Pró-Reitoria de Graduação
Curso de Biomedicina
Trabalho de Conclusão de Curso
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE
PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS DE Punica granatum L.
Autora: Maria Eugênia Zaban Silva
Orientador: Dr. Octavio Luiz Franco
Brasília - DF
2012
MARIA EUGÊNIA ZABAN SILVA
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE PEPTÍDEOS
ANTIMICROBIANOS DE Punica granatum L.
Monografia apresentada ao curso de
graduação
em
Biomedicina
da
Universidade Católica de Brasília, como
requisito parcial para obtenção do Título
de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Octávio Luiz
Franco
Co-orientador: Msc. Daniel Amaro
Sousa
Brasília
2012
Monografia de autoria de Maria Eugênia Zaban Silva, intitulada “Isolamento e
Caracterização Molecular de Peptídeos Antimicrobianos de Punica granatum L.”
apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de bacharel em Biomedicina
da Universidade Católica de Brasília, em 12/11/2012, defendida e aprovada pela banca
examinadora abaixo assinada:
___________________________________________
Prof. Dr. Octávio Luiz Franco
Orientador
Curso de Biologia – UCB
___________________________________________
Profª. Drª. Simoni Campos Dias
Examinador
Curso de Biologia - UCB
___________________________________________
Profª. Msc. Janaína de Souza Duarte
Examinador
Curso de Biomedicina – UCB
Brasília
2012
Dedico este trabalho aos meus pais, pelo
amor, êxito em minha educação, exemplos
de vida, conselhos e construção dos meus
valores morais e éticos.
AGRADECIMENTO
Agradeço a Deus, por me guiar em todos os caminhos e me capacitar a realizar
este trabalho;
Aos meus pais, Maria Luiza Zaban Silva e Silas Cardoso Silva, por terem
muitas vezes deixado de lado seus sonhos para viver os meus;
Ao meu irmão, Bruno Zaban Silva, por ser um grande amigo de todas as horas,
pelos conselhos e incentivos;
Ao meu namorado, Diogo Luiz Alves de Araújo, por todo o apoio, amor, carinho
e paciência dedicados a mim;
Ao Dr. Octávio Luiz Franco, pela orientação, confiança e dedicação nesses
anos de iniciação científica;
Ao Msc. Daniel Amaro, por ter me co-orientado durante a iniciação científica e
ter me ensinado a trabalhar em laboratório.
“A genialidade é 1% inspiração e 99% transpiração.”
Thomas Edison
RESUMO
Referência: ZABAN, Maria Eugênia. Isolamento e caracterização
molecular de peptídeos antimicrobianos de Punica granatum L. 2012. 53 pg.
Trabalho de conclusão de curso (Biomedicina). Universidade Católica de
Brasília, Brasília, 2012.
A bactéria Staphylococcus aureus consiste em um patógeno que causa
diversas doenças, como síndrome do choque tóxico, pneumonia necrosante,
endocardite e osteomielites. O uso indiscriminado de antibióticos tem
contribuído para seleção de microrganismos resistentes, dentre os quais várias
linhagens de S. aureus já foram reportadas, assim como algumas espécies de
fungos. Em resposta a isso, inúmeras pesquisas relacionadas a antibióticos
têm sido realizadas, dentre as quais algumas possuem foco na descoberta de
peptídeos antimicrobianos (PAMs). As sementes de romã (Punica granatum L.)
possuem um rico conteúdo proteico e propriedades fitoterápicas conhecidas,
inclusive de atividade efetiva contra patógenos microbianos. Porém não
existem relatos científicos destas propriedades relacionados a compostos
protéicos. Desta forma, este trabalho objetiva o isolamento de peptídeos a
partir de sementes de romã com atividade antimicrobiana, por meio de
purificação através de técnicas cromatográficas de fase reversa em coluna
analítica de HPLC e testes antimicrobianos contra cepas Escherichia coli ATCC
8739 e Staphylococcus aureus ATCC 25923. O presente trabalho relata um
novo peptídeo antimicrobiano, denominado granatidina. Este peptídeo
apresentou inibição de aproximadamente 30 % do crescimento de S. aureus
em uma concentração de 40 g.mL-1 , não apresentando, entretanto, atividade
deletéria contra E. coli e A. fumigatus nas concentrações testadas. A
determinação e análise de sua sequência N-terminal foram realizadas através
de um sequenciador automático, onde sua porção N-terminal apresentou 26
resíduos
determinados
por
sequenciamento
de
Edman
como
YTVPNAELNPLANQTEHQNFGNVPRE. A massa molecular de granatidina foi
analisada em MALDI-TOF, apresentou um íon majoritário de 4785,11 Da e dois
contaminantes de 5055,20 Da e 5305,82 Da. Em suma, identificou-se um novo
peptídeo antimicrobiano. Entretanto, existe ainda a necessidade de estudos
aprofundados a cerca do potencial terapêutico desta molécula, para que seu
uso como composto biotecnólogico no combate a infecções seja efetivo.
Palavras-chave: Punica granatum, romã, peptídeos antimicrobianos.
ABSTRACT
Reference: ZABAN, Maria Eugênia. Isolation and molecular
characterization of antimicrobial peptides from Punica granatum L. 2012. 53 pg.
Trabalho de conclusão de curso (Biomedicina). Universidade Católica de
Brasília, Brasília, 2012.
Staphylococcus aureus is a pathogen that causes several diseases such
as toxic shock syndrome, necrotizing pneumonia, endocarditis and
osteomyelitis. The indiscriminate use of antibiotics has contributed to selection
of resistant microorganisms, among which several strains of S. aureus have
been reported, as well as some species of fungi. In response to this problem,
many studies related to antibiotics have been conducted, among which some
have focused on the discovery of antimicrobial peptides (AMPs). The seeds of
pomegranate (Punica granatum L) have rich protein content and known
phytotherapic properties, including activity effective against microbial
pathogens. This work aims to isolate peptides from pomegranate seeds with
antimicrobial activities, once there are no scientific reports of these properties
related to proteinaceous compounds, through purification by chromatographic
techniques associated to antimicrobial evaluations against Escherichia coli
ATCC 8739 and Staphylococcus aureus ATCC 25923 strains. This study
reports a novel antimicrobial peptide named granatidin. This peptide was able to
inhibit 30 % S. aureus growth at a concentration of 40 g.mL-1, did not showing,
however, any fungicidal activity against E. coli and A. fumigatus in tested
concentrations. The determination and analysis of its N-terminal sequence was
carried through an automated sequencer, where 26 residues of N-terminus
portion
were
determined
by
Edman
sequencing
as
YTVPNAELNPLANQTEHQNFGNVPRE. The molecular mass of granatidin was
analyzed in MALDI-TOF, showing a majority ion of 4785,11 Da two
contaminants of 5055,20 Da e 5305,82 Da. In summary a novel antimicrobial
peptide was here displayed. Nevertheless the need for deep studies about the
therapeutic potential of this molecule seems to be essential for its use as a
biotechnological compound on an effective infection control.
Keywords: Punica granatum, pomegranate, antimicrobial peptides.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ................................................................................................. 10
1. REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................... 12
1.1 A RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS CONVENCIONAIS E A
PROBLEMÁTICA DAS INFECÇÕES HOSPITALARES. .............................. 12
1.2 PATÓGENOS ASSOCIADOS ÀS INFECÇÕES ..................................... 17
1.2.1 BACTÉRIAS ..................................................................................... 17
1.2.2 FUNGOS .......................................................................................... 19
1.3 PEPTÍDEOS COMO PROMISSORES COMPOSTOS
ANTIMICROBIANOS .................................................................................... 21
1.4 A SEMENTE DE Punica granatum L. ..................................................... 28
2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 30
2.1 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS DE
SEMENTES DE ROMÃ .................................................................................... 30
2.2 QUANTIFICAÇÃO PROTEICA ...................................................................31
2.3 BIOENSAIOS CONTRA BACTÉRIAS ........................................................ 31
2.4 ANÁLISE DE MASSA MOLECULAR ......................................................... 32
2.5 DETERMINAÇÃO E ANÁLISE DA SEQUÊNCIA N-TERMINAL................ 32
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 34
4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS.............................................................43
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 44
10
INTRODUÇÃO
O crescente número de microrganismos que se tornaram resistentes aos
medicamentos disponíveis tem deixado os serviços de saúde e profissionais
em alerta. Aliada a esta questão, encontra-se o fato de que indústrias
farmacêuticas reduziram o interesse na fabricação de antibióticos, dando
preferência a medicamentos para o tratamento de doenças crônicas que
atingem uma grande parte da população, como a diabetes, a hipertensão e as
cardiopatias. Essas doenças, por acompanharem o indivíduo por toda vida,
conferem muito mais lucro às indústrias, enquanto que o uso de antibióticos em
tratamentos tende a ser relativamente curto. Enquanto os investimentos
privados diminuíram, o problema da resistência bacteriana aumentou
significativamente (NORRBYA et al., 2005).
As infecções hospitalares (por definição, aquelas contraídas após a
admissão do indivíduo em ambiente hospitalar, seja ela manifesta durante sua
internação ou após a alta) constituem um problema grave aos cofres públicos e
à vida dos pacientes que são acometidos, demonstrando a necessidade de um
esforço por parte de todos os de profissionais de saúde que estejam
envolvidos, no sentido de detectar casos, treinar profissionais, fornecer material
informativo a pacientes e acompanhantes, controlar prescrição de antibióticos e
padronizar metodologias que previnam estas infecções (Portaria MS n° 2616
de 12/05/1998; Who et al. (2011).
Um dos principais microrganismos associado aos quadros de infecções
hospitalares
consiste
na
bactéria
Staphylococcus
aureus,
da
família
Staphylococcaceae. Esta bactéria parece ser a mais virulenta do seu gênero,
podendo ser capaz de produzir toxinas deletérias a células humanas
(TORTORA, 2005). As bactérias Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae
também são responsáveis por quadros graves. Além destas, existem ainda
organismos provenientes do reino Fungi que possuem potencial para infectar
humanos, principalmente pacientes imunocomprometidos. Dentre estes fungos,
Aspergillus spp aparece como representante (ANVISA, 2004a).
11
Uma alternativa ao problema da resistência bacteriana são os peptídeos
antimicrobianos (PAMs). Eles são partes integrantes da imunidade inata de
diversos organismos, de bactérias a plantas, de protozoários a insetos e
mamíferos. Eles se fixaram nas mais diferentes linhagens de organismos por
conferir vantagem de sobrevivência a seus possuidores desde o início da vida
na Terra. Já foram reportados PAMs com as mais diversas ações, entre elas
contra bactérias e fungos. Já foram reportados PAMs que neutralizam
lipopolissacarídeos tóxicos de bactérias Gram-negativas e modulam a resposta
imune inata e adaptativa em humanos. Em plantas, as proteínas microbicidas
podem ser classificadas em diversos grupos de acordo com sua massa
molecular, atividade, carga e estrutura dimensional. Entre eles, encontramos as
defensinas, tioninas, as α-glucanases, proteínas transferidoras de lipídeos e
proteínas killer (NIZET, 2001; BENKO-ISEPPON et al., 2010).
Uma vez que os PAMs têm sido encontrados nas plantas, as sementes
de romã aparecem como uma alternativa, pois apresentam alto conteúdo
protéico. Sendo assim, torna-se concreta a iniciativa e a perspectiva de
pesquisar e identificar proteínas de defesa nesta espécie. O presente estudo foi
focado
fundamentalmente
na
busca
de
peptídeos
com
atividade
antimicrobiana, com efeito contra patógenos humanos, e com potencial para
serem utilizados no desenvolvimento de produtos biotecnológicos.
12
1. REVISÃO DA LITERATURA
1.1 A RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS CONVENCIONAIS E A
PROBLEMÁTICA DAS INFECÇÕES HOSPITALARES.
O aumento de microrganismos resistentes aliado ao uso indiscriminado
de medicamentos tornou-se um desafio de grandes proporções, saindo do
âmbito anteriormente exclusivo de hospitais para se tornar um problema de
ordem pública. Juntamente com esta problemática alia-se o fato da indústria
farmacêutica priorizar a produção de medicamentos destinados a patologias
crônicas, devido ao grande número de pessoas que os usam e, muitas vezes,
por toda a vida (NORRBYA et al., 2005). Com isso decresce o investimento a
drogas antibióticas, onde estes são mais propensos à competição e a um curto
tempo de administração de seus usuários.
No Brasil, data-se na década de 50 os primeiros dados de infecção
hospitalar, com a utilização do termo “contaminação hospitalar”. Somente no
ano de 1968 começaram a surgir às primeiras Comissões de Controle de
Infecção Hospitalar (CCIH), sendo estas, entretanto, determinadas pelo
governo como de grande importância para os hospitais da previdência somente
em 1976. Em 1985, a grande repercussão da morte do recém-eleito Presidente
da República Tancredo Neves, por conta de uma infecção hospitalar, fez com
que o Ministério da Saúde elaborasse medidas que modificassem esse quadro
iminente no país, sendo que nos anos 90 foi publicada a Portaria MS nº
930/1992, sobre o Programa de Controle de Infecção Hospitalar Brasileiro.
Porém, ao descaso e não cumprimento desta Portaria por grande parte dos
hospitais brasileiros, o Ministério da Saúde emitiu a Lei Federal nº 9.431/1997,
que determinou a obrigatoriedade da manutenção de Programas de Controle
de Infecção Hospitalar (PCIH) em todos os hospitais do país, tendo como
objetivo a redução máxima possível da incidência e gravidade das infecções
nosocomiais (ANVISA, 2004a).
No ano seguinte, em 1998, o Ministério da Saúde emitiu a Portaria nº
2.616, a qual se mantém em vigor até hoje, que prossegue com a
13
obrigatoriedade de um programa de controle de infecção hospitalar em todos
os hospitais do território nacional, além de determinar a organização e
competências das CCIHs, critérios e conceitos acerca dos diagnósticos das
infecções hospitalares, orientações sobre a vigilância epidemiológica e
cuidados ao lavar as mãos, uso de germicidas, entre outros (PEREIRA, 2005).
Com o surgimento da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) em
1999, a qual, entre muitas outras atribuições, tornou-se responsável pelo
controle de infecção hospitalar em todo o território nacional, as secretarias
estaduais passaram a ter apoio técnico, com a expedição de normas e
legislações por esta agência de vigilância, permitindo a consolidação de
documentos e promovendo a socialização de informações. Portanto, para um
monitoramento mais efetivo no controle de infecções hospitalares, a ANVISA
elaborou a RDC nº 48/2000, que aponta a sistemática para inspeção/avaliação
dos PCIHs.
Recentemente, em 2010, a ANVISA lançou o manual de Indicadores
Nacionais de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde, que determinou a
notificação obrigatória em âmbito nacional (em Unidades de Terapia Intensiva)
dos indicadores de infecção de corrente sanguínea (IPCS) em pacientes com
uso de cateter venoso central (CVC), um dos principais dispositivos
hospitalares associados a infecções.
Através das informações acima, chegou-se a conclusão de que o
principal papel da Vigilância Sanitária, na temática de infecções hospitalares,
seja, de fato, a monitorização e controle de produtos, serviços e ambientes que
fazem parte do sistema de saúde, sendo estas ações respaldadas pelas
legislações e normas acima citadas. Um dos principais fatores analisados pode
ser relacionado à higiene do local, pois quando há uma efetividade neste
quesito básico há uma influência extremamente positiva em todos os outros
processos referentes a este estabelecimento. Apesar, entretanto, de ser uma
atividade básica e que deveria ser intrínseca, constitui, ainda atualmente, um
importante
foco
de
propagação
de
microrganismos,
acontecimento destas infecções (PEREIRA, 2005).
favorecendo
o
14
Uma das principais medidas para o controle das infecções hospitalares
consiste na assepsia correta das mãos e aplicação de álcool em seguida. Outra
medida que deveria ser implantada obrigatoriamente diz respeito ao isolamento
de pacientes já diagnosticados com infecção; logo, faz-se necessário uma
conscientização máxima por parte dos funcionários que tenham acesso a estes
pacientes, para que não ocorra transmissão de um leito para o outro. A correta
esterilização de materiais e o uso de equipamentos de proteção individual
(EPIs) que se descartem em local adequado logo após o contato com estes
pacientes faz-se necessário (MERMEL, 2010).
Um fato muito comum e que impressiona por sua ocorrência com
frequência consiste na ineficiência ou até mesmo a inatividade da CCIH em
alguns hospitais, acarretando em problemas tanto pela falta de capacitação dos
profissionais em relação a esta problemática, quanto ao gestor que não possui
conhecimento dos problemas que ocorrem em seu estabelecimento, muitas
vezes de ordem grave e que geram altos índices de mortalidade. Ocorre de
maneira muito comum, mesmo que haja uma CCIH, a ausência de um PCIH,
onde esta trabalha com ações sem um direcionamento efetivo (PEREIRA,
2005). Um estudo feito pela International Nosocomial Infection Control
Consortium (INICC), em 2010, demonstrou a gravidade do problema em UTIs,
no período de janeiro de 2003 a dezembro de 2008. Participaram deste estudo
173 UTIs de 25 países, dos continentes europeu, asiático, africano e
americano, onde, deste montante, 19 eram brasileiras. Estes dados reforçam
ainda mais a necessidade de uma CCIH eficiente, principalmente no que se
refere à questão de países com recursos limitados, pois, em alguns destes
territórios, ainda não há regras juridicamente vinculativas ou regulamentos
obrigatórios; nos poucos casos em que há um quadro efetivo, a adesão ainda
assim permanece irregular. O Brasil se encaixa nesta realidade, visto que,
como dito anteriormente, existem ainda hospitais que não realizam o controle
de infecções. Através destes dados evidencia-se a importância de uma efetiva
CCIH dentro destes estabelecimentos bem como a sua integração com os
outros setores do hospital, já que todos os profissionais, independente do cargo
ou se estão envolvidos ou não diretamente com os pacientes estão
15
relacionados tanto no acontecimento deste problema, como no controle do
mesmo.
As infecções hospitalares (aquelas contraídas após a admissão do
indivíduo em um ambiente hospitalar, que pode se manifestar durante a
internação ou após a alta) alia-se ao uso indiscriminado de medicamentos,
havendo uma concomitância da resistência microbiana com o fato do paciente
já estar com a saúde comprometida, agravando mais o quadro principalmente
em Unidades de Terapia Intensiva (Portaria MS n° 2616 de 12/05/1998).
Indivíduos que se encontram nestas condições, além de serem mais
susceptíveis, contam com a má conduta de trabalho de alguns profissionais de
saúde, como a má assepsia das mãos ou mesmo péssimas condições de
higiene do local de trabalho, assim como o fato do ambiente hospitalar ser
inevitavelmente uma fonte de patógenos virulentos e oportunistas, sendo
transmitidos tanto por vias endógenas (aquelas pertencentes ao próprio
paciente podendo, também, serem transmitidos por fatores inerentes ao
mesmo como quadros de imunossupressão, por exemplo) quanto exógenas, ou
seja, vias externas ao paciente, como o contato por mãos não higienizadas dos
profissionais de saúde ou seus acompanhantes (ANVISA, 2006).
Além deste fato, as complicações resultantes deste quadro são as
principais causadoras de morbimortalidade hospitalar, o que, além de elevar o
tempo que os pacientes permanecem internados, diminui a rotatividade dos
leitos e aumenta os custos dos hospitais como demonstrado no estudo
realizado por Oliveira et al., em 2009: dos 118 pacientes estudados em uma
UTI, aqueles que adquiriram infecção hospitalar tiveram o tempo de internação
aumentado em 15 dias, com o tempo de aparecimento da infecção, em relação
ao tempo de internação, nos 8 primeiros dias. Segundo Who et al. (2011), nos
Estados Unidos o aumento de 5.7 a 6.8 bilhões de dólares nos custos dos
hospitais se deve justamente a esta elevação do tempo de internação dos
pacientes.
Outro dado relevante abordado neste estudo diz respeito à distribuição
destas infecções por local de infecção, onde os quatro sítios primários
16
principais foram, em ordem crescente: trato urinário (80 % associada ao uso de
cateter uretral de permanência), trato respiratório (pacientes submetidos à
ventilação mecânica correm o risco de adquirirem pneumonia), corrente
sanguínea (pelo uso de cateteres) e sítio cirúrgico (relacionados ou a pacientes
submetidos a procedimentos de urgência, ou que apresentaram complicações
no pós-operatório), demonstrados pela Tabela 1.
Tabela 1: Principais procedimentos médicos associados com infecções hospitalares, doença
de base e seus respectivos patógenos.
PROCEDIMENTOS
DOENÇAS
PATÓGENOS
Bacilos Gram-negativos,
Cateterização urinária
Cistite
Enterococcus spp.
Staphylococcus spp.
Cirurgia
Feridas, septicemia
Bacilos Gram-negativos
Staphylococcus spp.
Terapia intravenosa
Infecção no local, septicemia
Enterobactérias,
Candida spp.
Pseudomonas spp.
Intubação respiratória
Pneumonia
Klebsiella spp,
Serratia spp.
Vírus Hepatite B,
Diálise renal
Sepse, reação pirogênica
Staphylococcus aureus,
Pseudomonas spp.
(ANVISA, 2004b, com adaptações).
Infere-se, portanto, que as infecções hospitalares não somente são
complicações que surgem em hospitais, mas constitui também como um dos
melhores indicadores de qualidade do serviço prestado ao paciente, que
engloba desde pequenos procedimentos essenciais por parte dos profissionais,
17
até condições organizacionais e relacionadas à estrutura oferecida pela
instituição que oferece o serviço de saúde.
Estima-se que acontecem em UTIs 10 a 25 % das infecções hospitalares
de um hospital sendo que, nos Estados Unidos, um estudo demonstrou que de
5 até 35 % dos pacientes que são admitidos neste local, podem ser acometidos
(MERIC et al., 2005). Um estudo realizado por Oliveira (2009) comprova, em
números, um dado alarmante: em UTIs brasileiras que relataram a ocorrência
de infecções hospitalares, a taxa destas foi de 9%, onde 14% deste montante
foi a óbito. Estes valores podem apresentar alterações pela falta de um método
de vigilância único para todas as unidades de saúde, porém são dados
importantes e que merecem uma maior atenção.
Portanto, faz-se necessário que haja um esforço maior por parte dos
profissionais de saúde (sejam eles enfermeiros, médicos, microbiologistas,
farmacêuticos) no sentido de detectar casos de infecção, padronizar
procedimentos, treinar os profissionais e fornecer material informativo aos
pacientes e acompanhantes, controlar a prescrição de antibióticos, recomendar
e respeitar as precauções e medidas de isolamento e padronizar a aquisição
de equipamentos e materiais (PUCCINI, 2009).
1.2 PATÓGENOS ASSOCIADOS ÀS INFECÇÕES
1.2.1 BACTÉRIAS
Dentre os principais microrganismos responsáveis pelos quadros de
infecções hospitalares encontram-se as bactérias, sendo que algumas são
encontradas na flora normal do indivíduo sem causar quadros patológicos.
Porém, em um estado de imunocomprometimento esta harmonia pode ser
desequilibrada ou pelo fato de se apresentarem em outros tecidos que não
colonizam naturalmente, causando patologias associadas (ANVISA, 2004a).
Sobre os principais patógenos associados a infecções encontramos os
componentes da família das Staphylococcaceae, compreendendo bactérias
18
Gram-positivas, dentre elas principalmente os S. aureus (Figura 1A), sendo a
bactéria mais virulenta de seu gênero (TORTORA, 2005). Estão associadas
principalmente a infecções em sítios como o pulmão, endocárdio, ossos e
faringe (BUNCE et al., 1992; ANVISA, 2004b). Além de possuir estruturas em
sua cápsula que dificultam a fagocitose pelas células de defesa do sistema
imunológico do hospedeiro, a bactéria S. aureus produz toxinas e as secreta
em sua superfície causando toxicidade às células humanas. Estão entre elas:
toxina alfa – responsável por formação de poros na membrana celular de
humanos; esfingomielase C – degrada lipídeos, constituinte principal da
membrana celular humana; toxina da síndrome do choque tóxico – ativa de
forma não específica os linfócitos, ocasionando reações do sistema imune
descontroladas acarretando, muitas vezes, em letalidade ao indivíduo
(TRABULSI, 2004).
Ainda sobre patógenos associados, dentre as maiores causadoras de
infecções
do
grupo
de
bactérias
Gram-negativas
encontram-se
as
Enterobactérias, representando mais de 80 % dos microrganismos isolados em
rotinas microbiológicas e estão relacionadas a 70 % das infecções do trato
urinário e 50 % de septicemias. Podem ser encontradas de maneira natural no
trato intestinal de humanos e animais, bem como no solo, plantas e água
(ANVISA, 2004b). São seus maiores representantes a E. coli, Klebsiella sp. e
Proteus sp., tanto em infecções do âmbito hospitalar, quanto em infecções na
própria comunidade (ANVISA, 2004b). As enterobactérias possuem algumas
características cruciais na aderência às superfícies ou membranas mucosas
como as fímbrias, que aumentam seu poder de virulência (TORTORA, 2005).
As Escherichia spp. são consideradas membros praticamente universais do
trato intestinal de humanos e outros animais, onde desempenham importantes
funções nos hospedeiros (síntese de vitamina K, por exemplo), não sendo
normalmente patogênicas. Porém, algumas linhagens são patogênicas, como
E. coli (Figura 1B), podendo causar diarreia, meningite, septicemia ou
infecções urinárias, devido à produção de enterotoxinas, sendo que as
linhagens de E. coli, uma bactéria bacilar que causa diarreia, podem ser
separadas em três grupos: Enteropatogênicas (EPEC - causando diarreia
19
aquosa, característica em crianças), Enterotoxigênicas (ETEC - causando
diarreia aquosa do tipo cólera) e Enteroinvasoras (EIEC – causando diarreia
que evolui apresentando muco e sangue). Algumas linhagens de EPEC podem
causar, com maior frequência, infecções do tipo disentéricas e febres
generalizadas (TORTORA, 2005).
Figura 1: Micrografia de eletrônica de S. aureus (A) e E. coli (B), causadoras de infecção
hospitalar.
Fonte:
Dennis
Kunkel
Microscopy,
Inc.
Disponíveis
em:
http://www.denniskunkel.com.
1.2.2 FUNGOS
O reino Fungi também possui representantes associados a infecções
hospitalares, representando um problema crescente de saúde pública. BeckSagué et al. em 2003 demonstraram que, nos Estados Unidos, a prevalência
de infecções fúngicas subiu de 6% para 10,4% em um período de dez anos. A
espécie Aspergillus spp. está entre as principais espécies fúngicas causadoras
de infecções (atrás somente da espécie Candida spp.), abrigando cerca de 200
espécies. Poucas destas, entretanto, são patogênicas ao homem, que
normalmente por meio da respiração aspiram seus esporos sem manifestação
de patologias (ALMEIDA, 2000). Por serem fungos oportunistas, a principal
taxa de mortalidade por estes se dá em pacientes imunocomprometidos, seja
pela Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), por quadros de câncer,
como a leucemia ou por uso de medicamentos imunossupressores e
corticóides.
20
O principal sítio de infecção por esta espécie compreende o trato
respiratório através da invasão de hifas e destruição do parênquima pulmonar,
sendo causada por diversas espécies do gênero, como o Aspergillus flavus
(Figura 2A), Aspergillus niger (figura 2B) e Aspergillus fumigatus (figura 2C),
sendo que 95 % dos casos de aspergiloses pulmonares são causadas pelo A.
fumigatus; a infecção por estes tem sido denominada aspergilose, levando a
uma complicação não somente nas cavidades que alojam os pulmões, mas
também aos seios paranasais, pele ou até mesmo locais que abrigam cateteres
intravenosos (PIANETTI, 2005).
Relatos na literatura demonstram que este aumento da ocorrência de
aspergilose como importante patologia associada à infecção hospitalar se
refere a obras ou reformas no ambiente hospitalar, concomitante a ausência de
uma manutenção efetiva dos filtros de ar, os quais abrigam os esporos dos
fungos (FRENCH, 2005). Ressalta-se, portanto, que haja uma efetiva
comunicação entre a CCIH e os demais setores do hospital, inclusive com os
funcionários que realizem estas obras.
Figura 2: Microscopia de A. flavus (A) A. niger (B) e A. fumigatus (C). Fontes: McGinnis e
Deanna A. Sutton. Disponíveis em: http://doctorfungus.org.
Com o crescimento do número de infecções hospitalares concomitante
ao uso abusivo de antibióticos, a seleção de microrganismos resistentes se
tornou grande fonte de preocupação para profissionais, estudiosos e cientistas,
pois, além de aumentar a morbimortalidade, contribui para a seleção de
21
microrganismos resistentes, o que torna imprescindível a busca por novas
alternativas de combate a estes patógenos.
1.3
PEPTÍDEOS
ANTIMICROBIANOS
COMO
PROMISSORES
COMPOSTOS
De encontro a esta problemática surgem os peptídeos antimicrobianos
(PAMs), como promessas de ferramentas biotecnológicas capazes de retardar
a resistência de microrganismos (BENKO-ISEPPON et al., 2010). Por possuir
uma estrutura diferente dos antibióticos convencionais, diminui a exposição da
bactéria frente a estes compostos e, consequentemente, decresce a pressão
seletiva.
Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) geralmente são compostos que
fazem parte do sistema imune inato de todos os seres vivos. Para aqueles que
não apresentam uma resposta imunológica adaptativa, os PAMs compõem a
barreira inata contra organismos patogênicos sendo que, em organismos mais
complexos, os PAMs participam tanto de uma resposta inata como adaptativa,
sendo de fundamental importância na resposta do hospedeiro a infecções
(NIZET, 2001).
Em geral, os peptídeos antimicrobianos possuem menos de 60 resíduos
de aminoácidos, possuem carga líquida positiva (BROGDEN, 2005), sendo
variados quando se trata de seus dobramentos estruturais, compreendendo αhélices, folhas-β e hélices estendidas, representados na Figura 3. Apresentamse também como moléculas anfipáticas. Esta propriedade deve-se a presença
de resíduos básicos de lisina, arginina ou histidina, juntamente com domínios
hidrofóbicos formados por alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina,
fenilalanina, triptofano e metionina. (FIDANOVA, 2010; ZHANG, 2001).
22
Figura 3 - Exemplos de grupos de PAMs baseados em estruturas. A) Defensina isolada de
castanha, um peptídeo com estrutura secundária mista (pdb 1BK8). B) Tachyplesina I, um
peptídeo em β-hairpin, estabilizado por pontes dissulfeto, extraído do caranguejo-ferradura
(pdb 1MA2). C) Indolicidina, um peptídeo sem estrutura secundária definida (1QXQ). D)
Phylloseptina-2, um peptídeo em conformação de α-hélice, extraído da secreção de sapos do
gênero Phyllomedusa (pdb 2JPY). As pontes dissulfeto estão representadas por bolas e
varetas.
Por meio destas características apresentadas que seus mecanismos de
ação são elucidados. A interação destes peptídeos se dá por inserção nas
membranas citoplasmáticas bacterianas com cargas negativas, além da
interação com lipopolissacarídeos presentes em bactérias Gram-negativas. Por
este modo ocorre a mudança na conformação da membrana bacteriana
acarretando na permeabilidade de sua bicamada lipídica, promovendo
desequilíbrio osmótico e, consequentemente, a morte da célula lesada. Esta
letalidade às células se deve à constituição destes peptídeos, sendo
23
diretamente influenciada por sua sequência de aminoácidos que, dependendo
de qual está presente, promove além de diferentes conformações moleculares,
alterações em suas propriedades bioquímicas como hidrofobicidade, carga e
anfipaticidade (HANCOCK, 2000).
Existem diferentes formas de interação entre esses peptídeos e as
membranas citoplasmáticas para que ocorra essa desestabilização; esta
acontece geralmente através de mecanismos formadores de poros através da
membrana, demonstrados na Figura 4. No modelo de barril (Figura 4A), os
peptídeos são inseridos de forma paralela na membrana, abrindo um poro. No
modelo carpete (Figura 4B), estes peptídeos solubilizam frações da membrana,
levando a formação de poros. A Figura 4C mostra a representação de um poro
toroidal, o qual tem sua formação a partir de PAMs inseridos de modo paralelo,
alternando-se com lipídeos da própria membrana (BRODGEN, 2005). Os
outros modelos apresentados na Figura 4 surgiram a partir de estudos e
experimentos científicos mais elaborados.
24
Figura 4 – Mecanismos formadores de poros em membrana. Inicialmente ocorre a interação do
peptídeo com a membrana bacteriana, por adsorção. Os diferentes mecanismos são
representados por: A) Modelo de barril. B) Modelo de carpete. C) Poro toroidal. D) Poro toroidal
desordenado. E) Modelo afinador de membrana. F) Acumulador de lipídeos carregados. G)
Formação de intermediários de membrana. H) Direcionamento a lipídeos oxidados. I)
Carreador de ânions. J) Despolarização não lítica. K) Modelo de eletroporação. (Adaptado de
Nguyen, 2011).
Porém, apesar da atuação em membrana ser o principal alvo, os
peptídeos pode possuir atividade sobre componentes dentro da célula,
deslocando através da membrana e atuando sobre os processos metabólicos,
ligando-se ao DNA, inibindo a replicação, entre outros. Outra atuação descrita
de grande relevância diz respeito à capacidade que alguns peptídeos possuem
de estimular as defesas do hospedeiro, contribuindo para a resposta
imunológica do indivíduo em frente ao patógeno (BROGDEN, 2005).
25
Os peptídeos antimicrobianos estão presentes nos mais diversos
organismos, pertencentes à imunidade inata destes e conferindo vantagem de
sobrevivência a seus possuidores. Já foram relatados na literatura peptídeos
com diferentes ações, contra vírus, bactérias, fungos, protozoários, nematoides
e insetos. Alguns outros peptídeos antimicrobianos apresentam ação citotóxica
seletiva para células tumorais e espermáticas. São encontrados ainda
peptídeos que neutralizam lipopolissacarídeos tóxicos de bactérias Gramnegativas e modulam a resposta imune inata e adaptativa em humanos
(JONES, 2006). Uma vez que os PAMs são encontrados em diversos
organismos, as plantas aparecem como importantes fontes destes peptídeos.
Atualmente já foram descritos centenas de PAMs em plantas os quais são
agrupados em famílias estruturais. As principais famílias relatadas na literatura
são a das defensinas, tioninas, proteínas de transferência de lipídios, snakinas
e os ciclotídeos (GARCIA-OLMEDO et al., 1998; HAMMAMI et al., 2009), com
suas funções descritas na Tabela 2 e representadas pela Figura 5.
26
Tabela 2: Peptídeos Antimicrobianos de Plantas e Suas Respectivas Funções
Nome do Peptídeo
Número de Aminoácidos ou
Tamanho
α e β Tionina
45-47
ϒ Tionina
(Defensina)
Proteínas de
Transferência de
Lipídeos (LTPs)
Ciclótides
Snakinas
45-54
Função do Peptídeo
Referência
Antifúngica/
Antibacteriana
(Bohlmann et al., 1988;
Florack and
Stiekema, 1994; GarciaOlmedo
et al., 1999)
Antibacteriana e Antifúngica
Efeito inibidor em Hidrolases
Atividade Inseticida
90-95
Formação de Cutícula e
Embriogênese
Estabelecimento de Simbioses
Adaptação ao Estresse Abiótico
Defesa
28-37
Antibacteriana (Gram-positiva)
Antifúngica
Inseticida
63
Cicatrização
Antifúngica
Interação Planta-Patógeno
(Schrader-Fischer and
Apel, 1993)
(Epple et al., 1995;
Osborn et al.,
1995; De Samblanx et
al., 1997;
Segura et al., 1998)
(Broekaert et al., 1997)
(Chen et al., 2002)
(Sterk et al., 1991)
(Krause et al., 1994)
(Hughes et al., 1992;
Torres-Schumann
et al., 1992; White et al.,
1994; Jung et al., 2003;
Jang et al., 2004;
Carvalho et al., 2006)
(Terras et al., 1992;
Molina et al., 1993;
Segura et al., 1993;
Dubreil et al., 1998;
Velazhahan et al., 2001;
Gonorazky et al., 2005;
Diz et al., 2006)
(Tam et al., 1999)
(Jennings et al., 2001;
Jennings et al., 2005)
(Berrocal-Lobo et al.,
2002)
(Bindschedler et al.,
2006)
(FARROKHI, 2008, com adaptações)
27
Figura 5. Protótipos das principais classes de PAMs encontrados em plantas. A)
Peptídeo antimicrobiano EcAMP-1, extraído de sementes de capim Echinochloa crus-galli, um
α-helical hairpin (pdb 2L2R). B) Cicloviolacina-O2, um ciclotídeo extraído de Viola odorata (pdb
2KNM). C) Proteína transportadora de lipídeos de Milho (pdb 1MZL). D) VrD1, uma defensina
isolada da planta Vigna radiata . Não foi resolvida nenhuma estrutura para snakinas. As pontes
dissulfeto estão representadas por bolas e varetas.
28
1.4 A SEMENTE DE Punica granatum L.
Mais popularmente conhecida como romã (Figura 6), Punica
granatum L. constitui-se como o principal representante da família Punicaceae.
Estudos mostram que este arbusto ramoso, que pode alcançar até 7 metros de
altura, possui frutos esféricos, com muitas sementes róseas ou avermelhadas e
gosto ligeiramente ácido. Tem como origem relatada os países da Ásia,
adaptando-se na região do Mediterrâneo, em países africanos e também na
América do Sul, sendo bastante conhecida no Brasil (LORENZI, 2008).
Devido a essa distribuição mundial, várias culturas apresentam
relatos do uso da romã em rituais e tradições, sendo, por muitas delas,
considerada um fruto sagrado. No islamismo, por exemplo, o fruto representa a
fertilidade e abundância; já no cristianismo, possui significado de vida eterna e
ressureição. Na mitologia grega, seu significado também era de vida,
renascimento; era adicionalmente o fruto símbolo de casamentos, por
representar a indissolubilidade dos mesmos (LANGLEY, 2000).
As propriedades fitoterápicas desta planta são amplamente
conhecidas, e seus efeitos são demonstrados por todas as suas estruturas
vegetais. Um estudo realizado por Langley, em 2000, demonstrou que as flores
da romãzeira são comumente utilizadas para prevenir a perda de dentes, por
possuírem atividades de controlar a hemostasia e adstringente. Além disto, os
brotos das flores, quando liofilizados, reconstituídos e pulverizados são
utilizados no tratamento da bronquite, com eficácia comprovada. O extrato de
romã mostra-se eficiente em melhorar a função cardiovascular, como foi
demonstrado por Mattiello e colaboradores, em 2009. Em 2010, Caligiani e
colaboradores pesquisaram e sugeriram que o óleo da semente de romã auxilia
no metabolismo do colesterol. Dentre tantas pesquisas realizadas acerca desta
planta, também se destaca o potencial cicatrizante no tratamento de feridas em
animais, demonstrado por Pirbalouti e colaboradores, em 2010.
A premissa para o surgimento de estudos científicos surge a partir
do momento em que a sabedoria popular faz uso de extratos obtidos da
29
natureza, sendo estas pesquisas estimuladas pela Organização Mundial da
Saúde. Estes estudos proporcionam, além de trabalhos de importância
científica, a produção de medicamentos em menor tempo, com baixo custo
sendo, portanto, mais acessíveis à sociedade (OLIVEIRA et al., 2006). Os
estudos realizados acerca desta planta se mostram promissores, porém ainda
existem poucos relatos científicos que detalhem seus mecanismos de ação,
efeitos dos constituintes químicos e toxicológicos.
Figura 6: Fruto da Punica granatum L., popularmente conhecida como romã. Fonte:
RevistaRX. Disponível em: http://revistarx.com.br/?p=2261
30
2.
MATERIAL E MÉTODOS
2.1 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS
DE SEMENTES DE ROMÃ
As romãs foram coletadas em uma área residencial localizada a 15°.88’
06’’ S, 48° 11’ 17’’O . Em seguida foram transportadas até o laboratório, para
extração, de acordo com protocolo descrito por Maria neto, 2011, com
modificações. As sementes, juntamente com os arilos (pesando um total de
798 g), foram separadas da casca, trituradas e homogeneizadas, onde a fração
proteica das sementes foi extraída utilizando tampão Tris-HCl a 1% com NaCl a
0,6M (1:3 m/v). Centrifugou-se este extrato a 5.000xg por 90 min a 4o C para
remoção dos restos celulares. O sobrenadante foi submetido à precipitação
com sulfato de amônio (0- 100%) para precipitação das proteínas, sendo em
seguida centrifugado a 5.000xg por 40 min a 4
o
C. O precipitado, que
corresponde à fração rica em proteínas, foi dialisado contra água destilada. O
extrato dialisado foi submetido à ultracentrifugação em tubos AMICON 10k
(Millipore), para uma separação prévia entre os peptídeos menores e maiores
de 10 kDa. A fração abaixo de 10 kDa foi liofilizada. Em seguida, 1,0 mg desta
fração foi então ressuspendida com o pareador iônico ácido trifluoracético a
0,1% e aplicada em cromatografia de fase reversa em coluna analítica de
HPLC (Vydac C-18TP 522), com fluxo de 1 mL.min-1, onde as proteínas retidas
foram eluídas com um gradiente não linear de acetonitrila (5% /10 min, 5-17%
/5 min, 17-60% / 40 min), sendo coletadas em frações P1, P2 e P3. A detecção
de proteínas foi feita a 216 nm. Um miligrama da fração P2 foi aplicado
novamente na mesma coluna, com a mesma configuração, com exceção de
uma mudança no gradiente de acetonitrila (5% /10 min, 5-17% /5min, 17-28%
/40min). A fração ativa (fração 11) foi recromatografada com o mesmo método
para aumentar a resolução.
31
2.2 QUANTIFICAÇÃO PROTEICA
A quantificação protéica foi realizada através do kit Quant-iT™ Protein Assay
Kit (Invitrogen). Um volume de 199 μL da solução tampão Quant-iT™ foi
homogeneizado por 2 s, juntamente com 1 μL do reagente fluorimétrico QuantiT™. Logo após, uma alíquota de 10 μL da amostra foi adicionada a 190 μL da
solução tampão padrão do reagente + fluorocromo padrão do reagente, sendo
então homogeneizada por 2 s e incubada a uma temperatura de 25° C por 15
min. Após este tempo, essa solução foi submetida ao processo de
quantificação no fluorímetro QubitTM e os valores de concentração protéica
presentes nas amostras foram calculados utilizando três padrões protéicos
distintos como referência na calibração prévia do equipamento.
2.3 BIOENSAIOS CONTRA BACTÉRIAS
Os testes contra bactérias foram realizados em meio líquido LB (45 g.L-1
de bactotriptona, 5 g.L-1 de Extrato de levedura e 10g.L-1 NaCl, diluídos em
águas destilada), utilizando controle negativo (água destilada) e controle
positivo (cloranfenicol 40 μg.mL-1). Determinou-se a atividade antimicrobiana
pelo método de micro diluição em caldo de acordo com M100-S22 do Clinical
and Laboratory Standarts Institute (CLSI, 2012). O crescimento bacteriano foi
determinado por espectrofotometria em leituras temporais consecutivas
utilizando um comprimento de onda de 595nm. Os ensaios foram feitos contra
as bactérias E. coli e S. aureus. O ensaio foi realizado pelo método de
microdiluição em caldo LB suplementado com as amostras. Neste método,
diluiu-se um inóculo, com caldo LB, para aproximadamente 5x104 UFC.mL-1 e
adicionou-se a uma placa de 96 poços, em triplicata, juntamente com a
amostra testada, a uma concentração de 200 µg.mL -1. O volume final por poço
foi para 0,1 mL. Monitorou-se o crescimento bacteriano a 595 nm, a cada 30
min, durante a fase exponencial de crescimento bacteriano. Cloranfenicol (80
µg.mL-1) foi usado como controle positivo e água destilada como controle
negativo.A exceção, a fração 11 foi testada a uma concentração de 40 µg.mL -1.
32
2.4 BIOENSAIOS CONTRA FUNGOS
O teste contra o fungo A. fumigatus foi realizado através de inoculação
de 50 μl de amostra (extrato rico) a uma concentração de 100 e 200 μg.ml-1 em
discos de papel de filtro sobre meio sólido YPD (1% de extrato de levedo, 2%
de peptona e 2% de glicose, 2% de ágar). Como controle negativo usou-se
água destilada e estéril e como controle positivo fungizona (anfotericina B) a
100 μg.ml-1. Os fungos foram inoculados no centro da placa, e os discos de
papel nas laterais, margeando o inóculo do fungo. Os meios foram mantidos
em estufa (37° C) por cinco dias. A análise da inibição foi feita avaliando-se a
presença de halos em volta dos discos (CLSI, 2012).
2.5 ANÁLISE DE MASSA MOLECULAR
A análise de puresa e massa molecular das frações obtidas foi realizada
em espectrômetro de massa MALDI-TOF/TOF Ultraflex II (Bruker Daltonics,
Alemanha) equipado com laser Smart BeamTM controlado pelo software
Flexcontrol 3.0. Objetivando as análises de MALDI-TOF MS, as frações
liofilizadas foram dissolvidas em água ultra pura e homogeneizadas a uma
solução saturada (50 μl TFA 3%, 250 μl ACN 100% e 200 μl de H2O Milli-Q) de
uma matriz constituída por ácido α-ciano-4-hidroxi-cinâmico (1:3). Em seguida
foram depositadas em duplicata em uma placa do tipo Anchorchip Var-384 e
cristalizadas à temperatura ambiente. Os componentes moleculares presentes
tiveram suas massas moleculares determinadas por MS com calibração
externa com mistura de peptídeos padrão (Peptide Calibration Standard I,
Bruker Daltonics) sob modo de operação refletivo e positivo (DAVE, 2011).
2.6 DETERMINAÇÃO E ANÁLISE DA SEQUÊNCIA N-TERMINAL
A sequência N-terminal do peptídeo isolado foi determinada usando um
sequenciador automático de proteínas Shimadzu PSSQ-21A em colaboração
33
com o Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Ceará,
baseado no método da degradação de Edman (EDMAN et al., 1950) Para isto,
100 µg do peptídeo puro foram ressuspendidos em 30 µL de acetonitrila e
aplicados no sequenciador. Obteve-se a sequência por análise através dos
programas PSI-Blast (ALTSCHUL et al., 1997) buscando por sequências
similares, que posteriormente foram alinhadas pelo programa ClustalW
(THOMPSON et al., 1994).
34
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A presença descrita em relatos científicos de moléculas proteicas
antimicrobianas em sementes de plantas (PELEGRINI, 2008; MARIA-NETO,
2011; NOLDE, 2011; MANDAL, 2012) tem estimulado diversas pesquisas nesta
área. Com este objetivo, as sementes de P. granatum foram maceradas com
tampão de extração Tris-HCl a 1 % contendo com NaCl a 0,6 M (1:3 m/v).
Obteve-se inicialmente um extrato bruto que não foi submetido à avaliação da
atividade antimicrobiana devido à alta quantidade de compostos não protéicos,
como compostos secundários, que poderiam gerar resultados falsos positivos.
Uma vez que o objetivo do trabalho era caracterizar compostos protéicos com
ação antimicrobiana, o extrato bruto foi então precipitado com sulfato de
amônio e em seguida dialisado, obtendo-se assim a fração rica em proteínas
(FR) das sementes, sendo esta testada na concentração de 200 μg.mL -1 contra
as bactérias S. aureus e E. coli bem contra o fungo A. fumigatus. A fração rica
foi capaz de inibir 100 % do crescimento de S. aureus e 39% do de E. coli,
(figura 7) mas não foi capaz de inibir o desenvolvimento de A. Fumigatus em
nenhuma das concentrações testadas (dados não mostrados).
35
Figura 7: Avaliação do potencial antimicrobiano da fração rica das sementes de Punica
-1
granatum contra S. aureus e E. coli a 200 μg.mL . O percentual foi calculado tendo como base
-1
o controle positivo (C+: cloranfenicol a 80 μg.mL ) como 100% de inibição, após 4 horas de
incubação. Água destilada foi utilizada como controle negativo.
Assim, devido a maior atividade contra S. aureus, este microrganismo foi
escolhido como modelo para realização dos testes subsequentes. Dados de
um estudo comparativo publicado por Gonçalves e colaboradores, em 2005,
demonstraram que, assim como a FR de romã apresentou atividade contra S.
aureus, outros extratos vegetais como os de Schinus terebinthifolius (conhecida
como aroeira vermelha), Eugenia uniflora (pitangueira) e Psidium guajava
(goiabeira) também se mostraram efetivos em inibir o crescimento de S.
aureus. Extratos proteicos de melão de São Caetano (Momordica charantia),
também apresentaram atividade contra S. aureus (Mahmood et al., 2012),
assim como os extratos de mamona (Ricinus communis), chicória (Cichorium
intybus) e manjericão (Ocimum basilicum) (Salahudin et al., 2011). Em seguida,
a FR foi aplicada em filtros AMICON® Ultra filter 10K, de modo a separar e
concentrar as proteínas menores de 10 kDa, gerando a fração FR10K, e
proteínas maiores que 10 kDa, que foram descartadas. A fração FR10K, com
concentração de 200 μg.mL-1 foi então avaliada contra S. aureus (Figura 8).
36
Figura 8: Avaliação do potencial antimicrobiano da fração FR10K contra S. aureus a 200
-1
μg.mL . O percentual foi calculado tendo como base o controle positivo (C+: cloranfenicol a 80
-1
μg.mL ) como 100% de inibição, após 4 horas de incubação. Água destilada foi utilizada como
controle negativo.
A FR10K (1mg por corrida, no total de 7 corridas) foi aplicada em
cromatografia de fase reversa (Figura 11A), onde foram observados no perfil
cromatográfico, monitorado em 216 nm, três regiões principais, P1, P2 e P3. A
fração P2 mostrou atividade antibacteriana, sendo capaz de inibir 95 % o
crescimento de S. aureus a uma concentração de 200 μg.mL-1 (Figura 9).
37
Figura 9: Avaliação do potencial antimicrobiano das frações P1, P2 e P3 contra S. aureus a
-1
200 μg.mL . O percentual foi calculado tendo como base o controle positivo (C+: cloranfenicol
-1
a 80 μg.mL ) como 100% de inibição, após 4 horas de incubação. Água destilada foi utilizada
como controle negativo.
A fração P2 (1 mg por corrida no total de 3 corridas) foi então
recromatografada (Figura 11B) na mesma coluna, porém o gradiente de
acetonitrila foi extendido para aumentar a resolução dos picos. Foram geradas
17 frações (F1 a 17) que foram então avaliadas contra S. aureus, onde apenas
a fração F11 mostrou atividade antimicrobiana (Figura 10).
38
-1
Figura 10: Avaliação do potencial antimicrobiano da fração 11 contra S. aureus a 200 μg.mL .
-1
O percentual foi calculado tendo como base o controle positivo (C+: cloranfenicol a 80 μg.mL )
como 100% de inibição, após 4 horas de incubação. Água destilada foi utilizada como controle
negativo.
A fração F11 (80 µg, apenas uma corrida) foi recromatografada nas
mesmas condições para assegurar sua pureza, onde 70 ug foram coletados e
esta fração foi nomeada então granatidina (Figura 11C). A granatidina
demonstrou atividade contra a bactéria Gram-positiva S. aureus (26,80%), na
concentração de 40 g.mL-1 (Figura 10). Na literatura encontram-se diversos
exemplos de peptídeos que possuem atividade bactericida contra S. aureus,
como o Pg-AMP1, obtido de P. guajava, apresentando atividade contra S.
aureus e, adicionalmente, após purificação, contra Klebsiella sp. e Proteus sp.
(PELEGRINI, 2008). Outros peptídeos tambem se mostraram efetivos contra o
S. aureus como o Cn-AMP1, originário da água de coco (Cocos nucifera L)
(MANDAL, 2009) que se mostrou efetivo contra P. aeruginosa e E. coli. Além
disso o peptídeo Cr-ACP1, proveniente de sementes de Cyca revoluta, uma
planta ornamental conhecida popularmente como sagu-de-jardim, demonstrou
atividade deletéria contra Staphylococcus epidermitis, Bacillus subtilis e P.
aeruginosa (MANDAL et al., 2012).
39
Figura 11: HPLC de Fase Reversa com 1 mg de cada fração de P. granatum com menos de
10 kDa, monitorado a 216 nm em coluna analítica Vydac C-18TP 522. Linhas diagonais
indicam o gradiente de eluição com acetonitrila. A) Fração FR10K, de onde foi coletada a
fração P2. B) Fração P2 recromatografada, gerando 17 frações. A fração ativa (11) está
indicada com uma seta. C) Fração11 recromatografada.
40
A massa molecular de granatidina foi analisada em MALDI-TOF, que
apresentou um íon majoritário de 4785,11 Da e dois contaminantes de 5055,20
Da e 5305,82 Da (Figura 12), indicando que o peptídeo ainda continha
impuresas e que uma separação subsequente deve ser feita para confirmação
da massa real do peptídeo. De acordo com Lehninger (2011), o cálculo do
número aproximado de resíduos de aminoácidos de uma proteína simples pode
ser feito, dividindo seu peso molecular por 110. Embora a massa molecular
média dos 20 aminoácidos primários seja cerca de 140, os aminoácidos
menores predominam na maioria das proteínas, principalmente em peptídeos
antimicrobianos. Desta forma, considerando-se o peptídeo como o íon
majoritário encontrado na análise de massa, a granatidina possui em torno de
44 aminoácidos. Estatísticas obtidas pelo banco de dados PhytAMP
demonstram que 83,4% dos peptídeos antimicrobianos obtidos de plantas
possuem entre 20 e 67 resíduos de aminoácidos. O peptídeo granatidina
corrobora com esta informação, pelo número de resíduos que seu peso
molecular indica possuir. Em busca realizada no banco de dados Antimicrobial
Peptide
Database
utilizou-se
como
parametro
de
busca
peptídeos
antimicrobianos de plantas que possuem entre 40 e 60 aminoácidos e atividade
deletéria contra bactérias Gram-positivas. Massas similares foram obtidas
como a descrita para o Ct-AMP1, com 49 resíduos, obtido da espécie Clitoria
ternatea, popularmente conhecida como ervilha borboleta (THEVISSEN, 2000);
Pn-AMP1 apresentando 41 aminoácidos, obtido de sementes de Ipomoea nil,
planta conhecida como corriola (KOO, 2004) e Ee-CBP com 45 aminoácidos,
um peptídeo isolado de Euonymus europaeus L., popularmente barrete-depadre.
41
Figura 12: Massa molecular de granatidina analisada em MALDI-TOF/TOF Ultraflex II
(Bruker Daltonics, Alemanha).
A fração 11, após recromatografada, foi submetida ao sequenciamento por
degradação de Edman, de forma que os primeiros 26 resíduos do N-terminal
do peptídeo granatidina foram obtidos, YTVPNAELNPLANQTEHQNFGNVPRE.
Esta sequência foi analisada e comparada em bancos de dados (nonredundant protein database (NCBI), SWISSPROT Data Bank, APD e
PhytAMP), porém não foram encontradas similaridades com outras sequências.
A falta de dados in silico pode ser possivelmente atribuída à baixa quantidade
de dados genômicos e proteômicos da ordem Myrtales, da qual P. granatum
faz parte.
Similarmente, outros peptídeos antimicrobianos apresentam baixa ou
nenhuma homologia com os bancos de dados, como os peptídeos Cn-AMP1,
Cn-AMP2 e Cn-AMP3 isolados a partir de água de coco (C. nucifera). Ao
comparar estes peptídeos com o banco NCBI não foi encontrada nenhuma
similaridade relevante. Porém ao comparar a estrutura primária da granatidina
42
com o banco APD, uma baixa homologia (30%) foi observada com os
peptídeos antimicrobianos temporina G e uperina 2.1 (MANDAL et al., 2009).
Outros peptídeos previamente isolados também não desmonstraram homologia
com o banco de dados. Como exemplo pode-se citar os peptideos IbAMP-1,
IbAMP-2, IbAMP-3 e IbAMP-4, isolados a partir de Inpatiens balsâmica
(TAILOR, 1997). Estes peptídeos possuem carga altamente básica e 2 pontes
dissulfeto, sendo derivados todos de um mesmo precursor de cDNA. A análise
de sua estrutura por dicroísmo circular e ressonância nuclear magnética por
prótons demonstrou uma estrutura formada por duas folhas β conectadas pelas
pontes disulfeto, padrão até então inédito em plantas (PATEL, 1998). Apesar
de não apresentarem homologia de sequência em bancos de dados, estes
peptídeos apresentam um padrão estrutural que já foi descrito em peptídeos
derivados de animais como a tachiplesina (LAEDERACH et al., 2002), derivada
de hemócitos de límulo (Limulus polyphemus); a protegrina (LAI et al., 2002),
derivada de javali (Sus scrofa) e a arenicina (ANDRA et al., 2008) derivada do
anelídeo Arenicola marina. Os peptídeos MiAMP-1, isolado de Macadamia
integrifolia (MCMANUS, 1999) e MBP-1, isolado a partir de Zea mays
(DUVICK, 1992) eram até recentemente classificados como fora de qualquer
família de peptídeos de planta. Com o avanço dos dados estruturais, foi
descoberto que estes peptídeos, apesar de apresentar baixa similaridade de
sequência, fazem parte da família das β-hairpininas (NOLDE, 2011).
Sendo assim, possivelmente, a partir do sequenciamento completo da
granatidina, aliado à resolução de sua estrutura, possa situar este peptídeo em
uma das famílias existentes ou uma nova família de peptídeos antimicrobianos
possa ser descrita.
43
4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Os dados aqui mostrados descrevem um novo peptídeo antimicrobiano,
denominado granatidina, encontrado em sementes de Punica granatum L.,
conhecida como romã. O peptídeo, nas concentrações testadas, possui
atividade antibacteriana in vitro contra S. aureus, importante bactéria
causadora de infecção hospitalar, porém não apresentou atividade fungicida
contra o fungo A. fumigatus, responsável por diversos casos de aspergilose em
hospitais. Futuramente outros estudos serão realizados para dar continuidade
ao que foi encontrado neste trabalho, como o isolamento completo do peptídeo
e caracterização molecular por sequenciamento completo visando a definição
de qual classe pode-se incluí-lo ou se estamos diante de uma nova família de
peptídeos antimicrobianos.
44
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