UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP
INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
PROVA DO ANTÍGENO ACIDIFICADO TAMPONADO E REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE NO DIAGNÓSTICO DA BRUCELOSE BOVINA EM ANIMAIS
ABATIDOS EM FRIGORÍFICO NO MUNICÍPIO DE COLÍDER/MT
Manuel Pedro Figueiró d’Ornellas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso,
Campus Universitário de Sinop, como parte das
exigências para a obtenção do título de Mestre em
Zootecnia.
Área de concentração: Zootecnia.
Sinop – Mato grosso
Maio de 2014
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MANUEL PEDRO FIGUEIRÓ D’ORNELLAS
PROVA DO ANTÍGENO ACIDIFICADO TAMPONADO E REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE NO DIAGNÓSTICO DA BRUCELOSE BOVINA EM ANIMAIS
ABATIDOS EM FRIGORÍFICO NO MUNICÍPIO DE COLÍDER/MT
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso,
Campus Universitário de Sinop, como parte das
exigências para a obtenção do título de Mestre em
Zootecnia.
Área de concentração: Zootecnia.
Orientador: Dr. Luciano Bastos Lopes
Sinop – Mato Grosso
Maio de 2014
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Agradecimentos
Primeiramente a Deus, que ilumina todos os dias de minha vida.
A minha família, em especial a um novo ser que esta pra nascer em abril, que me dará o gosto
de ser papai. Seja bem-vinda Ana Clara.
Agradeço a minha mulher pela compreensão e dedicação para que eu pudesse me dedicar ao
mestrado.
A minha Mãe, irmãos e meu pai Pedro (in memorian), que são meu alicerce nessa minha
caminhada.
À UFMT, a todos os professores que contribuíram para minha formação, à Embrapa
Agrossilvipastoril em nome do Orientador e Pesquisador Dr. Luciano Bastos Lopes, e o Coorientador Prof. Artur Kanadani Campos.
Ao Prof. João Paulo Amaral Haddad e ao Dr. Luciano Shiratsuchi pelo apoio na confecção dos
mapas.
A todos os auxiliares de inspeção que contribuíram na pesquisa, e ao Chefe do Sipoa Leandro
Machado que autorizou a pesquisa no Frigorífico, e ao Superintende do MAPA Sr. Francisco
Moraes Chico Costa.
A Dra. Valéria Mustacas que contribui na execução das técnicas da Biologia Molecular e a
todos estagiários, em especial a Camila Eicksten.
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Biografia
Manuel Pedro Figueiró d’Ornellas, filho de Pedro Martins d’Ornellas Neto (in memorian) e
Kátia Regina Figueiró d’Ornellas, nasceu em Cuiabá/MT em 24 de outubro de 1981.
Em 2000, ingressou como discente na Universidade de Cuiabá no curso de Medicina
Veterinária; em 2005, concluiu seus créditos, obtendo o título de bacharel em Medicina
Veterinária.
Em 2005, desenvolveu atividades como Médico Veterinário na Agropecuária Marambaia,
Petrópolis/RJ.
Entre os anos de 2006 a 2013, desenvolveu atividades relacionadas à Inspeção Sanitária em
frigoríficos, sendo encarregado do Serviço de Inspeção Federal 2601 e 4268 nas indústrias
Quatro Marcos, Independência, Guaporé Carne e JBS-FRIBOI.
Em 2012, iniciou o curso de mestrado no programa de pós-graduação em Zootecnia, na
Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Campus Universitário de Sinop, concentrando
seus estudos em Medicina Veterinária Preventiva, com foco no controle de zoonoses.
Atualmente, desenvolve atividades como Gerente Industrial no frigorífico Frigobom em Sinop,
MT.
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Lista de Tabelas
Tabela 01 Índice de interpretação do teste de Kappa
Tabela 02 Comparação de resultados entre as duas provas (AAT x PCR).
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Lista de Figuras
Figura 01
Figura 02
Figura 03
Figura 04
Figura 05
Figura 06
Figura 07
Figura 08
Figura 09
Figura 10
Figura 11
Municípios de MT incluídos no estudo
Município do Pará incluído no estudo para a avaliação pelo teste de
Kappa
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Reações do teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT)
Bovino com lesão extensa de bursite cervical
Coleta de linfonodos pelo SIF na linha de abate
Identificação das amostras de linfonodos das linhas D, H e I.
Reações positivas e negativas para Brucella abortus pela técnica de
PCR
Mapa com a identificação de propriedades consideradas foco e
livres da brucelose pelo INDEA com base nas GTA´s.
Mapa com a identificação de propriedades consideradas foco e
livres da brucelose de acordo com os resultados do teste do AAT.
Mapa representando a dispersão dos casos de brucelose com base
no teste do AAT entre os municípios avaliados.
Mapa representando a dispersão dos casos de brucelose com base
no teste do PCR entre os municípios avaliados.
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40
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Lista de Abreviaturas
µL
DNA
et al.
MAPA
mL
PCR
PNCEBT
Taq
AAT
INDEA
OIE
SIF
Embrapa
UFMT
Lanagro
dATP
dCTP
dGTP
dNTP
dTTP
EDTA
LPS
MgCl²
PH
Pb
TE
PK
RPM
TRIS
°C
V
%
Microlitro
Ácido desoxirribonucleico
e colaboradores
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
Mililitro
Reação em cadeia da polimerase
Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose
Thermus aquaticus
Antígeno Acidificado Tamponado
Instituto de Defesa Agropecuária do Mato Grosso
Organização Internacional de Epizootias
Serviço de Inspeção Federal
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Universidade Federal de Mato Grosso
Laboratório Nacional Agropecuário
Desoxi-adenosina trifosfato
Desoxi-citosina trifosfato
Desoxi-guanidina trifosfato
Base nitrogenada (A,C,G ou T)
Desoxi-timidina trifosfato
Ácido etileno diamino tetracético
Lipopolissacarídeos
Cloreto de magnésio
Potencial hidrogênionico
Pares de bases
Tampão TRIS-EDTA
Proteinase K
Rotações por minuto
Tris(hidroximetil) amino metano
Grau Celsius
Volts
Porcentagem
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D’ORNELLAS, Manuel Pedro Figueiró. Dissertação de Mestrado (Zootecnia), Universidade
Federal de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop, Março de 2014, 54 f. Prova do
Antígeno Acidificado Tamponado e Reação em Cadeia da Polimerase no diagnóstico da
brucelose bovina em animais abatidos em frigorífico no município de Colíder/MT.
Orientador: Prof. Dr. Luciano Bastos Lopes. Coorientador: Prof. Dr. Artur Kanadani Campos
Resumo: A brucelose é uma enfermidade infectocontagiosa zoonótica de caráter crônico,
causadas por bactérias do gênero Brucella, que acometem os animais e o homem. A doença
apresenta-se endêmica no Brasil, resultando em prejuízos econômicos tanto sob o ponto de vista
de produção bovina quanto de saúde pública. O objetivo do presente estudo foi demonstrar a
frequência de animais reagentes com base no teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT),
e comparar os resultados com a ocorrência das lesões macroscópicas no pós-abate com a
presença do DNA bacteriano pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Foram
obtidas amostras de sangue imediatamente após a insensibilização dos animais e linfonodos nas
linhas de abate D, H e I. Associada a coleta de material para o diagnóstico laboratorial, foi feita
a inspeção em busca de lesões macroscópicas pelo Serviço de Inspeção Federal (SIF) do
frigorífico localizado no município de Colíder/MT. Os resultados demonstraram uma frequência
de 14,3% segundo o teste do AAT. O teste de Kappa demonstrou haver uma baixa concordância
ente os testes do AAT e PCR. De acordo com o teste de McNemar, a frequência dos resultados
é significativamente diferente entre os dois testes.
Palavras chave: Brucelose, epidemiologia, bovinos.
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D’ORNELLAS, Manuel Pedro Figueiró. Master Thesis (Animal Science), Federal University of
Mato Grosso, Sinop, March 2014, 54 s. Card Test and Polymerase Chain Reaction for the
diagnosis of bovine brucellosis in culled animals in a slaughterhouse at Colíder/Mato
Grosso. Adviser: Orientador: Prof. Dr. Luciano Bastos Lopes. Co-adviser: Prof. Dr. Artur
Kanadani Campos
Abstract: Brucellosis is a zoonotic chronic infectious disease caused by bacteria of the genus
Brucella affecting animals and potentially humans. The disease presents itself endemic in
Brazil, resulting in economic losses both from the standpoint of beef production and public
health. The present study aimed to demonstrate the frequency of positive animals based on card
test (CT), comparing the results with the occurrence of macroscopic lesions at post-slaughter
and identification of bacterial DNA by the technique of polymerase chain reaction (PCR).
Blood samples were obtained immediately after the animals stunning and the lymph nodes in
slaughter lines D, H and I in one slaughterhouse located in the municipality of Colíder/MT.
Associated to material collected for laboratory diagnosis, inspections were made in search of
macroscopic lesions by the Federal Inspection Service (SIF). The results showed a frequency of
14.3 % according to the test of CT. According to the Kappa test, there is a poor correlation
among tests the CT and PCR. In accordance with the McNemar test, the frequency is
significantly different between results of the two tests.
Keywords: Brucellosis, epidemiology, cattle.
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1 - Introdução
A bovinocultura é um dos grandes pilares da produção agropecuária brasileira com
cerca de 211.279 milhões de cabeças, em destaque o estado de Mato Grosso com mais de 29
milhões segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2012). Localizado na
Região Centro-Oeste do Brasil, o estado é o terceiro em dimensão territorial, compreendendo
903.357,9 km2, distribuídos em 141 municípios, representando 10,6% do território nacional.
Mato Grosso responde por aproximadamente 17,5% do total de bovinos abatidos no Brasil
(IBGE, 2012).
Segundo o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), a expectativa é que
até 2020 a produção animal de carnes pelo Mato Grosso represente 44,5% da produção
brasileira, demonstrando o grande potencial da região. Pelo tamanho do rebanho e a importância
econômica da pecuária para o estado, justifica-se o desenvolvimento de pesquisas abordando as
questões relacionadas à saúde pública, perdas diretas e indiretas ocasionadas pela ocorrência de
doenças infecciosas, prevalência das principais zoonoses, entre outros assuntos ligados à saúde
animal.
A brucelose é uma doença infectocontagiosa provocada por bactérias do gênero Brucella de
distribuição mundial, acarretando frequentemente problemas sanitários e prejuízos econômicos
para pecuária nacional. Considerada endêmica em várias partes do mundo; sua incidência varia
consideravelmente entre os rebanhos, entre as áreas destinadas a bovinocultura e entre países.
No Brasil, o prejuízo total estimado foi de aproximadamente R$ 892 milhões, sendo que a cada
1% de variação na prevalência, estimou-se a variação de 155 milhões de reais no custo da
brucelose bovina no país (SANTOS et al., 2013). As principais manifestações nos animais são a
ocorrência de abortamentos, nascimentos prematuros, esterilidade e baixa produção de leite.
Além do comprometimento dos índices reprodutivos, queda na produção e da questão de saúde
pública por ser uma zoonose, a doença tem um caráter econômico importante, representando um
impacto significativo no comércio de subprodutos de origem animal (PAULIN E FERREIRA
NETO, 2003). A presença da doença nos rebanhos torna a pecuária vulnerável às barreiras
sanitárias, diminuindo a competitividade brasileira no cenário internacional. Barreiras não
tarifárias têm sido empregadas por alguns países dificultando ou mesmo restringindo o
comércio de animais e carne, comprometendo a viabilidade econômica de alguns setores. A
posição de destaque do agronegócio brasileiro no mercado mundial aumenta sua exposição a
problemas técnicos e de interesse comercial.
Em 2001, foi lançado pelo MAPA o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose
e Tuberculose Animal (PNCEBT). O programa tem como objetivo diminuir a prevalência e a
incidência dessas enfermidades, prescrevendo um conjunto de medidas sanitárias para
diminuição do número de focos, oferecendo assim produtos que atendam às expectativas do
mercado consumidor com baixo risco à saúde pública.
Na tentativa de se fornecer subsídios para a melhor implantação e gestão do PNCEBT,
Negreiros et al (2009) avaliaram a prevalência de focos e de animais soropositivos além de
identificar os fatores de risco para brucelose, verificando uma alta prevalência de brucelose em
rebanhos do Mato Grosso. A região que contempla o circuito pecuário 4 inclui o município de
Colíder, ponto focal deste estudo, com um rebanho estimado em 378.264 cabeças/ano base 2011
(IBGE, 2012). Foram incluídos nesse circuito os municípios com predominância para o sistema
de cria. A macrorregião contempla outras 15 cidades, totalizando um rebanho com 5.186.642 de
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cabeças de bovinos, em que foi encontrada uma prevalência de rebanho de 50,3% e 15,3% de
animais positivos segundo esses autores.
No Brasil não existem muitos inquéritos epidemiológicos ou estudos envolvendo os prejuízos
econômicos ocasionados pela brucelose bovina ou bubalina. Da mesma forma, há na literatura
poucos trabalhos avaliando a presença do agente e seus impactos nos rebanhos do estado de
Mato Grosso. O presente estudo tem o objetivo de demonstrar a ocorrência de animais negativos
e de reagentes com base no teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT), comparando-os
com a ocorrência das lesões macroscópicas no pós-abate e resultados obtidos pela técnica da
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
2 - Revisão de Literatura
2.1 – Etiologia
As bactérias do gênero Brucella são intracelulares facultativos, Gram-negativos, pleomórficos,
imóveis, não capsulados, não esporulam e variam de 0,4 e 0,8 µm de largura e 0,5 a 0,7 µm de
comprimento (POESTER, 1997). A temperatura de crescimento dessas bactérias é de 20 a 40°C,
sendo 37°C a temperatura ideal para o isolamento inicial e, o pH ideal é de 6,6 a 7,4; são
aeróbias e microaerófilas, necessitando de 5 a 10% de CO2 (OIE, 2010).
Possuem uma ampla capacidade de sobrevivência em ambientes que apresentam condições de
umidade, abrigo de luz solar direta, pH neutro, temperatura e matéria orgânica, podendo resistir
em pastagens, fetos abortados, anexos fetais e fezes úmidas por longos períodos (PAULIN e
FERREIRA NETO, 2003; BRASIL, 2006; OIE, 2010). A espécie Brucella abortus pode
permanecer nas pastagens por seis meses ou mais em resíduos de abortos ou partos, mas assim
como outras espécies, sensíveis à pasteurização (RUSSEL et al., 1984).
Segundo MARTINS (1994), na carne contaminada a Brucella abortus pode se manter viável
durante meses por ser pouco afetada pela acidificação muscular, sobretudo quando as carcaças
ou cortes são conservados à temperatura de refrigeração ou congelamento, sobrevivendo
igualmente à salmoura e a salga.
Classicamente, as bactérias do gênero Brucella podem ser divididas em dois grupos
antigenicamente distintos, denominadas lisas ou rugosas, com base nas características de
multiplicação em meios de cultura no cultivo primário e na constituição química da parede
celular – presença ou ausência da cadeia O – um dos componentes da membrana
lipopolissacáride (LPS) localizado na superfície externa, apresentando uma relação com a
virulência de algumas espécies (CARDOSO et al., 2006).
2.2 – Epidemiologia
A brucelose bovina é uma das principais zoonoses de interesse econômico, sendo amplamente
distribuída em vários continentes pelo mundo. Embora erradicada em alguns países da Europa,
Austrália e Nova Zelândia, continua emergente e se apresenta como um grave problema
sanitário e econômico, principalmente em países da América do Sul (PAULIN e FERREIRA
NETO, 2003).
Em humanos, a incidência estimada é de mais de 500 mil casos por ano (PAPPAS et al, 2006),
embora a prevalência real possa ser 25 vezes maior devido a fragilidade das informações e
notificações em alguns países (MANTUR et al, 2007). A brucelose é classificada como uma
enfermidade ocupacional de trabalhadores como açougueiros, magarefes e Médicos Veterinários
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(SOUZA et al., 1977). Coelho et al. (1995) detectaram um coeficiente de prevalência de 2,17%
em trabalhadores de matadouro industrial, comprovando a sua importância em grupos
ocupacionais.
No Brasil, a brucelose bovina ocorre endemicamente em todo o território nacional, entretanto no
Sul do Paraná, Norte do Rio Grande do Sul e Santa Catarina a prevalência é muito baixa
(POSTER et al., 2009). A doença pode ser diagnosticada em qualquer rebanho, independente
da forma ou sistema de produção e/ou criação e exploração econômica na qual seja submetido
(BRASIL, 1991). Por outro lado, a compra de animais pode ser um fator de risco para
ocorrência da doença em rebanhos como demonstrado por Dias (2004).
A doença foi detectada no Brasil em 1913 por Gonçalves Carneiro, desde então tem sido
relatada em rebanhos por meio de vários estudos epidemiológicos em diversas regiões do país
(GARCIA-CARRILLO, 1987). O primeiro estudo epidemiológico no Brasil descreveu um surto
de brucelose no município de São Carlos/SP em 1922. Brucella abortus é a espécie mais
prevalente no Brasil. Garcia-Carrílio (1987) relatou a disseminação da doença por todo o país
apontando uma prevalência de 10 a 20%, sendo os índices mais altos encontrados nos estados
do RS, SP, RJ e MG.
Em 1975, foi realizado o primeiro levantamento epidemiológico nacional sobre a situação da
brucelose bovina, e a prevalência de animais soropositivos foi de 6,25% em Mato Grosso
(Brasil, 2001). Naquela ocasião, o estado não havia sido dividido e os resultados dessa análise
compreendiam uma amostra para toda a área que hoje corresponde aos dois estados.
Recentemente, a situação epidemiológica em Mato Grosso e em alguns estados brasileiros foi
reavalia em uma série de estudos seccionais. Negreiros et al (2009) verificaram a situação
epidemiológica da doença em Mato Grosso em 4 circuitos produtores. A prevalência geral de
focos e de animais infectados foi: 41,2% e 10,2%, respectivamente. Com base nos circuitos, a
prevalência estimada em animais apresentou a seguinte ordem crescente: 4,1% para o circuito
pecuário 2; 7,9% para o circuito pecuário 1; 8,1% para o circuito pecuário 3 e 15,3% no circuito
pecuário 4. Já as prevalências de focos encontradas, em ordem crescente, foram as seguintes:
27,2% para o circuito 2; 36,9% para o circuito 1; 40,4% para o circuito 3 e 50,3% para o
circuito 4. Os fatores de risco (odds ratio, OR) associados à condição de foco no Estado foram:
exploração de gado de corte (OR= 1,8), exploração mista (OR=1,8), número de fêmeas no
rebanho de 11 a 50 (OR=4,8), número de fêmeas no rebanho acima de 51 (OR=6,8) e ocorrência
de aborto (OR=1,7).
Segundo Silva Junior (2008), a utilização de testes diagnósticos em rebanhos ou em frigoríficos
fornece dados sobre a situação epidemiológica, permitindo assim a detecção de focos de
doenças e a adoção de medidas de controle. Conhecendo-se a procedência dos animais de abate,
torna-se possível o acionamento e a integração dos órgãos responsáveis para que as decisões
sejam tomadas, por isso, a integração do serviço de fiscalização e monitoramento da Defesa
Sanitária com o Serviço de Inspeção de Produtos de Origem Animal, pode ser considerada
ponto chave para o sucesso das atividades propostas pelo PNCEBT, visto a sua atuação tanto na
proteção do consumidor quanto na vigilância epidemiológica.
Em um levantamento realizado pelo SIF 4268 (dados não publicados), entre os anos de 2009 e
2013 foram encontrados 117 casos de bursite cervical e outros 52 de artrite no exame postmortem. Entre 2011 e 2012, foram coletadas amostras de sangue e tecidos de 40 animais dos
21
que apresentaram lesões macroscópicas na inspeção post-mortem. As amostras de tecido e soro
foram enviadas para o Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais (LANAGRO/MG)
para realização dos exames bacteriológicos e sorológicos, respectivamente. Os resultados
obtidos demonstraram a ocorrência de 36 animais reagentes na sorologia, sendo que 21
obtiveram confirmação pelo teste bacteriológico, revelando a presença da B. abortus biovar 1
em quatorze das amostras; uma amostra com a presença do biovar 2; uma do biovar 4 e outras
cinco com o biovar 3. As lesões enviadas ao laboratório oficial foram principalmente
relacionadas à bursite cervical e artrite. Entre os anos de 2012 e 2013, foram coletadas 48
amostras de animais com lesões suspeitas enviadas à Universidade Federal de Goiás para
análise de PCR em Tempo Real, sendo então confirmadas 9 amostras positivas.
2.3 - Patogenia e sinais clínicos
A patogenicidade das bactérias do gênero Brucella está intimamente relacionada com os
mecanismos que permitem sua invasão, sobrevivência e multiplicação intracelular nas células
do hospedeiro, mantendo-as protegidas da ação do sistema imune (NIELSEN et al., 2004;
XAVIER et al., 2009). O aborto, principal característica da brucelose, ocorre devido à grande
replicação das bactérias no trofoblasto placentário, resultando em morte e expulsão fetal entre o
sexto e o oitavo mês de gestação e, a persistência da bactéria nos macrófagos leva às infecções
crônicas (ROOP et al., 2009).
A infecção natural se inicia principalmente pela mucosa oral, nasofaríngea, conjuntival ou por
solução de continuidade da pele, sendo que a porta de entrada principal da B. abortus em
bovinos é a mucosa orofaringeana (BISHOP et al., 1994; GORVEL MORENO, 2002;
CAMPANA et al., 2003; RIBEIRO, 2008). Após a penetração na mucosa, as bactérias são
fagocitadas principalmente por macrófagos, sendo carreadas até os linfonodos regionais, onde
se multiplicam e podem permanecer por semanas a meses, levando a hiperplasia e linfadenite
(LAGE et al., 2008). A partir dos linfonodos regionais, os microrganismos podem disseminar
livremente ou no interior de macrófagos, pela via hemática e linfática atingindo outros
linfonodos, principalmente os supramamários, e em órgãos como baço, fígado, e outros tecidos
ricos em células mononucleares (CAMPANA et al., 2003; LAGE et al., 2008; LIRA, 2008;
XAVIER et al., 2009).
Durante a fase de multiplicação celular, estas bactérias podem provocar alterações inflamatórias
e anatomopatológicas caracterizadas por granulomas difusos, levando à hiperplasia linfoide,
esplenomegalia e até hepatomegalia (LAGE et al., 2008). Porém, de acordo com Corrêa (1992),
nem todos os órgãos e tecidos invadidos por microrganismos de gênero Brucella apresentam
alterações evidentes e áreas de necrose. Os órgãos de predileção são aqueles que oferecem
elementos necessários para seu metabolismo, como o eritritol presente no útero gravídico,
tecidos mamários, ósseo a articulares, e todo o aparelho reprodutivo de fêmeas (FREITAS
OLIVEIRA, 2005).
Nos machos pode ocorrer aumento do volume dos testículos de forma uni ou bilateral, além dos
epidídimos, ampolas e vesículas seminais. Devido à reação inflamatória do tipo necrosante,
pode haver atrofia do órgão afetado, levando a quadros de subfertilidade, infertilidade ou
esterilidade (PAULIN e FERREIRA NETO, 2003; LAGE et al., 2008; NOZAKI, 2008).
No aparelho locomotor, os microrganismos do gênero Brucella, principalmente a B. abortus
localiza-se na bursa, tendões, músculos e articulações, causando artrites, principalmente nas
articulações carpianas e tarsianas; espondilites e bursites, especialmente nas vértebras torácicas
22
e lombares, podendo atingir a medula óssea e bainha dos tendões, sendo o achado clinico
clássico, o abscesso fistulado ou não na região da cernelha, lesão conhecida como “mal da
cernelha” ou “mal das cruzes” (PAULIN e FERREIRA NETO, 2003). Os inchaços nas
articulações dos joelhos e jarretes, conhecidos como higromas, também apresentam evidencias
de brucelose (RADOSTITIS et al., 2007; LAGE et al., 2008). Alguns autores associam a
presença de bursite à infecção brucélica, visto a frequência do isolamento e detecção do agente
em muitos casos (PARDI et al., 1956; VIANA et al., 2010).
Na inspeção sanitária realizada em matadouros-frigoríficos, os inspetores veterinários realizam
o julgamento de carcaças e vísceras de bovinos suspeitos de brucelose, mediante a observação
macroscópica de lesões sugestivas da enfermidade, não dispondo de meios de diagnóstico
específicos que possam associar diretamente as alterações observadas no exame sanitário com a
infecção brucélica (FREITAS e OLIVEIRA, 2005).
2.4 – Diagnóstico
Antes do desenvolvimento dos testes laboratoriais, o histórico clínico e o exame físico dos
animais doentes eram as únicas fontes de informação para o diagnóstico das doenças
infecciosas. Além do caráter subjetivo inerente ao examinador, a avaliação limitava-se apenas
aos sinais clínicos das doenças, sendo estes sinais, muitas vezes, comuns para uma diversidade
de doenças infecciosas.
O desenvolvimento da microbiologia na virada do século XX possibilitou a amplificação e
precisão dos métodos de diagnóstico. Mais recentemente, com o refinamento e sofisticação das
técnicas de biologia molecular, os testes diagnóstico têm se tornado uma ferramenta muito
importante na detecção e controle de agentes infecciosos.
Os métodos diagnósticos quando utilizados e interpretados de maneira correta, podem fornecer
informações importantes na tomada de decisões pelos médicos veterinários. Neste sentido, o
conhecimento do estado sanitário do indivíduo e da população suscetível possibilita o
desenvolvimento de estratégias de tratamento e monitoramento da sanidade animal. Além disso,
a mensuração da frequência de determinado agente etiológico em uma população animal
permite o delineamento epidemiológico das principais doenças, possibilitando o
desenvolvimento de programas de controle e erradicação.
É no exame post-mortem, o diagnóstico macroscópico realizado nos frigoríficos por inspetores
do Serviço de Inspeção Federal, Estadual e Municipal, que as bursites podem ser diagnosticadas
mediante exames macroscópicos (ALMEIDA et al., 2000). Em matadouros-frigoríficos, os
inspetores associam as lesões inflamatórias à ocorrência de brucelose, caracterizadas como
inflamações da bursite cervical localizadas na região da cruz, adjacentes a porção funicular do
ligamento cervical e apófises espinhosas cervicais (SOLA, 2011).
Entretanto, nem sempre há presença deste tipo de lesão nas carcaças em animais infectados ou
essas lesões são identificadas pelo serviço de inspeção. As bursites da cernelha de bovinos são
de difícil visualização à inspeção ante-mortem, sendo de pouco valor a tentativa de separar os
animais suspeitos (LANGENEGGER et al., 1975).
Em um estudo realizado por Viana et al (2010), foram avaliados 845 soros provenientes do
estado do Pará e Tocantins, a prevalência encontrada foi de 16,6% e 17,2% no AAT
respectivamente, sendo que nenhum dos animais apresentou sinais sugestivos de brucelose no
exame ante e post-mortem. O estudo aponta que o diagnóstico clínico da brucelose em
23
matadouro tem reduzida eficácia no controle do risco que a doença pode representar para os
trabalhadores e que também não é critério seguro para julgamento sanitário por permitir a
liberação, para consumo direto, de um grande número de animais que, por técnicas laboratoriais,
podem ser considerados infectados.
Para o melhor conhecimento da epidemiologia de uma enfermidade, é necessário o
conhecimento do melhor método de diagnóstico da doença, permitindo assim estudar a
ocorrência, distribuição e caracterização do agente em questão (MINHARRO et al., 2009).
Segundo Jacobson (1998), os testes sorológicos empregados no diagnóstico de doenças
infecciosas devem ser constantemente avaliados quanto ao seu desempenho mesmo depois de
validados. O teste kappa é uma alternativa para essa avaliação através da comparação entre
testes sem levar em consideração os valores de suas respectivas especificidades e sensibilidades,
além de não necessitar de padrões-ouro para ser realizado (MCKENNA e DOHOO, 2006). O
teste é baseado no número de respostas concordantes, ou seja, no número de casos cujo
resultado é o mesmo. Esta medida de concordância tem como valor máximo o 1, onde este valor
1 representa total concordância e os valores próximos e até abaixo de 0, indicam nenhuma
concordância, ou a concordância foi exatamente a esperada pelo acaso (LANDIS E KOCH,
1977).
Al-Garadia et al (2011) ressaltaram que a combinação de testes sorológicos com testes
moleculares, especialmente o PCR, é a melhor forma de controlar e erradicar a brucelose em
propriedades e diagnosticar corretamente animais infectados.
A importância de métodos eficientes de diagnóstico da brucelose em Mato Grosso é evidente
devido aos dados atuais de prevalência como já citado anteriormente.
2.4.1 - Métodos indiretos
Um dos pilares nos quais se baseiam as campanhas sanitárias destinadas à erradicação ou
diminuição de taxas de ocorrências da brucelose, consiste na disponibilidade de métodos
diagnósticos que sejam ao mesmo tempo confiáveis e de execução relativamente simples
(MATHIAS e MACMILLAN, 1995).
Devido às limitações dos procedimentos laboratoriais que se apoiam nos cultivos, os métodos
sorológicos têm sido os mais utilizados para o diagnóstico da brucelose (SUTHERLAND, 1980;
MOLNAR et al., 1997). Vários testes sorológicos têm sido projetados para atender esses
requisitos, a maioria desses testes é baseada na aglutinação de antígenos por anticorpos
específicos presentes no sangue de animais infectados (BRICKER, 2002).
Os testes de aglutinação mensuram a concentração de imunoglobulinas (Ig) séricas e são
sensíveis a diferentes isotipos de anticorpos (MITTAL e TIZARD, 1983). Fosgate et al. (2002)
recomendaram o AAT como prova de triagem para o controle da brucelose em bovinos e
bubalinos, devido a maior sensibilidade em comparação com outros testes. A prova do AAT
consiste em uma soroaglutinação em placa, em que o antígeno, na concentração de 8% de
volume celular, é tamponado em pH baixo (3,65) e corado com rosa de Bengala.
No entanto, esses testes não apresentam sensibilidade absoluta, incluindo o AAT, devendo-se
normalmente associar várias técnicas para aumentar o número de animais detectados. Animais
recentemente infectados ou com a infecção crônica podem não ser detectados pelas técnicas
sorológicas (COSTA, 2001). Visto que a sensibilidade é crucial na triagem, a ocorrência de
algumas amostras falso-positivas deve ser tolerada (BRICKER, 2002). Como recomendação,
24
provas confirmatórias de maior especificidade podem ser realizadas para evitar o sacrifício de
animais não infectados, porém geralmente elas são mais caras e laboriosas (NIELSEN, 2002).
O PNCEBT definiu como oficiais os testes do AAT e o teste de Anel em Leite (TAL), como
provas de triagem. Para testes confirmatórios, o programa estabeleceu o teste do 2Mercaptoetanol (2-ME) e a reação de Fixação do Complemento (FC) para detecção de
antígenos pelo emprego de anticorpos específicos com o objetivo de detectar uma exposição
prévia do animal ao agente (BRASIL, 2006). Meirelles-Bartoli et al (2010) estudaram os testes
adotados pelo PNCEBT para o diagnóstico sorológico da brucelose em bovinos e concluíram
que o teste do AAT apresentou elevada sensibilidade relativa, como se espera de um teste de
triagem. Segundo Samartino et al (1999) e Van Aert et al (1984), a sensibilidade e a
especificidade do AAT variam de 21 a 98,3% e 68,8 a 100%, respectivamente.
Pesquisa realizada por Filho et al (2011), que faz a comparação entre as provas de 2mercaptoetanol e de fixação do complemento para o diagnóstico sorológico da brucelose bovina
em bovinos com diferentes históricos vacinais, sugere-se a criação de um banco de soros de
referência, o qual poderia ser utilizado não só para a validação dos testes já existentes, como de
novos testes que desejam implementar no país.
2.4.2 - Métodos Diretos
Os métodos diretos de diagnóstico para brucelose incluem o isolamento e a identificação do
agente, a imunohistoquímica e os métodos de detecção de ácidos nucleicos pela técnica da PCR.
A bacteriologia envolve o isolamento e cultura do agente e é considerado o teste padrão-ouro,
tem como vantagem sua alta especificidade e capacidade de identificar diferentes espécies e
biovares do agente (LAGE et al., 2008). Porém, como a bacteriologia da Brucella spp. é
complexa devido as exigências nutricionais e de atmosfera enriquecida com CO2, pelo lento
crescimento, pela baixa sensibilidade e pela necessidade de trabalho em contenção em
laboratório de biossegurança de nível 3, os métodos moleculares vêm se destacando.
A detecção do DNA do agente bacteriano pela PCR apresenta enorme rapidez e sensibilidade,
além da grande vantagem de detectar pequenas quantidades de microrganismos em materiais
como abortos, sangue e sêmen, sem a necessidade de estarem viáveis como na cultura
bacteriológica (JÚNIOR, F.F.S, 2008). Considerando a acurácia e a rapidez de execução que a
PCR apresenta quando comparada ao cultivo bacteriológico, esta técnica tem se mostrado
eficiente no diagnóstico direto de microrganismos, atuando como ferramenta epidemiológica na
detecção de Brucella spp (SOLA, 2011; LEYLA et al, 2002).
Segundo Paulin e Ferreira Neto (2003), devem ser coletados das carcaças de bovinos no
momento do abate, os linfonodos retrofaríngeos, mandibulares, parotídeos, pré-escapulares e
ilíacos, mas principalmente os supramamários, onde o agente é isolado em quase 90% dos
animais infectados. Entretanto, devido ao processo de replicação difusão através da corrente
sanguínea e vasos linfáticos, há disseminação destes agentes por todo organismo, sendo possível
sua identificação no fígado, baço, pulmões e rins, além dos linfonodos e trato genital
(CAMPANA et al., 2003; LIRA, 2008).
Leary et al (2006), avaliaram a viabilidade do uso do PCR convencional e em tempo real para
diagnóstico da brucelose, analisando amostras de sangue, leite, e linfonodos das vacas
sorologicamente positivas. Os autores concluíram que os linfonodos são o melhor material para
o diagnóstico pelo método molecular. Não houve diferença entre PCR e o método
25
bacteriológico, entretanto, segundo os autores é improvável que os métodos de PCR substituam
os métodos sorológicos para a detecção de B. abortus em amostras clínicas.
3 - Material e Métodos
3.1 - Coletas de amostras
Foram coletadas 622 amostras de sangue e linfonodos em fêmeas bovinas com idade superior a
24 meses em matadouro-frigorífico sob Serviço de Inspeção Federal. O estabelecimento
encontra-se localizado no município de Colíder, estado de Mato Grosso. Os animais, bem como
as propriedades que participaram do experimento foram escolhidos aleatoriamente, entre
propriedades foco e não foco, contanto que houvesse abate de fêmeas. Os animais não
demonstraram alterações clínicas na inspeção ante-mortem. Todos os bovinos tinham histórico
de vacinação conforme declarado na Guia de Trânsito Animal (GTA).
As amostras de sangue foram coletadas na canaleta de sangria após insensibilização em tubos
estéril com ativador de coágulo, resfriadas e encaminhadas para Embrapa Agrossilvipastoril em
Sinop/MT. No laboratório de sanidade animal foram realizados os testes do AAT em todas as
amostras de soro. Foram coletadas as amostras de sangue e linfonodos até a obtenção de 80
amostras positivas pelo AAT, interrompendo-se então as coletas de ambos os materiais.
Na linha de abate foram coletadas as amostras de linfonodos das linhas D, H e I (ilíacos,
isquiático, retro mamário, pré-peitoral, mesentéricos). As amostras foram identificadas no que
se refere à linha de inspeção e número de identificação individual dos animais. As amostras
foram então congeladas à -20°C no túnel de congelamento e enviadas posteriormente para
Embrapa Agrossilvipastoril. No laboratório, as amostras foram aliquotadas, incluindo a parte
cortical e medular dos linfonodos, armazenadas em microtubos para posterior extração do DNA
e realização do PCR.
Associada à coleta de material para o diagnóstico laboratorial foi feita a inspeção em busca de
lesões macroscópicas, seguindo a rotina do Serviço de Inspeção Federal (SIF) do frigorífico. A
inspeção incluiu toda a carcaça com ênfase nas articulações carpianas e tarsianas e nas vértebras
torácicas e lombares na região da cernelha.
3.2- Testes laboratoriais
O teste do AAT foi realizado em todas as 622 amostras e interpretado de acordo com as normas
descritas no PNCEBT. Utilizou-se 30 µL de soro e 30 µL do antígeno para realização do teste,
sendo considerado positivo quando houvesse formação de grumos. O antígeno utilizado foi
fornecido pelo Lanagro/MG (Partida: 001/2012, Fab: 08/2012).
Para realização do PCR, a extração do DNA das amostras de linfonodo foi realizada de acordo
com o método descrito por Leal-Klevezas et al. (1995). No laboratório foi realizado o toalete
nos linfonodos e retiradas alíquotas, cerca de 1g por amostra. O material foi macerado e
suspendido. Desse material, foram aliquotados 500 µl de cada amostra para extração de DNA.
Durante a extração, foram adicionados 800 µL de TE (Tris-EDTA) pH 8,0 em cada amostra,
sendo então homogeneizadas e posteriormente centrifugadas a 13.000 rpm por 5 minutos. Após
a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e este processo repetido por mais duas vezes.
Após a primeira etapa, as amostras foram ressuspendidas com 350 µL por amostra da solução A
(5µL Tris-HCl 1M pH 8; 25 µL EDTA 0,5M pH 8;10 µL NaCl 5M; 400 µL água MiliQ
autoclavada) e, posteriormente, homogeneizadas para acondicionamento em microtubos a 80°C
26
por 10 minutos. No passo seguinte, foram adicionados 50 µL por amostra da solução B (50µL
SDS 10%, 10µL Proteinase K). Neste ponto, o microtubo foi mantido a 37°C por 24 horas.
Em seguida, foram adicionados 500 µL de fenol equilibrado, sendo então o material
homogeneizado e centrifugado a 13000 RPM por 5 minutos. Foram transferidos 400 µL da fase
aquosa para um novo microtubo de 1,5 mL e adicionado igual volume de fenol-clorofórmio.
Após nova centrifugação, foram transferidos 300 µL da fase aquosa para um microtubo
DNAse/RNAse free de 1,5 mL com adição de 300 µL de álcool isopropílico puro, sendo então
as amostras homogeneizadas e mantidas por 18 horas a -20°C para nova centrifugação a 13000
rpm por mais 30 minutos, descartando o sobrenadante. Foi adicionado nesta etapa 1 mL de
etanol 70% em cada amostra para posterior centrifugação a 13000 rpm por 20 minutos. O
sobrenadante foi descartado novamente e o sedimento mantido em termobloco a 56°C por 10
minutos. Finalizando o processo, foram adicionados 30 µL TE pH 8,0 e as amostras incubadas
em termobloco por 30 minutos a 56°C. As amostras foram armazenadas a -20°C até o momento
da reação.
Após a extração do DNA, cada amostra foi submetida à leitura espectrofotométrica em
Nanodrop (Thermo Scienific) nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm a fim de avaliar a
integridade e a determinação da concentração do DNA, relação entre ácidos nucleicos e
proteínas. Para a amplificação dos fragmentos alvo, foram utilizados os seguintes componentes:
10,5 µL de água Mili-Q esterilizada; 0,5 µL de Taq; 1 µL de cada iniciador (primer B4 e B5), 4
µL DNTP; 2 µL tampão e 2 µL da amostra de DNA. Foi utilizado o primer
5’TGGCTCGGTTGCCAATATCAA3’ e 3’CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG5’ (Sigma –
001/8 de 2013) descrito por Baily et al. (1992), com peso molecular 223pb. A temperatura
utilizada para o anelamento foi de 64°C, sendo a melhor temperatura entre os testes de 60, 62,
64°C. Como controle positivo nas reações, utilizou-se DNA extraído da cepa de referência 2308
de Brucella abortus e água livre de nucleases como controle. Assim como os antígenos do
AAT, o DNA também foi fornecido pelo LANAGRO/MG.
As análises dos produtos amplificados foram realizadas por eletroforese em gel de agarose 1,8%
(bcps31 e AMOS) e 3% (BruAb_0168), corados com brometo de etídeo e visualizados em
transluminador ultravioleta.
3.3 - Mapas
Os mapas foram gerados com o auxílio do programa de informação geográfica QGis 2.0 (Open
Source Geospatial Foundation (OSGeo) - licença pública).
3.4- Estatística
Após a obtenção de todos os resultados foi utilizado o teste Kappa para avaliar a concordância
ente as provas do AAT e PCR de acordo com Trusfield (1986) e o resultado interpretado
conforme tabela 1. Para verificar se houve independência entre o resultado das duas provas,
utilizou-se o teste qui-quadrado de McNemar, considerando os resultados como reagentes e não
reagentes adotando-se o nível de significância de 5% (JEKEL et al, 1999).
27
Tabela 1: Índice de interpretação do teste de Kappa.
Kappa
<0,0
0,00-0,20
0,21-040
0,41-0,60
0,61-0,80
0,81-0,99
1,00
Concordância
Nenhuma
Insignificante
Mediano
Moderado
Substancial
Ótima
Perfeita
4 – Resultados e Discussão
O diagnóstico é parte essencial de um programa sanitário. A brucelose é diagnosticada por
diferentes métodos que se complementam: o diagnóstico clínico baseia-se nos sinais sugestivos
da doença; o epidemiológico, no histórico do rebanho da propriedade e das propriedades
vizinhas; e o laboratorial, em exames complementares diretos e indiretos (PAULIN &
FERREIRA, 2003).
O sucesso de um programa de controle da brucelose depende muito da escolha dos testes que
serão utilizados para o diagnóstico. Os critérios adotados para a escolha de tais testes são: custo,
praticidade, repetibilidade, sensibilidade e especificidade, além da situação epidemiológica da
doença (CHAPPEL, 1989).
Entre as hipóteses previamente levantadas, havendo boa concordância entre o AAT e o PCR, os
frigoríficos poderiam utilizar o teste de triagem para destinação de suas carcaças
independentemente da avaliação no post-mortem, visto que o PCR tem sido utilizado como teste
confirmatório nos casos onde ocorrem lesões visíveis durante a inspeção na linha de abate.
Das 622 amostras, apenas 142 matrizes eram provenientes de propriedades consideradas foco
pelo Instituto de Defesa Agropecuária do Estado de Mato Grosso (INDEA) com base nas Guias
de Transporte Animal (GTA), 23% do total. Dos 89 animais reagentes ao AAT, 75 eram
oriundos de propriedades consideradas como não foco com base na GTA das propriedades,
apenas 14 matrizes eram provenientes de propriedades foco (figura 8). Com base nos resultados
do teste do AAT, foi encontrada uma frequência de 14,3% de animais reagentes. A distribuição
espacial dos focos nos municípios pode ser visualizada no mapa da figura 10. De acordo com a
avaliação categórica representada por diferentes cores, os municípios de Nova Canaã do Norte e
Alta Floresta apresentam o maior número de casos da doença. O município de Novo
Progresso/PA e Carlinda/MT vêm em seguida, com a segunda maior ocorrência de casos com
base apenas no teste do AAT. Com base apenas nas 169 amostras avaliadas pelos dois testes, a
ocorrência de casos cai em alguns municípios com base nos resultados do PCR, mas em Nova
Canaã do Norte, a ocorrência continua sendo a mais elevada, apresentando uma ocorrência entre
19 a 24 casos (figura 11).
Do total de animais analisados, apenas em dois foram encontradas lesões macroscópicas
sugestivas de brucelose, como demonstrado na figura 2, ambos de propriedades negativas
segundo as informações da GTA, representando 0,3% do total. Com base apenas no resultado
das amostras das quais o DNA foi extraído, independentemente do resultado do AAT, segundo
o teste de PCR a ocorrência de animais positivos seria de 36%.
28
Quando somados os resultados sorológico e molecular em uma estratégia de associação de
testes em paralelo, a ocorrência de animais reagentes sobe de 14,3% para 18%, mesmo não
tendo sido realizada a extração de DNA de todas as amostras para realização do PCR.
Do total de amostras coletadas, 169 foram analisadas por ambos os testes, sendo 34
consideradas positivas e 60 negativas tanto pelo método de PCR quanto pela sorologia. Todos
os resultados estão descritos na tabela 2, os resultados do AAT e PCR estão representados pelas
figuras 3 e 4.
Das 22 propriedades incluídas no estudo, em apenas duas não foram encontrados animais
reagentes com base no AAT, sendo uma delas considerada foco pelo INDEA (Figura 9). No
entanto, nas duas propriedades foram encontrados animais reagentes com base nos resultados de
PCR. Nota-se que na representação das propriedades na figura 9, apenas uma das propriedades
negativas foi identificada por um ponto no mapa, pois não havia disponibilidade da coordenada
geográfica da segunda.
Tabela 2. Comparação de resultados entre as duas provas (AAT x PCR).
TESTES
AAT positivo
AAT negativo
Total
PCR positivo
34
27
61
PCR negativo
48
60
108
Total
82
87
169
De acordo com os resultados, observou-se uma acurácia de 55,62% entre as provas, sendo
kappa igual a 0,1051 (p<0,05), com intervalo de confiança variando de -0,081 a 0,291. Pelo
teste de qui-quadrado de McNemar, a diferença entre os dois testes apresentou-se significativa
(p=0,0203), com χ2 igual a 5,88. Sendo assim, há evidência suficiente para se recusar a hipótese
nula, sendo então as proporções dos resultados significativamente diferentes umas das outras.
Os resultados indicam haver uma alta prevalência de animais positivos para brucelose oriundos
de municípios localizados no norte de Mato Grosso, mesmo em propriedades consideradas
livres da doença. Apesar de o diagnóstico sorológico ter identificado 14,3% de animais
positivos, apenas 2 apresentaram sinais de lesão macroscópica caracterizando um quadro de
bursite, embora seja este o critério para definir o destino das carcaças de acordo com as
exigências do mercado externo como a Rússia por exemplo (figura 4).
Embora seja o exame post-mortem a base para o diagnóstico macroscópico realizado por
inspetores, estes associam as lesões inflamatórias à ocorrência de brucelose, caracterizadas
como inflamações da bursite cervical localizadas na região da cruz e adjacências (Sola, 2011),
os resultados encontrados no presente trabalho sugerem ser este tipo de exame insuficiente para
o embasamento dos agentes do serviço de inspeção. A frequência de lesões encontradas (0,3%)
reforça o resultado encontrado por Viana et al (2010), onde dos 845 animais avaliados, com
uma prevalência de 16,6% e 17,2% nos estados do Pará e Tocantins, nenhum dos animais
apresentou sinais sugestivos de brucelose no exame ante e post-mortem.
Com base nos 2 animais com diagnóstico macroscópico positivo, o presente trabalho aponta que
o diagnóstico clínico da brucelose em matadouro tem reduzida eficácia para o critério seguro
para julgamento sanitário por permitir a liberação para consumo direto ou exportação, embora
ambos os animais foram considerados positivos pela técnica de AAT e PCR.
29
No Brasil, a brucelose bovina ocorre endemicamente em todo o território nacional,
independente do sistema de produção e/ou criação e exploração econômica. Segundo Negreiros
et al (2009), no MT a prevalência geral de focos e de animais infectados foi de 41,2% e 10,2%,
respectivamente. Com relação ao circuito pecuário 4, no qual se localiza o município de
Colíder, foco deste estudo, a prevalência animal foi de 15,3% e de rebanho de 50,3%. Os fatores
de risco encontrados demonstram haver uma Odds Ratio de 6,8% quando se tem um número de
fêmeas no rebanho acima de 51 animais. Embora o presente trabalho não tenha estudado a
prevalência dos rebanhos devido ao número amostral, a ocorrência de animais positivos está de
acordo com a prevalência encontrada por Negreiros et al (2009). Foram encontrados 14,3% de
animais reagentes com base no AAT, muito próximo do resultado de 15,3% de prevalência
animal descrita pelos autores. Já com relação às propriedades, em 91% foi encontrado pelo
menos 1 animal positivo com base no teste do AAT ou no teste PCR.
Ainda em relação ao trabalho de Negreiros et al (2009), a presença de fêmeas no rebanho como
fator de risco parece ser um importante fator para ocorrência da doença, já que a maior parte das
fazendas estudadas têm o sistema de cria como uma das atividades da pecuária bovina,
condizendo com o alto número de rebanhos positivos e animais reagentes. Devido às
dificuldades encontradas pelo segmento, somente no ano de 2013; 2 milhões de fêmeas foram
abatidas no estado até o mês de agosto, um crescimento de 73% quando comparado ao total do
exercício de 2010 (ACRIMAT, 2013). De acordo com a pesquisa realizada pela associação dos
criadores de Mato Grosso, 84% dos produtores do estado estão envolvidos com a atividade de
cria, seja ela como a única atividade ou quando é realizado o ciclo completo.
Como citado por Dias (2004), a compra e o trânsito de animais destinados à reprodução é um
dos fatores de risco para introdução da brucelose nos rebanhos. A implementação e manutenção
de um sistema de vigilância das doenças infecciosas, bem como a rastreabilidade da informação
nas cadeias produtivas demandam o uso de sistemas para o seu desenvolvimento, sem os quais
não é possível a construção de formas de rastreabilidade eficazes e úteis para atender as
regulamentações cada vez mais exigentes (MURAKAMI e SARAIVA, 2005). Fica clara a
importância da busca ativa de casos como política de saúde animal em um sistema de vigilância
epidemiológica de agravos transmissíveis, incluindo zoonoses importantes como a brucelose.
No entanto, como já discutido anteriormente, apenas a identificação de lesões sugestivas não é
suficiente para o sistema de vigilância no estado.
É inegável que os testes sorológicos constituem a base do diagnóstico em um programa
sanitário para controle ou erradicação da brucelose animal, sendo a principal alternativa para
viabilizar o teste em um grande número de amostras. No entanto, deve ser considerado que o
diagnóstico sorológico está sujeito a erros. A associação de testes é uma alternativa em alguns
casos para incrementar a sensibilidade ou especificidade dos testes, havendo estratégias para
cada necessidade.
Os resultados com base nas análises estatísticas demonstram que há concordância de resultados
acima do que é devido ao acaso (>0) entre os testes AAT e PCR, porém o valor de Kappa foi
considerado baixo (Kappa=0,1051). O mesmo ocorreu com o trabalho de Costa e colaboradores
(2012), onde a concordância foi baixa entre os testes de PCR e imunodifusão (IDGA).
Entretanto, a técnica de PCR pode ser uma alternativa interessante para ser aplicada em paralelo
a sorologia, aumentando a identificação de animais falsos negativos nos rebanhos, reduzindo
assim, a contaminação entre animais.
30
Estes resultados indicam que nem a sorologia nem o PCR são métodos de diagnósticos
completamente confiáveis para identificação de indivíduos positivos. Para contornar esse
problema, o PNCEBT prevê a repetição periódica dos testes até o completo saneamento do
rebanho (BRASIL, 2004a). Ilhan et al. (2008) enfatizaram a importância de utilizar mais de uma
técnica laboratorial para detecção de animais positivos para brucelose, especialmente quando há
um propósito epidemiológico em questão.
A maior parte dos testes baseados na formação de complexo antígeno-anticorpo é sensível à
temperatura e diferentes condições de trabalho, podendo afetar a interpretação dos resultados
(DOOHO et al, 2003). Além disso, testes sorológicos têm sua especificidade reduzida em
regiões onde a doença é endêmica (MORATA et al, 2003), sendo esta a realidade brasileira
como já discutido anteriormente. Outra observação diz respeito à característica deste estudo, no
qual foram incluídos animais naturalmente infectados. Dessa forma, foram avaliados animais
em diferentes estágios da infecção (latente, incubação e forma crônica), além de variação de
idade, estado reprodutivo e status imune.
O método de PCR, apesar da alta sensibilidade e especificidade, também pode apresentar
resultados falsos positivos (BAILY et al., 1992) ou falsos negativos. O protocolo de extração de
DNA, o tipo de amostra clinica, e limites de detecção para cada um dos protocolos, são fatores
que podem influenciar a eficácia da técnica (MORATA et al, 2003; NAVARRO et al, 2004;
MITKA et al, 2007). Foram utilizados os linfonodos das linhas D ou H, dependendo da
disponibilidade de material para extração. Não foi realizado um pool das amostras, pois em
alguns casos, as identificações nos sacos plásticos utilizados para coleta foram perdidas durante
o armazenamento. Sendo assim, apenas um dos linfonodos foi incluído no processo de
aliquotagem e processamento.
5 – Conclusão
O presente trabalho aponta que o diagnóstico clínico da brucelose em matadouro tem reduzida
eficácia para o critério seguro para julgamento sanitário por permitir a liberação para consumo
direto ou exportação.
A vigilância epidemiológica da Brucelose no estado de Mato Grosso é baseada na busca passiva
de casos, restringindo a abertura de focos à notificação de animais reagentes pelos veterinários
credenciados pelo PNCEBT. A busca ativa de focos pelos órgãos de defesa a saúde animal é
essencial para identificação de propriedades onde a doença ocorre no estado. Como
demonstrado nos mapas, à ocorrência da brucelose é alta no norte de MT e Sul do PA. Novos
estudos envolvendo o estudo epidemiológico da brucelose bovina devem ser realizados na
região.
A concordância entre os testes do AAT e PCR não se dá ao acaso, porém é baixa de acordo com
o teste de Kappa. Os testes podem ser associados em paralelo para identificação de animais
reagentes em programas onde está previsto o controle e a erradicação da doença, sendo uma
estratégia interessante em regiões onde a doença é endêmica.
31
6 - Referências Bibliográficas
ACRIMAT. Criadores de mato Grosso denunciam baixa rentabilidade do segmento da cria.
Acessado
em
08/02/2014.
Disponível
em:
http://pecuaria.ruralbr.com.br/noticia/2013/10/criadores-de-mato-grosso-denunciam-baixarentabilidade-do-segmento-da-cria-4287125.html.
AL-GARADIA, M.A.; KHAIRANI-BEIO, S.; ZUNITA, Z.; OMAR, A.R. Detection of
Brucella melitensis in blood samples collected from goats. Jornual Animal Veterinary, v. 10, p.
1437-1444, 2011.
ANGREVES, G.M. Avaliação etiológica de bursite cervical e correlação com a brucelose em
bovinos abatidos no estado de Mato Grosso. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) –
Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, 59f. 2008.
ALMEIDA, L.P.; REIS, D.O.; GERMANO, P.M.L. Brucelose em bovinos com bursite cervical
diagnosticada em abatedouro sob inspeção federal. Ciência Rural, v.30, n.2, p.287-291, 2000.
ALTON, G.G.; JONES, L.M.; ANGUS, R.D.; VERGER, J.M. Techniques for the Brucellosis
Laboratory. Institut National de la Recherche Agronomique, 190 p. 1988.
BAILY, G.G.; KRAHN J.B.; DRASAR, B.S.; STOKER, N.G. Detection of Brucella melitensis
and Brucella abortus by DNA amplification. Journal of Tropical Medicine Hygiene, v.95:
p.271-275, 1992.
BARTOLI MEIRELLES., R.B.; MATHIAS, L.A. Estudo comparativo entre os testes adotados
pelo PNCEBT para o diagnóstico sorológico da brucelose em bovinos. Arquivo do Instituto
Biológico, v.77, n.1, p.11-17, 2010.
BISHOP, G.C.; BOSMAN P.P.; HERR S. Bovine brucellosis. IN: Coetzer JAN, Thomson, G.R,
Tustin RC, eds. Infectious diseases of livestock. Austin: Texas A&M University Press, College
Station, v. 2, p.1053-1066, 1994.
BRASIL. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA DO ABASTECIMENTO E DA REFORMA
AGRÁRIA. Portaria n°. 23/76, de 20 de janeiro de 1997: Manual de procedimentos.
Movimentação interestadual de animais e produtos. 5.ed. Diário Oficial da União, Brasília, 16
de fev. 1976. Seção I, pt.I, p.2266-2269.
BRASIL. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. Programa
Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal (PNCEBT). Manual
técnico, Brasília, 184p. 2006.
BRICKER, J.B. Diagnostic strategies used for the identification of Brucella. Veterinary
microbiology, v. 90, p.433-434, 2002.
BRICKER, B.J. PCR as a diagnostic tool for brucellosis. Veterinary Microbiology, v. 90, p.435446, 2002.
CAMPANÃ, R.N.; GOTARDO, D.J.; ISHIZUCA, M. M. Epidemiologia e Profilaxia da
Brucelose Bovina e Bubalina. Coordenadoria de Defesa Agropecuária CDA/SAA. Campinas,
São Paulo, 2003, 20p.
32
CARDOSO, S.C.T.; COSTA, L.M.C. A brucelose no Brasil sob enfoque na saúde pública,
2006.
CARDOSO, P. G. Brucella spp noncanonical LPS: structure, biosynthesis, and interaction with
host immune system. Microbial Cell Factories, London, v.5, n.13, 2006.
CARVALHO, M. S.; BARROSO, M. R.; PINHAL, F.; TAVARES, F.M. Brucelose: Alguns
aspectos epidemiológicos. Medicina interna, Lisboa, v.2, n.4, p 259-261. 1995. Disponível em:
http://www.spmi.pt/revista/vol10-n2-brucelose.pdf.
CHAPPEL, R.J. Diagnosis of bovine brucellosis: Principles, practice and problems.
Surveillance, v.16, n.2, p.3-5, 1989.
COELHO, L.M.; MARTINS, L.; EVANGELISTA, F.H. Prevalência da brucelose nos
trabalhadores de matadouro em São Luís, Estado do Maranhão. Rev. Bras. Med. Vet., v.17,
p.85-88, 1995.
CORRÊA, W. M.; C. N. M. Enfermidades infecciosas dos animais domésticos. 2. Ed. São
Paulo: Madsi, p.213-215, 1992.
COSTA, E.A.; SANTANA, F.M.; CARVALHO, C.J.S.; MOUSTACAS,V.S.; SILVA,T.A.;
PAIXÃO, T.A.; SANTOS, R.L.SANTOS. Diagnosis of brucella ovis infection by serology and
PCR in urine samples from naturally infected rams in the State of Piauí. Arquivo Brasileiro
Medicina Veterinária e Zootecnia, v.64, n.3, p.751-754, 2012.
COSTA, I.C.; MESQUITA, A. J.; LINHARES, G. F. C.; FREITAS, M. R. Emprego da reação
em cadeia da polimerase, ELISA, soroaglutinação rápida e cultivo microbiológico na elucidação
da etiologia da bursite cervical. Revista brasileira de Ciência Veterinária, v.8, n. 3, p. 155-159,
2001.
COSTA, M. Brucelose bovina e equina. In: Doenças de ruminantes e equinos. Ed. Varela: São
Paulo, v. 1, p. 187-197, 2001.
DIAS, R.A. Caracterização espacial da brucelose bovina no estado de São Paulo. São Paulo.
Tese de doutorado, USP, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de São Paulo, 2004,
111p.
DOOHO, I.; MARTIN, W.; STRYHN, H. Analysis of survey data, Veterinary Epidemiologic
Research, AVC Inc., Charlottetown, 2003, pp. 35–42.
FILHO, P.M.S.; NASCIMENTO, K.F; FARIA, G.C.; ASSIS, R.A. Comparação entre as provas
de 2-Mercaptoetanol e de fixação de complemento para o diagnóstico sorológico da brucelose
bovina em animais com diferentes históricos vacinais. Veterinaria Not., v.17, n.1, p.26-32,
2011.
FOSGATE, G.T.; ADESIYUN, A.A.; HIRD, D.W.; JOHNSON, W.O.; HIETALA, S.K.;
SCHURIG, G.G.; RYAN, J. Comparison of serologic test for detection of Brucella infections in
cattle and water buffalo (Bubalus bubalis). American Journal of Veterinary Research, v. 63,
n.11, p.1598-1605, 2002.
FREITAS, J.A.; OLIVEIRA, J.P. Pesquisa de infecção brucélica em bovídeos abatidos
portadores de bursite. Arquivo Instituto Biológico, v. 72, n.4, p.427-433, 2005.
33
GARCIA-CARRILLO, C. La Brucelosis de los animales en America y su relacion con la
infeccion humana. Paris: Office International des Epizooties, 1987, p. 43-70.
GORVEL, J.P., MORENO,E. Brucella intracelular life: from invasion to intracellular
replication. Vet. Microbiol. V.90, p.281-297, 2002.
IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística – IBGE. Indicadores IBGE. Estatística da
Produção
Pecuária
–
Outubro
de
2010.
2010.
Disponível
em:
http://www.ibge.gov.br/home/estatística/indicadores/agropecuaria/produção agropecuaria/abateleite-couro-ovos 201002 publ completa.pdf. Acesso em 30 out. 2013.
IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Banco de dados agregados. Efetivo de
rebanhos (cabeças), Unidades da Federação e Município. Setembro de 2013. Disponível em:
http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/tabela/protabl.asp?c=73&z=p&o=25&i=P.
Acesso em: 30 out. de 2013.
ILHAN, Z.; AKSAKAL, A.; EKIN, H.I.; GULHAN.T.; SOLMAZ. H.; ERDENLIG. S.
Comparison of culture and PCR for the detection of Brucella melitensis in blood and lymphoid
tissues of serologically positive and negative slaughtered sheep. Letters in Applied
Microbiology, v.46, p. 301- 306, 2008.
JACOBSON, R.H. Validation of serological assays for diagnosis of infectious diseases. Revive
Scientifique et Techique, International Office of Epizotics, v.17 p. 469-526, 1998.
JÚNIOR, F.F.S. Diagnóstico da brucelose bovina em animais de frigorífico pela sorologia,
bacteriologia e PCR. Tese (Doutorado em Saúde Animal, Saúde Pública, Veterinária e
Segmento Alimentar) – Universidade Estadual de São Paulo, 77p, 2008.
KANUYAA, N.L.; MATIKOA, M.K.; KESSYA, B.M.; MGONGOA, F.O.; ROPSTADB, E.,
REKSENB, O.. A study on reproductive performance and related factors of zebu cows in
pastoral herds in a semi-arid area of Tanzania. Theriogenology, v. 65, n. 9, p. 1859–1874, 2006.
LAGE, A. P.; POESTER, F. P.; PAIXÃO, T.A.; SILVA, T.A.; XAVIER, M.N.; MINHARRO,
S.; MIRANDA, K. L.; ALVES, C. M.; MOL, J. P. S.; SANTOS, R.L. Brucelose bovina: uma
atualização. Revista brasileira de reprodução animal, v. 32, p. 202-212, 2008.
LAGE, A. P.; GONÇALVES, V. S. P.; LOBO, J. R. O programa nacional de controle e
erradicação da brucelose e tuberculose animal. Leite Integral, v. 3, p. 40-46, 2008.
LANDIS,
J.R.;
KOCH,
G.G. The
measurement
for categorical data. Biometrics, v. 33, p. 159-174, 1977.
of
observer
agreement
LANGENEGGER, J.; SECCHIN, H.; BAPTISTA, A. M. Bursites brucélicas na cernelha de
bovinos de abate e cuidados sanitários no matadouro. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.10,
p.45-49, 1975.
LEAL-KLEVEZAS,
D.S.; MARTINEZ-VAZQUEZ,
O.I.; LÓPEZ-MERINO,
A. AND MARTINEZ-SORIANO, J.P. Single-step PCR for detection of Brucella spp. from
blood and milk of infected animals. Journal Clinical Microbiology, v.33, p.3087–3090, 1995.
34
LEARY, O.S.; Brucella abortus by PCR assay in blood, milk and lymph tissue of serologically
positive cows. Research in Veterinary Science, v.81, p.170-176, 2006.
LEYLA,G.; KADRI,G.; UMRAN, O. Comparison of polymerase chain reaction and
bacteriological culture for the diagnosis of sheep brucellosis using aborted fetus samples.
Veterinary Microbiology, v.93, p.53-61. 2003.
LIRA, N. S. C. Lesões anatomopatológicas e detecção da Brucella ovis cepa REO 198 em
ovinos inoculados experimentalmente pelas vias intraprepucial e conjuntival simultaneamente,
2008. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, FMVZ/UNESP – Campus de Botucatu/SP,
Botucatu, São Paulo.
MANTUR, B.G., S.K. AMARNATH AND R.S. SHINDE. Review of clinical and laboratory
features of human brucellosis. Indian Journal of Medical Microbiology, v.25, p.188-202, 2007.
MARTINS, M. V. F. A brucella e os produtos alimentares de origem animal. Veterinária.
Tecnico., v. 2, p. 20-23, 1994.
MATOPE, G.; MUMA, J.B.N.; TOFT, E.; GORI, A.; LUND, K.; NIELSEN, E.; SKJERVE.
Evaluation of sensitivity and specifity of RBT, Celisa and fluoreccence polarisation assay for
diagnosis of brucellosis in cattle using latente class analysis, Veterinary Immunology and
Immunopathology, v.141, p. 58-63, 2011.
MATHIAS, L.A.; MCMILLAN,A.P.; GREISER-WILKE, I.; MOENNING,E.V. Comparação
entre a reação de fixação de complement, teste imunoenzimático indireto e teste
imunoenzimático competitivo no diagnóstico sorológico da brucelose em bovinos procedentes
de rebanhos com histórico da enfermidade. Arquivo. Veterinária, v.11, n.1, p.47-55, 1995.
McKENNA, S.L.B.; DOHOO, I.R. Using and interpreting diagnostic tests. Veterinary Clinics
Food Animal Practice, v. 22, n.1, p. 195-205, 2006.
MEIRELLES-BARTOLLI; L.A.MATHIAS. Estudo comparativo entre os testes adotados pelo
PBCBT para o diagnóstico sorológico da brucelose em bovinos. Arq. Inst. Biol. São Paulo, v.77,
n.1, p.11-17, 2010.
MEGID, J. Avaliação das provas de soroaglutinação rápida, soroaglutinação lenta, antígeno
acidificado e 2-mercaptoetanol no diagnóstico da brucelose bovina. Braz. J. Vet. Res. and Anim.
Sci., v. 37, n.5, 2000.
MINHARRO, S. Isolamento, tipificação e genotipagem de Brucella abortus isolados de bovinos
no Brasil. Tese (Doutorado em Ciência Animal - Medicina Veterinária Preventiva) – Escola de
Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais. 2009, 77p.
MITTAL, K.R.; TIZARD, I.R. Agglutination test and their modifications in the diagnosis of
bovine brucellosis. Compendium of Immunology and Microbiology of Infectious Diseases, v.6,
p.1-8, 1983.
MITKA, S.; ANETAKI, S.C.; SOULIOU, E.; DIZA, E.; KANSOUZIDOU, A. Evaluation of
different PCR assays for the early detection of acute and relapsing human brucellosis in
comparison with conventional methods. Journal Clinical of Microbiology, v. 45, p. 1211-1218,
2007.
35
MOLNÁR, L.; MÓLNAR, E.; LIMA,E.S.C.; DIAS, H.L.T. Avaliação de seis testes sorológicos
no diagnóstico da brucelose bubalina. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.22, n.2, p.41-44, 2002.
MORATA, P.; QUEIPO-ORTUNO, M.I.; REGUERA, J.M.; GARCIA-ORDONEZ, M.A.;
CARDENAS, A.; COLMENERO, J.D. Development and evaluation of a PCR-enzyme-linked
immunosorbent assay for diagnosis of human brucellosis. J. Clin. Microbiol., v. 41, pp. 144–
148, 2003.
MURAKAMI, E.; SARAIVA, A.M. Rastreabilidade da informação nas cadeia produtivas:
padrões de troca de dados. Veterinária. Brasileira. Agro informação., v. 7, p. 58-66, 2005.
NAVARRO, E.; CASAO, M.A.; SOLERA, J. Diagnosis of human brucellosis using PCR.
Expert Review of Molecular Diagnostics, v. 4, n. 1, p.115-123, 2004.
NEGREIROS, R.L.; DIAS, R.A.; FERREIRA, F.; FERREIRA NETO, J.S.; GONÇALVES,
V.S.P.; SILVA, M.C.P.; FIGUEIREDO, V.C.F.; LOBO, J.R.; FREITAS,J.; AMAKU, M.
Situação epidemiológica da brucelose bovina no Estado de Mato Grosso. Arq. Bras. Med. Vet.
Zootec. v.61, supl.1, p.56-65, 2009.
NIELSEN, K. Diagnosis of brucellosis by serology. Veterinary Microbiology, v.90, p.447-59,
2002.
NIELSEN, k.; DUNCAN, J.R.; STEMSHORN,B. et al. Relationship of humoral factors
(antibody and complement) to immune responsiveness, resistance and diagnostic serology.
Advances in Experimental Medical Biology, v.137, n.1, 2004.
NOZAKI, C.N. Aspectos epidemiológicos, clínicos e avaliação de métodos diagnósticos nas
fases de evolução da brucelose em ovinos inoculados experimentalmente com Brucella ovis.
Tese de doutorado em Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Júlio
Mesquita Filho”, Botucatu, 209f, 2008.
OLIVEIRA, J. P. Estudo de lesões sugestivas de brucelose em bovinos e bubalinos abatidos
para consumo. Dissertação de Mestrado em Ciência Animal - Universidade Federal do Pará,
2003.
OIE. Código sanitário para lós animais terrestres. 17ª ed. v.1, 2010. 343 P. Paris, OIE.
OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Disponível em:
<http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/2008/pdf/2.04.03_BOVINE_BRUCELL.pdf>.
Acesso em: 20 nov. 2013.
OIE. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE ANIMAL. Bovine brucellosis. Terrestrial
Animal
Health
Code
Chapter
11.3.,
1987.
Disponível
em:
http://www.oie.int/fileadmint/Home/eng/Health standards/tahc/2009/en chapitre 1. 11.3 htm,
2013. Acesso em: 20 nov. 2013.
PAPPAS, G., P. PAPADIMITRIOU AND N. AKRITIDIS. The new global map of human
brucellosis. Infect. Dis., v. 6, p. 91-99, 2006.
PARDI, M.C.; ROCHA, U.F.; SALIBRA, A. Brucella abortus (Bang) como causa de bursite
cervical em bovinos. Boletim da Sociedade Brasileira de Medicina Veterinária, Rio de Janeiro,
v.24, p.25-34, 1956.
36
PARDI, M.C.; SANTOS, I.F.; SOUZA, E.R.; PARDI, H.S. Aspectos higiênicos sanitários da
carne. Zoonoses mais comuns adquiridas profissionalmente por manipuladores de carne. In:
Ciência, higiene e tecnologia da carne, 2ed., Goiânia: CEGRAF-UFG/Niterói: EDUFF, 2006,
p. 358-359.
PAULIN, L.M.; FERREIRA NETO, J.S. A experiência brasileira no combate à brucelose
bovina. Arquivo do Instituto Biológico São Paulo, v.69, p 105-112, 2002.
PAULIN, L.M.; FERREIRA NETO J.S. O Combate à brucelose Bovina: situação brasileira.
Jaboticabal: Funep, 154p, 2003.
PAULIN, L.M.S.; SAMARTINO, L.E.; CONDE, S.B.; TURILLI, C.; FERREIRA, F.;
AMAKU, M.; DIAS, R.A.; FERREIRA, J.S. Avaliação de testes sorológicos de triagem para
diagnóstico da brucelose bubalina. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.62, n.4, p.989-992, 2010.
POESTER, F. P. Vacinas contra brucelose: Passado, presente e futuro. In: 50th Anniversari,
Meting Of Brucellosis Reseach Conference, p.8- 9, 1997.
POESTER, F.P; GONÇALVES, V.S.P.; LAGE, A.P. Brucellosis in Brazil. Veterinary
Microbiology, v.90, p.55-62, 2002.
POESTER, F.P., SAMARTINO, L.E.; LAGE, A.P. Diagnóstico da Brucelose Bovina. Cadernos
Técnicos de Veterinária e Zootecnia, BH, MG: FEP/MVZ, n47, p13-29, 2005.
POSTER, F.; FIGUEIREDO, V.C.F.; LOBO, J.R.; GONÇALVES, V.S.P.; LAGE, A.P.;
ROXO, E.; MOTA, P.M.P.C.; MULLER, E.E.; FEREIRA NETO, J.S. Estudos de prevalência
da brucelose bovina no âmbito do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose
Bovina. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.61, p.1-5, 2009.
RIBEIRO, D.C. Comparação de protocolos de extração de DNA para detecção de
Mycobacterium bovis através da PCR em homogeneizado de órgãos (dissertação de mestrado
em Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses FMVZ-USP). São Paulo, 2008.
ROMERO,C.; GAMAZO,C.; PARDO,M.; LÓPEZ-GONI. I. Specific detection of Brucella
DNA by PCR. Journal clinical microbiology, p. 615-617, 1995.
ROOP, R. M. et al. Survival of the fittest: how Brucella strains adapt to their intracellular niche
in the host. Medical Microbiology and Immunology, v.198, p.221-238, 2009.
RUSSEL, A. D.; YARNICH, V. S.; KOULIKOVSKII, A. V. Guidelines on disinfection in
animal husbandry for prevention and control of zoonotic diseases. Genève: WHO, p.61, 1984.
SAMARTINO, L.; GREGORET, R.; GALL, D.; NIELSEN, K. Fluorescence polarization
assay: application to the diagnosis of bovine brucellosis in Argentina. J. Immunoassay, v. 20, p.
115–120, 1999.
SANTOS, R.L.; MARTINS, M.T.; BORGES, A.M.; PAIXÃO, T.A. Economic losses due to
bovine brucellosis in Brazil. Pesq. Vet. Bras., v. 33, p. 759-764, 2013.
SELEEM, M. N.; BOYLE, S. M.; SRIRANGANATHAN, N. Brucellosis: A re-emerging
zoonosis. Veterinary Microbiology, v.140, p.392–398, 2010.
37
SILVA, B.C.; BRANDÃO, R.R.G.; SANTOS, M.T.J.; JUNIOR, F.F.S.; Soroprevalência da
brucelose em bovinos abatidos no município de Maceió, estado de Alagoas. Revista semente, p.
110-116, 2011.
SILVA JUNIOR, F.F. Diagnóstico da brucelose bovina em animais de frigoríficos pela
sorologia, bacteriologia e PCR. Tese. (Doutorado em Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária
e Segurança Alimentar) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Campus Botucatu,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu. 64f, 2008.
SOLA, M.C. Emprego da técnica de PCR em tempo real na detecção de DNA de Brucella spp
em lesões de carcaças e vísceras provenientes de matadouros frigoríficos sob Inspeção Federal,
2011.76f. (Dissertação de mestrado em Ciência animal aplicado a ciência, sanidade, higiene e
tecnologia e inspeção de alimentos Goiânia)- Escola de Veterinária e Zootecnia, Universidade
Federal de Goiás, Goiás. 76f, 2011.
SOUZA, A.P.; MOREIRA FILHO, D.C.; FÁVERO, M. Investigação da brucelose em bovinos
e em consumidores humanos de leite. Rev. Saúde Publica, v.11, p.238-247, 1977.
SUTHERLAND, S.S.; SEARSON, J. The immune response to Brucella abortus: The humoral
response. In: NIELSEN, K; DUNCAN, J,R. Animal brucellosis. Boca Raton: CRC Press, Cap.
3, p. 65-83, 1990.
TRUSFIELD, M. Veterinary epidemiology. London: Butterworth, 1986, 273p.
VAN AERT, A.; BRIOEN, P.; DEKEYSER, P.; UYTTERHAEGEN, L.; SIJENS, R.; BOEYE,
V. A comparative study of ELISA and other methods for detection of Brucella antibodies in
bovine sera. Vet. Microbiol., v.10, p. 13–21, 1984.
VEJARANO, M.P.; MATRONE, M.; KEID, L.B.; ROCHA, V.C.M.; IKUTA, C.Y.;
RODRIGUEZ, C.A.R.; SALGADO, V.R.; FERREIRA, F.; DIAS, R.A.; TELLES, E.O.;
FERREIRA NETO, J.S. Evaluation of four DNA extraction protocols for Brucella abortus
detection by PCR in tissues from experimentally infected cows with the 2308 strain. Vector
Borne and Zoonotic diseases. v.13, n.4, 2013.
VIANA, L.; BAPTISTA, F.; TELES. J. RIBEIRO, A.P.C.; PIGATTO, C. P. Soropositividade e
lesões sugestivas de brucelose em bovinos abatidos no estado de Tocantins, Brasil. Arquivos do
Instituto Biológico São Paulo, v.77, n.3, p. 517-520, 2010.
VIEIRA, N. R. Desenvolvimento de uma reação em cadeia pela polimerase (PCR) para
detecção de Brucella spp. em amostras de sangue de cães naturalmente infectados. (Dissertação
de mestrado em Epidemiologia Experimental e Aplicada as Zoonoses)- Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo. 92f, 2004.
XAVIER, M.N. Desenvolvimento de PCR espécie-específico para o diagnóstico da infecção por
Brucella ovis e avaliação comparativa de métodos sorológicos, Dissertação de mestrado em
Ciência Animal - Escola de Veterinária, UFMG, BH. 68f, 2009.
38
FIGURAS
Figura 1. Municípios de MT incluídos no estudo.
Figura 2. Município do PA incluído no estudo.
Figura 02- Município do Pará incluído no estudo para a avaliação pelo teste de Kappa.
39
Figura 3. Reações do teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT).
Figura 04. Bovino com lesão extensa de bursite cervical.
40
Figura 05. Coleta de linfonodos pelo SIF na linha de abate.
Figura 06. Identificação das amostras de linfonodos das linhas D, H e I.
41
Figura 7. Reações positivas e negativas para Brucella abortus pela técnica de PCR.
42
Figura 8. Mapa com a identificação de propriedades consideradas foco e livres da brucelose
pelo INDEA com base nas GTA´s.
Figura 9. Mapa com a identificação de propriedades consideradas foco e livres da brucelose de
acordo com os resultados do teste do AAT.
43
Figura 10. Mapa representando a dispersão dos casos de brucelose com base no teste do AAT
entre os municípios avaliados.
Figura 11. Mapa representando a dispersão dos casos de brucelose com base no teste do PCR
entre os municípios avaliados.
44