PAULO LEONARDO ARAÚJO DE GÓIS MORAIS
PROJEÇÃO RETINIANA, CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA E
NEUROQUÍMICA DA ZONA INCERTA DO MOCÓ (Kerodon rupestris)
Dissertação de Mestrado submetida
ao Programa de Pós-graduação em
Psicobiologia
da
Universidade
Federal do Rio Grande do Norte.
NATAL
2014
PAULO LEONARDO ARAÚJO DE GÓIS MORAIS
PROJEÇÃO RETINIANA, CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA E
NEUROQUÍMICA DA ZONA INCERTA DO MOCÓ (Kerodon rupestris)
Dissertação de Mestrado submetida
ao Programa de Pós-graduação em
Psicobiologia
da
Universidade
Federal do Rio Grande do Norte.
Orientador: Prof. Dr. Expedito
Silva do Nascimento Júnior
NATAL
2014
TÍTULO: PROJEÇÃO RETINIANA, CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA
E NEUROQUÍMICA DA ZONA INCERTA DO MOCÓ (Kerodon rupestris)
AUTOR: PAULO LEONARDO ARAÚJO DE GÓIS MORAIS
DATA DA DEFESA: 27/03/2014
EXAMINADORES:
__________________________________________
Prof. Dr. Fausto Pierdoná Guzen
__________________________________________
Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante
__________________________________________
Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a minha família, Ana Maria, José Orlando e Paula
Giovanna, base de tudo, que é diretamente responsável por tudo de bom que acontece
comigo e que sei que posso contar quando as coisas ruins acontecem. Amo vocês!
Agradecimento especial para o Prof Expedito Jr, meu orientador e grande líder, que
fez tudo e mais um pouco para me ajudar a trabalhar.
Aos professores Judney, Jeferson, Miriam, Celcimar e Ruthnaldo, pela compahia,
duvidas esclarecidas e sugestões, tantos para os experimentos e trabalhos quanto para
outras questões cotidianas.
A Todos os alunos que passaram pelo Labneuro, pelos momentos alegres, ajuda nos
experimentos, compahia nos diversos lugares, desde os almoços de confraternização até
nos congressos e simpósios da vida, em especial para Karen, André, Melquisedec,
Mariana, Nelyane, Fladjane, Helder, Wilqui, Renata, Nayra, Felipe, Joacil, Twyla,
Rovena, e um agradecimento especial a Dona Regina, responsável pela manutenção da
lei, da ordem e do funcionamento geral do Laboratorio.
Aos meus grandes amigos da biologia e agregados, Rodolfo, Rafael, George, Ivon
Edipo, Huguinho, Guido, Cleanto, Stanlley, Fernando, Daniel, Bozena, Alf,
Marilia, Vanessa, Aline, Helton e mais uma galera grande, pelos momentos de alegria,
conhecimento, e angustias compartilhados desde o período de graduação.
A galera do ABC Leozinho, Joao Paulo, Romario, Oreia, Duble, Michel, Idamilton,
Marquinhos, Bia, Junior e Nessah, excelentes compahias em jogos, viagens e em
vários outros momentos unidos por uma paixão em comum pelo ABC.FC.
E o que dizer das galeras dos cursos de Geofisica 2013.1 e Fisioterapia 2013.1 e .2,
que convivi pouco tempo, mas já os considero pacas? Amizades surgidas a pouco tempo
pela loucura de querer cursar outra graduação durante o mestrado, mas também
importantes para conhecer outros ares e áreas do conhecimento.
A Capes e CNPq, pelo suporte financeiro indispensável.
LISTA DE ABREVIATURAS
3v – terceiro ventrículo
5-HT – Serotonina
CB – Calbindina
ci – Capsula interna
CR – Calretinina
CS – Colículo superior
DA - Dopamina
f - Fornix
FIG – folheto intergeniculado
GABA -ácido gama aminobutírico
GFAP - Proteína acídica fibrilar glial
GLD – Núcleo Geniculado lateral dorsal
GLV – Núcleo Geniculado lateral ventral
HRP – horseradish peroxidase
IR- - Imunoreativo
MD - núcleo médio dorsal do tálamo
ml – lemnisco medial
mt – tracto mamilotalâmico
NO - óxido nítrico
NOS - óxido nítrico sintase
NPA – Núcleo pretectal anterior
NPY - Neuropeptídeo Y
NSO – núcleo supraóptico
NSQ – Núcleo supraquiasmático
PV – Parvalbumina
PVT – núcleo paraventricular do tálamo
Rt – núcleo reticular do tálamo
rts – radiação talâmica superior
TF – tampão fosfato
TH – Tirosina hidroxilase
VIP - Polipeptídeo intestinal vasoativo
VP – Vasopressina
VM - núcleo ventral póstero medial
ZI – Zona Incerta
ZIr - Zona Incerta rostral
ZId - Zona Incerta dorsal
ZIv - Zona Incerta ventral
ZIc - Zona Incerta caudal
LISTA DE FIGURAS
Tabela 1: Especificação das substâncias, bem como seus fabricantes e diluições,
utilizadas nos procedimentos de imunohistoquímica.
Figura 1: Área de distribuição do mocó.
Figura 2: mocó (Kerodon rupestris).
Figura 3: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó
coradas pelo método de Nissl nas subdivisões da ZI.
Figura 4: Em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, mostrando a
imunorreatividade contra CTb, evidenciando a projeção retiniana para a ZIc.
Figura 5: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra TH.
Figura 6: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra NOS.
Figura 7: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra 5-HT.
Figura 8: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra GFAP.
Figura 9: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra CB.
Figura 10: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra CR.
Figura 11: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra PV.
Tabela 2: Resumo esquemático da distribuição das substâncias neuroativas nas
subdivisões da ZI do mocó.
SUMÁRIO
RESUMO
10
ABSTRACT
11
1. INTRODUÇÃO
12
1.1 Zona Incerta (ZI)
12
1.2. Subdivisões da ZI
12
1.3 Hodologia da ZI
13
1.4 Aspectos Funcionais da ZI
14
1.5 Projeções retinianas
16
1.6 Projeções retinianas para núcleos classicamente não visuais
17
1.7 Sujeito experimental
18
1.8 Justificativa
20
2.OBJETIVOS
21
2.1 Objetivos gerais
21
2.2 Objetivos específicos
21
3. METODOLOGIA
22
3.1 Anestesia
22
3.2 Injeção intra ocular
22
3.3 Perfusão
23
3.4 Remoção dos Encéfalos
23
3.5 Microtomia
23
3.6 Método de Nissl
24
3.7 Imunohistoquímica
24
3.8 Análise das imagens
26
4. RESULTADOS
27
4.1 Citoarquitetura Nissl
27
4.2 Projeção retiniana
29
4.3 Neuroquímica
31
TH
31
NOS
32
5-HT
33
GFAP
34
CB
35
CR
36
PV
37
5 DISCUSSÃO
39
5.1 Citoarquitetura
39
5.2 Projeção retiniana
41
5.3 Neuroquímica
44
TH
44
NOS
46
5-HT
47
GFAP
48
CB
48
CR
49
PV
50
5.4 Considerações do funcionamento global da ZI
51
6. CONCLUSÕES
53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
54
8. ANEXO
69
RESUMO
A Zona Incerta (ZI) é um grupamento neuronal embriologicamente derivado do
tálamo ventral, em continuidade com o núcleo reticular do tálamo. Diversos estudos
com traçadores retrógrados e anterógrados revelaram a conexão da ZI com diversas
estruturas do sistema nervoso central. Dados moleculares e citoquímicos revelaram que
a ZI é um dos grupamentos neuronais com maior diversidade neuroquímica e
citoarquitetônica do diencéfalo, e estudos hodológicos e neuroquímicos permitiram
considerar o envolvimento da ZI em diversas funções, as quais se destacam a
nocicepção, atenção, estado de alerta, controle e manutenção da postura e controle da
atividade visceral. Este trabalho tem por objetivo caracterizar a citoarquitetura e o
conteúdo neuroquímico da ZI do mocó (Kerodon rupestris), bem como a aferência
óptica presente neste núcleo nesta espécie. A técnica de Nissl é eficiente para a
delimitação e caracterização citoarquitetônica da ZI do mocó; A ZIc recebe projeção da
retina contralateral, apresentando fibras Classe II ou modulator, sugerindo um caráter
modulatório da informação fótica; A ZI do mocó, assim como em outros roedores e
primatas, é caracterizada por uma complexa rede neuroquímica, sobretudo na porção
medial da ZIr, onde encontramos imunorreatividade de todas as substâncias neuroativas
investigadas, além de que A IR-NOS, GFAP e CR auxiliaram a delimitação da ZI no
nível médio em ZId e ZIv. Contudo, somente fibras IR 5-HT estão presentes em todas
as subdivisões da ZI. Esses dados demonstram a grande riqueza neuroquímica da ZI do
mocó, auxiliando para explicar o envolvimento em um amplo repertorio funcional.
Palavras chave: Zona Incerta, neuroquímica, citoarquitetura, projeção retiniana,
Kerodon rupestris.
11
ABSTRACT
The Zona Incerta (ZI) is embryologically derived from the ventral thalamus, in
continuity with the reticular nucleus of the thalamus. Studies usingneural tracers
technics have allowed identify a complex connectional map including the ZI.
Futhermore, cytochemical, molecular and functional data have shown abundant
variability in the neurochemical contend in the ZI, as well as,the involvement of the ZI
in the modulation of nociception, attention, alertness, control and maintenance of
posture and control of visceral activity. This work aims to characterize the
cytoarchitecture, neurochemical content of the ZI in the rock cavy (Kerodon rupestris),
and a direct retinal-ZI pathway present in this species. The Nissl staining is effective for
the delineation and characterization of ZI citoarchitecture. ZIc receives a contralateral
retinal projection showing varicosities, suggesting a modulatory character of photic
information. The ZI in the rock cavy, as in others rodents and primates, is characterized
by a complex neurochemical signature. The ZI neurochemistry presents great diversity,
especially in the medial portion of ZIr, where we have found immunoreactivity of all
neuroactive substances investigated, and that NOS-IR, GFAP and CR helped the
delimitation of middle ZI in ZId and ZIv. Nevertheless, just 5-HT-IR fibers are present
in all subdivisions of the ZI. These data demonstrate the great wealth of the
neurochemistry of rock cavy’s ZI and a direct retinal modulation in the ZI, helping to
explain it’s broad functional repertory.
Keywords: Zona Incerta, neurochemistry, cytoarchitecture, retinal projection,
Kerodon rupestris.
12
1. INTRODUÇÃO
1.1 Zona Incerta (ZI)
A ZI é um grupamento neuronal embriologicamente derivado do tálamo ventral
(Jones, 2007), em continuidade com o núcleo reticular do tálamo (rt) (Kolmac e
Mitrofanis, 1999). Desde sua primeira descrição, feita por Forel em 1877, diversos estudos
com traçadores retrógrados e anterógrados revelaram a conexão da ZI com diversas
estruturas do sistema nervoso central. Dados moleculares e citoquímicos revelaram que a
ZI é um dos grupamentos neuronais com maior diversidade neuroquímica e
citoarquitetônica do diencéfalo (Mitrofanis, 2005; Nicolelis et al, 1995). Esses estudos
hodológicos e neuroquímicos permitiram considerar o envolvimento da ZI em diversas
funções, as quais se destacam a atenção, estado de alerta, controle e manutenção da postura
e controle da atividade visceral (Mitrofanis, 2005) e nocicepção (Petronilho et al, 2012).
1.2. Subdivisões da ZI
Em diversas espécies estudadas, a ZI está organizada em subdivisões, e estas
variam de acordo com o autor. Por exemplo, Kawana e Watanabe (1981) caracterizaram
seis porções na ZI do rato: Pars rostropolaris, Pars ventralis, Pars dorsalis, Pars
caudalis, Pars magnocellularis e Pars retropolaris; enquanto outros autores consideram
4 subdivisões: rostral, caudal, ventral e dorsal (Nicolelis et al, 1992; Kim et al, 1992;
Lin et al, 1995; Mitrofanis e Mikuletic, 1999). Em estudos com o macaco Rhesus
(Macaca mullata), a ZI foi inicialmente subdivida em quatro setores: polo anterior,
lâmina superior, lâmina inferior e pólo posterior. Entretanto, não houve uma clara
identificação dos limites da ZI, resumindo a divisão da ZI em apenas lâmina dorsal e
lâmina ventral (Ma et al, 1992). No sagui, a ZI também foi delimitada em quatro
regiões: rostral, dorsomedial, ventrolateral e caudal, utilizando o método de Nissl e pela
imunohistoquímica contra NeuN, uma proteína nuclear específica de neurônios (Lima,
2008). No cão e no gato, a ZI foi subdividida em cinco regiões: rostral, ventral, dorsal,
caudal e dorsolateral, esta sendo uma dilatação da porção rostral. Estudos acerca da
subdivisão dorsolateral, que se estende lateralmente ao rt, mostram que ela é
característica de animais carnívoros, embora não tenha sido encontrada no furão
(Gorbachevskaya e Chivileva, 2008).
13
1.3 Hodologia da ZI
As principais fontes aferentes para a ZI são: retina, núcleo central do complexo
amigdalóide, núcleo sensitivo do trigêmio, área hipotalâmica posterior e lateral, núcleo
ventromedial do hipotálamo, rt, núcleo talâmico posterior, núcleo geniculado lateral
ventral (GLV), complexo ventrobasal, área pretectal, núcleo peripeduncular, as camadas
profundas e intermédia do colículo superior (CS), colículo inferior, núcleo coclear,
substância cinzenta periaquedutal, complexo parabraquial, pars reticulata da substância
negra (SN), áreas perirubrais, núcleo interpósito do cerebelo, área tegmentar ventral,
núcleo reticular pontino, núcleo grácil, núcleo cuneiforme, núcleo intersticial de Cajal,
núcleo do oculomotor, núcleo da coluna dorsal, núcleo do trato espinal do trigêmio,
núcleo supraquiasmático (NQS), folheto intergeniculado (FIG) e núcleo tegmental
pedunculopontino. Várias áreas corticais também se projetam para a ZI: córtex
cingulado, motor primário, pré frontal, sensório motor primário e secundário, occipital,
neocórtex temporal, piriforme, tubérculo olfatório e núcleo septal medial (Roger e
Cadusseau, 1985; Mitrofanis e Mikuletic, 1999; Mitrofanis, 2004; May et al, 1997;
Shaw e Mitrofanis, 2001, Lechner et al, 1993; Barthó et al, 2002, Çavdar et al, 2006,
Leak e Moore, 2001; Power et al, 2001, Mitrofanis, 2005; Mitrofanis et al, 2004;
Gaillard et al, 2013; Morin, 2013).
Em relação às eferências, a ZI é ponto de partida para estruturas como o rt,
núcleo parabraquial, núcleo oral da ponte, núcleo caudal da ponte, parte ventral do
bulbo, núcleo de Edinger Westphal, complexo olivar inferior, camadas intermediárias e
profundas do CS, complexo pré tectal, núcleo perioculomotor (núcleo intersticial de
cajal, núcleo de Darkschewitsch e núcleo da comissura posterior), núcleo rubro, núcleo
cuneiforme, corno ventral da medula espinal (especificamente na região cervical),
núcleo dorsal lateral, vários núcleos talâmicos (parafascicular, médio central,
paracentral, ventromedial, reuniens e lateral central), núcleos da base (globo pálido, SN,
Núcleo entopeduncular), FIG, núcleo central da amigdala, rafe, pituitária posterior,
habenula, bulbo olfatório, órgão subfornical, núcleos hipotalâmicos (núcleo posterior,
dorsal, lateral, NQS) e a banda diagonal de Broca (Ricardo, 1981; Kolmac et al, 1998;
Lechner et al, 1993; May et al, 1997; Watanabe e Kawana, 1982; Kim et al, 1992;
Wagner et al, 1995; Çavdar et al, 2006, Moga e Moore, 1997; Shaman–Lagnado et al,.
1985; Krout et al, 2002, Power et al, 2001; Mitrofanis, 2005;Heise e Mitrofanis, 2004;
Trageser e Keller, 2004; Gaillard et al, 2013; Morin, 2013; Da Silva et al, 2013).
14
1.4 Aspectos Funcionais da ZI
Os vários estudos sobre a neuroquímica e as conexões auxiliaram os
pesquisadores a propor prováveis funções para ZI, e a partir disso as pesquisas mais
recentes detalham sobre como a ZI atua no processamento de diversas informações,
através de estudos farmacológicos, eletrofisiológicos e de lesão. Mitrofanis (2005) faz
uma revisão geral sobre os estudos sobre a ZI, e aponta quatro funções gerais
desempenhadas pela ZI: Controle da atividade visceral, manutenção da postura e
locomoção, Atenção e excitação. Outros estudos ressaltam a importância da ZI no
processamento da informação nociceptiva.
O envolvimento da ZI em funções como a ingestão alimentar e hídrica,
comportamento sexual e mudanças na função cardiovascular exemplificam bem a sua
importância sobre a atividade visceral (Mitrofanis, 2005). Estudos de lesão, bem como
injeções de lidocaína na ZI, induzem um aumento de ingestão de comida e água,
sugerindo que a ZI atua em mecanismos de inibição dos sinais de saciedade (Tonelli e
Chiaraviglio, 1993). Em (1995), esses mesmos autores também verificaram que a
ativação do receptor D2 de dopamina (DA) na ZI inibe a ingestão alimentar e hídrica. A
ZI é alvo de diversos sistemas neuronais, entre eles GABA, DA serotonina (5-HT),
orexina, hormônio de concentração de melanina, que estão envolvidos com a liberação
de gonadotrofina (Siddiqui et al, 2004). Também há relatos que a injeção de Lglutamato na ZI diminui a frequência cardíaca e a pressão arterial (Spencer et al, 1988).
Estudos eletrofisiológicos e farmacológicos, estimulando ou inibindo esses sistemas,
detectaram que os neurônios da ZI apresentam características intrínsecas de membrana
que geram disparos rítmicos espontâneos (Trageser e Keller, 2006). A ZI se projeta para
o bulbo olfatório de ratos, estrutura fundamental para a percepção do ambiente dos
roedores em geral. Especula-se que a ZI, que recebe projeção do rt, serve como um
intermediário que modula a atividade dos neurônios do bulbo olfatório, alterando seu
padrão de atividade elétrica (Uemura-Sumi et al, 1985).
As conexões da ZI com o núcleo interpósito cerebelar (Aumann et al, 1996;
Mitrofanis e deFonseka, 2001), núcleo rubro (Mitrofanis, 2002), a região cervical da
medula espinal (Shaw e Mitrofanis, 2002), núcleo pontino (Mihailoff, 1995), e do CS
suportam a concepção da atividade modulatória da ZI sobre a manutenção da postura e
da locomoção. Experimentos farmacológicos também ratificaram o envolvimento da ZI
15
com funções motoras, como o trabalho de Supko et al (1991), que verificaram que a
injeção unilateral de L-glutamato age especificamente em receptores AMPA e cainato, e
provocam aumento de mobilidade, seguido de mudança postural. Em contrapartida, a
ativação de receptores de GABA na ZI diminui a atividade locomotora (Wardas et al,
1988). A ZI também apresenta conexão com o CS, atuando na modulação dos
movimentos dos olhos e da cabeça (Moschovakis, 1996). Esta modulação ocorre através
de células GABAérgicas localizadas na porção ventral da ZI, corroborado por estudos
eletrofisiológicos, que detectaram que a inibição da células da ZI sobre as células
coliculares, e farmacológicos, onde a administração de um agonista (mucimol) ou de um
antagonista (bicuculina) provocam movimentos irregulares (“tilts”) nos olhos e na
cabeça (Murer e Pazo, 1993). Outro importante estudo demonstrou evidências de que a
ZI é organizada somatotopicamente (Nicolelis et al, 1992), e outros que a ZI possui uma
conexão com os núcleos da base, núcleos fundamentais para a execução de movimentos
voluntários (Heise e Mitrofanis, 2004). Ainda no que tange a sensibilidade, verificou-se
que a ZI apresenta ativação neuronal rítmica, e que esse padrão de disparo é muito
importante para a sensibilidade, regulando, por exemplo, a atividade dos músculos das
vibrissas em ratos da linhagem Long Evans, apresentando queda significativa na taxa de
disparo espontâneo, alterações estas também documentadas em células corticais, em
indivíduos com lesão unilateral da ZI (Shaw et al, 2013).
Trabalhos realizados mostram que a ZI é envolvida no processamento
nociceptivo. A ZI recebe expressiva entrada de fibras do tracto espinotalâmico, além de
ter conexão com o núcleo posterior do tálamo, substância cinzenta periaquedutal, núcleo
pretectal anterior, núcleo tegmental pedunculopontino e núcleo magno da rafe, todas
sendo estruturas envolvidas com o processamento nociceptivo (Trageser e Keller, 2004;
Trageser et al, 2006; Masri et al, 2011). Um recente estudo detectou uma forte e rápida
inibição nociceptiva após injeção de glutamato na ZI (Petronilho et al, 2012). Estudos
mais detalhados vêm mostrando que essas conexões exercem forte influência sobre a
atividade destes núcleos supracitados e da ZI, e que essas conexões são
predominantemente inibitórias, ou seja, a ZI pode atuar nesses núcleos inibindo a ação
destes, ou estes inibindo a ação da ZI, ambos provocando diminuição da sensação
dolorosa. Os mecanismos destas alças regulatórias não são totalmente elucidados, mas
mostram o inegável papel da ZI sobre a nocicepção (Trageser e Keller, 2006; Trageser
et al, 2004; Masri et al, 2011, Petronilho et al, 2012).
16
1.5 Projeções retinianas
No sistema nervoso central dos mamíferos, a entrada de luz proveniente da retina
alcança dois sistemas funcionais distintos: o sistema formador de imagem, responsável
pela formação das imagens do ambiente, e o sistema não formador de imagem,
responsável pela integração visuomotorae da geração e regulação dos ritmos biológicos.
Outro grupo de fibras oriundas da retina, projetam-se para áreas classicamente nãovisuais, envolvidas com diversas outras funções e dentre elas a ZI, região de interesse
neste estudo.
O sistema formador de imagem, classicamente denominado de sistema visual
primário, é composto por vários conjuntos neuronais localizados no diencéfalo e
mesencéfalo são responsáveis pela formação de imagens. O núcleo geniculado lateral
dorsal (GLD) é principal estação de retransmissão do sinal visual (Jones, 2007). Já o
GLV está envolvido em funções como estimulação visual e visuomotora (Jones, 2007). O
complexo pré tectal um conjunto de núcleos localizados na transição entre o mesencéfalo
e o diencéfalo, sendo responsável pelo controle do reflexo pupilar (Kaas e Huerta, 1988).
Este complexo foi alvo de estudos no macaco-de-cheiro (Saimiri sciureus), que o dividiu
em cinco núcleos: Pré tectal anterior, medial e posterior, núcleo o trato óptico e núcleo
olivar pré tectal, todos eles recebendo projeção da retina (Hutchins e Weber, 1985). Outro
componente do sistema formador de imagem é o CS. Este apresenta uma estrutura
laminar, geralmente contendo sete camadas, sendo as camadas superficiais as que
recebem aferência retiniana. O CS está envolvido com integração vísuomotora e o
controle dos movimentos dos olhos e da cabeça (Kaas e Huerta, 1988).
O Sistema não formador é composto por quatro pequenos núcleos mesencefálicos:
núcleo terminal dorsal, lateral, medial e o núcleo intersticial do fascículo superior
posterior (Blanks et al, 1995; Kaas e Huerta, 1988), responsável pela integração sensório
motora dos movimentos da cabeça e do pescoço (Simpson, 1984; Giolli et al, 2006).
Classicamente, esse conjunto de núcleos é chamado de sistema óptico acessório.
Juntamente com esses núcleos mesencefálicos, existem estruturas responsáveis pela
geração e modulação dos ritmos circadianos, e essas estruturas compõem o sistema de
temporização circadiana. O sistema de temporização é formado por estruturas neurais
osciladoras, moduladoras e vias de sincronização (Lima et al, 2012), orquestradas pela
atividade do NSQ do hipotálamo, núcleo que recebe forte projeção da retina através do
trato retino hipotalâmico. Outra importante estrutura que compõe o sistema de
17
temporização circadiana é o FIG, que se trata de uma lâmina celular intercalada entre o
GLD e o GLV, que recebe projeção bilateral da retina. (Moore e Lenn, 1972; Moore,
1973; Morin e Allen, 2006; Cavalcante et al, 2006; Morin, 2013).
1.6 Projeções retinianas para núcleos classicamente não visuais
Com o desenvolvimento de técnicas utilizando traçadores mais sensíveis, os
pesquisadores começaram a detectar projeções retinianas para áreas classicamente não
visuais. Diversas áreas talâmicas consideradas não visuais foram descritas como retinorecipientes, como os núcleos anterodorsal e lateral posterior (Kudo et al., 1988;
Youngstrom et al., 1991; Martinet et al., 1992; Fite e Janusonis, 2001). No tronco
encefálico, projeções retinianas foram detectadas no núcleo dorsal da rafe (Foote et al.,
1978; Shen e Semba, 1994; Fite et al., 1999; Fite e Janusonis, 2001), no núcleo
parabraquial (Fite e Janusonis, 2002; Engelberth et al., 2008), como também no CS
(Itaya e Van Hoesen, 1982). Projeções retinianas também foram descritas nos núcleos
intralaminares e da linha média (Cavalcante et al.. 2005), no núcleo habenular lateral
(Qu et al., 1996.). O tubérculo olfatório, o complexo amigdalóide no prosencéfalo basal
e o córtex piriforme são outros exemplos de terminais retinianos não envolvidos com o
sistema formador de imagem (Cooper et al, 1993; Martinet et al, 1992; Mick et al,
1993; Herbin et al, 1994; Elliot et al, 1995).
Considerando especificamente o mocó, o trabalho de Nascimento Jr, et
al.,(2010) detectou a presença de projeções retinianas para o núcleo médio dorsal do
tálamo (MD), conexão até então inédita na literatura, sendo mais um exemplo de
estrutura retinorecipiente e para o PVT (Nascimento Jr et al, 2008).
18
1.7 Sujeito experimental
O mocó (Kerodon rupestris) é um roedor pertencente à família caviidae, nativo
da caatinga do nordeste brasileiro, também com presença registrada no norte do estado
de Minas Gerais (Cabrera, 1961) e com introdução bem sucedida na ilha de Fernando de
Noronha em 1967 (Oren, 1984). Animais dessa família são dotados de grande
capacidade de adaptação aos mais diversos tipos de ambiente, entretanto o mocó exibe
uma preferência por habitar regiões áridas de pedreiras com várias fendas e rachaduras,
onde costuma ficar alojado. Considerando a classificação filogenética baseada em
aspectos morfológicos e comportamentais, o gênero kerodon, a que pertence ao mocó, é
agrupado monofileticamente com os gêneros Cavia, Galea e Microcavia, compondo a
família Caviidae (Cabrera, 1961; Lacher, 1981), entretanto, considerando aspectos
genéticos, o gênero kerodon é incluído na família hydrochaeridae, a mesma família da
capivara, pertencente ao gênero Hydrochaeris (Rowe e Honeycutt, 2002).
Figura 1: Área de distribuição do mocó
Figura 2: mocó (Kerodon rupestris)
19
O mocó apresenta coloração cinza clara, castanho ferruginoso na região caudal e
no dorso, um pouco acastanhada nas patas e branco na região cervical, podendo atingir
30cm de altura e pesar 1kg quando adulto (Moojen, 1952; Carvalho, 1969). As patas
dotadas de coxins calosos e unhas rígidas lhe confere ótima habilidade saltatória e para
escalar, apesar de não possuir garras e cauda, adaptações comuns em animais com essas
habilidades. Tem olfato e audição bastante aguçados, o que lhes permite detectar a
presença de seus predadores a uma longa distância (Carvalho, 1969).Sua alimentação
composta principalmente de cascas de árvores, com preferência para o mufumbo
(Cobretum leprosum), Parreira Brava (Cissampelos pareira) e a faveleira (Cnidoscolus
phyllacanthus). Na ausência dessas árvores, o mocó alimenta-se de gramíneas em geral
(Lacher, 1981; Carvalho, 1969). O mocó tem um período médio de gestação de 65 dias,
com número médio de 1,2 filhotes por gestação. Apesar da baixa quantidade de filhotes
gerada por gestação, a reprodução ocorre durante o ano todo, exceto durante os meses
de abril a junho, e o baixo período gestacional garantem uma elevada produção de
filhotes durante o ano (Lacher, 1981).
Seu padrão de atividade locomotora mostra que nos dias mais escuros o mocó
sai para se alimentar durante a manha e a tarde, enquanto que nos dias mais claros a sua
atividade concentra-se no período noturno (Carvalho, 1969). Sousa e Menezes (2006)
fizeram a caracterização do ritmo de atividade do mocó em condições controladas de
laboratório, e verificaram que o mocó apresenta atividade durante todo o dia, com picos
de atividade nas fases do amanhecer e entardecer, sugerindo assim um comportamento
predominantemente crepuscular. Desde então, o mocó vem sendo utilizado como
modelo experimental em nosso laboratório, e estudos prévios demonstraram projeções
retinianas para o PVT (Nascimento Jr et al, 2008) e MD (Nascimento Jr et al, 2010a),
descrição do TRH e da neuroquímica do NQS e do FIG (Nascimento Jr et al, 2010b).
Mais recentemente, foram descritos os grupamentos serotonérgicos (Soares et al, 2012)
e dopaminérgicos (Cavalcanti, 2011), além de um estudo detalhado sobre a anatomia do
olho e análise da neuroquímica da retina do mocó (Oliveira, 2013), bem como a
descrição das fibras serotonérgicas dos núcleos intralaminares e um estudo comparativo
entre a neuroquímica do núcleo médio dorsal do tálamo do mocó com o primata do
novo mundo Callitrhix jacchus (Silva, 2013; Sousa et al, 2013). À longo prazo, a meta é
torná-lo um modelo experimental nas áreas de comportamento e fisiologia, para os
quais os estudos neuroanatômicos fornecem embasamento essencial.
20
1.8 Justificativa
Considerando a importância da ZI no controle e modulação de diversas funções
do organismo, bem como de sua atual importância clínica em relação à alternativas de
tratamentos para doenças neurodegenerativas, como esclerose múltipla e mal de
Parkinson, é de fundamental conhecer e esclarecer características neuroanatômicas e
neuroquímicas da ZI. Também vale destacar que, mesmo com os avanços dos estudos,
pouco se sabe sobre como a ZI interage com tantas regiões do sistema nervoso, que
desempenham funções tão distintas, indo desde locomoção até controle hormonal.
Quanto
ao
modelo
experimental,
o
mocó
apresenta
características
morfofuncionais e hábitos comportamentais que garantem singularidades quando
comparados com outros animais da ordem Rodentia. Principalmente em relação ao
nicho temporal crepuscular que ele exibe, o mocó é ideal para estudos cronobiológicos
comparativos, uma vez que os demais modelos experimentais clássicos são tipicamente
diurnos e noturnos. Essas características, peculiaridades e estudos prévios vão cada vez
mais consolidando o mocó como um modelo experimental confiável. Recentemente o
mocó entrou na lista de espécies ameaçadas de extinção da International Union for
Conservation of Nature, órgão mundial que atenta para a questão da preservação e
conservação biológica (Catzeflis et al, 2008). Sendo assim, cresce exponencialmente em
importância os estudos de qualquer natureza sobre o mocó, uma vez que existe um
grande risco de perda de biodiversidade em um bioma endêmico como a caatinga. Por
isso, estudos comportamentais e anatômicos podem ajudar a preservar esta espécie e a
manter o ecossistema ecologicamente equilibrado.
21
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Caracterizar a citoarquitetura e o conteúdo neuroquímico da ZI do mocó
(Kerodon rupestris), bem como a aferência óptica presente neste núcleo nesta espécie.
2.2 Objetivos específicos
• Definir citoarquitetonicamente as subdivisões da ZI do mocó.
• Mapear e descrever os aspectos morfológicos das projeções retinianas
marcadas positivamente para CTb na ZI do mocó.
• Caracterizar o conteúdo neuroquímico presente na ZI do mocó, utilizando o
padrão imunorreativo para 5-HT, GFAP, NOS, TH, CB, CR e PV.
22
3. METODOLOGIA
3.1 Anestesia
Os 4 animais utilizados neste trabalho foram anestesiados conforme o seguinte
protocolo: inicialmente foi utilizado como medicação pré-anestésica o sulfato de
atropina na dosagem de 0,04 mg/Kg, via subcutânea, e 2 mg/Kg de Tramadol, via
intramuscular; passados 15 minutos, os animais receberam ketamina e xilazina,
administradas após serem misturados na mesma seringa, na dosagem de 20 mg/Kg e
2mg/Kg respectivamente. O plano anestésico, bem como sua manutenção, foi realizado
por meio de máscara com oxigênio e isoflurano.
3.2 Injeção intra ocular
Após a completa anestesia de um deles, este foi submetido a uma injeção
intraocular unilateral de 70μl de uma solução aquosa da CTb (List Biological
Laboratories, Inc., Campbell, CA)a 5%, contendo dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% com
a finalidade de aumentar a permeabilidade e, consequentemente, melhorar a captação do
traçador. A injeção ocorreu no olho esquerdo, conforme protocolo do laboratório,
utilizando-se uma agulha calibre 30 (8,00mm X 0,3mm), lentamente, sob pressão, com
auxílio de uma microbomba propulsora, a qual impulsiona a solução em um fluxo de
1μl/minuto. Essa agulha foi introduzida na junção esclera-corneal, atingindo o corpo
vítreo em um ângulo de aproximadamente 45º. Após o término do fluxo da solução, a
agulha foi mantida por mais 15 minutos, visando diminuir um possível refluxo da
solução.
Encerrada esta etapa de injeção intra-ocular, o animal permaneceu em
observação a fim de assegurar a normalidade das funções vitais, e em seguida, retornava
à gaiola de isolamento onde permaneciam por um período de cinco dias, tempo ideal
para o transporte do traçador. Passado este período de sobrevida, os animais eram
novamente anestesiados, utilizando o mesmo protocolo descrito para a injeção de CTb,
para que fosse iniciado o processo de perfusão transcardíaca.
23
3.3 Perfusão
Atingido o plano anestésico, cada animal foi submetido à perfusão transcardíaca,
que compreende os seguintes passos:
1 –Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame e sob
ponto de água.
2 –Toracotomia, com incisão de pele, músculos e arco costal, sendo estes
removidos em bloco, para exposição do coração.
3 –Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha de dimensões
17mm x 1,5 mm, a qual é direcionada para o cone arterioso, seguindo-se uma incisão no
átrio direito. A agulha foi conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer), passandose 300ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 com heparina
(Parinex, Hipolabor, 2ml/1000 ml de solução salina) durante um tempo estimado de seis
minutos.
3.4 Remoção dos Encéfalos
Finalizada a etapa de perfusão, os animais foram posicionados no aparelho
estereotáxico para roedores. Depois de se fazer uma incisão longitudinal na pele e
rebatê-la lateralmente, fez-se a limpeza da superfície óssea, facilitando a visualização do
bregma e do lambda, os quais ficaram nivelados na mesma altura dorsoventral,
ajustando-se a barra dos incisivos. Em seguida, os ossos da calota craniana foi removido
com o uso de broca e trocater, expondo-se o encéfalo. Estes foram retirados
delicadamente para evitar danos, preservando os olhos e nervos ópticos (uma vez que
estes animais foram também utilizados em outra pesquisa). Logo após esta etapa, os três
blocos foram armazenados em uma solução contendo sacarose a 30% em tampão
fosfato (TF) 0,1M, pH 7,4, a 4 ºC, até serem submetidos à microtomia.
3.5 Microtomia
Terminada a etapa de pós-fixação e imersão em tampão sacarose 30%, os
encéfalos foram submetidos à microtomia cuja espessura dos cortes foi padronizada em
30µm.Os encéfalos foram congelados por gelo seco e seccionados em micrótomo de
deslizamento, obtendo-se secções coronais. Estas foram coletadas em um meio líquido
de tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, distribuídas seqüencialmente em 6 compartimentos, de
24
maneira cíclica e alcoóis cada. Os cortes de um compartimento foram imediatamente
montados em lâminas de vidro gelatinizadas e submetidas à coloração pelo método de
Nissl para permitir uma melhor demarcação das estruturas. Os cortes dos demais
compartimentos foram transferidos para solução anticongelante e conservados a -20 ºC
para utilização posterior em procedimentos de imunohistoquímica.
3.6 Método de Nissl
A coloração pelo método de Nissl é constituída por uma série de etapas que se
iniciam com a desidratação do tecido passando-o em concentrações crescentes de
alcoóis etílicos (70% - 1 vez, por 1h, 95% - 2 vezes, 3 minutos cada, 100% - 2 vezes, 3
minutos cada). Posteriormente são deslipidificados em dois recipientes com xilol, por 3
e 30 minutos, nessa ordem. Na seqüência, o tecido é reidratado em concentrações
decrescentes de 25lcoóis (mesmo processo anterior, mas no sentido inverso),
submergido em água destilada por 2 minutos, colocado 1 minuto na solução de thionina
a 0,25%. Por fim os cortes foram rapidamente submergidos e emergidos por 1 minuto
em água destilada e novamente desidratados e deslipidificados como descrito
anteriormente, sendo acrescentada apenas uma etapa (antes da desidratação em álcool
100%). Os cortes foram deslipidificados em xilol em dois recipientes (2 e 4 minutos,
respectivamente) e finalmente cobertos com lamínula utilizando como meio
demontagem o ERV-Mount.
3.7 Imunohistoquímica
Para iniciar a imunohistoquímica, foi feito um pré-tratamento (incubação em
peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,3% em TF 0,1M, pH 7,4) por 20 minutos, com a
finalidade de abolir artefatos causados pela liberação de peroxidases endógenas. No
início, entre as soluções e ao final desta fase, os cortes foram submetidos a 5 lavagens
de 5 minutos cada em TF 0,1 M, pH 7,4.
O próximo passo consistiu na incubação dos cortes em anticorpo primário,
permanecendo em incubação por 16 horas em rotor com rotação lenta. Ao fim deste
período, os cortes passaram por 5 lavagens em TF 0,1 M pH 7,4, em agitador orbital e
em seguida colocados em contato com o anticorpo secundário, por 90 minutos à
temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor. Os anticorpos utilizados, bem como
suas concentrações, estão listados na tabela 1.
25
Tabela 1: Especificação das substâncias, bem como seus fabricantes e diluições,
utilizadas nos procedimentos de imunohistoquímica.
Antígeno
CTb
Anticorpo primário
Cabra [1:5000]
List Biological
Anticorpo secundário
Soro normal/ BSA
Asno [1:1000]
Sigma
Asno
[1:50]
TH
Camundongo [1:10000] Sigma
Cabra [1:1000] Jackson
BSA
NOS
Coelho [1:1000] Sigma
Cabra [1:1000] Jackson
BSA
CB
Coelho [1:1000] Sigma
Cabra [1:1000] Jackson
BSA
CR
Coelho [1:1000] Sigma
Cabra [1:1000] Jackson
BSA
PV
Coelho [1:5000] Sigma
Cabra [1:1000] Jackson
BSA
5-HT
Coelho [1:5000] Sigma
Jumento [1:1000] Jackson
BSA
GFAP
Camundongo [1:1000] Sigma
Cabra [1:1000] Jackson
BSA
Em seguida, os cortes passaram por 5 lavagens em TF 0,1 M em agitador orbital
e depois colocados na solução do complexo avidina-biotina (Protocolo ABC, Kit elite
da Vector), numa diluição de 1:100 em Triton X-100 a 0,4%, contendo NaCl, por 90
minutos à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor. Terminada esta fase, as
secções foram novamente submetidas a 5 lavagens em TF 0,1 M em agitador orbital.
Para visualização da reação, as secções foram postas em meio contendo H2O2
como substrato e a 3,3’,4,4’tetrahidrocloreto-diaminobenzidina (DAB), utilizada como
cromógeno durante 5 minutos e após esta, os cortes foram submetidos a mais 5 lavagens
em TF 0,1 M em agitador orbital.Os cortes foram então montados em lâminas
gelatinizadas, que após secas foram imersas em solução de tetróxido de ósmio a 0,05%
com intuito de intensificar a reação. Após as etapas de desidratação, em baterias de
álcool de graduação crescente até o álcool absoluto, e diafanização em xilol, as
lamínulas foram montadas sobre os cortes com o uso de ERV-Mount.
26
3.8 Análise das imagens
As secções do mesencéfalo, coradas pelo método de Nissl e/ou submetidas à
imunohistoquímica foram examinadas ao microscópio óptico (Olympus BX41) em
campo claro. Imagens digitais foram obtidas de secções representativas usando uma
videocâmara digital (Nikon DXM1200) e Motican 5.0 M camera. As imagens foram
analisadas, corrigidas minimamente para brilho e contraste e os desenhos
esquemáticos foram montados no software Canvas X® (ACD Systems, Victoria,
BritishColumbia, Canada). Os resultados foram documentados em fotomicrografias e
esquemas construídos a partir das mesmas no Power Point.
Para análise das fibras e terminais retinianos, foi utilizado o software Canvas
X Para aferir aspectos morfológicos nas fibras retinianas na ZI. Esses terminais
retinianos foram classificados em 3 tipos, baseado no tamanho do terminal, sua
localização pela fibra e pela complexidade de configuração. Classificação semelhante
foi proposta por Guillery et al (2001): botões de passagem, botões terminais e botões
em cluster. Os axônios foram classificados de acordo com sua espessura: Fibras Classe
I e Classe II.
27
4. RESULTADOS
4.1 Citoarquitetura Nissl
O método de Nissl, que utiliza o corante thionina, mostrou-se eficaz para a
marcação dos neurônios e delimitação da ZI do mocó. A ZI apresenta 4 porções: ZI
rostral (ZIr), ZI dorsal (ZId), ZI ventral (ZIv) e ZI caudal (ZIc). A ZIr está em
continuidade com o rt, entre o tracto mamilotalâmico (mt) e o fórnix (f) e dorsal à
capsula interna (ci) (Figura 3A). Apresenta neurônios densamente agrupados na região
medial. Seguindo a orientação do eixo rostrocaudal, a ZI média, localizada dorsalmente
ao núcleo subtalâmico (sub) e ventralmente ao lemnisco medial (ml), é subdividida em
ZId e ZIv (Figura 3B). Essa subdivisão é feita baseada na diferença citoarquitetônica e
da
quantidade
dos
neurônios.
A
ZId
apresenta
neurônios
com
formato
predominantemente fusiforme, mais esparsamente distribuídos e com menor intensidade
de coloração, Já a ZIv apresenta neurônios fusiformes e ovalados, com maior tamanho,
intensidade de coloração e quantidade em comparação com a ZId. A ZIc, localizada
dorsalmente à SN, ventralmente a radiação talâmica superior (rts) e lateral ao fascículo
retroflexo (fr), possui regiões de maior concentração neuronal em sua região mais
medial e mais lateral (Figura 3C) com formato fusiforme e irregular, respectivamente.
28
29
4.2 Projeção retiniana
Pequenas fibras e terminais IR-CTb foram detectados na ZI contralateral do
mocó. Essas fibras estão presentes apenas na ZIc, estando dispostas lateromedialmente e
apresentando numerosas varicosidades ao longo do seu maior eixo, bem próximas ao
GLD (Figura 4A). No caso registrado, foram contabilizadas 123 varicosidades
contabilizadas em 3 secções da ZIc, onde 62,6% são botões de passagem, com tamanho
médio de 1,77 µm² com 1,40 de desvio padrão (DP), enquanto que as varicosidades
localizadas nas extremidades da fibra, denominados botões terminais representam
26,8%, com tamanho médio de 1,70 µm² e DP=1,32 (Figura 4D). Demais varicosidades
são do tipo cluster, correspondendo a 10,6%, com tamanho médio de 2,92 µm² e DP=
1,49. As fibras são de pequeno calibre, sendo classificadas como fibras Classe II.
30
31
4.3 Neuroquímica
TH
Na ZI do mocó, células e fibras IR-TH foram detectadas na ZIr, sendo possível
visualizar poucas células marcadas (Figura 5A). Estes neurônios apresentam formato
triangular e irregular, com axônios de pequeno tamanho (Figura 5B).
Figura 5: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade para TH em A (tracejado em preto) e em B detalhando a
morfologia dos neurônios e das extensões IR-TH. Abreviações: vide lista de
abreviações. Barra: 100μm em A e 30μm em B.
32
NOS
A ZI do mocó apresenta neurônios IR-NOS em todas as subdivisões da ZI, com
formato ovoide e fusiforme, com pequenas varicosidades (Figura 6D). Na ZIr são
visualizadas células IR-NOS concentradas na porção medial (Figura 6A). A ZIv possui
mais células marcadas em comparação com a ZId, localizados principalmente na região
lateral, próximo ao rt (Figura 6B). Na ZIc, neurônios IR-NOS concentram-se na região
lateral, com poucas células presentes na região medial (Figura 6C).
Figura 6: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra NOS nas subdivisões da ZI (tracejado em preto)
seguindo a sequência rostral (A), médio (B) e caudal (C). D representa a caixa
delimitada em B. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra: 300μm (A-C), 40μm
(D).
33
5-HT
Na ZI do mocó identificamos a marcação de fibras e varicosidades IR-5-HT em
todas as subdivisões (Figura 7 A-C). Na ZId e ZIv, uma maior quantidade de fibras e
varicosidades foram detectadas (D).
Figura 7: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra 5-HT nas subdivisões da ZI (tracejado em preto)
seguindo a sequência rostral (A), médio (B) e caudal (C). Em D, ampliação da caixa em
B detalhando as fibras IR-5-HT na ZId. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra:
1mm A-C e 40μm em D.
34
GFAP
Células IR-GFAP foram encontradas na ZIr (Figura 8A), ZId (Figura 8B) e ZIc
(Figura 8C), enquanto que na ZIv a marcação foi negativa (Figura 8B). Células
estreladas com pequenas radiações estão presentes nas 3 regiões marcadas, mas na ZIr
também detectamos células maiores, de formato ovoide (Figura 8D).
Figura 8: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra GFAP nas subdivisões da ZI (tracejado em preto)
seguindo a sequência rostral (A), médio (B) e caudal (C). D representa a caixa
delimitada em A. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra 300μm A-C e D 40μm.
35
CB
Células IR-CB foram detectadas na ZIr (Figura 9A), apresentando formato
alongado e irregular (Figura 9B). Na ZId, ocorre uma grande quantidade de neurópila,
enquanto a ZIv há uma menor quantidade (Figura 9B). Na ZIc, ocorre uma
concentração de neurópila na porção lateral, mesma região onde encontra-se a projeção
retiniana (Figura 9C).
Figura 9: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra CB nas subdivisões da ZI (tracejado em preto)
seguindo a sequência rostral (A), médio (B) e caudal (C). D representa a caixa
delimitada em A. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra 100μm em A, 300μm
em B e C, D em 40μm.
36
CR
Neurônios IR-CR apresentam formato ovoide, localizados na ZIr, ZId e ZIc. Na
ZIr, ocorre uma concentração desses neurônios próximos ao mt (Figura 10A). Na ZId
detectamos grande marcação por toda sua extensão. Em contrapartida, a ZIv não
apresenta nenhuma imunorreatividade para CR (Figura 10B e D). Na ZIc, os neurônios
estão esparsamente distribuídos em toda sua extensão (Figura 10C).
Figura 10: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra CR nas subdivisões da ZI (tracejado em preto)
seguindo a sequência rostral (A), médio (B) e caudal (C). D representa a caixa
delimitada em B. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra: 500μm (A-C), 120μm
(D).
37
PV
Células e neurópila IR-PV foram detectadas na região medial da ZIr (Figura
11A) e intermédia da ZIc (Figura 11C), apresentando formato ovoide e irregular (Figura
11B).
Figura 11: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó,
mostrando a imunorreatividade contra PV na ZIr em A e ZIc em C. Em B corresponde
ampliação da caixa delimitada A.Abreviações: vide lista de abreviações. Barra: 100μm
(A e C), 40μm (B).
38
Tabela 2: Resumo esquemático da distribuição das substâncias neuroativas nas
subdivisões da ZI do mocó.
Substância/Divisão
ZIr
ZId
ZIv
ZIc
Projeção da retina(CTb)
-
-
-
+
TH
+
-
-
-
NOS
+
-
+
+
5-HT (fibras)
+
+
+
+
GFAP
+
-
+
-
CB
+
-
-
-
CR
+
+
-
+
PV
+
-
-
+
39
5. DISCUSSÃO
5.1 Citoarquitetura
A ZI do mocó está dividida em 4 porções, de acordo com a análise
citoarquitetônica observada em nossos resultados. Devido a grande diversidade celular
da ZI e algumas dificuldades em delimitar claramente suas subdivisões, o número destas
varia de autor para autor: de 2 a 6 em ratos, entretanto, os estudos mais recentes
consideram apenas 4, de 2 a 4 em macacos e superior a 5 em gatos (Mitrofanis, 2005).
Em rato, a ZI é classicamente subdividida em quatro regiões: rostral, dorsal,
ventral e caudal. Na região rostral corre uma predominância de células fusiformes, com
raras células ovoides. A região dorsal possui células ovoides com tamanho médio,
enquanto que na ventral as células são densamente agrupadas e com formato fusiforme.
Por fim, a região caudal apresenta células de tamanho pequeno a médio com formatos
fusiforme, ovoide e multipolar, podendo também apresentar células multipolares com
grande tamanho (Kolmac e Mitrofanis, 1999; Power et al, 2001) Em um estudo que
focou somente as porções dorsal e ventral, foram detectados neurônios com morfologia
bipolar e fusiforme, com grandes dendritos (Trageser e Keller, 2006).
Na ZI do cachorro, foram delimitadas 5 regiões, rostral, dorsal, ventral, caudal, e
uma extensão do nível rostral, denominada porção dorsolateral. Esta porção dorsolateral
é típica em carnívoros, apesar de não ter sido identificada no furão. Os neurônios têm
diversos formatos e tamanhos em todas as porções, mas com prevalência de neurônios
de tamanho intermediário e formato fusiforme na porção rostral, formato ovoide de
pequeno tamanho na porção dorsal, formato triangular de tamanho intermediário na
porção ventral, e nas porções dorsolateral e caudal não houve uma prevalência de um
tamanho ou formato específico (Gorbachevskaya e Chivileva, 2008).
Apesar de haver diferenças entre as células, a delimitação dessas porções é
complicada, sobretudo nas porções rostral e caudal (Mitrofanis, 2005). Devido a essa
dificuldade de delimitação, vários autores consideram caracteríticas neuroquímicas e
funcionais para delimitar a ZI (Kuzemensky, 1977; Kawana e Watanabe, 1981;
Romanowskiet al, 1985; Nicolelis et al, 1995). A ZI apresenta uma riquíssima
diversidade neuroquímica, sendo detectadas mais de 20 substâncias neuroativas, e por
isso estas vem sendo utilizadas para auxiliar a delimitação das bordas e subdividir a ZI
em porções. Por exemplo, a PV é encontrada em células localizadas na porção ventral
da ZI, enquanto que a NOS é encontrada na porção dorsal no rato (Mitrofanis, 2005).
40
Aspectos funcionais, como já dito anteriormente, também auxiliam na
delimitação da ZI. Estudos realizados com traçadores neuronais retrógrados e
anterógrados demonstram que a região dorsal da ZI apresenta grande conexão com o CS
(Mitrofanis, 2005), enquanto que a regiaão ventral conecta-se com o núcleo rubro
(Mitrofanis, 2002a) e com regiões centrais no processamento auditivo (Mitrofanis,
2002b). A divisão da ZI, levando em conta apenas aspectos funcionais, mostra a
delimitação de subsetores funcionais específicos. Os subsetores mais bem estudados são
o visual (Power et al, 2001) e o auditivo (Mitrofanis, 2002b), e esses subsetores são
delimitados de acordo especificamente com os estudos de projeção levando em conta
outras regiões encefálicas envolvidas com a respectiva função, como por exemplo o CS,
GLD e córtex occipital para a visão, e o núcleo coclear, GLV, Coliculo inferior e córtex
temporal para a audição, todas essas se projetando para a ZI, e mostrando um padrão
convergente para regiões específicas. Isso mostra que a ZI é um importante centro de
convergência de diversas informações sensoriais, uma característica muito importante
para uma estrutura envolvida em tantas funções distintas de controle hormonal,
fisiológico e locomotor. É importante ressaltar que outros subsetores também foram
encontrados, como o somatossensorial, motor e límbico, além das conexões entre os
setores da ZI, além da conexão com a ZI contralateral (Mitrofanis, 2005), mostrando a
enorme complexidade dessa estrutura, e talvez por isso explicando sua riqueza
citoarquitetônica e neuroquímica.
41
5.2 Projeção retiniana
Os estudos sobre projeções retinianas fornecem uma melhor definição do trajeto
axonal, além de possibilitar uma visualização detalhada dos terminais, algo fundamental
para compreensão do funcionamento de diversos sistemas que utilizam a informação
visual (Rouiller e Welker, 2000). A CTb, a subunidade B da toxina colérica, é um
traçador axonal, altamente sensível, que atual tanto retrogradamente como
anterogradamente (Angelucci et al, 1996; Gaillard et al, 2013). Sua utilização como
traçador das vias retinianas tem sido amplamente empregada em diversos animais, como
pombo (Schimizu et al, 1994), primatas (Nakagawa et al, 1998; Costa et al, 1999;
Mitrofanis et al, 2004; Cavalcante et al, 2005; Engelberth et al, 2008; Lima et al, 2012)
e roedores (Youngstrom, 1991; Abrahamson e Moore, 2001;Mitrofanis, 2005; Gaillard
et al, 2013). No mocó, vários alvos retinianos já foram detectados utilizando CTb, como
o NSQ e FIG (Nascimento Jr et al, 2010a), MD (Sousa, 2013; Nascimento Jr et al,
2010b), PVT (Nascimento Jr et al, 2008), trabalhos estes que comprovam a eficácia da
CTb para estudos de traçados axonais nesta espécie. Em relação à ZI, detectamos a
presença de fibras e terminais IR-CTb na porção lateral da ZIc.
Em gatos, Matteau (2003) detectou fibras e terminais imunorreativos nas
porções medial e lateral da ZI. A morfologia dos axônios neste núcleo variou
dependendo se a entrada foi localizada no lado contralateral ou ipsilateral. Na ZI
contralateral, as fibras possuem configuraçãosemelhante a cordas, com varicosidades de
tamanho médio, enquanto que a ZI ipsilateral continham fibras curtas e varicosidades ao
longo de seu eixo. Em ambos os lados da ZI, os axônios apresentam pequeno calibre.
Em roedores, vários estudos demonstram projeções retinianas alcançando a ZI. Em
hamster, a porção medial da ZI recebe projeções da retina em forma de fascículos. O
autor sugere que a ZI recebe informações fóticas da retina e as integra com informações
do sistema de temporização circadiana, ambos atuando na modulação do
comportamento e da fisiologia (Youngstrom et al, 1991). Em camundongos, fibras
retinianas na ZI foram mostradas, mas não delimitaram a porção retinorecipiente
(Abrahamson e Moore, 2001). Em ratos, um estudo utilizando traçadores retrógrados e
anterógrados mostrou que região lateral das porções dorsal e caudal são
retinorrecipientes da ZI, além das outras principais regiões visuais como o córtex
occipital, CS e GLD. Este estudo comprovou a existência de um subsetor específico da
ZI para a visão, localizado na porção lateral da porção dorsal e caudal. Acerca deste
42
achado, sugere-se uma participação da ZI no processamento visual, especificamente em
relação aos movimentos dos olhos e da cabeça e de comportamentos sócio-sexuais
(Power et al, 2001). No rato do Nilo (Arvicanthis niloticus), uma pequena projeção
retiniana foi encontrada na porção dorsolateral da ZI (Gaillard et al, 2013). No sagui,
fibras e terminais IR-CTb foram detectadas na região ventral da porção caudal da ZI,
apresentando varicosidades (Lima, 2008).
Como já destacado na introdução, a ZI apresenta conexão com os principais
centros visuais, como o CS, GLD e córtex occipital. Entretanto, os estudos apontam que
a ZI é um ponto de integração em que a informação fótica atua para modular os
movimentos dos olhos e da cabeça, relacionada com a focalização ideal da imagem na
retina (Moschovakis, 1996; Mitrofanis, 2005), ou seja, não está diretamente ligado à
formação de imagem. Diversos estudos com o mocó (Nascimento Jr et al, 2010a;
Nascimento Jr et al, 2010b; Nascimento Jr et al, 2008) verificaram várias semelhanças
hodológicas, neuroquímicas e de projeções retinianas com outros roedores em outras
regiões do sistema nervoso, entretanto estudos comportamentais e estudos hodológicos
mais específicos são necessários para a compreensão desse mecanismo visuomotor, bem
como auxiliar a responder sobre aspectos evolutivos e ecológicos do mocó em seu
habitat natural. Além de estudos dessa natureza, um estudo anatômico do olho e do
crânio mostram diversas características que permite a identificação de adaptações de
cada espécie ao seu campo visual, o qual é peculiar para cada nicho temporal. O mocó
tem olhos laterais situados em órbita óssea bem constituída e musculatura extrínseca
bem diferenciada, pupila em fenda vertical e cristalino com ~45% do diâmetro axial do
olho. Características estruturais, neuroquímicas, bem como a distribuição de cones S e L
sugerem quem o mocó apresenta um maior ganho de sensibilidade à luz em detrimento
de uma melhor resolução da imagem, sendo compatível com seu padrão de atividade
crepuscular (Oliveira, 2013), dados comportamentais encontrados no trabalho de Sousa
e Menezes (2006). O estabelecimento dessa informação reforça a importância de
descrever a funcionalidade da ZI em função do nicho temporal explorado pelo mocó.
Vale novamente o destaque que as fibras IR-CTb foram encontradas na ZIc, um indício
inicial que caso exista um subsetor visual no mocó, este é localizado em uma região
diferente do rato, mostrando uma variabilidade no contexto morfológico entre esses
roedores.
43
No contexto das características sobre como as informações aferentes chegam em
seus alvos, diversos estudos demonstraram que a morfologia das fibras axonais e dos
terminais sinápticos apresentam diferenças importantes, e que essas diferenças também
refletem em diferenças funcionais, sobre como as informações são transportadas e
processadas. Fibras Classe I, ou Drivers, possuem terminais de grande tamanho, com
alta capacidade de potenciais excitatórios pós-sinápticos (PEPS) e ativam receptores
ionotrópicos, e no sistema visual, estas fibras são presentes em núcleos talâmicos
específicos para a formação de imagens, como o GLD, enquanto que Fibras classe II, ou
modulators, possuem terminais de pequeno tamanho, baixa capacidade de disparo de
PEPS e que ativam receptores glutamatérgicos metabotrópicos (Shermam e Guillery,
2011). As fibras retinianas da ZI do mocó são de pequeno calibre, e mais de 60% de
suas varicosidades encontram-se no eixo dessas fibras, ou seja, essa projeção retiniana é
composta por fibras do tipo II, com predominância de varicosidades do tipo botões de
passagem. Esses dados demonstram que a ZI recebe informação direta da retina, mas
não está envolvida com a formação de imagem, usando esta informação para outras
finalidades.
A ZI é uma importante estação de processamento e retransmissão de
informações, e essa projeção retiniana é um indício de que a ZI utiliza informação fótica
de forma a orientar e regular comportamentos, juntamente com outras propriedades
inerentes de disparo espontâneo enquanto o animal está em atividade (Mitrofanis, 2005;
Trageser e Keller, 2004; Trageser et al, 2006). Isso é interessante principalmente
quando consideramos o aspecto de locomoção, onde a ZI pode ter uma maior atividade
durante o período crepuscular, ajustando e otimizando as atividades do mocó nesse
período onde o mocó apresenta pico de atividade, e tendo menor atividade durante os
períodos com atividade locomotora reduzida. Como já dito, o mocó apresenta uma visão
que privilegia a detecção de luz em sacrifício de uma melhor resolução da imagem, e
considerando o nicho temporal explorado pelo mocó e seu nível trófico na cadeia
alimentar da caatinga, onde ocupa níveis primários, é importante para a sobrevivência
do
animal
que
centros
regulatórios
temporais,
fisiológicos,
locomotores
e
comportamentais, como a ZI, obtenham uma importante pista ambiental como a luz para
orquestrar o funcionamento do animal, e veremos adiante como a complexa rede
neuroquímica da ZI pode auxiliar nesse funcionamento.
44
5.3 Neuroquímica
TH
A DA é uma substância resultante da ação da enzima DOPA-descarboxilase
sobre a di-hidroxi-fenilalanina (DOPA), a qual deriva da tirosina por ação da TH (Marín
et al., 2005; Chen et al., 2008). É importante considerar que, nos últimos anos, a
expressão de TH em amostras encefálicas tem sido amplamente utilizada como
marcador molecular de DA neuronal, embasado por evidências provenientes de estudos
com ferramentas fisiológicas, hodológicas, farmacológicas, clínicas e de biologia
molecular, permitem assegurar que os grupamentos neuronais imunorreativos a TH no
mesencéfalo, diencéfalo, telencéfalo e retina são constituídos por neurônios produtores
de DA e, portanto, a imunorreatividade a TH pode ser considerada um marcador
molecular confiável para identificação de grupamentos dopaminérgicos (Prakash e
Wurst, 2006).
Neste estudo, foram visualizados neurônios IR-TH na região A13, que está
medialmente à ZIr, e também de poucos neurônios IR-TH na ZIr. Esses neurônios
possuem formato triangular e irregular (Figura 5A e B). De acordo com Abrahamson e
Moore (2001), a ZI é considerada um grupamento dopaminérgico (região A13), que
recebe projeção do PVT, ou região A14. Todas essas regiões apresentam conectividade
e propriedades farmacológicas dos sistemas dopaminérgicos nigroestriatal e
mesolímbico (Tonelli e Chiaraviglio, 1995). Outros estudos sugerem que esses
neurônios são responsáveis pelo controle de diversas funções hormonais, como a
inibição da liberação de prolactina, a secreção do hormônio luteinizante e do hormônio
de concentração de melanina, além de ser modular a ingestão hídrica e alimentar (Sita et
al, 2003). Alguns trabalhos mostram que a ZI apresenta conectividade dopaminérgica
com regiões hipotalâmicas laterais através de estudos com fluorescência (Bjorklund et
al, 1975) e que ratos com lesão na ZI comem menos que ratos controle (McDermott e
Grossman, 1980). Assim, é provável que neurônios IR-TH da ZI possam estar
envolvidos no controle de ingestão alimentar.
Desde o estudo de Mundinger em 1965, que verificou que a lesão cirúrgica da ZI
alivia os déficits motores característicos da doença de Parkinson, alerta-se para o
interesse desta região com esta doença. Estudos mais recentes, com estudos
eletrofisiológicos e com citocromo oxidase, um marcador de atividade metabólica, que
45
existe uma hiperatividade da ZI em ratos parkinsonianos (Perier et al, 2000). Além
disso, a estimulação de alta frequência da ZI melhora o tremor em pacientes com
esclerose múltipla, bem como a acinesia e bradicinesia em Parkinsonianos. Esses
resultados iniciais indicam que esta é uma região chave na geração de circuitos de
movimentos, e que a sua atividade anormal contribui para os sintomas da doença de
Parkinson. No entanto, há muito que não entendemos desse circuito emcasos normais,
sendo assim necessário um maior conhecimento acerca de ser funcionamento (Heise e
Mitrofanis, 2004), e expandir o conhecimento acerca das células IR-TH, bem como suas
características, citoarquitetura e projeções, é fundamental.
Um
trabalho
dopaminérgicos
do
realizado
mocó,
em
com
nosso
maior
laboratório
ênfase
nos
delimitou
núcleos
os
núcleos
dopaminérgicos
mesencefálicos: Zona retrorubral, SN pars compacta e Área Tegmentar Ventral.
Através da tecnica de imunohistoquímica, viu-se que neurônios IR-TH nessas regiões
apresentam formato bipolar, multipolar, ovoide e triangular (Cavalcanti, 2011),
características semelhantes aos neurônios IR-TH da ZI. O achado de neurônios IR-TH,
bem como a descrição da conexão entre a ZI e os núcleos da base são outros
importantes indicativos da influência da ZI na motricidade. Os núcleos da base são
estruturas chave no processamento da informação motora consciente, e que a lesão
desses núcleos provocam uma série de distúrbios como as coréias e o parkinsonismo.
Estudos mais recentes mostram que uma das possibilidades de tratamento ou de
amenizar os sintomas do parkinsonismo consiste na ativação da ZI, o que torna ainda
mais relevante do ponto de vista clínico.
46
NOS
A NOS é a enzima responsável pela conversão de L-arginina em óxido nítrico
(NO), que tem ação em processos inflamatórios e, no sistema nervoso, atua como um
neurotransmissor, mesmo sem preencher todos os requisitos básicos que caracterizam
um neurotransmissor convencional. De natureza gasosa e lipofílica, o NO no sistema
nervoso atua na modulação de transporte das monoaminas e na nitrosilação de
receptores glutamatérgicos N-Metil-D-Aspartato, ou NMDA (Pierucci et al, 2011),
influencia a síntese e liberação de outros neurotransmissores, desempenha um
importante papel na potenciação a longo prazo, na depressão de longo prazo e na
secreção neuroendócrina (Simon et al, 2013). Na ZI do mocó, encontramos células IRNOS na ZIr, ZIv e ZIc, e sem imunorreatividade na ZId. Em ratos, células IR-NOS são
abundantes na ZId e ausentes nas demais regiões (Kolmac e Mitrofanis, 1999;
Mitrofanis, 2005), mais uma vez mostrando variabilidade, agora
no contexto
neuroquímico, entre esses roedores.
Como já discutido, a ZI apresenta um importante papel na motricidade e na
regulação visceral do organismo, que sua lesão promovem um série de disfunções e que
sua eletroestimulação auxilia no tratamento do parkinson e da esclerose múltipla, e
muito discute-se sobre a participação dos neurônios dopaminérgicos da ZI nesses
fatores (Heise e Mitrofanis, 2004; Sita et al, 2003). Recentes estudos mostraram que o
NO tem papel chave na transmissão dopaminérgica, influenciando diretamente em seu
funcionamento, sendo também alvo de estudos neuroquímicos e no tratamento de
Parkinson. No trabalho de Del-Bel et al (2007), a administração de fármacos agonistas e
antagonistas para a NOS encefálica promovem aumento e diminuição, respectivamente,
da atividade locomotora em diversas espécies, e que existe uma pequena colocalização
neuroquímica entre NOS e TH, sugerindo que neurônios IR-TH sintetizam a NOS, que
acaba por modular a transmissão dopaminérgica (Pierucci et al, 2011). É importante
destacar a presença de células IR-NOS na ZIr do mocó, onde também existe neurônios
IR- TH, e que o NO pode estar modulando a ação dos neurônios dopaminérgicos.
47
5-HT
Estudos apontam que a ZI recebe informações de diversos sistemas neuronais,
que influenciam a liberação de gonadotrofina, entre eles, o sistema serotonérgico.
Verificou-se que a ativação de receptores serotonérgicos 5-HT1A e 5-HT7 nos neurônios
IR-5-HT da ZI exercem ação inibitória sobre a liberação do hormônio luteinizante
ocasionando uma diminuição de sua concentração no plasma sanguíneo (Siddiqui et al,
2004). A rafe, mais especificamente o núcleo dorsal e o núcleo magno, enviam projeção
para a ZI em ratos, ambos atuando na modulação de impulsos fóticos durante o dia
subjetivo, ocasionando avanço de fase na atividade circadiana dos neurônios (Medanic e
Gillete, 1992). Considerando exclusivamente a ação de fibras serotonérgicas, estas
agem alterando o limiar de disparo das células ou ativando segundo-mensageiros, ou
seja, atuam diretamente na modulação da atividade dos neurônios (Chapin e Andrade,
2001). Vale relembrar que a ZI desempenha uma grande gama de funções e informações
sobre o funcionamento do organismo, então é importante considerar a existência de um
sistema de modulação serotonérgica a nível celular para coordenar essas atividades.
O trabalho de Silva (2013) realizou uma caracterização das fibras serotonérgicas
dos núcleos da linha média e intralaminares do tálamo do mocó, que foram classificadas
de acordo com o número de varicosidades e do diâmetro axonal: Fibras Rugosas, com
fibras espessas e elevados volume e número de varicosidades; Fibras Granulares, sendo
fibras finas, com diversas e pequenas varicosidades, semelhante a grânulos; e as Fibras
Semi Granulares, apresentando espessura semelhante às granulares, mas com menor
número de varicosidades, com distribuição irregular. Baseado nisso, detectamos que a
ZI apresenta fibras de todos os tipos, com as fibras de maior diâmetro e quantidade de
varicosidades localizadas na ZId. Em outro estudo do nosso laboratório, foram
delimitados 11 núcleos do sistema serotonérgico/núcleos da rafe do mocó, nomeados no
sentido rostrocaudal de: linear rostral, linear caudal, dorsal da rafe, mediano,
paramediano, supralemniscal, pontino, interpósito, magno, pálido e obscuro, distruídos
ao longo da linha média do tronco encefálico, com exceção do supralemniscal. Exceto
pelo núcleo linear rostral, todos os outros núcleos foram detectados em estudos com
outros animais (Soares et al, 2012), inclusive com os núcleos dorsal e magno, já
supracitados, com conexão serotonérgica com a ZI. Estudos se fazem necessários para
verificar a existência dessa conexão afim de conhecer as funções que esta desempenha
no mocó.
48
GFAP
A proteína acídica fibrilar glial, GFAP, é expressa em astrócitos, constituindo
um marcador seletivo para essas células gliais. Os astrócitos participam do
funcionamento da barreira hematoencefálica, uma vez que, alguns de seus
prolongamentos reforçam as junções oclusivas das células que formam a parede dos
capilares cerebrais regulando a troca de substâncias dentro do sistema nervoso central
(Abbott, 2002). Células gliais apresentam outras funções, como originar populações
específicas de neurônios durante o desenvolvimento (Kriegstein e Gotz, 2003), além de
um papel neuroprotetor após danos no sistema nervoso central em decorrência de
traumas (Anderson et al, 2003), produção de fatores neurotróficos, nutrição e migração
neuronal, e estudos mais recentes demonstraram que os astrócitos tem papel ativo na
transmissão sináptica, como responder ao aumento da concentração livre de cálcio após
a transmissão sináptica (Eysseric et al, 2000), e que existem células gliais que fazem
sinapse com neurônios (Bergles et al, 2000), e posteriormente essas sinapses foram
encontradas em diversas áreas do sistema nervoso, como hipocampo (Bergles et al,
2000; Mangin et al, 2008) e cerebelo (Lin et al, 2005, Bergles et al, 2010).
Este é o primeiro estudo que detecta células IR-GFAP na ZI, apresentando
marcação positiva na ZIr, ZId e ZIc, e negativa na ZIv. A detecção de células da glia na
ZI é bastante relevante tendo em vista o grande enfoque na importância dessas células
na nutrição e atividade dos neurônios, ainda mais quando se trata de uma região com
grande riqueza neuroquímica, funcional e de conexões com outras regiões do sistema
nervoso.
CB
As proteínas ligantes de cálcio são mensageiros intracelulares que medeiam os
efeitos dos neurotransmissores na sinalização celular regulando a concentração de cálcio
intracelular. CB, CR e PV, proteínas ligantes de cálcio analisadas nesse estudo
apresentam alta afinidade ao íon Ca+2 e baixo peso molecular (Goodman et al, 1979).
Além disso, estão relacionadas com o controle da divisão, movimentação e crescimento
celular, e também utilizadas como marcadores citoarquitetônicos (Celio, 1990).
49
Em ratos, células IR-CB apresentam pequenos somas, com formato ovoide ou
redondo, e compõe entre 5 e 10% do número total de células na região rostral e medial,
enquanto que a formação de 20-25% das células no setor caudal (Kolmac e Mitrofanis,
1999). Outro estudo demonstrou uma maior população de células IR-CB na ZIc, maior
que na ZId e ZIv (Watson et al, 2013). Em (2004), Mitrofanis et al detectaram a
presença de CB em todas as porções da ZI em Macaca fascicularis, distribuída de forma
homogênea. No sagui, células IR-CB ocorreram em todas as porções, com maior
concentração na porção caudal, e poucas células marcadas nas porções rostral e
ventrolateral (Lima, 2008). Outros estudos em sagui detectaram células IR-CB com
intensidade de marcação variável, com grandes somas e longos processos axonais na
ZIv, enquanto que na ZId poucas células foram coradas, sem a detecção dos processos
axonais (FitzGibbon et al, 2000), resultado semelhante ao encontrado por Watson et al
(2013), que encontrou mais células na ZIc em comparação às ZId e ZIv.
CR
A CR pertence a uma subclasse de proteínas de gatilho, ou seja, está mais
envolvida na modulação de mudanças transitórias de cálcio do que no simples
tamponamento intracelular (Dowd et al, 1992), inclusive com diferenças estruturais –
apresenta 6 domínios, 5 deles que podem se ligar ao cálcio - relevantes em comparação
com a PV – que tem apenas 3 domínios, dois que podem se ligar ao cálcio (Kuznicki et
al, 1996). No mocó, a região mais rica em células IR-CR foi a ZId e na região medial da
ZIr.
No sagui, células IR-CR foram encontradas em todas as porções da ZI, com uma
maior concentração na região dorsal (Lima, 2008). Em outro estudo em sagui,
FitzGibbon et al (2000) detectou a presença de neurônios IR-CR nas porções ventral e
dorsal, sem uma delimitação clara de divisão, diferentemente do observado para PV e
CB, e esses neurônios podem ter grande ou pequeno soma, com marcação
imunoistoquímica intensa. Sabe-se que a porção caudal da ZI projeta-se para os núcleos
parafasciculares e intralaminares do tálamo e para a camada I do córtex (Arai et al,
1994; Power e Mitrofanis, 1999; Nicolelis et al, 1995). A CB e CR estão presentes em
neurônios talâmicos que se projetam para camadas corticais profundas – V e VI –
alterando a excitabilidade dos neurônios piramidais, função semelhante àqueles
neurônios IR-CR que se projetam para a camada I (Arai et al, 1994).
50
Considerando a riqueza neuroquímica e importância funcional da ZI, é esperado
que esta possua diversos mecanismos de controle da atividade celular, afim de otimizar
o fluxo de informações recebidas, processadas e emitidas para suas conexões pelo
sistema nervoso, e o controle da concentração intracelular de cálcio mediado pelas
proteínas ligantes de cálcio é fundamental. Vários trabalhos detectaram a presença
dessas proteínas na ZI em primatas (Mitrofanis, 2004; Lima, 2008) e roedores (Nicolelis
et al, 1992; Trageser et al, 2006; Kolmac e Mitrofanis, 1999), mostrando conservação
desse mecanismo durante a evolução desses clados.
PV
Células IR-PV foram encontradas na ZIr e ZIc (Figura 10 D e F), enquanto que
na ZId e ZIv não ocorrem células. Isso é uma novidade em relação aos dados registrados
na literatura, que destacam que células IR-PV é presente apenas na porção ventral da ZI
(Mitrofanis, 2005, Nicolelis et al, 1992; Trageser et al, 2006).
A PV pode ser encontrada em diversas regiões, como o cérebro, músculos, osso
e glândulas do sistema endócrino (Jones e Hendry, 1989). Alguns estudos mostram que
o tipo celular que contém PV é dominante na ZI ventral (Kolmac e Mitrofanis, 1999;
Nicolelis et al, 1992, Mitrofanis, 2005). Em estudos com sagui, células IR-PV também
predominaram na ZI ventral, com grande densidade e células de grande tamanho
(FitzGibbon et al, 2000). Lima (2008) também verificou uma forte marcação na porção
ventral, mas com neurônios mais esparsamente distribuídos. Em Macaca fascicularis,
IR-PV apresentam tamanho médio e formato ovoide, presente em todas as regiões da
ZI, mas com predominância na porção ventral (Mitrofanis, 2004). Entretanto, a
marcação de IR-PV da ZI do mocó mostra que é justamente a ZIv e ZId que não
apresenta marcação imunohistoquímica
Kolmac e Mitrofanis (1999) observaram que IR-PV apresentam diferenças entre
si quanto ao seu tamanho e formato: parte delas possuem corpos grandes e formato
ovoide, enquanto outras possuem corpos pequenos e formato alongado, e postulou que
as células grandes são neurônios de projeção, enquanto as de pequeno tamanho são
interneurônios. Células IR-PV recebem projeção direta do núcleo pretectal anterior
(NPA), e especula-se que essa conexão auxilia na sincronização da atividade da ZI e do
NPA de inibir os núcleos talâmicos somatosensoriais de primeira ordem (Giberet al,
2008). Um desses núcleos de primeira ordem é o núcleo posterior do tálamo. Verificou51
se que este comunica-se com a ZI, através de estudos com traçadores anterógrados e
com imunohistoquímica para PV na ZI, e que essa conexão era fundamental para que a
ZI suprimisse a atividade do núcleo posterior durante um estímulo nociceptivo
(Trageser et al, 2006).
5.4 Considerações do funcionamento global da ZI
Vários estudos explorando a neuroquímica e a hodologia da ZI foram realizados
desde sua descoberta em 1877, e a partir daí estudos visando descrever o funcionamento
global da ZI vem sendo propostos. A ZI, sendo uma das portas de entrada para o
diencéfalo, recebe uma série de inputs somáticos (exteroceptivos) e viscerais
(interoceptivos) além de informações de outras regiões do sistema nervoso, que
processa e retransmite essas informações para uma miríade de outras regiões. Atreladas
a isso, a diversidade neuroquímica e características eletrofisiológicas dos neurônios da
ZI mostra a enorme complexidade de funcionamento dessa região (May et al, 1997;
Trageser e Keller, 2004; Mitrofanis, 2005). 2 modelos são propostos para explicar como
a ZI funciona: um modelo exteroceptivo e um interoceptivo. A proposta exteroceptiva
consiste que a ZI recebe as informações do ambiente pelos sistemas sensoriais, e que ela
auxilia o organismo a se orientar espacialmente, envolvendo reações posturais e
aumento da atenção para a situação, e que a partir daí, mudanças fisiológicas e viscerais
aconteceriam para otimizar a resposta ideal perante aquele estímulo. Já a proposta
interoceptiva é o contrário: a ZI responde inicialmente às necessidades fisiológicas e
viscerais, como a fome e a sede, e em seguida ocorrem as mudanças de postura,
locomoção e atenção de forma a saciar essas necessidades (Mitrofanis, 2005).Levando
em conta que regiões diencefálicas são recrutadas de forma imediata a fim de gerar uma
resposta rápida (Merker, 2004), a ZI tem um papel chave para uma resposta rápida e
otimizada em respostas a alterações fisiológicas ou comportamentais, uma vez que ela
atua de forma decisiva na detecção de estímulos externos e internos, regulando
respostas buscando manter a homeostase do indivíduo. Quando analisamos a hodologia
da ZI, vemos que ela de fato apresenta conectividade com regiões sensoriais, motoras,
integrativas e regulação visceral (Power et al, 2001; Mitrofanis, 2005; Heise e
Mitrofanis, 2004), além de uma riqueza neuroquímica extensa, condizente com a
complexidade de interação entre a ZI e suas aferências e eferências. Contudo, estudos
mais específicos entre essas interações, como ocorrem e em que condições, são
necessárias para confirmar qual modelo é o que melhor ilustra o funcionamento global
52
da ZI, ou até mesmo a conjecturar outro modelo. A projeção da retina diretamente para
a ZI, bem como a característica dessas fibras (modulatórias) fornecem informações
acerca da ausência/presença de luz no ambiente, fundamental para auxiliar e coordenar
sua atividade.
Através da técnica imunohistoquímica detectamos a presença de células
imunorreativas que indicam a presença de neurotransmissores clássicos (GABA, 5-HT,
DA), neuropeptídeos que modulam a transmissão sináptica (VP, NPY), além de
substâncias que controlam a atividade desses neurônios e eficiência das sinapses, como
as proteínas ligantes de cálcio CB, CR e PV, NO e células da glia através da IR-GFAP.
Para uma região com ampla conectividade com outras regiões do sistema nervoso e
envolvida com tantas funções, esse resultado era esperado, com destaque para a ZIr,
com neurônios ou fibras IR a todas as substâncias analisadas neste trabalho. A
diversidade citoarquitetônica também mostrou-se evidente na ZI do mocó, sendo
possível através do Nissl, e com auxilio do NeuN, delimitá-la em 4 subdivisões, algo
que não é realizado no rato, que necessita de características neuroquímicas e funcionais
para tal, especialmente considerando o nível médio da ZI, onde há subdivisão em ZId e
ZIv (Mitrofanis, 2005; Nicolelis et al, 1992).
53
6. CONCLUSÕES
A técnica de Nissl é eficiente para a delimitação e caracterização
citoarquitetônica da ZI do mocó;
A ZIc recebe projeção da retina contralateral, apresentando fibras Classe II e
varicosidades do tipo Passagem (maior parte), Terminais e em Cluster,
sugerindo um caráter modulatório da informação fótica;
A ZI apresenta células gliais na ZI, sendo o primeiro trabalho a fazer um registro
sobre essas celulas em roedores;
A ZI apresenta grande diversidade neuroquímica, sobretudo na porção medial da
ZIr, onde encontramos imunorreatividade de todas as substâncias neuroativas
investigadas;
A IR-NOS, GFAP e CR auxiliam na delimitação da ZI no nível médio em ZId e
ZIv;
Somente fibras IR 5-HT estão presentes em todas as subdivisões da ZI do mocó.
54
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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69
8. ANEXO
Retinal projections into the Zona Incerta of the rock cavy
(Kerodon rupestris): a CTb study.
Paulo Leonardo Araújo de Góis Moraisa, Melquisedec Abiaré Dantas de
Santanaa, Judney Cley Cavalcantea, Miriam Stela Maris de Oliveira Costaa
Jeferson de Sousa Cavalcanteb, Expedito Silva do Nascimento Jra
aDepartment
of Morphology/Laboratory of Neuroanatomy, Federal
University of Rio Grande do Norte, 59072-970, Natal-RN, Brazil.
bDepartment of Physiology/Laboratory of Neurochemical Studies,
Biosciences Center, Federal University of Rio Grande do Norte, 59072970, Natal-RN, Brazil.
Correspondence should be addressed to:
Present address: Department of Morphology/Laboratory of
Neuroanatomy, Biosciences Center, Federal University of Rio Grande
do
Norte, 59072-970, Natal-RN, Brazil.
Telephone Number: 55 84 32153431
Fax: 55 84 32119207
E-mail address: [email protected]
70
Abstract
The Zona Incerta is a key neural substrate of higher brain functions. A neural population
in the caudal ZI projects into the superior colliculus. This recently has been identified as
a
important structure for the saccades. Applying CTb, we describe a retinal projection into
the caudal ZI and the distribution of its terminal varicosities in the rock cavy, a
Brazilian
rodent, which has been used as an anatomical model to enhance the comprehension
about
the phylogeny of the nervous system. Contrary to other investigated rodents, the retinal
fibers in the rock cavy lie in the caudal Zona Incerta (ZIc), suggesting a functional
specialization in the rock cavy. The high resolution, and qualitative analysis of retinal
fibers in the present work provide a substrate to interpretation of the visual system, and
its phylogenetic pathways among species.
Key words: Zona Incerta; Rodents; Rock cavy; Cholera toxin subunit b; Retinal
projections; Incerto-tectal pathway
71
1. INTRODUCTION
The ZI is classically known for its reduced fiber staining, lying among the
densely myelinated tracts that constitute the major afferent destined for the thalamus.
Closer inspection shows a great diversity of cells and this cytoarchitectonic feature
allows the partition of the ZI into three distinct divisions: rostral, middle, and caudal,
the middle being divided into dorsal and ventral subdivisions, sometimes referred to as
the laminae [Kawana and Watanabe, 1981; Watanabe and Kawana, 1982;
Romanowski et al., 1985; Mitrofanis, 2005]. The connections of the ZI are very
extensive with its efferent transmitting along almost every neuroaxis from the cerebral
cortex to the spinal cord [Romanowski et al., 1985; Roger and Cadusseau, 1985;
Shammah-Lagnado et al., 1985; Schall, 1995]. Nowadays, the precise function of the
ZI is still not clearly defined, although several laboratories have made extensive efforts
in the field and have described its direct influence on arousal and attention [Ficalora
and Mize, 1989], visceral activity [Mok and Mogenson, 1986; Spencer et al., 1988;
Sanghera et al., 1991; Mitrofanis, 2005], posture and locomotion [Milner and
Mogenson, 1988; Murer and Pazo, 1993]. As well, some studies have shown that
abnormal caudal ZI activity manifests in clinical symptoms of Parkinson’s disease
[Alusi et al., 2001; Nandi et al., 2002]. Additionally, morphological studies have
indicated a specific GABAergic afferent from the ZI to the superior colliculus [Ficalora
and Mize, 1989] mainly in the intermediate gray layer of the superior colliculus
[Ricardo, 1981]. In rats, the same collicular layer that receives inputs from the ZI
projects back to the ZI [Roger and Cadusseau, 1985]. These GABAergic incertotectal
cells exhibit a decrease of their firing rate shortly before the onset of saccade. These
observations suggest that the ZI could play a role in the generation of eye movement
and selection of targets for focus changes as well [Hikosaka and Wurtz, 1985; Ma,
996]. In the present study we describe the terminal morphology of retinal axons to the
ZI of a Brazilian experimental model from our laboratory, the rock cavy (Kerodon
rupestris). In addition, this study is the first to provide a morphological classification of
retinofugal fibers in the ZI. The morphological studies of the retinofugal terminals have
improved our understanding of the visual system [Ling et al., 1998]. Direct retinal
projections to non-visual areas have been shown as a powerful modulator of non-visual
functions such as cognition, conditioned fear, circadian rhythms, and affective behavior
[Vandewalle et al., 2009; Ren et al., 2013]. We also describe the cytoarchitectonic
characterization of the caudal ZI (ZIc) in the rock cavy. The rock cavy has advanced our
understanding about the nervous system, providing a framework for the interpretation of
evolutionary patterns, allowing inferences to be drawn about the nervous system and its
phylogenetic congruence among diverse biological features.
2. MATERIALS AND METHODS
Five adult male rock cavies (body weight range, 300-500 g) captured from rural
towns in of the state of Rio Grande do Norte, Brazil, were used in this study. The
maintenance and use of all experimental animals adhered to the ethical requirements
approved by the Brazilian Society of Neuroscience and Behaviour, which follows the
recommendations of the Society for Neuroscience (USA). All experiments were
approved by the local ethic committee for animal use (CEUA – UFRN
number.015/2009). The animals were housed under natural light, temperature, and
humidity conditions, with food and water freely available. All surgical procedures, such
as injection and perfusion, were performed in the mornings around 9:00.
72
The rock cavies were anaesthetized with ketamine (40 mg/kg i.m.), and
xylazine (4mg/kg i.m.), placed on a surgical table, and restrained in a headholder. After
topical application of tetracaine hydrochloride to the cornea, they received a unilateral
intraocular injection of cholera toxin subunit B (CTb) (List Biological Laboratories,
Inc., Campbell, CA). A total of 80μl of a 1 mg/ml aqueous CTb, containing 5%
dimethylsulfoxide, was injected into the vitreous humor through a 30-gauge needle
catheter attached to a micropump, which pumped the solution at the rate of 1μl/min. To
minimize reflux and the spread of the tracer to the extraocular muscles. To avoid
postoperative local infection, the ocular surface was cleaned with saline during the
surgical procedure. The needle was left in the site until 15 min post-injection and then
withdrawn. The ocular surface was then rewashed with saline and antibiotic ointment
was applied topically.
After 5-7 days post-injection, the rock cavies were reanesthetized with the same
anesthetic and perfused transcardially with saline in 0.1M phosphate-buffer pH 7.4 (PB)
followed by 4% paraformaldehyde in PB solution. After perfusions, the animals were
positioned in the stereotaxic frame and the incisor bar was adjusted until the lambda and
bregma heights were equal. The skull bone was then removed and the brains exposed.
The brains were divided into three blocks on a plane 2.00 mm anterior to the bregma
and another at the lambda level. The brains were removed and, after post-fixation in the
same fixative for 2-4 hours, stored in 30% sucrose in PB solution. The frozen brains
were cut into 30 μm coronal sections, which were obtained parallel to the stereotaxic
planes by mounting each block on the stereotaxic plane of a horizontal sliding
microtome. The sections were collected in PB and a one-insix series was subjected to
immunohistochemistry to detect CTb. Floating sections were incubated with a goat antiCTb antiserum (List Biological Labs, Campbell, CA, USA) diluted at 1:5000 in PB
containing 0.3% Triton X-100 and 5% normal donkey serum for 18-24 h. The sections
were incubated with a secondary antiserum (biotinylated donkey anti-goat IgG; Jackson
Labs, Westgrove, PA, USA) diluted at 1:1000 in the same medium as above for 90 min.
The sections were reacted with ABC reagent (Elite ABC kit, Vector Labs, Burlingame,
CA, USA) for 90 min and then reacted for peroxidase activity in a solution of
diaminobenzidine (DAB) tetrahydrochloride and 0.01% H2O2 in PB.
After three rinses in PB, the sections were mounted on precleaned and
gelatinchrome alumen-coated slides and allowed to dry. The sections were then treated
with osmium tetroxide to enhance the visibility of the reaction product. The sections
were then dehydrated, delipidated and coversliped with DPX. One of remaining series
was Nissl stained to identify the cytoarchitectonic boundaries of the regions under
examination. All immunohistochemical procedures were performed at room
temperature. As a control for the specificity of staining, some sections were submitted
to the immunohistochemical reaction without the primary antiserum. Approximately,
five sections per animal containing the region of interest were examined under
brightfield illumination and at low (10 X objective) and high (100 X objective, oil
immersion) magnification in an Olympus microscope. Arbors were either documented
photographically, using a digital video camera (Nikon, DXM1200) or were drawn with
the aid of a drawing tube attached to the microscope. The images were minimally
processed for brightness and contrast using Adobe Photoshop 7.0.
73
3. RESULTS
In the ZI of the rock cavy, as in the rat [Kawana and Watanabe, 1981; Watanabe
and Kawana, 1982; Romanowski et al., 1985; Mitrofanis, 2005], the following major
sectors were identified: a rostral sector (ZIr) which has densely packed spindle-shaped
cells (Fig 1A and B); a dorsal sector (ZId), that has medium-sized and oval-shaped
cells; a ventral sector (ZIv), that is made up of medium-sized fusiformeshaped cells that
are more densely packed then the cells in the ZId (Fig 1C and D); and finally, a caudal
sector (ZIc) which has collections of cells with small and medium-sized somata that are
either fusiform or rounded in shape (Fig 1E and F). The images in Figure 1 show the
Nissl stained coronal sections and drawings of the rock cavy’s diencephalon, throughout
the rostrocaudal length. The figure 1F represent the location of the retinal fibers in the
ZIc. The ZIc has a very diffuse cell distribution throughout the lateromedial extension
(Fig 1E).
Sparse CTb-immunolabeled axonal arbors were observed strictly in the ZIc of
the five subjects used on this study. The retinofugal fibers were observed only on the
contralateral side. In general, three types of optic terminals can be identified in ZIc: (1)
Simple en passant varicosities and terminal swellings that are widely distributed in all
ZIc, these sort of terminals are present in poorly branched fibers decorated with
varicosities and swellings (Fig 2C and G); (2) String-like configurations that are
comprised of axon collaterals studded with boutons of various size. These swellings
occur close together, and beaded collaterals form a longitudinal arrangement in which,
at least two fibers travel together for a distance (Fig 2D and H). The string-like
terminals were seen most frequently in the lateral part of the ZIc (see Table 1 and Figure
3), just adjacent of the lateral geniculate nucleus, but clearly outside it; (3) Type R1-like
in the rock cavy that are comprised of large, elliptical varicosities along the length of the
caliber axons (Fig 2E and I), and Type R2-like terminals that consist of medium and
small varicosities forming rosette-like clusters of boutons (Fig 2F and J); in general the
R1-like and R2-like terminals shows a complementary distribution between the lateral
and medial part of the ZIc. About 63% of all R1-like terminals are concentrated in the
lateral part, while just 41,2% of the R2-like terminals are at the same location (see Table
1 and Fig 3). The R1-like and R2-like terminals resemble the corresponding
retinogeniculate endings.
74
FIGURE 1. Digitalized brightfield photomicrographs of coronal sections of the rock
cavy brain through the thalamus rostrocaudal length showing Nissl-stained section
depicting the cytoarchitecture of the ZIr (A); ZId and ZIv (C); and ZIc (E), and drawings showing the
density and distribution of labelled axons at the same level (B, D, and F). Note that the retinofugal fibers
were detected only in the ZIc. Abbreviations: ZIc: Caudal Zona Incerta; ZIv: Ventral Zona Incerta; ZId:
Dorsal Zona Incerta; ZIr: Rostral Zona Incerta; DLG: Dorsal Geniculate Nucleus; IGL: Intergeniculate
Leaflet; opt: Optic Tract; cp: Cerebral Peduncle; fr: Fasciculus Retroflexus; mt: Mamillothalamic Tract;
scp: Superior Cerebellar Peduncle; F; Fornix; STh: Subthalamic Nucleus; ml: Medial Lemniscus; Po:
Posterior thalamic nucleus; VPM: Ventral Posteromedial Thalamic Nucleus; VPL: Ventral Posterolateral
Thalamic Nucleus; str: Superior Thalamic Radiation; 3v: Third ventricle; Rt: Reticular Thalamic Nucleus;
LDVM: Laterodorsal Thalamic Nucleus, dorsomedial part; LDVL; Laterodorsal Thalamic Nucleus,
ventrolateral part; CL: Centrolateral Thalamic Nucleus; SN: Substantia Nigra; PC: Paracentral Thalamic
Nucleus. Scale bar: 180 μm.
75
FIGURE 2. Digitalized brightfield photomicrographs of coronal sections of the rock
cavy brain through ZIc showing CTb-immunostained fibers (A and B) and detailed
morphology of the retinal axons in the ZIc showing higher magnification view of cholera toxin-labeled
varicosities in the simple endings (C), string-like terminals (D) R1-like terminals (E) and R2-like
terminals (F). Black arrowheads point to simple ending terminal boutons; White arrowheads point to
string-like terminal boutons; White arrow points to R1-like terminal boutons; and Black arrow points to
R2-like terminal boutons. G-J: Camera-lucida drawings that depict the morphology of simple endings
(G); stringlike terminals (H); R1-like terminals (I); and R2-like terminals (J). Abbreviations as in Figure
1. Scale bar: A= 180 μm; B= 90 μm; C – J= 10 μm
76
TABLE 1. Retinal fibers distribution. Total number, frequencies, and demographic indices in five
cases.
FIGURE 3. Schematic diagram illustrating the density and differential distribution of
labeled axons and terminals seen on coronal sections through the lateral and medial part
of the ZIc. Dark circle in B represent the simple endings distribution; Stars in C represent the distribution
of the String-like terminals especially in the lateral part of the ZIc; Open cycle and black square in C
represent R1-like and R2-like terminals respectively. Scale bar: A= 260 μm; B-D= 100 μm.
77
4. DISCUSSION
Using a sensitive anterograde, we traced the presence of a consistent direct
retinal projection to the ZIc of the rock cavy. The stained terminals/fibers are unlikely to
originate from transynaptic transport of another retinal recipient area, since CTb does
not appear to be transported transsynaptically [Angelucci et al., 1996]. In addition,
since the survival times of the animals were short, the CTb-IR fibers were not observed
in well known secondary visual areas, such as the primary visual cortex. To date, this
kind of direct retinal projection to the ZI has only been described for the Nile glass
hamster rat, rat, and hamster [Gaillard et al., 2013; Power et al., 2001; Youngstrom
et al., 1991] At high magnification, the appearance of the retino-ZIc axon arbors
resembles that of other terminal specializations of retinofugal axons in the mediodorsal
thalamic nucleus of the rock cavy [Nascimento Jr et al., 2010]. The morphological
diversity of the endings observed in the lateral and medial portions of the ZIc of the
rock cavy could be due to source-specific factors, such as subpopulations of retinal
ganglion cells each, forming cell-specific terminals in the ZI. Additionally, these
distinct morphologies of retinal afferents in the ZIc suggest a differential influence on
postsynaptic cells [Sherman, 2005; Petrof and Sherman, 2013], as well as a
functional dichotomy in the ZIc.
Saccadic eye movements are dramatically modified by administration of GABA
antagonists or agonists in the superior colliculus [Hikosaka and Wurtz, 1985; Jaspers
and Cools, 1990]. As is well known, the substantial nigra and the ZI are the main
source of GABAergic innervation to the superior colliculus [Kato et al., 2006; Ficalora
and Mize, 1989; Appell and Behan, 1990; Bickford and Hall, 1992]. Functional
studies have shown a reduction of neuron spikes just before the saccades in the ZI
[Hikosaka and Wurtz, 1985; Ma, 1996]. In monkeys, the neuronal activity in the ZI is
“paused” before the start of saccade and resumes at the end [Ma, 1996]. Taken together,
these results suggest that the ZI cells inhibit collicular neurons. The rat incertotectal
pathway arises from a cytoarchitectonically and cytochemically distinct ventral
subdivision of the ZI and terminates topographically as well defined clusters of
terminals in the intermediate gray layer of the superior colliculus [Kim et al., 1992;
Ricardo, 1981]. Our results show retinal terminals in the ZIc, suggesting a direct retinal
modulation in the rock cavy incerto-tectal pathway. Moreover, the present work is the
first to describe the differences in fiber morphologies and their distribution inside the
ZI. Overall, the present work suggests a phylogenetic stability of this projection with a
slight difference in the rock cavy. Our work, as well, establishes the indispensable
morphological background for understanding the functional significance of this pathway
in rodents, helping to comprehend the phylogenetic routes used by visual system.
78
Acknowledgments
We thank Miriam Regina Celi Escala de Oliveira Costa for assistance with
experiments, histological preparations and animal surgery. This study was supported by
funding from the National Council of Technological and Scientific Development
(CNPq)
and by Coordination for Improvement of High Level Staff (CAPES). The English
version of this text was revised by Sidney Pratt, Canadian, BA, MAT (The Johns
Hopkins University), RSAdip (TEFL).
Conflict of Interest Statement
The authors declare no conflict of interest.
Author Contributions
PLAGM: Participated in the design of the research and data analysis, and manuscript
writing.
MADS: Participated in the analysis of the results.
JCC: Participated in the design of the research, and manuscript writing.
MSMOC: Participated in the design of the research, data analysis, and manuscript
writing.
JSC: Participated in the design of the research and data analysis.
ESNJ: Designed, supervised studies, interpreted results, and prepare the manuscript.
79
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