enzimática foi observado que todos os isolados, apresentaram atividade fortemente positiva para proteinase
(tabela 1). A espécie C. albicans apresentou a maior atividade proteolítica
com valores de Pz entre 0,28 a 0,47, seguida da C. tropicalis (0,37 a 0,40),
C. glabrata (0,35 a 0,5) e por último as 2 amostras de Trichosporon (0,5).
Tabela 1: Atividade proteolítica das leveduras isoladas
Espécies (n)
N
P
FP
Candida albicans (22)
+
Candida tropicalis (4)
+
Candida glabrata (18)
+
Trichosporon asahii (1)
+
Trichosporon cutaneum (1)
+
N: negativa P: positiva e FP: fortemente positiva.
Nossos dados mostraram-se acima dos obtidos por Matsumoto et al. 13, onde
78,8% dos 80 isolados de Candida spp obtidos de sangue e de cateteres
apresentaram atividade enzimática forte. A atividade enzimática fortemente
positiva apresentada neste estudo mostra um importante fator de virulência
que contribui para a patogenicidade dessas leveduras.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
Conclusões
Candida albicans foi à levedura mais freqüentemente isolada, porém, a espécie Candida glabrata apresentou grande prevalência em relação à literatura e que pode estar relacionado com o clima da região. No que corresponde
a proteinase, todas as leveduras isoladas dos pacientes do Hospital Santa
Tereza têm a habilidade de produzir a enzima, e o elevado nível de atividade
proteolítica apresentado comprova um importante fator de virulência que
contribui na patogenicidade dessas leveduras avaliadas.
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