A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA: ALGUNS
ASPECTOS BIOQUÍMICOS,
FISIOLÓGICOS E MICROBIOLÓGICOS
LUIZ CARLOS BASSO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ESALQ/USP
V SEMANA DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA, Piracicaba 19/20- 5-2011
CONTEÚDO DA APRESENTAÇÃO
•
O PROCESSO INDUSTRIAL E OS ESTRESSES IMPOSTOS À LEVEDURA
•
SELEÇÃO DE LEVEDURAS E SEU BENEFÍCIO PARA A FERMENTAÇÃO
INDUSTRIAL
•
REDUÇÃO DA CONTAMINAÇÃO BACTERIANA: ALTERNATIVAS
RELACIONADAS COM AS LEVEDURAS
•
A DIVERSIDADE DOS LACTOBACILLUS E ESTRATÉGIA PARA O
CONTROLE DAS BACTÉRIAS
•
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A SINGULARIDADE DA
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
AÇUCAR
CARBONO
ETANOL
CO2
LEVEDURA
CÉLULA
FILHA
PORQUE A LEVEDURA TRANSFORMA
O AÇÚCAR EM ETANOL?
AÇUCAR
(100g)
ATP
CARBONO
BIOMASSA
(5%)
ETANOL+ CO2 = 90%
OUTROS = 5%
A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
+
FRUTOSE
HEXOSE
GLICOSE
P
NH4+
BIOMASSA
TREALOSE E
GLICOGÊNIO
Mg++
K+
PROTEINAS
SACAROSE
ATP
GLICEROL
K+
PIRUVATO
AMINOÁCIDOS
Zn++
NH4+
AC.ORGÂNICOS
CO2
ETANOL
ETANOL
AC.ORGÂNICOS :
SUCCÍNICO,
MÁLICO, PIRÚVICO
O PROCESSO FERMENTATIVO
COM RECICLO DE CÉLULAS
ÁCIDO
MOSTO
pH=1.8-2.5
CUBA
2-5 horas
32-40oC
6-10 horas
DORNA
7-14% cels
Pé de cuba
CENTRÍFUGA
CREME
pH=3.7-4.5
VINHO
7-11%EtOH
O coração da fermentação: a dorna
Açúcar
da cana
5 – 10 µ
ETANOL
LEVEDURA
Saccharomyces cerevisiae
CONTAMINANTES DA FERMENTAÇÃO
Açúcar
da cana
ETANOL
LEVEDURA
+
BACTÉRIA
O SUBSTRATO:
CALDO DE CANA E MELAÇO
AGUA
EXTRAÇÃO
CALDO
CANA
(16-20% AT)
BAGAÇO
SACAROSE
(CRISTAIS)
CONCENTRAÇÃO
(EVAPORAÇÃO)
MELAÇO
(50-60% AT)
SUBSTRATO
(18-20%AT)
FATORES LIMITANTES
DA PRODUTIVIDADE
Alta densidade de células (10-14%) : deficiências minerais-N,P,Mg,Mn,Zn
Fermentação rápida (6-10 h)
Pressão osmótica (sais, açúcar)
Etanol (7-11%)
Acidez (pH=1.8-2.5)
Temperatura (32 - 40oC)
Contaminação bacteriana
Sulfito, Alumínio, excesso K, Ca, etc
FATORES ESTRESSANTES
PRESSÃO
OSMÓTICA
TEMPERATURA
ETANOL
K+, Ca++
AÇÚCAR
DESN.PROTEINAS
ÁGUA
HSO3-
H2SO3
GLICEROL
H+
SULFITO = S02
ATP
2H
H+
AC. ORGÂNICOS
SO4-2
H+
CH3COOH
COOH
COO-
CHOH
CHOH + H+
CH3
CH3
+
ATP-Al
ADP
ADP
ADP
CH3COO-
CONT. BACTERIANA = ACIDOS .ACÉTICO E LÁTICO
+
ATP-Mg
H2SO4
Al+3
A ESTEQUIOMETRIA DA FERMENTAÇÃO
Açúcar
da cana
1% NO RENDIMENTO EM
ALCOOL TEM GRANDE
IMPACTO NO LUCRO !
ETANOL E CO2: 80-90% DO AÇÚCAR
BIOMASSA
GLICEROL
ÁCIDOS ORGÂNICOS
OUTROS SUBPRODUTOS
AÇÚCAR RESIDUAL
10-20%
BALANÇO DE MASSA
(EM ANAEROBIOSE)
PRODUTOS DA
FERMENTAÇÃO
% DO ART CONSUMIDO
ETANOL
GÁS CARBÔNICO
BIOMASSA
GLICEROL
AC. SUCCÍNICO
AC. ACÉTICO
ÓLEO FUSEL
OUTROS
OUTROS SUBPRODUTOS
Para um consumo total do açúcar pela levedura
84-92
1-5
2-9
0,3 - 1,2
0,1 - 0,7
0,1 - 0,4
< 0,1
GANHOS EM PRODUTIVIDADE
VARIEDADES DE CANA E MELHORES PRÁTICAS
AGRÍCOLAS
MELHOR ENGENHARIA DO PROCESSO
MELHOR ASSEPSIA
NUTRIÇÃO DA LEVEDURA
LINHAGENS DE LEVEDURAS
LINHAGENS TRADICIONALMENTE
EMPREGADAS (1987)
IZ-1904
TA (M300-A)
PANIFICAÇÃO
HAVERIA NECESSIDADE DE NOVAS
LINHAGENS ????
LEVEDURAS INDUSTRIAIS
1987: 1ª avaliação com reciclos
17% ART AA30
7-8%EtOH
30 0 C
PARÂMETROS
PARÂMETROS
AVALIADOS
AVALIADOS
PAN/TA
FL
IZ-1904
IZ-1904
1
REND.
(%)(%)
REND.ETANOL
ETANOL
1
GLICEROL
(%)(%)1 1
GLICEROL
2
TAXA
(%)2
TAXACRESCIMENTO
CRESCIM. (%)
3
VIABILIDADE
(%)(%)
VIABILIDADE
3
3 3
GLICOGÊNIO
(%)(%)
GLICOGÊNIO
3
TREALOSE
(%)(%)
TREALOSE
21% ART A 33
3
FL
0C
PE -2
89,5
93,2
COERÊNCIA
88,8
88,8
90,0
90,0
4,6
4,6
5,1
5,1
5,7
41
41
--10
10
80
80
28
28
16
16
7
7
35
49
SOBREVIVERIA
48
97
AO ESTRESSE
INDUSTRIAL?
9
16
7
7
0
0
3,7
4
1 – Fração do açúcar metabolizado transformado em etanol ou glicerol
2 – Taxa de crescimento da levedura no transcorrer de 6 ciclos
3 – Valores referentes à levedura do 60 ciclo fermentativo
9
LEVEDURAS INDUSTRIAIS
1987: 1ª avaliação com reciclos
17% ART AA30
7-8%EtOH
30 0 C
PARÂMETROS
PARÂMETROS
AVALIADOS
AVALIADOS
PAN/TA
FL
IZ-1904
IZ-1904
1
REND.
(%)(%)
REND.ETANOL
ETANOL
1
GLICEROL
(%)(%)1 1
GLICEROL
2
TAXA
(%)2
TAXACRESCIMENTO
CRESCIM. (%)
3
VIABILIDADE
(%)(%)
VIABILIDADE
3
3 3
GLICOGÊNIO
(%)(%)
GLICOGÊNIO
3
TREALOSE
(%)(%)
TREALOSE
21% ART A 33
3
FL
0C
PE -2
89,5
93,2
COERÊNCIA
88,8
88,8
90,0
90,0
4,6
4,6
5,1
5,1
5,7
41
41
--10
10
80
80
28
28
16
16
7
7
35
49
SOBREVIVERIA
48
97
AO ESTRESSE
INDUSTRIAL?
9
16
7
7
0
0
3,7
4
1 – Fração do açúcar metabolizado transformado em etanol ou glicerol
2 – Taxa de crescimento da levedura no transcorrer de 6 ciclos
3 – Valores referentes à levedura do 60 ciclo fermentativo
9
A CARIOTIPAGEM E A QUEBRA DE
UM PARADIGMA (1989)
Colonias
individuais
DNA intacto
Eletroforese
TA
VR2
VR1
CR
PE
SA
BG
MA4
ME3
ME1
IZ
+
SURPRESAS INICIAIS
PERMANÊNCIA DAS LINHAGENS NO PROCESSO
LEVEDURAS /
SAFRA (DESTIL.)
PAN
TA
NF (Canadá)
JA-1
DIAS DE PROCESSO
SAFRA
SAFRA
SAFRA
91/92 (3)
92/93 (6)
93/94 (9)
-
20-30
30-40
30-40
15-40
30-40
30
-
-
-
>150
>100
JA-1 –Colônia isolada no final da safras anteriores
pela propria destilaria (Jardest)!
AVALIAÇÃO DE LINHAGENS
ISOLADAS DE PROCESSO
1993
PARÂMETRO*
TA
RENDIMENTO(%) 86,8
GLICEROL(%ART) 4,49
TAXA CRESC.(%)
44
VIABILIDADE
76
FINAL(%)
JA-1 SA-1
87,3
3,98
44
88,0
3,71
45
91
93
6 CICLOS FERMENTATIVOS
IMPLANTAÇÃO DAS
LINHAGENS SELECIONADAS
SAFRA 94/95 – 25 DESTILARIAS
LEVEDURA
SA-1 CR-1 JA-1 FL/IT
o
(N DEST.)
(20) (20) (20) (5)
TAXA PERMA- 45
48
25
5
0
NÊNCIA (%)
TAXA DOMI41
14
10
0
NÂNCIA (%)
GRANDE BIODIVERSIDADE
(SUCESSÃO DE DIFERENTES LINHAGENS)
DEST. A 27/07/04
STRAINS DOMINANTES E
PERSISTENTES
DESTILARIA B 31/08/04
DOMINÂNCIA = COMPETITIVIDADE
PERSISTÊNCIA = MÚLTIPLA TOLERÂNCIA
O PROCESSO INDUSTRIAL COMO
FONTE DE LINHAGENS APROPRIADAS
•
•
•
•
GRANDE BIODIVERSIDADE
LINHAGENS PERSISTENTES (TOLERANTES ?)
LINHAGENS DOMINANTES (COMPETITIVAS ?)
POUCAS LINHAGENS DOMINANTES E PERSISTENTES
PRESSÃO SELETIVA DO PROCESSO COM
RECICLO DE CÉLULAS
2 CICLOS/DIA
200-250 DIAS
RESISTENTES, MAS
SELEÇÃO OU ADAPTAÇÃO EVOLUTIVA
LEVANDO A LINHAGENS COM TOLERÂNCIA A
VÁRIOS TIPOS DE ESTRESSE, MESMO
DESCONHECIDOS
NÃO
NECESSARIAMENTE
COM BONS
ATRIBUTOS
FERMENTATIVOS
A MAIORIA DAS LINHAGENS SÃO
IMPRÓPRIAS PARA A FERMENTAÇÃO
INDUSTRIAL
15%
ESPUMA
FLOCULAÇÃO
SOBRA DE ART
85%
COM PROBLEMAS
SEM PROBLEMAS
PRIMEIRO PASSO: ESPUMA, FLOCULAÇÃO E
AÇÚCAR RESIDUAL
SUSPENSÃO
HOMOGENEA
ESPUMA
ESPUMA E
FLOCULAÇÃO
AÇÚCAR RESIDUAL
SEGUNDO PASSO:
DESEMPENHO
FERMENTATIVO
• Rendimento em etanol
• Produção de glicerol
• Taxa de crescimento
• Velocidade de fermentação
• Manutenção de alta viabilidade durante reciclos
(altos conteúdos celulares de glicogênio e trealose)
FERMENTAÇÕES COM RECICLO SIMULANDO O PROCESSO
INDUSTRIAL
DESEMPENHO FERMENTATIVO
PARÂMETROS FERMENTATIVOS
PANIFIC.
PE-2
RENDIMENTO EM ETANOL (%)
89
93
GLICEROL (%)
5.7
3.7
TAXA DE CRESCIMENTO (%)
5.8
8.2
VIABILIDADE (%)
48
97
GLYCOGENIO CELULAR (%MS)
9
16
TREALOSE CELULAR (%MS)
4
9
6 CICLOS FERMENTATIVOS A 33oC, 9% ETANOL
SA-1
3o PASSO: REINTRODUÇÃO NO
PROCESSO INDUSTRIAL
• PROPAGAÇÃO DAS LINHAGENS
SELECIONADAS
• INTRODUÇÃO EM VÁRIAS DESTILARIAS (EM
ATÉ 70 EM 11 ANOS/SAFRAS)
• MONITORAMENTO PELA CARIOTIPAGEM
(AMOSTRAS MENSAIS)
CAPACIDADE DE IMPLANTAÇÃO
• PERSISTÊNCIA
• DOMINÂNCIA
REINTRODUÇÃO NO PROCESSO
INDUSTRIAL
LINHAGENS INTRODUZIDAS
(DESTILARIA A – SAFRA 95)
PANIFICAÇÃO
KG
10.000
PE-2
0,5
VR-1
0,5
SA-1
0,5
MONITORAMENTO PELA CARIOTIPAGEM –
DINÂMICA POPULACIONAL
PROPORÇÃO
100%
80%
60%
40%
20%
0%
10
25
PAN
70
DIAS
PE-2
155
SA
VR-1
190
CAPACIDADE DE IMPLANTAÇÃO
MONITORAMENTO EM 24-70 DESTILARIAS DURANTE 11 ANOS (1995-2006)
DESTILARIAS COM A
LINHAGEM
LINHAGEM (%)
INTRODUZIDA
PE-2
BG-1
CAT-1
SA-1
VR-1
CR-1
OTHERS*
58
42
51
32
25
17
0
PROPORÇÃO DA
LINHAGEM (%)
54
65
45
44
15
6
0
* PANIFIC., VINHO, CERVEJARIA, Y-904, IZ-1904, TA, NF, M-26, ETC.
40% DAS DESTILARIAS OPERAM COM LINHAGENS INDÍGENAS !
BENEFICIOS DAS LEVEDURAS
SELECIONADAS
• MAIOR RENDIMENTO EM ETANOL
• MENOR FORMAÇÃO DE ESPUMAS
• MENOR FLOCULAÇÃO
A SELEÇÃO PODERIA SER
DIRECIONADA TAMBÉM PARA A
REDUÇÃO DA CONTAMINAÇAO
BACTERIANA?
• MAIOR RENDIMENTO EM ETANOL
• MENOR FORMAÇÃO DE ESPUMAS
• MENOR FLOCULAÇÃO
• AÇÃO ANTIBACTERIANA ?
LEVEDURAS COM ATIVIDADE
ANTIBACTERIANA
QUE ATRIBUTOS PODERIAM SER
CONSIDERADOS?
• Produzir algum inibidor?
• Reduzir os alimentos requeridos pela bactéria?
• Leveduras geneticamente modificadas (lisozima,
nisina, pediocina...)
• Etc...
RELAÇÕES TRÓFICAS ENTRE
LEVEDURAS E BACTÉRIAS
REDUÇÃO DO RENDIMENTO EM ETANOL
-METABÓLITOS BACTERIANOS
-BIOMASSA BACTERIANA
-MAIOR PRODUÇÃO DE GLICEROL PELA LEVEDURA
REDUÇÃO DA VIABILIDADADE DA LEVEDURA
FLOCULAÇÃO
ESPUMA
Antagonismo entre leveduras e
bactérias
Ácidos lático e acético
ácido
succínico
bactéria
COOH
C6H12O6
CH2
levedura
CH2
10 H++10 e-
1
COOH
+
5 GLICEROL
2 CO2
ÁCIDO SUCCÍNICO X CONTAMINAÇÃO
BACTERIANA
CONTAMINAÇAO
(cel/mL x 10>6)
60
50
40
30
20
10
0
Cherubin (2003)
1
2
3
4
CICLOS
M-26
PE-2
5
6
Oliva Neto (2006)
M-26: 46% a
mais que PE-2
QUAIS SERIAM OS SUBSTRATOS PARA
AS BACTÉRIAS ?
CINETICA FERMENTAÇAO
(4 HORAS DE ALIMENTAÇAO)
4
12
3
9
2
6
1
3
0
0
2
4
HORAS
GLIC
FRUT
SAC
6
ETANOL
8
0
A ATIVIDADE DA INVERTASE É MAIOR QUE A
VELOCIDADE DE ABSORÇÃO DA GLICOSE E
FRUTOSE PELA LEVEDURA
GLICOSE
H 2O
O
+
INVERTASE
FRUTOSE
SACAROSE
Não é absorvida
pela levedura
Açúcares absorvidos pela
levedura com preferencia
pela glicose
Lactobacilos: tipos de metabolismo
Homo-fermentativa
Açúcares
Ácido Lático
Hetero-fermentativa
Açúcares
Ácido Lático
Ácido Acético
Gallo, 1989; Costa et al. (2008)
Manitol
CO2
Etanol
Consumo de glicose e frutose por Lactobacilos
isolados de destilarias
A bactéria hetero-fermentativa
tem preferência pela frutose
Homo-fermentativo
Glicose
Frutose
1,00
1,00
0,80
0,80
Açúcares (%)
Açúcares (%)
Glicose
Hetero-fermentativo
0,60
0,40
0,60
0,40
0,20
0,20
0,00
0,00
0
5
10
15
20
25
30
tempo (horas)
35
40
45
50
Frutose
0
5
10
15
20
25
30
tempo (horas)
35
40
45
50
A FERMENTAÇÃO FAVORECE
O CRESCIMENTO DO TIPO HETEROFERMENTATIVO
CINETICA FERMENTAÇAO
(4 HORAS DE ALIMENTAÇAO)
4
12
3 X mais
frutose
3
9
2
6
1
3
0
0
2
4
HORAS
GLIC
FRUT
SAC
6
ETANOL
8
0
Fermentação contaminada com bactérias
homo- e heterofermentativa
BACTERIAS
(Cel/mL x 10e7)
50
40
30
20
10
0
1
2
S/ BACT
3
CICLOS
HOMO
4
HETERO
5
Poucas diferenças nos níveis de
acido lático
ACIDO LATICO
(mg/L)
4000
3200
2400
1600
800
0
1
2
S/ BACT
3
CICLOS
HOMO
4
HETERO
5
A bactéria hetero-fermentativa
produz mais ácido acético
ACIDO ACETICO
(mg/L)
1800
1200
600
0
1
2
S/ BACT
3
CICLOS
HOMO
4
HETERO
5
A bactéria hetero-fermentativa afeta
mais a viabilidade da levedura
VIABILIDADE
(%)
100
90
80
70
1
2
S/ BACT
3
CICLOS
HOMO
4
HETERO
5
Somente a bactéria hetero-fermentativa
produz manitol
MANITOL
(mg/L)
2000
1500
1000
500
0
1
2
S/ BACT
3
CICLOS
HOMO
4
HETERO
5
Apenas a bactéria hetero-fermentativa
induz maior formação de glicerol
GLICEROL
(%)
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
1
2
S/ BACT
3
CICLOS
HOMO
4
HETERO
5
A bactéria hetero-fermentativa
afeta mais o rendimento
RENDIMENTO
(%)
92
90
88
86
84
82
1
2
S/ BACT
3
CICLOS
HOMO
4
5
HETERO
Haveria necessidade de combater todos os tipos de lactobacilos?
Como avaliar os antibacterianos (homo- e hetero)?
PODEMOS REDUZIR O CRESCIMENTO
BACTERIANO ?
REDUZINDO OS ALIMENTOS PARA AS BACTÉRIAS:
AÇÚCARES
AMINOÁCIDOS E VITAMINAS (MOSTO E LEVEDURAS
MORTAS)
A CONTAMINAÇÃO BACTERIANA
SELEÇÃO DE LEVEDURAS PARA METABOLIZAÇÃO MAIS
RÁPIDA DOS AÇÚCARES
Considerações finais
 As leveduras selecionadas colaboram para reduzir os custos
de produção do etanol
 Novas e mais apropriadas linhagens ainda podem ser
selecionadas a partir da biodiversidade encontrada nas
destilarias (processos diferentes, diferentes linhagens)
 Os lactobacilus hetero-fermentativos se mostram mais
perniciosos para a fermentação em relação aos do tipo
homo-fermentativo
 Novas linhagens com características antibacterianas
poderão ser isoladas (baixos teores de açúcar durante a
fermentação)
OBRIGADO PELA
ATENÇÃO !
LUIZ CARLOS BASSO
[email protected]