UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Luiz Eduardo de Sousa
Exercício físico promove efeito antioxidante e restaura a
expressão das enzimas óxido nítrico sintases no bulbo
ventrolateral rostral de ratos com hipertensão renovascular
Ouro Preto – MG
2015
Luiz Eduardo de Sousa
Exercício físico promove efeito antioxidante e restaura a
expressão das enzimas óxido nítrico sintases no bulbo
ventrolateral rostral de ratos com hipertensão renovascular
Tese apresentada ao Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas
(NUPEB) para obtenção do título de
Doutor em Ciências Biológicas.
Área de concentração:
Bioquímica Metabólica e Fisiológica
Orientadora:
Prfa. Dra Andreia Carvalho Alzamora
Ouro Preto – MG
2015
2
S725e
Sousa, Luiz Eduardo.
Exercício físico restaura a expressão das óxido nítrico sintases no bulbo
ventrolateral rostral de ratos com hipertensão renovascular [manuscrito] / Luiz
Eduardo Sousa. - 2015.
86f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientadora: Profa. Dra. Andreia Carvalho Alzamora.
Coorientador: Prof. Dr. Mauro Cesar Isoldi.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de
Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas.
Área de Concentração: Bioquímica Metabólica e Fisiológica.
1. Exercícios físicos. 2. Pressão arterial. 3. Óxido nítrico. 4. Stress (Fisiologia).
I. Alzamora, Andreia Carvalho. II. Isoldi, Mauro Cesar. III. Universidade
Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.
CDU: 615.72:616.12-008.33
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
Dedicatória
À minha esposa Laila e filhas, Liz e Júlia
3
Agradecimentos
Mais uma etapa concluída! Não foi uma tarefa fácil; muito trabalho,
dedicação e disponibilidade nessa missão foram determinantes para que tudo se
concluísse.
À Deus pela vida e possibilidade de chegar aonde cheguei.
À Minha esposa Laila por sempre me motivar, incentiva e apoiar em todos
os momentos. Acredito que sem seu apoio, tudo se tornaria mais árduo. Suas
palavras de incentivo me impulsionaram para seguir em frente, seu carinho me
acalentava nos momentos de dúvida e dificuldade.
Às duas “pessoinhas” que ainda no ventre de minha esposa, também se
tornaram fonte de pura alegria e energia para que eu continuasse nesse caminho.
Minhas filhas amadas, Liz e Júlia! Um dia, com certeza, entenderão sua
importância e força em minha vida.
Aos meus pais, Oscar e Cleyde, por me oferecerem todo apoio e
mostrarem ao longo da vida, os valores de responsabilidade, humildade, e
honestidade. Aos meus irmãos, Carla, Geisa, Sorele, José Marcus, agradeço pelo
carinho.
À família Binato Junqueira, agradeço infinitamente. Sempre me apoiaram e
motivaram em todas as escolhas. Ao meu sogro Luiz Eduardo, minha sogra
Suzana, e aos cunhados Joaquim e Rafael, vocês são especiais.
À minha orientadora Profa. Dra Andrea Carvalho Alzamora, por acreditar e
depositar sua confiança em meu trabalho. Passamos por momentos tranquilos e
difíceis, alegres e tristes, mas sempre tivemos nossos objetivos alcançados.
Ao Prof. Dr. Mauro, meu coorientador, uma pessoa incrível, agradeço por
estar sempre lado a lado comigo, ensinando e orientando efetivamente, sempre
que precisei. Suas piadas foram pequenas doses relaxantes em momentos de
“alta tensão”.
Aos Profs. Dr. Leonardo, Dra. Tânia e Dra. Lenice, que fizeram parte da
banca de Qualificação, meus sinceros agradecimentos, suas colocações e
sugestões contribuíram significativamente para o desenvolvimento do meu
trabalho.
Aos amigos que sempre me apoiaram e ajudaram efetivamente, meus
sinceros agradecimentos. Ao Prof. Dr. Frank, grande amigo, pela ajuda técnica e
apoio fraterno. À amiga Ana Carla pelo carinho. Ao Prof. Dr. Wanderson, pela
ajuda técnica e incentivo. À amiga Verônica, pelas palavras motivadoras e
momentos de descontração.
Aos colegas do Laboratório de Fisiologia e Biofísica da Universidade
Federal de Minas Gerais, especialmente aos Profs. Dr. Robson, Dra. Maria José e
Dra. Ana Paula; agradeço as orientações e suporte técnico recebidos.
4
Aos colegas da Universidade Federal de Ouro Preto, que me deram
pequenas e fundamentais ajudas, como as acadêmicas Keyla e Mirla. A turma do
Laboratório de Hipertensão obrigado pelo companheirismo, Grazi, Uberdan, Aline,
Maria Andrea, Claudiane, Jerônimo, Waleska, Gabi, Renato, Everton, Rodrigo e
Jamile.
Aos funcionários do CCA, sempre fui muito bem recebido por todos. Aos
colegas do DECBI, agradeço pelo incentivo. Agradeço especialmente, aos Profs.
Dr. Gustavo, Dra. Uyrá, Dr. Leandro, Dra. Lisandra, e Dra. Renata Guerra.
À FAPEMIG, REDE TOXIFAR, CNPQ, INCT, NANOBIOFARMACÊUTICA e
PRONEX (FAPEMIG/CNPQ) pelo financiamento.
Ao sacrifício dos animais experimentais, meu agradecimento.
5
Over the Hills and Far Away
(Page/Plant)
6
RESUMO
Introdução: O exercício físico tem importante ação no sistema nervoso e órgãos
reguladores da pressão arterial. Objetivos: Verificar o efeito do exercício físico
sobre a expressão das óxido nítrico sintases (NOSs) no bulbo ventrolateral rostral
(RVLM) e estado redox no encéfalo, coração, rins e aorta de ratos com
hipertensão renovascular. Métodos: em ratos hipertensos modelo dois rins, um
clipe (2R1C), normotensos (SHAM), sedentários (SD) e exercitados (EX)
verificamos o efeito do NO no RVLM através da microinjeção de L-arginina e LNAME em ratos submetidos ao protocolo de 4 semanas de exercício físico.
Analisamos no RVLM a expressão do mRNA das enzimas: isoformas das NOS
(nNOS, iNOS e eNOS), catalase, MnSOD, Cu/ZnSOD e subunidade da NADPH
p22phox em ratos exercitados por 4 semanas. Em ratos submetidos aos protocolos
de 4 e 8 semanas, verificamos a concentração de TBARS e atividade da catalase
no RVLM, bulbo ventrolateral caudal (CVLM), hipotálamo, ventrículo esquerdo,
rins e aorta. Resultados: a microinjeção de L-arginina no RVLM aumentou
(p<0,05) a pressão arterial média (PAM) nos grupos SHAM-SD e 2R1C-SD
comparado à salina. Nos animais 2R1C-EX e SHAM-EX, a L-arginina não
produziu efeito significativo. A microinjeção de L-NAME no RVLM produziu efeito
similar à salina nos grupos SHAM-SD, SHAM-EX e 2R1C-EX, contudo, no grupo
2R1C-SD induziu redução (p<0,05) da PAM. No RVLM, a expressão do mRNA da
nNOS, eNOS e iNOS foi maior (p<0,05) no grupo 2R1C-SD em comparação ao
SHAM-SD, entretanto, essa expressão foi normalizada no grupo 2R1C-EX. A
expressão do mRNA da catalase e Cu/ZnSOD no grupo 2R1C-SD foi menor
(p<0,05) enquanto a expressão de p22phox no 2R1C-SD foi maior (p<0,05)
comparado ao SHAM-SD. No grupo 2R1C-EX a expressão do mRNA da catalase
foi maior (p<0,05), e a expressão de Cu/ZnSOD e p22phox foi similar ao SHAM-SD.
A concentração de TBARS no grupo 2R1C-SD, submetidos ao protocolo de 4
semanas, aumentou (p<0,05) no córtex cerebral, hipotálamo, RVLM, ventrículo
esquerdo, aorta e rim esquerdo, comparado ao SHAM-SD. Enquanto no grupo
2R1C-SD submetido ao protocolo de 8 semanas houve aumento (p<0,05) no
TBARS no ventrículo esquerdo, aorta e rim esquerdo. Contudo, o grupo 2R1CEX, submetido ao protocolo de 4 semanas, apresentou redução (p<0,05) da
concentração de TBARS no hipotálamo, RVLM, ventrículo esquerdo, aorta e rim
esquerdo em comparação com 2R1C-SD. No grupo 2R1C-EX submetido ao
protocolo de 8 semanas houve redução (p<0,05) no TBARS no hipotálamo,
ventrículo esquerdo, aorta e rim esquerdo, comparado com o grupo 2R1C-SD. A
atividade da catalase foi reduzida (p<0,05) no hipotálamo, RVLM, ventrículo
esquerdo, aorta e rins no grupo 2R1C-SD submetido ao protocolo de 4 semanas,
comparado com SHAM-SD, entretanto, no grupo 2R1C-EX a atividade da
catalase foi normalizada em todos esses tecidos. Conclusão: O exercício físico
restaurou a expressão do mRNA das NOS no RVLM de ratos 2R1C-EX, além
disso, o exercício mostrou um efeito antioxidante no RVLM, coração, rins e aorta
de ratos 2R1C-EX, o que poderia contribuir para redução dos níveis de pressão
arterial e controle da hipertensão.
Palavras-chave: hipertensão arterial, óxido nítrico, estresse oxidativo, exercício
físico.
7
ABSTRACT
Introduction: Exercise has important action in the nervous system and organs of
the cardiovascular system. Aim: To investigate the effect of physical exercise on
nitric oxide synthases (NOS) mRNA expression in the rostral ventrolateral medulla
(RVLM) and redox state in the brain, heart, kidneys and aorta of renovascular
hypertensive rats. Methods: Hypertensive rats two kidneys, one clip (2K1C)
model, normotensive (SHAM) sedentary (SD) and trained (EX) for 4 and 8 weeks.
We analyzed the effect of NO by L-arginine and L-NAME microinjection into RVLM
of rats subjected to 4 weeks of exercise. We analyzed mRNA expression of NOS
isoforms (iNOS, eNOS and nNOS), catalase, MnSOD, Cu/ZnSOD, subunit of
NADPH p22phox of rats trained for 4 weeks. In rats trained for 4 and 8 weeks we
analyzed the concentration of TBARS and catalase activity in the RVLM, caudal
ventrolateral medulla (CVLM), hypothalamus, left ventricle, aorta and kidney.
Results: Microinjection of L-arginine into the RVLM increased (p<0.05) mean
arterial pressure (MAP) in the SHAM-SD and 2K1C-SD groups, compared to
saline. In the 2K1C-EX and SHAM-EX groups, L-arginine produced no significant
effect. The microinjection of L-NAME into RVLM induced similar effect to saline, in
the SHAM-SD, SHAM-EX and 2K1C-EX groups; however, L-NAME reduced the
MAP in the 2K1C-SD group. In the RVLM, the mRNA expression of nNOS, eNOS
and iNOS was higher (p<0.05) in 2K1C-SD group, compared to SHAM-SD group,
however, this expression was normalized in 2K1C-EX group. The mRNA
expression of catalase and Cu/ZnSOD in the 2K1C-SD was smaller (p<0.05) while
the expression of p22phox in 2K1C was greater (p<0.05) compared to SHAM-SD. In
2K1C-EX group the mRNA expression of catalase was higher (p<0.05), and the
expression of Cu/ZnSOD and p22phox was similar to the SHAM-SD. The TBARS
concentration increased in the brain cortex, hypothalamus, RVLM, left ventricle,
aorta and left kidney in the 2K1C-SD group subjected to 4 weeks of exercise.
While in 2K1C-SD group the concentration of TBARS increased in the left
ventricle, aorta and left kidney in rats subjected to 8 weeks of exercise. However,
the concentration of TBARS reduced (p<0.05) in the hypothalamus, RVLM, left
ventricule, aorta and left kidney in the 2K1C-EX, compared to 2K1C-SD subjected
to 4 and 8 weeks of exercise (except in the RVLM). The catalase activity was
reduced (p<0.05) in the hypothalamus, RVLM, left ventricle, aorta and kidney of
2K1C-SD group subjected to 4 weeks of exercise, however, in the 2K1C-EX group
the catalase activity was normalized in these tissues. Conclusion: The exercise
restored mRNA expression of NOS in the RVLM of 2K1C-EX rats and, the
exercise showed an antioxidant effect in the RVLM, heart, kidney and aorta of
2K1C-EX rats. The exercise could contribute to reducing the levels of blood
pressure and controlling of hypertension.
Key-words: arterial hypertension, nitric oxide, oxidative stress, physical exercise
8
Lista de Figuras
Figura 1. Esquema simplificado da cascata enzimática do sistema renina
angiotensina. (pág. 18)
Figura 2. Esquema mostrando as fases da hipertensão renovascular 2R1C. (pág.
21)
Figura 3. Avaliação do ganho de massa corporal (gramas, g) em ratos SHAM e
2R1C, sedentários (SD) e submetidos a exercício físico (EX) na 2ª, 3ª, 4ª, 5ª, 6ª,
7ª e 8ª semana após as cirurgias. (pág. 49)
Figura 4. Registros típicos de pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão
arterial média (PAM, mmHg) e frequência cardíaca (FC, bpm de ratos SHAM-SD,
SHAM-EX, 2R1C-SD e 2R1C-EX. (pág. 51)
Figura 5. Registros típicos do efeito induzido pela microinjeção de L-arginina
(50nmol/100nl) no RVLM sobre a pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão
arterial média (PAM, mmHg) e frequência cardíaca (FC, bpm) de um rato
representativo dos grupos SHAM-SD, SHAM-EX, 2R1C-SD e 2R1C-EX. (pág. 52)
Figura 6. Efeito sobre a variação da pressão arterial média (PAM, mmHg) e
frequência cardíaca (FC, bpm) induzido pela microinjeção de L-arginina
(50nmol/100nl) antes e cinco minutos após L-NAME (10nmol/100nl) e salina
(100nl) no RVLM de ratos normotensos (SHAM painel A); hipertensos (2R1C
painel B), sedentários (SD) e submetidos a exercício físico (EX). (pág. 54)
Figura 7. Níveis relativos de malondialdeído (MDA, nm/mg ptn) pelo método de
TBARS no córtex cerebral, hipotálamo, CVLM e RVLM de ratos SHAM e 2R1C
(SD e EX) submetidos ao protocolo de 4 semanas de exercício. (pág. 56)
Figura 8. Níveis relativos de malondialdeído (MDA, nm/mg ptn) pelo método de
TBARS no ventrículo esquerdo, artéria aorta, rim esquerdo e rim direito de ratos
SHAM e 2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 4 semanas de exercício.
(pág. 57)
Figura 9. Atividade da enzima catalase (CAT, U/mg ptn) no córtex cerebral,
hipotálamo, CVLM e RVLM de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX) submetidos ao
protocolo de 4 semanas de exercício. (pág. 58)
Figura 10. Atividade da enzima catalase (CAT, U/mg ptn) no ventrículo esquerdo,
artéria aorta, rim esquerdo e rim direito de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX)
submetidos ao protocolo de 4 semanas de exercício. (pág. 59)
Figura 11. Níveis relativos de malondialdeído (MDA, nm/mg ptn) pelo método de
TBARS no córtex cerebral, hipotálamo, CVLM e RVLM de ratos SHAM e 2R1C
(SD e EX) submetidos ao protocolo de 8 semanas de exercício. (pág. 60)
9
Figura 12. Níveis relativos de malondialdeído (MDA, nm/mg ptn) pelo método de
TBARS no ventrículo esquerdo, artéria aorta, rim esquerdo e rim direito de ratos
SHAM e 2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 8 semanas de exercício.
(pág. 61)
Figura 13. Atividade da enzima catalase (CAT, U/mg ptn) no córtex cerebral,
hipotálamo, CVLM e RVLM de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX) submetidos ao
protocolo de 8 semanas de exercício. (pág. 62)
Figura 14. Atividade da enzima catalase (CAT, U/mg ptn) no ventrículo esquerdo,
artéria aorta, rim esquerdo e rim direito de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX)
submetidos ao protocolo de 8 semanas de exercício. (pág. 63)
10
Lista de Tabelas
Tabela 1. Sequências de primers usados nas análises de qRT-PCR. (pág. 44)
Tabela 2. Valores da pressão arterial média (PAM, mmHg) mensuradas através
da pletismografia de cauda. (pag. 48)
Tabela 3. Valores de massa corporal (gramas, g) avaliados até a oitava semana.
(pág. 49)
Tabela 4. Valores do peso úmido dos rins (direito e esquerdo) e coração (g/100g
de massa corporal). (pág. 50)
Tabela 5. Percentual (%) de variação do peso úmido do rim esquerdo (clipado)
em relação ao respectivo peso úmido do rim direito. (pág. 50)
Tabela 6. Efeito induzido pela microinjeção de L-arginina (50nmol/100nl), L-NAME
(10nmol/100nl) e salina (100nl) no RVLM sobre a variação de pressão arterial
média e frequência cardíaca de ratos normotensos (SHAM), hipertensos (2R1C),
sedentários (SD) e submetidos a exercício físico (EX). (pág. 53)
Tabela 7. Expressão do mRNA (unidade arbritária) das óxido nítrico sintases,
catalase, Cu/ZnSOD, MnSOD e p22phox no bulbo ventrolateral rostral (RVLM) de
animais submetidos ao protocolo de EX de 4 semanas. (pág. 55)
11
Lista de Abreviaturas
2R1C
A-779
AMP
Ang-(1-7)
Ang-(1-9)
Ang-I
Ang-II
AP
AT1
AT2
BH2
BH4
Ca+
CAT
cGMP
CVLM
ECA
ECA2
eNOS
EROs
EX
FC
GABA
GC
GPx
GSH
GSSG
H2O2
HA
iNOS
K+
L-Arg
L-NAME
Mas
MDA
mtNOS
NADPH
NEP
nNOS
NO
NOSs
NTS
O2
O2OH
ONOOPA
PAM
Hipertensão renovascular dois rins, um clipe
Antagonista da Ang-(1-7)
Aminopeptidase
Angiotensina (1-7)
Angiotensina (1-9)
Angiotensina I
Angiotensina II
Área postrema
Receptor AT1 para Ang-II
Receptor AT2 para Ang-II
Dihydrobiopterin
Tetrahydrobiopterin
Cálcio
Catalase
Guanosina 3’5’ monofosfato cíclico
Bulbo ventrolateral caudal
Enzima conversora de angiotensina
Enzima conversora de angiotensina 2
Óxido nítrico sintase endotelial
Espécies reativas de oxigênio
Exercício físico
Freqüência cardíaca
Ácido gama-aminobutírico
Guanilato ciclase
Glutadiona peroxidase
Glutadiona reduzida
Glutadiona oxidada
Peróxido de hidrogênio
Hipertensão arterial
Óxido nítrico sintase induzível
Potássio
L-arginina
NG-nitro-L-arginina metil ester
Receptor para Ang-(1-7)
Malondialdeído
Óxido nítrico sintase mitocondrial
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase
Endopeptidase neutra
Óxido nítrico sintase neuronal
Óxido nítrico
Óxido nítrico sintases
Núcleo do trato solitário
Oxigênio
Ânion superóxido
Radical hidroxila
Peroxinitrito
Pressão arterial
Pressão arterial média
12
PCP
PD123319
PEP
PVN
RVLM
SD
SHAM
SNC
SNS
SOD
SON
SRA
TBARS
Prolilcarboxipeptidase
Antagonista de AT2
Proliendopeptidase
Núcleo paraventricular do hipotálamo
Bulbo ventrolateral rostral
Sedentários
Ratos normotensos
Sistema nervoso central
Sistema nervoso simpático
Superóxido dismutase
Núcleo supra-óptico do hipotálamo
Sistema renina angiotensina
Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
13
Sumário
1.
Introdução .......................................................................................................... 16
1.1
Envolvimento do sistema renina angiotensina na hipertensão arterial.. 17
1.2
Modelo experimental de hipertensão renovascular dois rins, um clipe
(2R1C) de Goldblatt ............................................................................................... 19
1.3
Participação do SRA no controle central da pressão arterial ................. 21
1.4
Envolvimento do óxido nítrico no controle da função cardiovascular ... 23
1.5
Estresse oxidativo na hipertensão arterial ............................................... 26
1.6
Efeito do exercício físico sobre a função cardiovascular ........................ 30
2.
Justificativa ........................................................................................................ 35
3.
Objetivos ............................................................................................................ 36
4.
3.1
Objetivo Geral ............................................................................................. 36
3.2
Objetivos Específicos ................................................................................ 36
Metodologia ....................................................................................................... 37
4.1
Animais ....................................................................................................... 37
4.2
Cirurgia para o Desenvolvimento da Hipertensão Renovascular ........... 37
4.3
Protocolo de Exercício Físico .................................................................... 38
4.4
Avaliação Indireta da Pressão Arterial Através da Pletismografia de
Cauda ..................................................................................................................... 39
4.5
Avaliação da Massa Corporal .................................................................... 39
4.6
Confecção de Cânulas Vasculares ............................................................ 39
4.7
Canulação e Isolamento da Artéria e Veia Femorais.... Error! Bookmark not
defined.
4.8
Registro Direto da Pressão Arterial Média, Frequência Cardíaca e
Microinjeção .......................................................................................................... 40
4.9
Expressão do mRNA da NOS, catalase, MnSOD, Cu/ZnSOD e p22phox no
RVLM ..................................................................................................................... 42
5.
4.10
Análise da catalase e TBARS..................................................................... 45
4.11
Análise do dano oxidativo (TBARS) .......................................................... 46
4.12
Atividade da enzima antioxidante catalase............................................... 46
4.13
Análise Estatística ...................................................................................... 47
4.14
Protocolo Experimental.............................................................................. 47
Resultados ......................................................................................................... 48
5.1
Evolução da pressão arterial após as cirurgias ....................................... 48
5.2
Massa corporal ........................................................................................... 48
5.3
Massa úmida dos rins e coração ............................................................... 50
14
5.4
Níveis basais de pressão arterial média e frequência cardíaca .............. 51
5.5
Efeitos induzidos pela microinjeção de L-arginina e L-NAME no RVLM
sobre a pressão arterial média e frequência cardíaca ........................................ 52
5.6
Expressão do mRNA das isoformas de NOS, catalase, Cu/ZnSOD,
MnSOD e p22phox no RVLM ................................................................................... 54
5.7
Níveis relativos de malondialdeído (TBARS) e da atividade da enzima
catalase nos grupos submetidos ao protocolo de 4 semanas .......................... 55
5.8
Níveis relativos de malondialdeído (TBARS) e da atividade da enzima
catalase nos grupos submetidos ao protocolo de 8 semanas .......................... 59
6.
Discussão........................................................................................................... 64
7.
Conclusão .......................................................................................................... 72
8.
Referências bibliográficas ................................................................................ 73
9.
Produção Acadêmica ........................................................................................ 86
9.1
Artigos Completos Publicados em Periódicos ......................................... 86
9.2
Apresentação em Eventos Científicos ...................................................... 86
15
1. Introdução
H
ipertensão arterial sistêmica (HA) é um dos principais fatores de risco
para desenvolvimento de doenças cardiovasculares e um dos maiores
problemas de saúde pública no Brasil e no mundo 1. É uma condição
clínica multifatorial caracterizada por níveis elevados e sustentados de pressão
arterial
(PA).
Comumente
está
associada
a
alterações
metabólicas
e
morfofuncionais de órgãos-alvo, como o coração, encéfalo, rins e vasos
sanguíneos 1. A hipertensão é uma condição complexa, pois aproximadamente
90% dos casos são classificados como hipertensão essencial, onde uma causa
precisa é desconhecida 2. Aproximadamente 50% dos pacientes hipertensos
apresentam mecanismos neurogênicos envolvidos na patogênese da hipertensão
arterial 3.
Frequentemente a gênese da HA está atrelada a alterações fisiopatológicas
como aumento da atividade do sistema renina angiotensina (SRA) e do sistema
nervoso simpático (SNS)
4; 5; 6
. Observam-se também alterações, em diversos
tecidos, na atividade ou biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) e o aumento da
produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) 7; 8; 9.
Alterações no funcionamento das vias nervosas (centrais e periféricas) que
regulam a pressão arterial também contribuem para o desenvolvimento e
manutenção da HA 4. Estudos mostram que o NO e as EROs influenciam o
controle neural central da função cardiovascular, especialmente nas áreas do
bulbo ventrolateral rostral (RVLM) e ventral (CVLM), núcleos específicos do
hipotálamo e núcleo do trato solitário (NTS)
10; 11; 12
. O RVLM é uma importante
área do controle cardiovascular, pois apresenta projeções eferentes do bulbo para
os neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula espinal modulando a
atividade simpática
4
. Neurônios do RVLM desempenham papel crucial no
controle da pressão arterial
13
. Em situações fisiopatológicas específicas, a
hiperatividade do RVLM é um fator determinante para a geração e manutenção
HA 10; 14.
Como medida não-medicamentosa para tratamento e controle da HA, o
exercício físico (EX) se destaca pelos seus efeitos na redução dos níveis
pressóricos e pela capacidade de prevenir a HA. Também foi demonstrando que o
16
EX reduz o estresse oxidativo em órgãos do sistema circulatório, e melhora a
reatividade ao NO no endotélio vascular
15
. Porém, não está claro se o efeito do
EX como regulador da PA envolve modificações/normalização dos níveis e
atividades do NO e EROs no RVLM, hipotálamo, rins, coração e artéria aorta de
ratos com hipertensão renovascular.
1.1 Envolvimento do sistema renina angiotensina na hipertensão arterial
O SRA é bem conhecido devido a sua capacidade de regular a PA e a
homeostase de fluídos corporais
6; 16
. Classicamente, o SRA é ativado pela
renina, enzima liberada pelos rins em resposta à diminuição do fluxo sanguíneo
renal
17
. A renina é sintetizada e armazenada na forma inativa chamada pró-
renina nas células justaglomerulares das arteríolas aferentes proximais dos
glomérulos renais. Com a redução da perfusão sanguínea nos rins, as células
justaglomerulares liberam a renina que terá ação sistêmica
18; 19
. Sistemicamente,
a renina cliva o angiotensinogênio formando o decapeptídeo angiotensina I (AngI) que tem pouca ação vasoativa. Alguns minutos após a formação da Ang-I
ocorre a formação do octapeptídeo angiotensina II (Ang-II) que se dá
principalmente nos pulmões, catalisada pela enzima conversora de angiotensina
(ECA) 17; 18; 20. A Ang-I também pode ser metabolizada pela enzima conversora de
angiotensina II (ECA2) que remove o aminoácido leucina do terminal C da Ang-I
formando a Ang-(1-9) e após clivagem forma a Ang-(1-7), um peptídeo
vasodilatador e anti-proliferativo
21; 22
. A ação da Ang-(1-7) ocorre através de sua
interação com o receptor Mas 21; 22.
A ação da Ang-II em diferentes tecidos ocorre via acoplamento com
receptores AT1 e AT2. Nos vasos sanguíneos, a interação entre Ang-II e receptor
AT1 induz a vasoconstrição, enquanto com receptor AT2 induz a vasodilatação
23;
24
. O receptor AT1 apresenta duas subunidades, AT1a e AT1b, que são
farmacologicamente indistinguíveis, mas são produtos de genes diferentes, que
são diferentemente expressos e regulados
25; 26; 27
. A interação da Ang-II com
receptor AT1 também está associada a danos teciduais como proliferação celular,
enquanto o receptor AT2 induz resposta oposta
23; 24
. A Figura 1 ilustra de forma
simplificada a cascata enzimática do SRA.
17
Figura 1. Esquema simplificado da cascata enzimática do sistema renina angiotensina. ECA,
enzima conversora de angiotensina; AMP, aminopeptidase; ECA2, enzima conversora de
angiotensina 2; PEP, prolilendopeptidase; PCP, prolilcarboxipeptidase; NEP, endopeptidase
neutra; AT1 e AT2, receptores para Ang-II; Mas, receptor para Ang-(1-7) (Adaptado de Santos et
al., 2013)
Atualmente sabe-se que os vários componentes do SRA são encontrados em
diversos tecidos como rins, artérias, coração e sistema nervoso
21; 24
. Nos rins, os
componentes do SRA foram identificados de forma diferenciada na medula e
córtex renal. A Ang-(1-7), por exemplo, parece ocorrer predominantemente no
córtex, enquanto a Ang-II predomina na medula renal 21.
No coração a síntese e presença dos componentes do SRA sugerem a
produção local de peptídeos que modulam a estrutura e função cardíaca
21; 28
.A
Ang-II mostrou ser um importante mediador de fibrose cardíaca e hipertrofia
patológica na hipertensão renovascular modelo dois rins, um clipe (2R1C), sendo
o
desequilíbrio
entre
Ang-II/Ang-(1-7),
NO/EROs
a
chave
para
lesão
cardiovascular nesse modelo experimental de hipertensão 29.
No encéfalo foi confirmada, por técnicas de biologia molecular, a presença de
componentes do SRA
30
. A Ang-II produzida pela renina cerebral promove
diferentes efeitos fisiológicos no sistema circulatório, dependendo da área
encefálica. Os componentes do eixo ECA2/Ang-(1-7)/Mas também foram
identificados no tecido nervoso
31
. O SRA cerebral está associado a modulação
da neurotransmissão, secreção de vasopressina e atividade do sistema nervoso
18
simpático
26
. O receptor AT1 está presente em diversos tecidos inclusive nas
áreas encefálicas responsáveis pelo controle cardiovascular como o CVLM,
RVLM e hipotálamo 26; 31.
Em ratos com hipertensão renovascular 2R1C, foi observado que a Ang-(1-7)
está, em parte, envolvida com melhora da sensibilidade do barorreflexo. Esses
dados foram observados em ratos 2R1C, previamente tratados com inibidor da
ECA, submetidos à infusão intracerebroventricular do antagonista da Ang-(1-7), o
A-779 32.
Nos rins, o alto nível de Ang-II está associado ao estresse oxidativo, aumento
da expressão de citocinas proinflamatórias e de genes associados com fibrose
túbulo-intersticial. Contudo, o tratamento com ECA2 reduziu as respostas
mediadas pela Ang-II, mostrando que a Ang-(1-7) apresenta efeito renoprotetor 33.
Tem sido descrito que o eixo ECA/Ang-II/AT1 do SRA está envolvido em
diversas lesões de órgãos e tecidos, como o coração, rins, artérias e tecido
nervoso. Porém, mecanismos contra-regulatórios como o eixo ECA2/Ang-(17)/Mas do SRA atuam em diferentes estados patológicos.
1.2 Modelo experimental de hipertensão renovascular dois rins, um clipe
(2R1C) de Goldblatt
Diversos são os modelos experimentais usados para investigar o mecanismo
fisiopatológico envolvido no desenvolvimento e manutenção da HA, no estudo de
novas terapias e sua profilaxia
34; 35
. A hipertensão renovascular de Goldblatt
(2R1C) caracteriza-se por mecanismo fisiopatológico onde inter-relações
hormonais e neurais estão envolvidas no desenvolvimento e manutenção da
hipertensão
19; 34
. A hipertensão modelo 2R1C é induzida com a implantação
cirúrgica de um clipe de prata em umas das artérias renais, promovendo redução
do fluxo sanguíneo para o rim correspondente (rim clipado) e, assim ativando o
SRA e SNS. Classicamente, o desenvolvimento da hipertensão 2R1C envolve
modificações no SRA, e pode ser descrito em três fases (Figura 2), de acordo
com Martinez-Maldonado (1991).
A fase 1 (1 a 4 semanas após implantação do clipe) da hipertensão 2R1C é
descrita
como
renina-angiotensina
hiperatividade do SRA
dependente,
pois
é
mediada
pela
19
. Imediatamente após a implantação do clipe na artéria
19
renal esquerda ocorre aumento da secreção de renina, da atividade da renina
plasmática, dos níveis sistêmicos de Ang-II e aumento da PA
retenção de água e sódio não é proeminente nessa fase
36; 37
. Contudo, a
19
. Administração de
inibidores da ECA ou de bloqueadores de AT1 promove redução da PA,
evidenciando o papel da Ang-II na manutenção da HA
19
. Além do aumento da
Ang-II circulante na fase 1, também ocorre aumento do tônus simpático, onde
podemos observar redução da PA após desnervação renal em ratos 2R1C
38
.A
partir da terceira ou quarta semana após a cirurgia, observa-se também atrofia do
“rim clipado” e hipertrofia do rim “não clipado” 19.
A fase 2 (5 a 8 semanas após implantação do clipe) a Ang-II induz a retenção
de sódio e água, ocorre estímulo da produção de aldosterona pela zona
glomerular da glândula supra-renal, vasoconstrição das arteríolas eferentes dos
glomérulos, estimulação nervosa do centro da sede e secreção do hormônio
antidiurético que irão promover aumento da ingestão de água, retenção e
expansão do volume plasmático 19. Esta fase está associada com retenção de sal,
aumento da resistência vascular periférica e da PA, como conseqüência da
redução do fluxo plasmático renal e da taxa de filtração glomerular 19.
Após a quarta semana da cirurgia 2R1C ocorre aumento da atividade da ECA
tecidual, especificamente na aorta, coração, rins e pulmões, enquanto a atividade
da ECA plasmática aumenta até a quarta semana e permanece estável até a
décima segunda semana
39
. O aumento da atividade da ECA tecidual ocorre
concomitante com a elevação da PA e está relacionado com hipertrofia cardíaca,
possivelmente devido ao efeito da Ang-II como promotora
39
. Desta forma, os
níveis teciduais elevados de Ang-II e renina, mesmo com seus níveis plasmáticos
normalizados, são responsáveis pela hipertensão nesta fase
40
.
Na fase 3 (>9 semanas após implantação do clipe), a PA permanece elevada
em comparação com a fase 1 mesmo com redução da atividade da renina
plasmática e dos níveis circulantes de Ang-II. Nessa fase, mesmo com remoção
do clipe ou administração do inibidor ECA não ocorre redução dos níveis
pressóricos (Figura 2) 19.
Desta forma, podemos observar que a resposta fisiológica do organismo do
animal submetido à cirurgia 2R1C varia de acordo com o tempo e
desenvolvimento da HA. Até 4 semanas, a hipertensão é renina-angiotensina
20
dependente, com altos níveis circulantes de Ang-II e ECA, enquanto após a
quarta semana, ocorre aumento dos níveis teciduais de Ang-II e ECA.
Figura 2. Esquema mostrando as fases da hipertensão renovascular 2R1C. O eixo Y representa o
tempo de desenvolvimento da hipertensão em semanas: Fase 1 com duração aproximada de 4
semanas; Fase 2 se estende da quinta a oitava semana; Fase 3 é considerada após a nona
semana. O eixo X representa a pressão arterial em mmHg. 1 valor de pressão arterial normal. (a)
pré-tratamento com inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA) impede o
desenvolvimento da hipertensão induzida pela cirurgia. Sem inibição da ECA ocorre aumento
expressivo da pressão arterial com aumento da atividade da renina plasmática e da concentração
de Ang-II circulante. (b) inibição da ECA ou remoção do clipe entre o sétimo e décimo dia da fase
2 promove rápida redução da pressão arterial ao valores de pressão da fase 1. Durante a fase 2, a
pressão arterial pode permanecer estável (c) ou continuar a subir (d) mesmo com diminuição da
atividade da renina plasmática. Na fase 3 a pressão arterial permanece elevada em relação a fase
1, (e) ocorre diminuição da atividade da renina e plasmática e da Ang-II circulante e, mesmo com
remoção do clipe ou administração do inibidor da ECA (f) não ocorre redução da pressão arterial,
permanecendo igual à fase 2. Ang-II, angiotensina II. Inib. ECA, inibidor da enzima conversora de
angiotensina. (Adaptado de Martinez-Maldonado, 1991).
1.3 Controle central da pressão arterial
O fator neurogênico da HA envolve uma série de alterações fisiológicas e
bioquímicas nas regiões reguladoras da função cardiovascular no sistema
nervoso autônomo (SNA), como barorreceptores, quimiorreceptores, receptores
renais aferentes, ou em circuitos e núcleos centrais que induzem a resposta
autonômica 4; 41; 42.
21
Os barorreceptores controlam a PA em curto prazo, momento a momento. A
estimulação dos barorreceptores promove redução da atividade do sistema
nervoso simpático, aumento da atividade do sistema nervoso parassimpático e,
4; 43
consequentemente redução da PA
. Os quimiorreceptores atuam através da
detecção de hipóxia e hipercapnia, resultando em hiperventilação, ativação do
sistema nervoso simpático e aumento da PA 43; 44.
As primeiras sinapses centrais dos baro e quimiorreceptores ocorrem no NTS,
tornando-o assim um importante centro integrador do controle cardiovascular 4. O
NTS mantém projeções eferentes para diferentes áreas envolvidas no controle da
função cardiovascular
45
como a área depressora CVLM, que mantém sinapses
inibitórias ascendentes com a área pressora RVLM, através de conexão
GABAérgica 45; 46. Existe também projeção neuronal do NTS para o RVLM através
de conexão glutamatérgica direta 47.
Como já mencionado, o CVLM caracteriza-se como uma região depressora e
importante para a modulação do barorreflexo, por atenuar a atividade pressora do
RVLM e, também por ativar o sistema nervoso parassimpático através de
projeções com o núcleo ambíguo
45; 47; 48
. O SRA pode influenciar o CVLM de
várias formas, como ocorre no modelo 2R1C. A Ang-II, por exemplo, induziu efeito
hipotensor quando microinjetado no CVLM, sendo esse efeito inibido pela
losartana (antagonista de AT1) e PD123319 (antagonista de AT2) tanto em ratos
normotensos como em hipertensos (2R1C) 49.
O RVLM apresenta neurônios eferentes que mantêm sinapses com os
neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula espinal. Diversas áreas
encefálicas modulam a ativação do tônus simpático do RVLM além do CVLM e
NTS, como a área tegumentar lateral, núcleo paraventricular do hipotálamo
(PVN), formação reticular pontina e área pressora caudal 45.
O mecanismo pelo qual a Ang-II influencia na atividade do RVLM também
envolve conexões com a área postrema com regiões do bulbo e hipotálamo. A
Ang-II circulante, através da área postrema (área desprovida de barreira hematoencefálica) modula o tônus simpático, via conexão direta ou indireta com o RVLM
45; 50
.
Estudos mostram que a Ang-II exerce efeito hipertensor no RVLM. A Ang-II
quando microinjetada diretamente no RVLM aumenta a PA em animais
anestesiados, enquanto o antagonista da Ang-II ou inibidor da ECA reduz a PA e
22
a atividade simpática
45; 51
. Foi observado também que em ratos 2R1C, o RVLM
apresentou maior expressão do receptor AT1 14.
A complexidade do SNA vai além do que está apresentado neste trabalho.
Novos elementos reguladores da função neural tem sido descritos, como os
componentes do eixo ECA2/Ang-(1-7)/Mas 21, NO e ROSs 9.
1.4 Envolvimento do óxido nítrico no controle da função cardiovascular
Na década de 80, foi demonstrado que o relaxamento vascular induzido pela
acetilcolina era dependente do endotélio e, ficou evidente que esse efeito era
mediado por um fator humoral lábil, o fator de relaxamento dependente do
endotélio
52
. Em 1987, foi descoberto que o fator de relaxamento derivado do
endotélio era o NO
53
. Com base nos seus diversos efeitos fisiológicos e
possibilidades terapêuticas para doenças cardiovasculares, o NO foi escolhido a
molécula do ano de 1992 pela revista Science 54.
NO é um gás que desempenha várias funções fisiológicas e de sinalização
celular em diferentes tecidos, incluindo no sistema nervoso
55; 56
. No sistema
circulatório, o NO exerce importante papel na função cardíaca e endotelial como
vasodilatação
29
, prevenção de adesão de plaquetas, exerce ação antiinflamatória
e proteção contra aterosclerose 7. A ação vasodilatadora do NO envolve a
geração
de
guanosina
3’,5’-monofosfato cíclico
(cGMP) dependente da
modulação de canais iônicos de Ca2+ e K+ 56.
O estresse de cisalhamento do fluxo sanguíneo no endotélio vascular (shear
stress) e mediadores químicos como acetilcolina, bradicinina, substância P,
estimulam a produção de NO a partir da L-arginina (L-arg) numa complexa reação
catalisada pelas enzimas sintetizadoras de NO, as óxido nítrico sintases (NOSs)
29
. As NOSs catalisam a oxidação da L-arginina em NO e L-citrulina, num
processo que exige NADPH e co-fator BH4 (tetrahydrobiopterin), tendo O2 como
substrato 56.
Três isoformas de NOS são conhecidas: neuronal (nNOS ou NOS I), induzível
(iNOS ou NOS II) e endotelial (eNOS ou NOS III)
55; 56
. Uma quarta isoforma,
variação da nNOS, encontrada na membrana mitocondrial é descrita como óxido
nítrico sintase mitocondrial (mtNOS)
56
. Essas isoformas são proteínas
homodiméricas com subunidades de 125 a 160 kDa, em que cada subunidade
23
consiste em dois domínios: um domínio oxigenase ou heme N-terminal, que
catalisa os passos da reação. Esse domínio liga os substratos O2 e L-arginina e
os dois grupos prostéticos redox, Fe(III)-heme e BH4. O outro domínio é redutase
C-terminal, que fornece os elétrons para reação catalisada pela NOS. Desta
forma a NOS precisa do BH4 para produzir NO. Na ausência desse co-fator, a
NOS catalisa de maneira eficiente a oxidação de O2, mediada pela NADPH
56; 57;
58; 59
. Quando a NOS está “desacoplada” (NOS uncoupled) os elétrons fluem do
domínio redutase para o heme e são desviados para o oxigênio molecular em vez
da L-arginina, resultando na formação de anion superóxido. O principal
mecanismo responsável pelo desacoplamento das NOS é a deficiência do BH 4 60.
A síntese de NO ocorre numa grande variedade de células, como nos
neurônios, células endoteliais e macrófagos. A nNOS está presente nos neurônios
56; 61
, túnica adventícia de vasos cerebrais, cardiomiócitos, miócitos, pulmão,
corpo cavernoso entre outros
atividade regulada pelo Ca2+
56
sendo constitutivamente expressa com sua
61
. A eNOS também é constitutivamente expressa e
dependente de Ca2+ sendo presente no endotélio vascular
61
astrócitos, medula óssea, cardiomiócitos, hepatócitos e outros
56
, neurônios,
. A iNOS é
independente de Ca2+ e sua expressão é induzida por macrófagos, astrócitos e
micróglias, seguida de estimulação imunológica ou inflamatória
56; 61
. A iNOS pode
ser encontrada em hepatócitos, células endoteliais, músculo vascular, fígado, rins
56
e no encéfalo 62.
Na célula, o NO atua como mensageiro intracelular, difundindo-se
rapidamente e influenciando alvos específicos. Contudo, diversas células de
vários tecidos produzem NO e, no tecido nervoso, podem influenciar neurônios
em diferentes e extensas regiões do sistema nervoso central (SNC)
56; 61
. Os
efeitos fisiológicos do NO no SNC são observados nos vasos, células da glia e
nos neurônios. Seus efeitos são dependes da síntese de cGMP, via ativação de
guanilato ciclase (GC) 56; 61.
Além do efeito dependente de cGMP, o NO modula a atividade neuronal em
vias independentes, como a reação de NO com ânion superóxido (O2-)
resultando na formação de peroxinitrito (ONOO) e subseqüente nitração e
oxidação de proteínas
61
. Todas as isoformas de NOS têm potencial para produzir
O2-, porém a iNOS é a que tem maior potencial devido a depleção de L-arginina
durante a inflamação
61
. A produção de O2- pela nNOS ocorre quando o receptor
24
de glutamato é estimulado e o influxo de cálcio para a célula é prolongado
56
.A
reação do NO com o O2- é rápido o suficiente para evitar a ação de antioxidantes,
formando assim o ONOO 56.
No tronco encefálico, neurônios que reagem ao NO são encontrados no NTS,
CVLM e RVLM
63
. Sendo o papel do NO e das NOS, especialmente no RVLM,
altamente complexo e variável. No hipotálamo, o PVN e núcleo supra-óptico
(SON) apresentam produção de NO pelos neurônios parvocelulares e
magnocelulares. Os neurônios parvocelulares que produzem NO são encontrados
na mesma região que apresenta projeções nervosas para o tronco encefálico e
medula espinal, indicando as vias em potencial nas quais o NO influencia o
sistema nervoso autônomo 63.
No RVLM, todas as isoformas de NOS estão presentes, porém, apresentam
diferentes funções na atividade nervosa simpática
64
. Evidências sugerem que a
sinalização do NO no RVLM é dependente da via GC/cGMP, pois a microinjeção
de azul de metileno (inibidor da GC) atenuou o efeito pressor induzido por doador
ou precursor de NO 64; 65.
A ação do NO no RVLM é contraditória. Estudos têm relatado que o NO
derivado da nNOS, no RVLM, promove aumento da atividade simpática via
ativação da transmissão glutamatérgica, enquanto que o NO derivado da iNOS
promove diminuição da atividade simpática via estimulação da transmissão
GABAérgica 64; 66. Sendo a atividade da nNOS mais prevalente que a da iNOS em
condições fisiológicas
62; 64
. Contudo, em ratos espontaneamente hipertensos
(SHR), o NO derivado da eNOS apresentou ação inibitória sobre o RVLM, pois a
transfecção de adenovirus codificado com eNOS resultou em simpatoinibição e
resposta depressora, possivelmente envolvendo ativação GABAérgica
67
.
Na insuficiência cardíaca, a redução da nNOS e dos níveis de NO no RVLM
contribuiu para aumento da atividade simpática
68
. Enquanto o aumento da
expressão de nNOS no RVLM promoveu inibição simpática em animais SHR 64.
Em relação à expressão da iNOS os dados da literatura são discordantes. Foi
observado em ratos normotensos que o aumento da expressão de iNOS esteve
associado com aumento da PA
64
, enquanto ratos com hipertensão 2R1C
apresentaram maior expressão da iNOS, o que poderia estar envolvido na
ativação do RVLM, pois houve redução da PA após microinjeção do inibidor da
iNOS (aminoguanidina) 14. Entretanto, outro estudo sugere que a baixa atividade e
25
expressão da iNOS no RVLM estão envolvidos no aumento da atividade simpática
em animais SHR 69.
Dados da literatura sugerem que a ação (excitatória ou inibitória) do NO no
RLVM é variável devido ao modelo experimental, tipo e dose do doador ou
precursor do NO utilizado
64; 70
. Baixas doses de doador ou precursor de NO no
RVLM aumentaram a PA e atividade simpática, enquanto altas doses tiveram
efeitos opostos em ratos
70
. Microinjeção de L-arg no RVLM, nas concentrações
de 1 e 10 nmol/50nL promoveram aumento da PAM em ratos normotensos.
Enquanto a microinjeção na concentração de 50 nmol/50nL induziu resposta
70
depressora
. A microinjeção bilateral no RVLM do inibidor não específico para
NOS, o NG-nitro-L-arginina-metil-ester (L-NAME; 10 nmol/50nL) induziu redução
da PA, em contraste, a microinjeção unilateral de L-NAME não promoveu
resposta
70
. Por outro lado, outro estudo mostrou que em ratos normotensos a
microinjeção de L-arg, nas concentrações de 5, 24 e 140nmol, promoveu aumento
gradual da PA 65.
O SRA também parece influenciar a atividade do NO no RVLM. A Ang-II ativa
os receptores AT1 no RVLM promovendo aumento da atividade simpática via
ativação glutamatérgica, o que pode estar envolvido no fator neurogênico da
hipertensão. Enquanto o NO mostrou ser capaz de diminuir a formação de Ang-II
em diversas áreas do bulbo 64.
Podemos então observar que a função do NO no RVLM ainda não está
esclarecida, pois diversos estudos apontam resultados divergentes. Sendo que
em ratos com hipertensão 2R1C, os resultados são ainda insuficientes para
esclarecer o verdadeiro papel do NO no controle central da função cardiovascular.
1.5 Estresse oxidativo na hipertensão arterial
Estresse oxidativo é um desequilíbrio entre a geração de compostos
oxidantes e a atuação do sistema antioxidante. A geração de radicais livres
constitui um processo contínuo e fisiológico. Durante diversos processos
metabólicos, os radicais livres atuam como mediadores para a transferência de
elétrons nas reações bioquímicas
71
. A produção em proporções apropriadas
possibilita a geração de ATP, ativação de genes e participação nos mecanismos
26
de defesa durante infecção. Contudo, a produção exagerada de radicais pode
conduzir a danos oxidativos em diferentes órgãos e tecidos 72.
A instalação do estresse oxidativo decorre da geração aumentada de radicais
livres (compostos oxidantes) ou em detrimento da velocidade de remoção desses
pelos compostos antioxidantes. Esse processo conduz a oxidação de moléculas
com conseqüente perda de suas funções biológicas, cuja manifestação é o dano
oxidativo contra tecidos 72.
A geração de radicais livres ocorre, de forma geral, nas mitocôndrias (por
meio da cadeia transportadora de elétrons), membranas celulares e no
citoplasma. Tais mecanismos podem ser catalisados pelos íons ferro e cobre. O
oxigênio (O2), na mitocôndria, por ação do citocromo oxidase, sofre redução
tetravalente, com recepção de quatro elétrons, resultando na formação de água.
A ação do citocromo oxidase controla a geração de radicais livres, impedindo a
produção excessiva na mitocôndria. Entretanto, cerca de 2 a 5% do oxigênio
metabolizado nas mitocôndrias são desviados para outras vias moleculares, e
reduzidos de forma univalente, dando origem aos radicais livres 72.
Como conseqüência da redução univalente do O 2, são gerados os radicais
O2, hidroxila (OH) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Apesar do H2O2 não ser um
radical livre, é uma espécie com alto potencial reativo, além de participar da
formação do radical OH. O radical O2 participa das reações de geração de OH,
e, também pode gerar o radical livre óxido nítrico (NO) e consequentemente
gerar ONOO, também potencialmente reativo. Outras importantes enzimas
geradoras de radicais livres são as NADPH oxidases (nicotinamide adenine
dinucleotide
phosphate
monooxigenase,
oxidases),
lipoxigenase
e
NOS
xantina
oxidase,
73
NADPH
.
A
citocromo
é
uma
p450
proteína
transmembrana que tem função de transferir elétrons através das membranas
celulares capaz de gerar OH e O2. Ela é composta por duas subunidades
ligadas à membrana (p22phox e gp91phox), por três subunidades citoplasmáticas
(p40phox, p47phox e p67phox) e pela proteína G Rac 1 74.
Normalmente, o aceptor de elétrons é o oxigênio e, desta forma, gera-se O2
72
. Em situações patológicas, como na HA, o co-fator da NOS, o BH4, pode ser
oxidado para dihydrobiopterin (BH2). Neste caso, a NOS irá produzir O2 além de
NO 75.
27
O sistema de defesa antioxidante pode ser classificado em não-enzimático
(inclui compostos antioxidantes de origem dietética) e enzimático. O sistema
enzimático inclui as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e
glutadiona peroxidase (GPx). Essas enzimas agem impedindo ou controlando a
formação de radicais livres e espécies não-radicais
72
. Em condições fisiológicas,
o O2 que é produzido combina com a SOD que o dismuta em H 2O2 que será
metabolizado em H2O pela ação da CAT e GPx 72; 75.
A principal defesa contra O2 e ONOO é o grupo das SODs. Em mamíferos
existem três isoformas de SOD (SOD1 ou Cu/ZnSOD; SOD2 ou MnSOD; SOD3
ou ecSOD), cada uma delas são produtos de genes distintos e estão em locais
diferentes da célula, mas catalisam a mesma reação
73
. A localização distinta das
isoformas das SODs é particularmente importante, pois segmenta a sinalização
redox na célula. O mecanismo de dismutação do O 2 pela SOD envolve a
atividade de metais de transição, indicando que a atividade da SOD requer um
metal catalisador como cobre (Cu), zinco (Zn) e manganês (Mn)
73
. O local de
atividade da Cu/ZnSOD é no citoplasma, espaço intermembrana da mitocôndria e
lisossomos. A MnSOD atua na matriz mitocondrial e a ecSOD na matriz
extracelular, superfície celular e fluídos extracelulares
73
.
As enzimas GPx e CAT agem, de forma integrada, impedindo o acúmulo de
H2O2. Essa ação é importante uma vez que o H2O2 com participação do ferro e
cobre, resulta na geração do radical OH, contra o qual não há sistema
enzimático de defesa. O OH é o principal indicador de peroxidação lipídica, tendo
como conseqüência a alteração da função biológica das membranas celulares,
alteração de proteínas, culminando na disfunção biológica
72
. Outras enzimas
também são conhecidas como sistema de defesa contra H 2O2 como
peroxiredoxinas e tioredoxina redutase 76.
O fato da produção excessiva de OH ser altamente danosa ao organismo, a
ação das enzimas antioxidantes é fundamental para equilibrar o sistema. Desta
forma, a GPx se destaca, uma vez que sua ação depende da manutenção do
ciclo redox da glutadiona, por meio do controle da relação entre glutadiona
reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) 72.
Quando a produção de radicais livres ou espécies reativas supera a
capacidade de ação dos antioxidantes, favorece-se a oxidação de moléculas,
gerando marcadores de estresse oxidativo, que podem ser identificados e
28
quantificados. Os marcadores de estresse são derivados, principalmente, da
oxidação de lipídeos, proteínas e DNA. Outra forma de verificar o estresse
oxidativo é empregando métodos indiretos, baseados na capacidade antioxidante.
Os malondialdeídos (MDA) são produtos da oxidação de lipídeos, que podem ser
quantificados pelas técnicas de TBARS (thiobarbituric reactive acid substances)
77
. Um estudo clínico mostrou que homens hipertensos apresentavam níveis de
MDA elevados, por outro lado, os níveis de antioxidantes estavam elevados no
grupo controle. Esse estudo mostrou que o status de antioxidantes totais tinha
significativa correlação negativa com PA
78
. Outros marcadores de dano oxidativo
são derivados da oxidação de proteínas como carbonilos e 3-nitrotirosina, e
derivados da oxidação de DNA como 8-OHdg (prostaglandin F2-Alfa-8
Isoprostane) e 5-HMdU (5-hidroxymetil-2´-desoxyuridine) 72.
Diversos estudos mostram que no quadro de hipertensão experimental,
ocorre aumento do estresse oxidativo sistêmico e em órgãos específicos como no
cérebro
79; 80
e nos rins
81
. Na hipertensão induzida pela infusão crônica de Ang-II,
foi demonstrado o aumento da expressão de Nox 1, gp91phox e p22phox que são
subunidades da NADPH oxidase.
Aumento da produção de EROs nos rins pode desenvolver hipertensão. Foi
observado que camundongos knockout para SOD apresentaram maior nível de
PA comparados com grupo controle. O desenvolvimento da HA esteve associado
com aumento da produção de O2 e inativação do NO nos vasos dos rins 82; 83.
A geração de EROs também está associada com doenças cardiovasculares
como insuficiência cardíaca
84
. Um estudo mostrou relação direta entre geração
de EROs, falência do miocárdio e alterações hemodinâmicas, especificamente via
geração de OH no quadro de insuficiência cardíaca
84
. Redução das defesas
antioxidantes como SOD, catalase e GPx ou redução da concentração de
antioxidantes endógenos como vitamina E, vitamina C e glutadiona aumentam os
níveis de EROs nos quadros de falência cardíaca subseqüente ao infarto do
miocárdio
84
. Contudo, o estresse oxidativo na falência cardíaca pode ser um
quadro primário por conta da geração de EROs em vez do declínio das defesas
antioxidantes no coração
84
. Em ratos com hipertensão 2R1C, um estudo mostrou
que houve remodelação cardíaca associada com estresse oxidativo. Ratos 2R1C
apresentaram hipertrofia ventricular associada com aumento de TGF-β e fibrose
85
.
29
As artérias muitas vezes são os principais alvos dos danos promovidos pela
hipertensão, principalmente devido à reação inflamatória induzida pela doença. A
inflamação crônica pode ativar a produção de EROs, o que também está
associado com a HA
86
. A inflamação é a primeira resposta imune para eliminar
patógenos ou reparar dano no tecido. Células do sistema imunológico, como
neutrófilos e macrófagos produzem EROs na tentativa de eliminar o patógeno.
Contudo, o processo inflamatório contínuo, como pode ocorrer na hipertensão
arterial, pode levar a produção excessiva de EROs. Na hipertensão arterial o
estresse oxidativo é a principal causa de disfunção endotelial, primariamente
através da redução de NO, devido a sua reação com superóxido resultando na
formação de ONOO
86
. É conhecido que o aumento do O2 na vasculatura
impede a ação vasodilatadora do NO, promovendo contração da musculatura lisa
vascular e proliferação de células inflamatórias 87.
A ação de compostos antioxidantes também está diretamente relacionada
com o estímulo produzido pelos compostos oxidantes, onde pequeno estímulo
como baixas concentrações de EROs são capazes de induzir a expressão de
enzimas antioxidantes e outros mecanismos de defesa
88
. A base desse
fenômeno é explicada pelo conceito de hermose, caracterizada pela relação doseresposta, onde baixas doses de determinada substância são estimuladoras
enquanto altas doses são inibitórias 88.
Apesar dos comprovados efeitos deletérios promovidos pelos radicais livres
em diferentes tecidos, não está totalmente claro, qual a participação de
compostos
oxidantes
e
antioxidantes
nas
áreas
centrais
de
controle
cardiovascular de ratos com hipertensão 2R1C. Estresse oxidativo pode ser
considerado a causa ou conseqüência da HA. Em órgãos reguladores da PA, o
estresse oxidativo apresenta papel crucial no desenvolvimento da HA.
1.6 Efeito do exercício físico sobre a função cardiovascular
O exercício físico regular apresenta comprovados benefícios para a saúde,
sendo indicado como medida preventiva para diversas doenças cardiovasculares,
como a HA 89; 90. Diversos tipos de exercícios promovem redução da PA, sendo os
aeróbios (combinados ou não com exercícios resistidos) de intensidade moderada
os mais efetivos 91.
30
Exercícios aeróbios reduzem a PA em indivíduos com pressão normal e em
hipertensos, porém essa redução é mais pronunciada nos hipertensos. A resposta
diferenciada entre os indivíduos pode ser explicada pelo tipo de EX, freqüência,
intensidade e tempo
89
. Apenas uma sessão de exercício também promove
redução da PA em indivíduos hipertensos. Esse efeito agudo do EX é
denominado hipotensão pós-exercício, que pode perdurar por até 20 horas
hipotensão
pós-exercício
deve
ser
considerada
mesmo
nos
89
.A
estudos
experimentais com exercício crônico. Como o efeito pode durar quase dois dias
após a última sessão de EX, algumas análises experimentais devem ser feitas
após esse período, a fim de se evitar os efeitos agudos do EX.
Segundo recomendações do American College of Sports Medicine
89
, para
redução da PA, a freqüência ideal é entre 3 a 5 vezes por semana, com
intensidade moderada (40 – 60% do VO2 de reserva), o tempo de duração deve
ser de no mínimo 30 minutos e o tipo de EX deve ser o aeróbio podendo ser
suplementado pelo exercício de resistência
89
. Segundo dados do nosso
laboratório, ratos com hipertensão 2R1C que praticaram natação (com e sem
carga) por 5 semanas, 5 dias por semana, 60 minutos diários tiveram redução da
PA e da FC, quando comparado com ratos 2R1C sedentários 92.
O efeito agudo do EX sobre a PA ocorre devido à vasodilatação nos músculos
previamente exercitados e diminuição da atividade nervosa simpática
89; 93; 94; 95
.
Contudo, o efeito crônico do EX é que está envolvido com o controle da PA em
longo prazo. Importantes adaptações hemodinâmicas, estruturais e autônomas
são promovidas pelo EX regular, mesmo em condições patológicas
89; 96
. Entre as
adaptações do EX incluem redução da atividade do sistema nervoso simpático,
aumento da atividade do sistema nervoso parassimpático, aumento do NO
vascular, aumento das enzimas antioxidantes, redução da Ang-II em diversos
tecidos, entre outros que serão descritos a seguir.
Alterações estruturais no sistema circulatório em resposta ao EX aeróbio como
remodelamento
vascular,
angiogênese
e
hipertrofia
cardíaca
contribuem para a redução da resistência vascular periférica e da PA
fisiológica
89
. Redução
da resistência vascular mediada pelo EX também envolve adaptações neurohumorais, estruturais e alterações na responsividade vascular a estímulos
vasoativos. Redução da atividade nervosa simpática ou influência de estímulos
vasodilatadores (como o NO) são exemplos de mudanças neurais que promovem
31
redução da resistência vascular e da PA
89
. Um estudo de Graham e Rush (2004)
mostrou que o EX melhora a atividade do NO como mediador da vasodilatação do
músculo liso vascular, possivelmente por induzir o aumento de eNOS e
diminuição de compostos oxidantes 97.
A hipertrofia cardíaca ocorre em resposta a situações que envolvem aumento
do metabolismo, da PA, do volume ou ambos, como EX, gestação e HA. O EX
(aeróbio, sem carga) induz hipertrofia cardíaca excêntrica (fisiológica), com
crescimento longitudinal dos cardiomiócitos. Enquanto a HA, associada ao
sedentarismo, promove hipertrofia cardíaca concêntrica (patológica) e fibrose
cardíaca
98
. Dados do nosso laboratório mostraram que ratos hipertensos 2R1C
submetidos a natação sem carga apresentaram redução do número de células
inflamatórias e redução na deposição de colágeno no coração, em comparação
com ratos 2R1C sedentários 92.
Quanto aos efeitos do EX sobre o SRA, foi observado redução dos níveis de
renina, Ang-II e ECA em SHR, sendo esses efeitos não observados em ratos
normotensos
99
. Em ratas, foi observado que o EX regular, do tipo natação,
promoveu redução da ECA e Ang-II e aumento da ECA2 e Ang-(1-7) no miocárdio
100
.
Por outro lado Silva e colaboradores (2011), mostraram que os animais SHR
que nadaram por 8 semanas (com carga) apresentaram maior expressão do
receptor Mas na artéria aorta
101
. Possivelmente um mecanismo capaz de
aumentar o efeito vasodilatador da Ang-(1-7). Também foi observado que o LNAME reduziu o efeito vasodilatador da Ang-(1-7), o que sugere a interação do
NO com Ang-(1-7) na vasodilatação. Esse efeito foi observado em anéis de aorta
que foram tratados com acetilcolina e Ang-(1-7)
101
. Esses dados, em conjunto,
mostram que o EX induz adaptações cardíacas benéficas, tanto por reduzir a
atividade do eixo ECA/Ang-II/AT1, como por aumentar a atividade do eixo
ECA2/Ang-(1-7)/Mas.
No SNC, estudos sugerem que o controle motor e autonômico apresentam
interações essenciais para a regulação cardiovascular durante EX, como aumento
do débito cardíaco e da PA
102; 103
. Foi demonstrado por Kerman e colaboradores
(2003 e 2006) que áreas bulbares, pontinas e hipotalâmicas apresentam
neurônios simpato-motores
102; 103
. Um grande número desses neurônios foi
observado no RVLM, mostrando que essa área é influenciada também por
32
estímulos motores
103
. Considerando que áreas centrais relacionadas com a
função cardiovascular participam das respostas pressóricas durante o EX,
podemos predizer que as adaptações promovidas pelo EX modulam esses
neurônios, especialmente no RVLM, contribuindo para redução da PA.
O EX regular promove plasticidade neural e angiogênese em áreas
específicas do SNC, promovendo melhora da memória e cognição, que são
funções associadas com alterações no número, estrutura e função de neurônios
104
. Nas áreas encefálicas envolvidas com o controle cardiovascular o EX também
promove alterações importantes. O RVLM recebe várias projeções (diretas ou
indiretas) de receptores musculares que são ativados pelo EX. Entre os
neurotransmissores do RVLM, o glutamato parece estar envolvido na resposta
cardiovascular induzida pelo EX
105
. Ratos sedentários apresentaram maior
resposta simpatoexcitatória devido à ativação glutamatérgica no RVLM. Em
relação à transmissão GABAérgica, os dados são inconclusivos sobre sua
participação no RVLM de animais exercitados e sedentários 105.
Em SHR foi observado modificações neuronais, promovidas pelo EX, no
hipotálamo associadas com redução da PA, restauração da transmissão
GABAérgica e alterações na atividade das NOS
106
. Em ratos com insuficiência
cardíaca, o EX restaurou os níveis de nNOS no PVN. Expressão de nNOS no
PVN aumentaram em ratos exercitados, quando comparados com sedentários.
Esses dados sugerem que a inibição simpática associado com o EX regular em
ratos com insuficiência cardíaca pode ser devido, em parte, às alterações nos
níveis de nNOS no PVN 107.
Dados não publicados do nosso laboratório (Maia et al.) mostraram que ratos
2R1C sedentários apresentaram níveis elevados de PAM, redução da
sensibilidade da bradicardia reflexa, aumento de células inflamatórias, aumento
do diâmetro de cardiomiócitos, deposição de colágeno e hipertrofia cardíaca
concêntrica. Contudo, ratos 2R1C submetidos ao EX por até 4 semanas, reduziu
PAM, aumentou a sensibilidade da bradicardia reflexa, reduziu deposição de
colágeno e preveniu a hipertrofia concêntrica. Além disso, reduziu a deposição de
colágeno nos rins. Após 6 semanas de EX, apesar dos níveis de PAM e
sensibilidade da bradicardia reflexa nos ratos 2R1C exercitados serem similares
aos 2R1C sedentários, o EX induziu efeitos benéficos sobre a morfologia renal e
cardíaca, como aumento do diâmetro de cardiomiócitos e diminuição da
33
deposição de colágeno, para valores similares aos ratos normotensos
sedentários. Em síntese, esse estudo mostrou que o EX realizado por até 10
semanas, com volume, freqüência e intensidade constante induz benefícios
distintos na função cardiovascular e estrutura renal e cardíaca em ratos 2R1C.
Além disso, foi sugerido que a sexta semana representa um momento de
transição em que os fatores hipertensivos superam os efeitos benéficos do EX (de
intensidade constante) sobre a função cardiovascular.
O exercício também apresenta importante efeito antioxidante em diferentes
tecidos, especificamente os exercícios de intensidade moderada. São irrefutáveis
as evidências mostrando os benefícios do exercício moderado na prevenção de
doenças crônicas, como doenças cardiovasculares, hipertensão e obesidade
108
.
O exercício extenuante (principalmente se for esporádico) causa dano estrutural à
célula muscular, como ruptura da linha Z. Entretanto alguns desses danos são
devidos a produção de radicais livres
108
. O mecanismo pelo qual o exercício
promove aumento na geração de EROs não pode ser somente explicado pelo
aumento do consumo de oxigênio na mitocôndria. Um estudo mostrou que
aproximadamente 2% do oxigênio usado pela mitocôndria é convertido em EROs
somente no estado de repouso. Porém, quando a mitocôndria encontra-se
produzindo ATP a partir do ADP, a proporção de oxigênio convertido em EROs
reduz para cerca de um décimo do observado no estado de repouso 109. Com base
nessa informação, o papel da mitocôndria na formação de EROs durante o
exercício deve ser reconsiderada e, talvez, fontes alternativas de EROs devem
ser identificadas 108; 109.
Dados indicam que existem fontes extracelulares geradoras de EROs como a
xantina oxidase. Um estudo realizado com ciclistas competidores do Tour of
France de 2001, mostrou que os atletas que receberam alopurinol (um inibidor da
xantina oxidase) apresentaram menores níveis de malondialdeído no plasma ao
término da prova. Esse dado sugere que a xantina oxidase está envolvida no
dano tecidual associado com exercício físico de alta intensidade
110
.
Apesar dos diversos efeitos benéficos do EX para o controle da PA e sobre o
estado redox, ainda não está esclarecido se esses benefícios envolvem
alterações nas vias de NO e no estresse oxidativo no encéfalo e órgãos
periféricos de ratos com hipertensão renovascular.
34
2. Justificativa
A hipertensão arterial é considerada um dos principais problemas de saúde no
mundo, afetando cerca de 30% da população. Fatores como o sedentarismo
contribuem para o desenvolvimento da hipertensão, sendo o exercício físico
regular uma importante estratégia não farmacológica de controle e prevenção da
doença.
Alguns fatores fisiopatológicos estão atrelados à hipertensão como aumento
da atividade do sistema renina angiotensina e do estresse oxidativo em áreas
encefálicas reguladoras da função cardiovascular. O óxido nítrico (NO) também é
um fator determinante na função cardiovascular, pois participa do controle do
tônus arterial e do controle central do sistema nervoso autônomo.
Desta forma, o estudo da participação das EROs e NO no encéfalo é
fundamental para o entendimento da gênese e manutenção da hipertensão
arterial. Bem como a compreensão do papel do exercício físico sobre o estresse
oxidativo e NO no encéfalo e órgãos periféricos de animais hipertensos.
Apesar das evidências sobre os efeitos benéficos do exercício físico sobre a
hipertensão, o mecanismo pelo qual ele influencia o equilíbrio redox e a atividade
do NO no bulbo e em órgãos periféricos ainda necessita ser esclarecido.
Os estudos dos mecanismos pelos quais o exercício físico influencia os
parâmetros de NO, estresse oxidativo, pressão arterial e freqüência cardíaca são
imprescindíveis para o desenvolvimento de novas possibilidades terapêuticas na
hipertensão arterial.
Dessa forma, o presente estudo verificou o efeito do EX, natação sem carga
sobre a resposta pressórica induzida pela microinjeção de L-Arg no RVLM, bem
como a participação de EROs e enzimas antioxidantes no encéfalo, coração, rins
e aorta de ratos com hipertensão renovascular.
35
3. Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Verificar o efeito do exercício físico sobre a expressão de NOS e estado redox
no encéfalo, coração, rins e aorta de ratos com hipertensão renovascular.
3.2 Objetivos Específicos
Em ratos hipertensos (2R1C) e normotensos (SHAM), sedentários (SD) e
submetidos a exercício físico (EX):

Avaliar o efeito da microinjeção de L-arginina, um precursor de NO, e de LNAME, um inibidor não específico para NOS, no RVLM sobre a pressão
arterial média e freqüência cardíaca.

Avaliar modificações na expressão das isoformas de NOS (nNOS, iNOS e
eNOS) no RVLM.

Avaliar
modificações
na
expressão
das
enzimas
catalase,
MnSOD,
Cu/ZnSOD e p22phox no RVLM.

Mensurar os níveis das enzimas catalase e das substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico no RVLM, CVLM, hipotálamo, ventrículo esquerdo do coração,
artéria aorta e rins.
36
4. Metodologia
4.1 Animais
Foram utilizados ratos Fischer machos com aproximadamente 9 a 11
semanas de vida, pesando entre 150 e 200g, provenientes do Centro de Ciência
Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
Os animais foram acondicionados em caixas de polietileno com até quatro
animais por caixa, com livre acesso (ad libitum) a água e ração comercial para
roedores (Nuvilab). Os animais foram mantidos em ambiente com ciclo
claro/escuro de 12 horas. As caixas eram limpas a cada dois dias. Todo o
procedimento experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética (CEUA) da
Universidade Federal de Ouro Preto, protocolo n°.2012/20.
4.2 Cirurgia para o desenvolvimento da hipertensão renovascular
Para indução da hipertensão arterial foi utilizado o método descrito por
Goldblatt
34
, denominado dois rins, um clipe (2R1C). Os ratos foram submetidos
ao jejum de 12 horas, com livre acesso à água. O jejum de 12 horas promove um
esvaziamento temporário e parcial das alças intestinais, o que facilita o acesso
cirúrgico à artéria renal. No dia da cirurgia, os animais anestesiados com mistura
de quetamina (Syntec, LTDA) e xilazina (Divisão Vetbrands Saúde Animal)
(50mg/kg e 10mg/kg, ip, respectivamente), foram colocados em decúbito dorsal
em uma prancha cirúrgica e submetidos à tricotomia e assepsia (álcool iodado
2%) da região abdominal. Em seguida foi realizada uma incisão de 3 a 5 cm
caudal
às
últimas
costelas
esquerdas.
Afastadores
foram
colocados
bilateralmente na incisão cirúrgica e as alças intestinais foram rebatidas, em
seguida a artéria renal esquerda foi isolada com uso de pinças.
Com a artéria renal esquerda isolada, um clipe de prata 950 (5% de liga de
cobre com ótimo grau de dureza) apresentando 8 mm de comprimento e 2 mm
de largura, em forma de U, foi implantado ao redor da artéria. Com auxílio de um
calibrador, o grau de constrição do clipe foi estabelecido em 0,2 mm de diâmetro
interno. De acordo com Britto
32
, o grau de constrição de 0,2 mm proporciona um
índice de obtenção de pressão arterial maior que 130 mmHg.
37
Em outro grupo os animais foram submetidos à cirurgia fictícia (SHAM), que
consistiu dos mesmos procedimentos cirúrgicos da cirurgia 2R1C, mas sem a
colocação do clipe de prata na artéria renal. Os animais SHAM foram utilizados
como controle (ou normotensos).
Em todos os animais o abdome foi suturado com pontos contínuos,
envolvendo a camada muscular primeiramente e depois a pele. Ao final dos
procedimentos cirúrgicos, em todos os animais, foi administrado antibiótico (24 UI
das penicilinas e 0,01 mg de estreptomicina e diidroestreptomicina/ 100 g do
peso corporal – pentabiótico veterinário/ FORT DODGE Saúde Animal Ltda.
Indústria Brasileira).
4.3 Protocolo de exercício físico
Os protocolos de exercício físico (EX) e de sedentarismo (SD) foram
realizados num período de 4 ou 8 semanas em grupos distintos de animais. Desta
forma os animais foram alocados em 8 grupos:
o 4 semanas: SHAM-SD, SHAM-EX, 2R1C-SD e 2R1C-EX
o 8 semanas: SHAM-SD, SHAM-EX, 2R1C-SD e 2R1C-EX
Quatro dias após a cirurgia, os ratos 2R1C e SHAM foram separados nos
grupos experimentais, EX e SD. O exercício físico consistia de natação sem carga
adicional cinco vezes por semana. No primeiro dia os animais nadaram por 20
min, no segundo dia 40 min e a partir do terceiro dia 60 min até completarem as 4
ou 8 semanas de exercício físico. O EX foi realizado em tanques coletivos de 38
por 60 cm de largura e 50 cm de profundidade, a temperatura da água foi mantida
em 30 ± 2°C, através do uso de um termostato.
Os grupos sedentários, 2R1C-SD e SHAM-SD, foram colocados em
recipientes coletivos com quatro animais em cada, com água rasa à ± 10 cm de
profundidade, na temperatura de 30 ± 2°C, para que a manipulação e exposição
às condições de exposição à água fossem semelhantes aos demais animais
submetidos ao protocolo de EX.
38
4.4 Avaliação indireta da pressão arterial através da pletismografia de
cauda
Todos os grupos submetidos aos protocolos de 4 e 8 semanas de EX foram
submetidos à pletismografia de cauda para avaliação indireta da PA e FC. O
animal foi colocado em um sistema de contensão para ratos (LE 5022, Panlab) e
permaneceu em uma caixa de aquecimento (LE 5610, Panlab) para facilitar as
medidas de PA. Neste sistema de contenção somente a cauda do animal fica
mantida exteriorizada na qual foi acoplado um manguito de borracha e um
transdutor (LE 5160-R, Panlab) para registro da PA e FC. Cerca de cinco
mensurações foram realizadas em cada animal e a média foi utilizada nas
análises dos resultados.
A avaliação por pletismografia foi realizada no início de cada semana após as
cirurgias SHAM ou 2R1C. Nos grupos do protocolo de 4 semanas de EX, a
pletismografia foi realizada na 2ª, 3ª e 4ª semana após as cirurgias. Enquanto nos
grupos de 8 semanas, foi realizada na 2ª, 3ª, 4ª, 5ª, 6ª, 7ª e 8ª semanas após as
cirurgias.
4.5 Avaliação da massa corporal
A massa corporal dos animais foi avaliada semanalmente, utilizando-se de
uma balança digital (Fiziola). Os animais foram pesados no dia das cirurgias
(2R1C ou SHAM) e antes da 5ª, 10ª, 15ª e 20ª sessão de EX ou de sedentarismo
para os animais dos grupos de 4 semanas. Enquanto nos grupos de 8 semanas
de EX, os animais foram pesados na 5ª, 10ª, 15ª, 20ª, 25ª, 30ª, 35ª e 40ª sessão,
e também no dia do experimento.
4.6 Confecção de cânulas vasculares
Cânulas vasculares foram confeccionadas com 4 cm (para canulação da
artéria) ou 3 cm (para canulação da veia) de tubos de polietileno PE-10,
polimerizados por aquecimento a 17 cm de tubos de polietileno PE-50. O interior
das cânulas foi preenchido com uma solução salina (NaCl, 0,9%) e a extremidade
39
livre do PE-50 foi fechada com uma fina ponta metálica. Tomou-se o cuidado para
não deixar bolhas de ar no interior das cânulas.
4.7 Isolamento dos vasos femorais e canulação
Ao completarem o protocolo de EX os animais 2R1C e SHAM (EX e SD) foram
anestesiados com uretana (1,2 g/kg, i.p., SIGMA, USA). Todos os procedimentos
cirúrgicos e avaliações hemodinâmicas foram realizados com os ratos
anestesiados. Em seguida para registrar os parâmetros cardiovasculares e
administrar anestésico realizou-se uma pequena incisão na pele da região ventral
da raiz do membro posterior, separando o tecido adiposo para localização do
feixe vascular e nervoso femoral. Após isolamento dos vasos femorais, as cânulas
foram introduzidas nos respectivos vasos até o nível da artéria aorta (via artéria
femoral) e da veia cava inferior (via veia femoral). A seguir, as mesmas foram
amarradas junto ao feixe vascular com fio cirúrgico.
A canulação da artéria femoral foi realizada para conexão com o sistema de
aquisição de dados e registro dos parâmetros cardiovasculares, enquanto a
canulação da veia femoral para administração de anestésico (uretana).
4.8 Registro direto da pressão arterial média, frequência cardíaca e
microinjeção
A avaliação dos parâmetros cardiovasculares, PAM e FC, foram realizadas
através do registro direto em animais anestesiados com uretana (1,2g/kg, i.v.,
SIGMA, USA), canulados e acoplados ao sistema computadorizado de aquisição
de dados (UIM100A, Powerlab System, AD instruments). A uretana apresenta
ação similar nos sistemas nervoso autônomo simpático e parassimpático, o que
favorece seu uso nos estudos da função cardiovascular
111
.
A PAM foi monitorada por um transdutor de pressão modelo Gould conectado
a um amplificador (ML221 Bridge Amp). A pressão arterial pulsátil (PAP) e FC
foram continuamente amostradas pelo sistema de conversão analógico/digital
(PowerLab) a uma frequência amostral de 1000Hz e armazenados em disco
rígido (computador pessoal). A amplitude do range foi previamente definida em 20
mV. Posteriormente, o sinal foi processado por um software (LabChart 5) para se
40
obter a PAM, FC, as características temporais e as alterações máximas dos
parâmetros desejados. PAM e FC foram derivados em tempo real a partir de
pulsos de PAP, utilizando o LabChart 5. Essas variáveis foram apresentadas
simultaneamente em canais distintos no monitor e armazenadas no disco rígido
do computador.
A PAM foi calculada automaticamente pelo software (LabChart 5) seguindo
a formula:
PAM = PAS + (PAD x 2)
3
Para a realização da traqueostomia, a musculatura cervical foi afastada e a
traquéia exposta. Em seguida, foi transpassado entre a traquéia e o esôfago um
fio cirúrgico para posterior amarração da cânula. Por fim, foi feito uma incisão na
traquéia e uma cânula de polietileno (PE-90) foi introduzida e fixada à traquéia. A
traqueostomia teve como finalidade manter as vias aéreas livres e facilitar a
aspiração da via aérea inferior. Dose adicional de uretana (0,1 a 0,2 g/kg) foi
administrada quando necessária para manter o nível de anestesia. O controle da
anestesia foi monitorado observando a variação da pressão arterial, freqüência
cardíaca, reflexo da córnea e nocicepção da cauda.
Com os animais canulados e traqueostomizados, eles foram colocados em
decúbito ventral em um aparelho estereotáxico (David Kopf, modelo DKI 900). A
cabeça do animal foi estabilizada com uma inclinação de aproximadamente 11°
com o auxílio das barras auriculares e da barra incisora. Em seguida, realizou-se
uma incisão mediana na região cervical posterior, separando-se a musculatura e
expondo a membrana atlanto-occipital. A seguir, foi realizada uma craniotomia
occipital, seccionando-se a membrana atlanto-occipital e as meninges (dura-máter
e aracnóide) para exposição da superfície dorsal do bulbo e visualização do óbex.
As microinjeções foram feitas usando uma micropipeta de vidro (30-50 μm,
diâmetro interno) de ponta tripla, devidamente fixada ao micromanipulador do
estereotáxico. As microinjeções foram realizadas pela pressão de ar exercida por
uma seringa de plástico (20 ml) conectada à extremidade distal da pipeta. As
drogas foram microinjetadas no RVLM tendo o óbex como ponto de referência. As
coordenadas foram 2,1 mm rostral e 1,8 lateral ao óbex, a profundidade foi
41
determinada no momento em que a micropipeta tocou o osso na superfície ventral
do bulbo.
A introdução da micropipeta no RVLM promovia aumento transitório da PAM,
o que servia como forma adicional
(indireta) de confirmar o correto
posicionamento da micropipeta. Após registrar os valores basais de pressão
arterial e freqüência cardíaca, foi microinjetado unilateralmente L-glutamato no
RVLM para confirmar o local da microinjeção. L-glutamato é um aminoácido
excitatório que evoca resposta pressora quando microinjetado no RVLM. A
microinjeção de L-glutamato induziu efeito pressor (+12.2 ± 0.7 mmHg)
comparada com a salina (+3.4 ± 0.9 mmHg).
Para controlar os efeitos de volume e/ou pressão exercida pela microinjeção
das drogas, o mesmo volume (100 nL) de veículo (NaCl, 0,9%, salina) foi
microinjetado em ordem aleatória. Para testar o efeito cardiovascular induzido
pelo precursor de NO no RVLM, foi microinjetado unilateralmente L-arginina (50
nmol/100nL) e o L-NAME (10 nmol/100nL). A microinjeção foi realizada após
estabilização dos parâmetros cardiovasculares por um período entre 10 a 15
minutos. A L-arginina foi microinjetada antes e 5 minutos depois a microinjeção de
L-NAME no RVLM.
Ao término do experimento de microinjeção os animais foram eutanasiados
com overdose de uretana intravenosa.
4.9 Expressão do mRNA da NOS, catalase, MnSOD, Cu/ZnSOD e p22phox no
RVLM
O qRT-PCR (real-time reverse transcription polymerase chain reaction) foi
realizado em grupos diferentes de ratos. Para análise quantitativa da expressão
42
do mRNA no RVLM, o cérebro foi rapidamente removido e imediatamente
armazenado em nitrogênio liquido, em seguida, estocado em freezer -80°C até
ser processado.
O RVLM foi removido bilateralmente seguindo as seguintes coordenadas em
relação ao óbex: 2,0 a 2,2 de extensão rostrocaudal, 1,7 a 1,9 de extensão láterolateral, na superfície ventral do bulbo. Estruturas da superfície do bulbo (pirâmides
e sulco bulbopontino) também foram utilizadas como referência anatômica para
dissecação do RVLM.
O tecido foi homogeneizado com 1mL de TRIzol Reagent (SIGMA) em
seguida incubado por 5 minutos à temperatura ambiente, para permitir a completa
dissociação das proteínas nucleares. Posteriormente foi adicionado 134μL de
clorofórmio, específico para biologia molecular (SIGMA), e em seguida, as
amostras foram agitadas em vórtex por 15 segundos. As amostras foram
incubadas por 15 minutos à temperatura ambiente, centrifugadas a 12.000 x g por
15 minutos a 4°C (Vision – Micro high speed refrigerated centrifugue), e separada
a fase superior que continha o RNA.
O RNA foi precipitado com 650 μL de isopropanol (SIGMA) por 10 minutos à
temperatura ambiente, seguido de centrifugação a 12.000 x g por 35 minutos a
4°C. O sobrenadante foi removido e o RNA lavado com 1,3 mL de etanol 75%. O
RNA foi recuperado por centrifugação a 12.000 x g por 15 minutos a 4°C, a
lavagem com etanol foi repetida e as amostras foram armazenadas a -80°C por
no mínimo 1 hora. Após nova centrifugação, o etanol foi descartado e o
precipitado de RNA deixado por 10 minutos à temperatura ambiente para
evaporação do excesso de etanol. O RNA foi ressuspendido em 10-50 μL de água
tratada com dietil-pirocarbonato (H2O DEPC, SIGMA). Em seguida o RNA foi
tratado com DNase conforme instruções do fabricante (turbo-DNA-freeTM,
Ambion).
Em cada amostra foi adicionado 10% de volume tampão para DNase e 1μL
de DNase I. A seguir, as amostras foram incubadas por 30 minutos a 37°C. Foram
acrescentados 10% do volume de reagente de inativação, seguido por incubação
por 2 minutos a temperatura ambiente. As amostras então foram centrifugadas a
10.000 x g por 2 minutos para precipitar o reagente de inativação com a DNase.
A concentração de RNA foi determinada por leitura da razão OD260/OD280
em espectrofotômetro (NanoVue Plus, GE). A reação de transcriptase reversa
43
(RT-PCR) foi realizada com 1 μg de RNA total, utilizando 1 μl de oligonucleotídeo
randômico (0,1 μg/μ) (Randon Primer – PROMEGA) e 1ul de dNTPs (10nM)
(Invitrogen), em reação com volume final de 13 μl corrigido com H2O/DEPC. O
tubo contendo essa mistura de reação foi aquecido por 5 minutos a 65°C.
Imediatamente após a incubação, foi transferido para cuba com gelo,
adicionando-se 4 μl de tampão de PCR 5X, 1 μl de DTT 10nM, 1 μl do inibidor de
ribonuclease 40U/μl, e 1 μl de Superscript III 200U/ μl (Invitrogen), finalizando um
volume de 20 μl por reação.
A mistura foi homogeneizada, rapidamente centrifugada e incubada por 3
minutos a 42°C, 5 minutos a 25°C e 50 minutos a 50°C, sendo a reação inativada
a 70°C por 15 minutos. O cDNA sintetizado foi utilizado nas reações de PCR
quantitativo (em tempo real).
Para esses ensaios, foram preparadas soluções contendo os primers (300nM
para as enzimas nNOS, iNOS, eNOS, catalase MnSOD, Cu/ZnSOD, p22 phox e
18s) e SYBR Green (Invitrogen). As sequências dos primers estão na Tabela 1.
Tabela 1 Sequências de primers usados nas análises de qRT-PCR
Gene
Sequência (5’-3’) forward
Sequência (5’-3’) reverse
nNOS
GCCATCCAGCGCATAATGACCCAG
GAGGGTGACTCCAAAGATGTCCTC
eNOS
CTGCCCTTGGCCTGCGCTGGT
ACACAGGTCCCTCATGCCAAT
iNOS
GAGTGAGGAGCAGGTTGAGGATTAC
GACCGCACCGAAGATATCCTCAG
Catalase
ATTGCCGTCCGATTCTCC
CCAGTTACCATCTTCAGTGTAG
Cu/ZnSOD
ATACACAAGGCTGTACCACTGC
CCTCTCTTCATCCGCTGGAC
MnSOD
AGGCGGCAATCTGTAAGC
TGTGTCTGTGGGAGTCCAAG
TGCTCATCTGTCTGCTGGAG
GTCAGGTACTTCTGTCCACACC
GTAAGTGCGGGTCATAAG
CCATCCAATCGGTAGTAGC
p22
18s
phox
Óxido nítrico sintase neuronal (nNOS); óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), óxido nítrico sintase
induzível (iNOS); cobre/zinco superóxido dismutase (Cu/ZnSOD); manganês superóxido dismutase
phox
(MnSOD); subunidade p22
da NADPH; cDNA ribossomal endógeno 18s.
Os cDNAs dos genes eNOS, nNOS, iNOS, catalase, MnSOD, Cu/ZnSOD,
p22phox e o constitutivo 18s foram amplificados usando os primers especificados
na Tabela 1 e SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). As análises
dos dados foram feitas pela comparação entre número de cópias dos poços
controle e experimentais, obtida entre as porções de crescimento geométrico das
curvas, passando-se uma reta denominada limiar (threshold) que cruza essas
44
porções. A expressão relativa de cada mRNA foi determinada pelo método Ct, no
qual o valor Ct é o número de ciclos por onde o sinal cruza a reta limiar.
Considerando o número de ciclos por onde passa a reta limiar Ct, foi encontrado o
ΔCt que é a diferença do valor médio para o gene de interesse e para o RNA 18s.
A seguir, foram subtraídos os valores médios encontrados para os poços
experimentais da média dos poços controle, obtendo-se o ΔΔCt (=ΔCt amostra - ΔCt
calibrador
). Esse valor foi colocado como exponencial negativo na base 2 (2ΔΔCT),
obtendo-se assim o número de vezes que o gene estará expresso após o
tratamento em questão em relação ao controle.
As soluções com o cDNA foram distribuídas nos poços da placa de
experimento (30 μl/poço). Todos os ensaios foram realizados em um
termociclador (BioCycler – 7300 Real time PCR system – Appied Biosystem) nas
seguintes condições: 7 minutos a 95°C seguido por 40 ciclos de 10 segundos a
95°C e 1 minuto a 60°C.
4.10 Análise da catalase e TBARS
Para análise do dano oxidativo outros diferentes grupos de animais foram
utilizados. Os tecidos coletados (RVLM, CVLM, hipotálamo, córtex cerebral,
ventrículo esquerdo, aorta e rins) foram armazenados no gelo (em tubos
devidamente etiquetados). Depois cada órgão foi homogeneizado em 1ml de
tampão fosfato de potássio pH 7,5 e centrifugado a 1500 x g (4700 rpm) por 10
minutos. O sobrenadante foi coletado e o volume final de todas as amostras
ajustado para 1,5 ml com tampão fosfato. Essas amostras foram armazenadas
em freezer -80°C para posterior análise bioquímica.
O tecido CVLM foi dissecado seguindo as mesmas dimensões do
procedimento de dissecação do RVLM. Contudo a coleta foi feita na região
imediatamente caudal ao RVLM. O hipotálamo foi coletado utilizando-se uma
pinça curva e ponta fina, na região caudal ao quiasma óptico e medial ao tracto
óptico, numa profundidade de aproximadamente 1 mm. O córtex cerebral foi
coletado sempre no hemisfério cerebral esquerdo. A aorta abdominal foi coletada
para análise, bem como a região central dos rins (contendo o hilo renal). Nestes
casos, todo órgão foi utilizado para análise, devido ao seu tamanho reduzido.
45
Para coleta do ventrículo esquerdo, foram removidos os átrios e o ventrículo
direito, preservando o septo interventricular.
4.11 Análise do dano oxidativo (TBARS)
A peroxidação lipídica foi determinada através do ensaio de substancias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA) utilizando o método de Draper. A
determinação da concentração de TBARS se baseia na capacidade do ácido
tiobarbitúrico em se ligar a lipídeos oxidados. Resumidamente, 100 mg do tecido
foram homogeneizados com 1 mL de tampão por 10 minutos a 4º C. O
sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica. 500 μL do
sobrenadante do homogenato foram misturados com ácido tricloroacético (TCA)
(28% p/v em HCL 0,25N), TBA (1% em ácido) colocado em banho de gelo. O
precipitado foi removido por centrifugação a 1000 x g por 15 minutos a 4º C, e a
absorbância do sobrenadante foi determinada a 532 nm. Os resultados foram
expressos em U/ml/mg proteína 112.
4.12 Atividade da enzima antioxidante catalase
A atividade da CAT foi mensurada a partir da taxa de decréscimo de peróxido
de hidrogênio a uma absorbância de 240nm, representada por U/mg de proteína.
Foram utilizados os seguintes reagentes: Tampão Fosfato e peróxido de
hidrogênio, que foram preparados de acordo com o protocolo a seguir:
1. Tampão fosfato (PBS):
NaCl (136, 9 mM) - 8,0086 g (anidro PA)
Na2HPO4 (0,27 mM) - 0,0383 g (anidro)
- 0,48 g (2 H2O)
- 0,0724 g (7 H2O)
KH2PO4 (1,1 mM) - 0,1496 g (anidro PA)
Obs.: Diluído em água destilada com volume final de 1000 ml (conservar em
geladeira)
2. Tampão com peróxido = 25 ml de tampão para 40 μl de peróxido de hidrogênio
Após preparo dos reagentes foi iniciada a leitura em espectrofotômetro, onde o
tampão com peróxido foi aliquotado juntamente com cada uma das amostras em
cubeta de quartzo (970 μl e 30 μl, respectivamente). A leitura foi realizada durante
46
60 segundos, com registros a cada 10 segundos. O teor protéico total é médio
das amostras dos tecidos foram realizados pelo método de Bradford 113.
4.13 Análise estatística
A normalidade dos dados foi testada usando o teste de Kolmogorov-Smirnov.
Dados paramétricos foram expressos em média ± erro padrão da média (EPM)
seguido por ANOVA e pós-teste de Newman-Keuls. A diferença foi considerada
significativa quando valor de p > 0,05. Para análise dos dados foi utilizado o
software Graphpad Prism 5.
4.14
Protocolo experimental
47
5. Resultados
5.1 Evolução da pressão arterial após as cirurgias
Os valores de pressão arterial média (PAM) apresentados na Tabela 2 foram
avaliados por pletismografia de cauda da primeira à oitava semana em ratos
hipertensos (2R1C) e normotensos (SHAM), sedentários (SD) e submetidos a
exercício físico (EX) por 4 ou 8 semanas.
Os valores basais de PAM dos ratos 2R1C-SD e 2R1C-EX foram superiores
(p<0,05) aos dos animais SHAM-SD a partir da terceira semana após a realização
das cirurgias. Contudo, os animais 2R1C-EX apresentaram PAM basal inferior
(p<0,05) em relação aos ratos 2R1C-SD na segunda e após a quarta semana. Em
todas as semanas em que foram avaliadas a PAM, não foi observada diferença
significativa entre os animais SHAM-SD e SHAM-EX (Tabela 2).
n
1ª
2ª
3ª
4ª
5a
6a
7a
8a
SHAM
SD
10
109±2
110±2
109±3
110±2
110±6
103±3
115±7
113±5
EX
10
109±3
111±2
112±1
110±2
114±8
115±9
111±9
109±5
2R1C
Tabela 2. Valores da pressão arterial média (PAM, mmHg) mensuradas através da pletismografia
de cauda.
SD
10
103±1
117±3
120±7*
142±3*
144±6*
152±3*
149±7*
156±9*
EX 10 103±2 104±1*# 117±4* 125±1*# 134±3*# 129±8*# 139±8*# 132±8*#
Ratos normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C) sedentários (SD) e submetidos a exercício
a
a
a
a
físico (EX). 1ª, 2ª, 3ª, 4ª, 5 , 6 , 7 e 8 semanas após as cirurgias SHAM e 2R1C. Valores
expressos em média ± EPM (n = 10/grupo). *p<0,05 em relação ao grupo SHAM-SD.# p<0,05 em
relação ao grupo 2R1C-SD (ANOVA seguido de Newman Keuls).
5.2 Massa corporal
Para avaliar o efeito do EX sobre a variação da massa corporal dos animais,
estes foram pesados semanalmente, a contar da data da realização das cirurgias
2R1C ou SHAM. Como apresentado na Tabela 3, os ratos 2R1C-EX
apresentaram menor (p<0,05) massa corporal em comparação com ratos SHAMSD e 2R1C-SD a partir da segunda semana. Os ratos SHAM-EX apresentaram
48
maior (p<0,05) massa corporal que os ratos 2R1C-EX a partir da quinta semana e
menor (p<0,05) que os ratos SHAM-SD a partir da quarta semana.
n
1ª
2ª
3ª
4ª
5a
6a
7a
8a
SHAM
SD
10
193±5
220±4
245±5
269±7
318±8
325±6
339±8
341±6
EX
10
191±5
215±4
243±5
260±4*
266±4*
270±4*
2R1C
Tabela 3. Valores de massa corporal (gramas, g) avaliados até a oitava semana.
SD
10
190±5
223±7
249±9
270±9
275±7*
283±4*
β
β
β
β
278±9*
282±3*
289±5*
295±6*
EX 10 189±6 196±5*# 220±6*# 249±5*# 252±5*# 257±7*# 260±8*# 263±6*#
Ratos normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C) sedentários (SD) e submetidos a exercício
a
a
a
a
físico (EX). 1ª, 2ª, 3ª, 4ª, 5 , 6 , 7 e 8 semanas após as cirurgias SHAM e 2R1C. Valores
expressos em média ± EPM (n=10/grupo). * p<0,05 em comparação com o grupo SHAM-SD. #
p<0,05 em comparação com o grupo 2R1C-SD. β p<0,05 em comparação com grupo 2R1C-EX
(ANOVA seguido de Newman Keuls).
Como apresentado na Figura 3 o ganho de massa corporal do grupo 2R1C-SD
foi maior (p<0,05) em comparação com o grupo 2R1C-EX a partir da 6a semana e
foi menor (p<0,05) que o grupo SHAM-SD na 7a semana. O grupo 2R1C-EX teve
menor ganho (p<0,05) de massa em comparação com o grupo SHAM-SD na 7a e
8a semana.
2R1C-SD
2R1C-EX
SHAM-SD
SHAM-EX
180
160
140
#
120
*#
#

100
60
*
*
8
80
7
Ganho de massa corporal (gramas)
200
40
20
6
5
4
3
2
0
Semanas
Figura 3. Avaliação do ganho de massa corporal (gramas, g) em ratos SHAM e 2R1C, sedentários
a
a
a
a
(SD) e submetidos a exercício físico (EX) (n=8-10/grupo) na 2ª, 3ª, 4ª, 5 , 6 , 7 e 8 semana após
as cirurgias. *p<0,05 em comparação com o grupo SHAM-SD. #p<0,05 em comparação com o
grupo 2R1C-EX. β p<0,05 em comparação com 2R1C-SD (ANOVA seguido de Newman Keuls).
49
5.3 Massa úmida dos rins e coração
A avaliação da massa úmida relativa dos rins dos animais SHAM e 2R1C (SD
e EX) foi utilizada como confirmação de sucesso da cirurgia 2R1C. A Tabela 4
mostra que a massa úmida relativa do rim esquerdo dos animais 2R1C (SD e EX)
foi menor (p<0,05) em relação à massa do rim esquerdo dos ratos SHAM-SD.
Entretanto, a massa úmida relativa do rim direito dos ratos 2R1C (SD e EX) foi
maior (p<0,05) quando comparados à massa do rim direito dos ratos SHAM-SD.
Para verificar se o grau de constrição da artéria renal dos ratos 2R1C-SD foi
semelhante aos dos animais do grupo 2R1C-EX avaliou-se o percentual de
variação do rim esquerdo (clipado) em relação ao rim direito (não clipado). A
Tabela 5 mostra que os valores de percentual de variação do grupo 2R1C-EX
foram similares aos dos animais 2R1C-SD e superiores aos valores de percentual
de variação dos animais SHAM-SD. Não houve diferença entre os valores de
percentual de redução dos animais SHAM-SD e EX.
Os animais 2R1C-SD, 2R1C-EX e SHAM-EX tiveram valores de massa úmida
relativa do coração superior (p<0,05) aos animais SHAM-SD (Tabela 4).
Tabela 4. Valores do peso úmido dos rins (direito e esquerdo) e coração (g/100g de massa
corporal).
SHAM
2R1C
n
RE
RD
Coração
n
RE
RD
Coração
0,325±0,01
6
0,278±0,01*
0,413±0,01*
EX
6
0,321±0,01
0,331±0,01
0,392±0,008*
6
0,273±0,02*
0,441±0,01*
0,368±0,01*
0,335±0,01
#
0,311±0,01
0,372±0,01*
7
#
SD
RE, rim esquerdo; RD, rim direito. Ratos normotensos (SHAM), hipertensos (2R1C) sedentários
(SD) e submetidos a exercício físico (EX). (n=6-7/grupo). *p<0,05 em comparação com ratos
SHAM-SD. Valores expressos em média ± EPM. #p<0,05 em comparação com o rim esquerdo do
grupo 2R1C-SD (ANOVA seguido de Newman-Keuls).
Tabela 5. Percentual (%) de variação do peso úmido do rim esquerdo (clipado) em relação ao
respectivo peso úmido do rim direito no respectivo animal.
SHAM
SD (n=7)
2R1C
EX (n=6)
SD (n=7)
EX (n=6)
-1,0±2,6
-2,3±1,1
-39,9±6,6*
-32,7±12,8*
Percentual de variação do peso úmido do rim esquerdo em relação ao peso úmido do rim direito
[(g/100g de massa corporal) (rim esquerdo/rim direito X 100 – 100)] em ratos normotensos
(SHAM), hipertensos (2R1C) sedentários (SD) e submetidos a exercício físico (EX). Valores
expressos em média ± EPM. ). (n=6-7/grupo). *p<0,05 em relação ao rato SHAM-SD (ANOVA
seguido de Newman Keuls).
50
5.4 Níveis basais de pressão arterial média e frequência cardíaca
Os níveis basais de PAM e FC em ratos anestesiados 2R1C e SHAM (SD e
EX) estão representados na Figura 4. Os níveis basais da PAM e FC avaliados
diretamente foram realizados na quarta semana após a cirurgia.
SHAM-SD
SHAM-EX
5s
2R1C-SD
5s
5s
E
5s
F
*
150
125
#
500
*
100
75
50
#
400
FC (bpm)
PAM (mm/Hg)
2R1C-EX
300
200
100
25
0
0
SHAM
2R1C
SHAM
2R1C
Figura 4. Painéis A, B, C e D, registros típicos de pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão
arterial média (PAM, mmHg) e frequência cardíaca (FC, bpm) de ratos SHAM-SD (painel A),
SHAM-EX (painel B), 2R1C-SD (painel C) e 2R1C-EX (painel D) anestesiados com uretana (1,2
g/kg i.v.). 5s = 5 segundos. Painel E, pressão arterial média basal (PAM, mmHg) e painel F,
frequência cardíaca (FC, bpm) de ratos SHAM e 2R1C, SD e EX. (n=5/grupo). Ratos normotensos
(SHAM), hipertensos (2R1C) sedentários (SD) e submetidos a exercício físico (EX) por 4
semanas.
*p<0,05 em comparação com os ratos SHAM-SD. (n=6/grupo). #p<0,05 em
comparação com ratos 2R1C-SD (ANOVA seguido de Newman Keuls).
51
Os animais submetidos ao protocolo de oito semanas, a PAM e FC não foram
avaliadas diretamente, apenas por pletismografia de cauda. A Figura 4 (painéis
A, B, C e D) ilustra os registros típicos de pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg),
FC (bpm) e PAM (mmHg). Como apresentado na Figura 4 (painel E), a PAM dos
ratos 2R1C-SD (131±4,8 mmHg, n=6) foi maior (p<0,05) do que a PAM basal dos
ratos SHAM-SD (103,4±0,7 mmHg, n=6). A PAM dos ratos 2R1C-EX (118,6±4,2
mmHg, n=6) foi menor (p<0,05) do que a PAM dos ratos 2R1C-SD (131±4,8
mmHg, n=6) e maior (p<0,05) em relação aos ratos SHAM-SD. Além disso, os
valores de FC basais dos ratos 2R1C-EX (360±13,5 bpm, n=6) foram inferiores
(p<0,05) à FC dos ratos 2R1C-SD (412±5,5 bpm, n=6).
5.5 Efeitos induzidos pela microinjeção de L-arginina e L-NAME no RVLM
sobre a pressão arterial média e frequência cardíaca
Para verificar o efeito do NO no RVLM de ratos 2R1C e SHAM, SD e EX, foi
realizada microinjeção do precursor do NO, L-arginina (50 nmol/100nl) no RVLM
com intenção de avaliar seus efeitos sobre a PAM e FC. A Figura 5 ilustra, nos
registros típicos, os efeitos das microinjeções de L-arginina no RVLM.
A
B
C
D
Figura 5. Registros típicos do efeito induzido pela microinjeção (seta preta) da L-arginina
(50nmol/100nl) no RVLM sobre a pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão arterial média
(PAM, mmHg) e frequência cardíaca (FC, bpm) de um rato representativo de cada grupo SHAMSD (Painel A), SHAM-EX (Painel B), 2R1C-SD (Painel C) e 2R1C-EX (Painel D). Ratos
normotensos (SHAM), hipertensos (2R1C), sedentários (SD) e submetidos a exercício físico (EX)
por 4 semanas.
52
De acordo com a Figura 6 (painéis A e B) e Tabela 6, nossos resultados
mostram que a L-arginina microinjetada no RVLM induziu efeito pressor (p<0,05)
nos animais sedentários (SHAM-SD e 2R1C-SD) em relação à respectiva salina,
enquanto nos animais exercitados (SHAM-EX e 2R1C-EX) não apresentou efeito
significativo. Contudo o efeito da L-arginina no grupo 2R1C-SD foi menor (p<0,05)
que o grupo SHAM-SD. A microinjeção de L-NAME no RVLM apresentou efeito
(p<0,05) hipotensor apenas nos animais 2R1C-SD em relação à microinjeção de
salina. Entretanto, a microinjeção de L-NAME bloqueou o efeito hipertensivo
induzido pela L-arginina somente nos grupo SHAM-SD.
Em relação à FC, a microinjeção de L-arginina no RVLM apresentou efeito
bradicárdico em relação à salina somente nos animais 2R1C-EX. Enquanto a
microinjeção de L-NAME no RVLM apresentou efeito bradicárdico em relação à
salina somente no grupo SHAM-EX (Figura 6, painel C e D e tabela 5).
Em relação ao efeito da L-arginina no RVLM sobre a FC, observamos que
produziu bradicardia (p<0,05) nos grupos SHAM-EX e 2R1C-EX em comparação
com salina. A microinjeção de L-NAME produziu efeito bradicárdico maior
(p<0,05) nos grupos SHAM-EX em comparação com salina e L-arginina. Contudo
o L-NAME não bloqueou o efeito bradicárdico da L-arginina nos grupos SHAM-EX
e 2R1C-EX. Nos grupos SHAM-SD e 2R1C-SD, a L-arginina e L-NAME
produziram efeito bradicárdico mas não foram diferentes entre si (Figura 6,
painéis C e D).
Tabela 6. Efeito induzido pela microinjeção de L-arginina (50nmol/100nl), L-NAME (10nmol/100nl)
e salina (100nl) no RVLM sobre a variação de pressão arterial média e frequência cardíaca de
ratos normotensos (SHAM), hipertensos (2R1C), sedentários (SD) e submetidos a exercício físico
(EX).
SHAM-SD
SHAM-EX
2R1C-SD
2R1C-EX
L-Arg
ΔPAM
ΔFC
ΔPAM
ΔFC
11,8±1,7*
-6,8±2,3
2,4±0,7
-1,1±0,7*
ϒ
ΔPAM
ΔFC
ΔPAM
ΔFC
6,4±1,0*
-4,5±4,3
1,3±0,3
-0,5±0,8*
1,4±1*
# ϒ
L-NAME
1,6±0,9
-2,1±0,4
4,1±2,9
-5,7±1*
-9,6±6,6*
-1±0,2*
2,5±0,8
Salina
2,2±0,6
-2,7±2,6
2,0±0,9
3,3±1,7
1,8±0,5
-4,5±1,2
2,0±0,4
4,8±1,0
2,3±7,8
1,6±1,1
-1,2±1,3*
4,6±0,6
-2,8±0,7
1,9±0,4
4,5±2,1
L-Arg 2
0,9±2,8
ϒ
ΔPAM, variação da pressão arterial média (mmHg). ΔFC variação da
(batimentos por minuto - bpm), L-Arg,L-arginina. L-Arg 2, microinjeção de
após o L-NAME. EPM, (n=5/grupo). *p<0,05 em relação a salina. # p<0,05
respectiva microinjeção no grupo SHAM-SD. ϒ p<0,05 em comparação
seguido de Newman Keuls)
freqüência cardíaca
L-arginina 5 minutos
em comparação com
com L-Arg (ANOVA
53
2R1C-SD
SHAM-SD
15
*
15
#
 PAM (mmHg)
10

5
2R1C-EX
SHAM-EX
B
10
*
 PAM (mmHg)
A
0
-5
-10
-15
5
0
-5
-10
-15
*
-20
SHAM-SD
-20
2R1C-SD
2R1C-EX
SHAM-EX
10
10
#
0
-5

5
 FC (bpm)
 FC (bpm)
5
*
0
-5
-10
-10
-15
-15
*
*
*
*
*
Figura 6. Efeito sobre a variação da pressão arterial média (PAM, mmHg) e frequência cardíaca
(FC, bpm) induzido pela microinjeção de L-arginina (50nmol/100nl) antes e cinco minutos após LNAME (10nmol/100nl) e salina (100nl) no RVLM de ratos sedentários (SHAM e 2R1C, painel A) e
exercitados (SHAM e 2R1C, painel B), (n=5/grupo). *p<0,05 em comparação com respectiva
salina. # p<0,05 em comparação com a respectiva microinjeção no grupo SHAM-SD. ϒ p<0,05 em
comparação com L-arginina antes L-NAME (ANOVA seguido de Newman Keuls).
5.6 Expressão do mRNA das isoformas de NOS, catalase, Cu/ZnSOD,
MnSOD e p22phox no RVLM
Como mostrado
na Tabela 7, os níveis de expressão do mRNA das
isoformas nNOS, eNOS, iNOS e p22phox no RVLM foi maior (p<0,05) nos ratos
2R1C-SD em relação aos ratos SHAM-SD. Os ratos 2R1C-SD também
apresentaram redução (p < 0,05) da catalase e Cu/ZnSOD em comparação com
SHAM-SD. No entanto os ratos 2R1C-EX apresentaram níveis de nNOS, eNOS e
nNOS menores (p<0,05) e aumento (p < 0,05) da expressão da catalase em
54
relação aos ratos 2R1C-SD. Porém, nos animais SHAM-EX houve redução
(p<0,05) da expressão do mRNA da nNOS no RVLM, em relação ao grupo
SHAM-SD.
Tabela 7. Expressão do mRNA (unidade arbitrária) das óxido nítrico sintases, catalase,
phox
Cu/ZnSOD, MnSOD e p22
no bulbo ventrolateral rostral (RVLM) de animais submetidos ao
protocolo de EX de 4 semanas.
phox
Grupos
nNOS
eNOS
iNOS
Catalase
Cu/ZnSOD
MnSOD
p22
SHAM-SD
0.9 ± 0.1
2.8 ± 0.1
0.5 ± 0.07
3.9 ± 0.2
4.2 ± 1.2
0.4 ± 0.1
2.5 ± 0.3
SHAM-EX
0.3 ± 0.04*
2.2 ± 0.4
0.2 ± 0.02
4.3 ± 0.4
3.3 ± 0.7
0.6 ± 0.3
3.9 ± 1.1
2R1C-SD
3.3 ± 0.4*
8.5 ± 0.5*
1.2 ± 0.07*
2.2 ± 0.2*
0.5 ± 0.1*
0.3 ± 0.1
9 ± 1.5*
2R1C-EX
2.0 ± 0.2
#
0.2 ± 0.05
2.3 ± 0.1
0.6 ± 0.6
4.3 ± 1
5-6
5-7
5-8
N
5-6
#
2.0 ± 0.6
6-8
#
6-7
4.2 ± 0.3
6-8
#
Valores expressos em media ± EPM. n = número da amostra. Óxido nítrico sintase neuronal
(nNOS). Óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Óxido nítrico sintase indusivel (iNOS).
Cobre/zinco superóxido dismutase (Cu/ZnSOD). Manganês superóxido dismutase (MnSOD).
phox
Subunidade p22
da NADPH. Dois rins, um clipe (2R1C). Ratos normotensos (SHAM). Ratos
exercitados (EX). Ratos sedentários (SD). (n=6-8/grupo). * p<0.05 Comparado com SHAM-SD. #
p<0.05 comparado com o respectivo grupo 2R1C-SD (ANOVA e Kruskal Wallis test).
5.7 Níveis relativos de malondialdeído e da atividade da enzima catalase
nos grupos submetidos ao protocolo de 4 semanas
A Figura 7 representa os níveis relativos de malondialdeído (MDA, método
TBARS) no córtex cerebral (painel A), hipotálamo (painel B), CVLM (painel C) e
RVLM (painel D) de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX; n = 5 por grupo) submetidos
aos protocolos de 4 semanas de EX. Os resultados mostram que houve aumento
(p<0,05) dos níveis relativos de malondialdeído no córtex cerebral, hipotálamo e
RVLM de ratos 2R1C-SD em comparação aos ratos SHAM-SD. Contudo, houve
redução dos níveis de malondialdeído no RVLM e hipotálamo (p<0,05) nos ratos
2R1C-EX em comparação aos ratos 2R1C-SD (Figura 10, painéis B e D). Não foi
observado diferença nos níveis de malondialdeído no CVLM entre todos os
grupos apresentados (Figura 7, painel C).
55
Córtex cerebral
A
*
0.4
0.3
0.2
0.1
MDA U/mg proteina
MDA U/mg proteina
3.0
0.5
0.0
*
2.5
2.0
1.5
1.0
#
0.5
0.0
SHAM
SHAM
2R1C
CVLM
C
*
0.6
MDA U/mg proteina
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
2R1C
RVLM
D
0.6
MDA U/mg proteina
Hipotálamo
B
0.6
0.5
0.4
#
0.3
0.2
0.1
0.0
SHAM
2R1C
SHAM
2R1C
Figura 7. Níveis relativos de malondialdeído (MDA, nm/mg ptn) pelo método de TBARS no córtex
cerebral (painel A), hipotálamo (painel B), CVLM (painel C) e RVLM (painel D) de ratos SHAM e
2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 4 semanas de EX. (n=5/grupo). *p<0,05 em
comparação com ratos SHAM-SD. #p<0,05 em comparação com ratos 2R1C-SD (ANOVA seguido
de Newman Keuls).
A Figura 8 representa os níveis relativos de malondialdeído (MDA, método
TBARS) no ventrículo esquerdo, artéria aorta, rim esquerdo (clipado) e rim direito
(não clipado) de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 4
semanas de EX. Os resultados mostram que houve aumento (p<0,05) dos níveis
relativos de malondialdeído no ventrículo esquerdo, artéria aorta e rim esquerdo
de ratos 2R1C-SD em comparação com ratos SHAM-SD (Figura 8, painéis A, B e
C). Contudo, houve redução (p<0,05) dos níveis relativos de malondialdeído do
ventrículo esquerdo e artéria aorta de ratos 2R1C-EX, em comparação com ratos
2R1C-SD (Figura 8, painéis A e B). Não foi observado nos níveis de
malondialdeído no rim direito (não clipado) entre todos os grupos experimentais
(Figura 8, painel C).
56
A
Ventrículo esquerdo
2.0
0.6
*
0.4
#
0.2
MDA U/mg proteina
MDA U/mg proteina
0.8
0.0
1.0
#
0.5
SHAM
2R1C
Rim esquerdo
2R1C
Rim direito
D
0.8
0.8
0.6
*
0.4
0.2
0.0
*
MDA U/mg proteina
MDA U/mg proteina
*
1.5
0.0
SHAM
C
Aorta
B
0.6
0.4
0.2
0.0
SHAM
2R1C
SHAM
2R1C
Figura 8. Níveis relativos de malondialdeído (MDA, nm/mg ptn) pelo método de TBARS no
ventrículo esquerdo (painel A), artéria aorta (painel B), rim esquerdo (painel C) e rim direito (painel
D) de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 4 semanas de EX. (n=5/grupo).
*p<0,05 em comparação com ratos SHAM-SD. #p<0,05 em comparação com ratos 2R1C-SD
(ANOVA seguido de Newman Keuls).
A Figura 9 representa a atividade da enzima catalase de ratos SHAM e
2R1C (SD e EX) nos animais submetidos ao protocolo de 4 semanas de EX. Os
resultados mostram que houve redução (p<0,05) da atividade da catalase no
hipotálamo e RVLM de ratos 2R1C-SD em comparação com ratos SHAM-SD.
Contudo, houve aumento (p<0,05) dos níveis de catalase no hipotálamo e RVLM
de ratos 2R1C-EX, em comparação com ratos 2R1C-SD (figura 9, paineis B e D).
Não foi observado diferença nos níveis da catalase no córtex e no CVLM em
todos os grupos experimentais (figura 9, painéis A e C).
57
Córtex cerebral
A
3.0
Atividade da enzima
(U/mg proteína)
Atividade da enzima
(U/mg proteína)
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.5
#
2.0
1.5
1.0
*
0.5
0.0
SHAM
SHAM
2R1C
CVLM
C
2R1C
RVLM
D
3.0
3.0
Atividade da enzima
(U/mg proteína)
Atividade da enzima
(U/mg proteína)
Hipotálamo
B
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
#
2.5
2.0
1.5
*
1.0
0.5
0.0
SHAM
2R1C
SHAM
2R1C
Figura 9. Atividade da enzima catalase (CAT) (U/mg ptn) no córtex cerebral (painel A), hipotálamo
(painel B), CVLM (painel C) e RVLM (painel D) de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX) submetidos ao
protocolo de 4 semanas da EX. (n=5/grupo). *p<0,05 em comparação com ratos SHAM-SD.
#p<0,05 em comparação com ratos 2R1C-SD (ANOVA seguido de Newman Keuls).
A Figura 10 representa a atividade da enzima catalase de ratos SHAM e
2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 4 semanas de EX. Os resultados
mostram que houve redução (p<0,05) dos níveis de catalase no ventrículo
esquerdo, artéria aorta, rim esquerdo (clipado) e rim direito de ratos 2R1C-SD em
comparação com ratos SHAM-SD. Contudo, houve aumento (p<0,05) dos níveis
de catalase no ventrículo esquerdo, artéria aorta, rim direito e rim esquerdo de
ratos 2R1C-EX, em comparação com ratos 2R1C-SD (figura 10, painéis A, B, C e
D).
58
A
Ventrículo esquerdo
8
#
6
4
*
2
Atividade da enzima
(U/mg proteína)
Atividade da enzima
(U/mg proteína)
8
0
4
#
2
2R1C
*
Rim esquerdo
SHAM
2R1C
Rim direito
D
8
8
6
#
4
*
2
0
Atividade da enzima
(U/mg proteína)
Atividade da enzima
(U/mg proteína)
6
0
SHAM
C
Aorta
B
6
#
4
*
2
0
SHAM
2R1C
SHAM
2R1C
Figura 10. Atividade da enzima catalase no ventrículo esquerdo (painel A), artéria aorta (painel B),
rim esquerdo (painel C) e rim direito (painel D) de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX) submetidos ao
protocolo de 4 semanas de EX. (n=5/grupo). *p<0,05 em comparação com ratos SHAM-SD.
#p<0,05 em comparação com ratos 2R1C-SD (ANOVA seguido de Newman Keuls).
5.8 Níveis relativos de malondialdeído e da atividade da enzima catalase
nos grupos submetidos ao protocolo de 8 semanas
A Figura 11 representa os níveis relativos de malondialdeído (MDA, método
TBARS) no córtex cerebral (painel A), hipotálamo (painel B), CVLM (painel C) e
RVLM (painel D) de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX; n = 5) submetidos aos
protocolos de 8 semanas de EX. Os resultados mostram que não houve diferença
dos níveis relativos de malondialdeído nos animais 2R1C-SD em comparação
com SHAM-SD nos diferentes tecidos cerebrais estudados, contudo, houve
redução (p < 0,05) dos níveis relativos de malondialdeído no RVLM dos animais
2R1C-EX em comparação com 2R1C-SD (Figura 11, painel D).
59
Figura 11. Níveis relativos de malondialdeído (MDA, nm/mg ptn) pelo método de TBARS no córtex
cerebral (painel A), hipotálamo (painel B), CVLM (painel C) e RVLM (painel D) de ratos SHAM e
2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 8 semanas de EX. (n=5/grupo). #p<0,05 em
comparação com ratos 2R1C-SD (ANOVA seguido de Newman Keuls).
A Figura 12 representa os níveis relativos de malondialdeído (MDA, método
TBARS) no ventrículo esquerdo, artéria aorta, rim esquerdo (clipado) e rim direito
(não clipado) de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 8
semanas de EX. Os resultados mostram que houve aumento (p<0,05) dos níveis
relativos de malondialdeído no ventrículo esquerdo, artéria aorta e rim esquerdo
de ratos 2R1C-SD em comparação com ratos SHAM-SD (Figura 12, painéis A, B
e C). Houve redução (p<0,05) dos níveis relativos de malondialdeído do ventrículo
esquerdo, artéria aorta e rim esquerdo de ratos 2R1C-EX, em comparação com
ratos 2R1C-SD (Figura 12, painéis A e B). Não foi observado nos níveis de
malondialdeído no rim direito (não clipado) (Figura 12, painel C).
60
Ventrículo esquerdo
A
*
0.2
#
MDA U/mg proteina
MDA U/mg proteina
0.4
0.0
1.5
#
1.0
0.5
0.0
Rim esquerdo
0.8
SHAM
2R1C
2R1C
Rim direito
D
0.8
*
0.6
#
0.4
0.2
0.0
MDA U/mg proteina
SHAM
MDA U/mg proteina
*
2.0
0.6
C
Aorta
B
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
SHAM
2R1C
SHAM
2R1C
Figura 12. Níveis relativos de malondialdeído (MDA, nm/mg ptn) pelo método de TBARS no
ventrículo esquerdo (painel A), artéria aorta (painel B), rim esquerdo (painel C) e rim direito (painel
D) de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 8 semanas de EX. (n=5/grupo).
*p<0,05 em comparação com ratos SHAM-SD. #p<0,05 em comparação com ratos 2R1C-SD
(ANOVA seguido de Newman Keuls).
A Figura 13 representa a atividade da enzima catalase de ratos SHAM e
2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 8 semanas de EX. Os resultados
mostram que houve aumento (p<0,05) da atividade da catalase no RVLM de ratos
2R1C-EX em comparação com ratos 2R1C-SD. Não foi observado diferença nos
níveis da catalase no córtex cerebral, hipotálamo e no CVLM (figura 13, painéis A,
B e C).
61
Córtex cerebral
A
3.0
Atividade da enzima
(U/mg protein)
Atividade da enzima
(U/mg protein)
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
SHAM
SHAM
2R1C
CVLM
C
2R1C
RVLM
D
3.0
3.0
Atividade da enzima
(U/mg protein)
Atividade da enzima
(U/mg protein)
Hipotálamo
B
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
#
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
SHAM
2R1C
SHAM
2R1C
Figura 13. Atividade da enzima catalase (CAT) (U/mg ptn) no córtex cerebral (painel A),
hipotálamo (painel B), CVLM (painel C) e RVLM (painel D) de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX)
submetidos ao protocolo de 8 semanas de EX. (n=5/grupo). #p<0,05 em comparação com ratos
2R1C-SD (ANOVA seguido de Newman Keuls).
A Figura 14 representa a atividade da enzima catalase de ratos SHAM e
2R1C (SD e EX) submetidos ao protocolo de 8 semanas de EX. Os resultados
mostram que houve aumento (p<0,05) da atividade da catalase no rim esquerdo e
direito de ratos 2R1C-EX, em comparação com ratos 2R1C-SD (figura 14, painéis
C e D). Não houve diferença na atividade da catalase no ventrículo esquerdo e
aorta dos demais grupos (Figura 14, painéis A e B).
62
A
8
Atividade da enzima
(U/mg protein)
Atividade da enzima
(U/mg protein)
12
10
8
6
4
2
SHAM
4
2
SHAM
2R1C
Rim esquerdo
10
*
8
6
4
2
12
Atividade da enzima
(U/mg protein)
*
2R1C
Rim direito
D
#
12
Atividade da enzima
(U/mg protein)
6
0
0
C
Aorta
B
Ventrículo esquerdo
#
10
8
6
4
2
0
0
SHAM
2R1C
SHAM
2R1C
Figura 14. Atividade da enzima catalase no ventrículo esquerdo (painel A), artéria aorta (painel B),
rim esquerdo (painel C) e rim direito (painel D) de ratos SHAM e 2R1C (SD e EX). (n=5/grupo).
*p<0,05 em comparação com ratos SHAM-SD submetidos ao protocolo de 8 semanas de EX.
#p<0,05 em comparação com ratos 2R1C-SD (ANOVA seguido de Newman Keuls).
63
6. Discussão
O presente estudo mostrou que a microinjeção de L-arginina no RVLM induziu
efeito pressor nos ratos 2R1C-SD, contudo seu efeito foi menor nos ratos SHAMSD. As expressões, no RVLM, do mRNA das isoformas de NOSs, p22phox e
concentração de TBARS foram maiores em ratos 2R1C-SD. A expressão do
mRNA das enzimas antioxidantes Cu/ZnSOD, catalase e a atividade da catalase
foram menores em ratos 2R1C-SD, sugerindo um aumento do estresse oxidativo
no RVLM de ratos hipertensos sedentários. Somado a isso, o exercício físico
reduziu os valores basais de pressão arterial e freqüência cardíaca nos ratos
2R1C-EX, enquanto o efeito cardiovascular induzido pela microinjeção de Larginina no RVLM foi bloqueado nos ratos exercitados, 2R1C-EX e SHAM-EX. Em
conjunto os resultados mostraram que o exercício físico normalizou a expressão
do mRNA da isoformas de NOSs e a concentração de TBARS, aumentou a
expressão do mRNA e atividade enzimática da catalase no RVLM de ratos
hipertensos 2R1C-EX. Esses dados sugerem que o exercício físico tem a
capacidade de restaurar os níveis de pressão arterial via redução da expressão
das NOS e do balanço redox no RVLM de ratos 2R1C. Os dados também
mostraram que o exercício reduziu o ganho de massa corporal nos ratos 2R1CEX e SHAM-EX, o que está de acordo com a literatura, onde o exercício físico
aeróbio geralmente promove redução de gordura corporal
114
.
De acordo com dados da literatura, o efeito do NO no RVLM é contraditório.
Alguns estudos
62; 65; 70; 115
mostraram, em ratos normotensos, que baixas doses
de L-arginina (1-50 nmol) microinjetadas no RVLM aumentaram a pressão arterial.
Contudo, outros dados
62; 70; 116
mostraram que a microinjeção de altas doses de
L-arginina (50-100 nmol) no RVLM reduziram a pressão arterial em ratos
normotensos. Chan et al. (2001) mostraram em ratos normotensos que o efeito
hipotensor induzido pela L-arginina (100nmol) no RVLM foi bloqueado pelo
antagonista seletivo para iNOS (aminoguanidina), enquanto o antagonista de
nNOS (7-nitroindazole) não teve efeito. Esse dado indica que a atividade de
diferentes isoformas das NOSs induz efeitos distintos sobre a pressão arterial.
Dados de Chan et al.
62
e outros
69; 70
sugerem que altas doses de NO
induzido pela L-arginina ou nitroprussiato de sódio (doador de NO) possam
produzir efeitos não fisiológicos através da formação de EROs ou de espécies
64
reativas de nitrogênio no RVLM. Os resultados do presente estudo estão de
acordo com essa observação, onde foi mostrado que microinjeção de L-arginina
no RVLM induziu efeito hipertensor em ratos 2R1C e SHAM sedentários. O efeito
pressor foi reduzido em ratos 2R1C-SD comparado com SHAM-SD, sugerindo
que em ratos 2R1C-SD possa haver maior nível de NO endógeno. Foi o que
observamos através do aumento da expressão do mRNA de nNOS, iNOS e
eNOS nos ratos 2R1C-SD. Os dados também mostraram que o exercício físico
alterou os níveis de NO e EROs no RVLM de ratos 2R1C-EX, deixando os níveis
de nNOS, eNOS, iNOS, catalase e TBARS similares aos dos ratos SHAM-SD.
Contudo, em ratos SHAM-EX o exercício reduziu a expressão apenas de nNOS
em comparação com o grupo SHAM-SD. Os dados também mostraram que o
efeito hipertensivo induzido pela microinjeção de L-arginina no RVLM foi
bloqueado em ratos exercitados (2R1C-EX e SHAM-EX), sugerindo que a
atividade das NOS, especialmente nNOS, é menor que os níveis necessários
para formar NO a partir da L-arginina no RVLM.
A iNOS também tem papel importante na excitação do RVLM. Foi
demonstrado que o aumento da expressão de iNOS no RVLM promove
simpatoexcitação via aumento do estresse oxidativo, em ratos normotensos.
Como a simpatoexcitação do RVLM pode ser abolida com inibidores da iNOS,
tem-se sugerido que a L-arginina ou BH4 são insuficientes quando a iNOS está
super-expressa, promovendo a geração excessiva de EROs. Entretanto todas as
isoformas de NOSs têm potencial para formar anion superóxido. Quando o cofator BH4 está reduzido, a atividade das NOS produzem anion superóxido em vez
de NO
64
. Estudos também mostram que a eNOS desacoplada aumenta a
produção de EROs, inibe a via de sinalização eNOS/cGMP e aumenta o estresse
oxidativo na microvasculatura cerebral9;
64; 117
. Esses dados indicam que a
interação entre eNOS e EROs na vasculatura encefálica inicia uma cascata de
eventos inflamatórios que estão diretamente relacionados com a patogênese da
hipertensão neurogênica 9; 64.
Morimoto et al. (2000) mostraram que microinjeção de L-NAME no RVLM não
alterou significativamente os valores de pressão arterial, freqüência cardíaca e da
atividade nervosa simpática em ratos normotenso. Em adição, nossos resultados
mostraram que a microinjeção no RVLM de L-NAME preveniu o efeito pressor
induzido pela L-arginina somente em ratos SHAM-SD e não nos ratos 2R1C-SD,
65
reforçando a hipótese que os níveis de NO devem ser diferentes entre ratos
normotensos e hipertensos.
Algumas evidências
118; 119
indicam que as EROs no RVLM de SHR são
reduzidas após microinjeção do mimético da SOD. De acordo com esses dados, a
microinjeção de vitamina C no RVLM reduz a pressão arterial somente em ratos
2R1C e não em normotensos, mostrando que ocorre maior formação de EROs no
RVLM de ratos 2R1C. Estudo em um modelo de hipertensão induzida pela Ang-II
mostrou aumento da expressão do mRNA de p22phox na vasculatura de animais
sedentários
120
, enquanto o exercício físico aumentou a expressão da proteína
Cu/ZnSOD no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN)
15
. No presente estudo,
os resultados mostraram redução da expressão do mRNA da Cu/ZnSOD e altos
níveis de expressão da p22phox no RVLM de ratos 2R1C-SD, sugerindo a
existência de elevadas concentrações de ânion superóxido no RVLM. Entretanto,
o exercício físico, no grupo 2R1C-EX, normalizou os níveis de expressão do
mRNA da Cu/ZnSOD e p22phox deixando-os similares aos do grupo SHAM-SD,
possivelmente contribuindo para a redução do ânion superóxido no RVLM,
indicando um incremento das defesas antioxidantes induzidas pelo exercício físico
no grupo 2R1C-EX. Estudos mostram que o exercício físico normaliza a
expressão de AT1R e da NADPH oxidase, além de reduzir a geração de ânion
superóxido no RVLM e PVN de coelhos que receberam infusão intraventricular de
Ang-II
121; 122
e em animais com insuficiência cardíaca
que a subunidade p22
phox
122; 123
. Pesquisas indicam
participa diretamente da geração de EROs no RVLM. O
bloqueio, no RVLM, da p22phox atenuou a geração de EROs e disfunção da cadeia
transportadora de elétrons na mitocôndria induzida pela Ang-II 124.
Com objetivo de verificar o envolvimento do peróxido de hidrogênio no RVLM
de ratos hipertensos, analisamos a atividade e expressão do mRNA da catalase.
Em concordância com Chan et al. (2006) que mostrou redução do mRNA e
atividade da catalase no RVLM de SHR, nossos resultados mostraram redução da
expressão do mRNA e atividade da catalase no RVLM de ratos 2R1C-SD, em
comparação com SHAM-SD. Em conjunto, esses dados indicam que o aumento
do peróxido de hidrogênio contribui para o dano oxidativo no RVLM de ratos
2R1C-SD.
A
peroxidação
lipídica
é
um
dos
especificamente nas membranas celulares
indicativos
de
dano
oxidativo,
79
. De fato, o tecido cerebral possui
66
grande montante de fosfolipídeos e ácidos graxos poliinsaturados que são
suscetíveis a oxidações, devido à baixa atividade das enzimas antioxidantes e
elevado consumo de oxigênio
125
. Os exercícios regulares de intensidade
moderada apresentam a capacidade de estimular enzimas antioxidantes em
126; 127
diferentes regiões encefálicas em ratos normotensos
128
, no RVLM de SHR
129
e no músculo esquelético
, no tecido cardíaco
108
. Os resultados do presente
estudo estão de acordo com esses dados, onde a concentração de TBARS no
RVLM foi maior em ratos 2R1C-SD comparado com SHAM-SD, e o exercício
físico reverteu esses parâmetros no RVLM de ratos 2R1C-EX deixando-os
semelhantes aos SHAM-SD. Desta forma, os dados sugerem que o estresse
oxidativo no RVLM pode mediar uma disfunção central que levaria ao aumento da
atividade simpática, enquanto o exercício físico, através do seu efeito
antioxidante, seria capaz de normalizar esses efeitos. O mecanismos pelo qual as
EROs influenciam o tônus simpático no RVLM ocorre devido ao aumento do input
glutamatérgico
e
atenuação
GABAérgica,
resultando
no
aumento
da
simpatoexcitação e da pressão arterial 64.
Os resultados também mostraram o efeito antioxidante do exercício no
hipotálamo, uma importante área reguladora da função cardiovascular. O
hipotálamo apresentou aumento da concentração de TBARS nos animais 2R1CSD, em contrapartida apenas o exercício por quatro semanas reduziu o TBARS
no hipotálamo nos animais 2R1C-EX. Observamos aumento da atividade da
catalase no hipotálamo de ratos 2R1C-EX, exercitados por quatro semanas, em
comparação com 2R1C-SD. De fato o PVN é um importante núcleo hipotalâmico
que participa da simpatoexcitação e hipertensão no modelo 2R1C
80
. O estresse
oxidativo no modelo na hipertensão renovascular está associado com aumento da
expressão de AT1 no PVN e aumento da atividade simpática
80
. Outro estudo
também evidenciou o envolvimento do SRA na ativação do hipotálamo, onde a
Ang-II induziu o aumento de citocinas pró-inflamatórias e estresse oxidativo no
PVN, contribuindo com o quadro de hipertensão arterial
130
. A inibição das EROs
no PVN atenuou a atividade de componentes do SRA, as citocinas próinflamatórias e o estresse oxidativo no modelo de hipertensão induzida pela Ang-II
130
. No presente estudo não foi observado alteração na concentração de TBARS
e atividade da catalase no hipotálamo de ratos 2R1C-SD e EX por oito semanas.
Um estudo mostrou que o treinamento físico (com ajuste de intensidade) realizado
67
por 8 semanas apresentou efeitos distintos nos parâmetros de estresse oxidativo
ao longo do tempo em SHR. O exercício realizado por duas semanas promoveu
redução da p47phox, das EROs, de NF-ĸB e de TNFα no PVN, enquanto o
treinamento até 4 semanas reduziu apenas gp91 phox, e, na oitava semana não foi
observado alteração nos marcadores de estresse oxidativo no PVN 131.
Encontramos também aumento da concentração de TBARS no córtex
cerebral em ratos 2R1C-SD que foi reduzida pelo exercício físico. Esses dados
estão de acordo com Hirooka et al. (2006), onde mostrou que ratos hipertensos
(SHRSP
–
spontaneously
hypertensive
stroke
prone
rat)
apresentaram elevados níveis de TBARS no córtex cerebral
sedentários
132
. De fato o
exercício físico moderado aumenta a expressão do mRNA de enzimas
antioxidantes do cérebro concomitante a redução dos níveis de componentes
oxidantes
125
. Estudos mostraram que o cérebro apresenta um importante fator
protetor, o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)
133
. Tem sido sugerido
que o BDNF regula o desenvolvimento cerebral, neuroplasticidade, neurogênese
e plasticidade sináptica
134
. Algumas evidências mostram que o exercício físico
induz aumento dos níveis de EROs e de BDNF em algumas regiões encefálicas,
contudo, o nível de dano oxidativo não aumentou
126; 135
. Esses dados sugerem
que o BDNF, induzido pelo exercício físico regular, exerce fator protetor contra o
dano oxidativo cerebral.
Quando foi analisada a concentração de TBARS e atividade da catalase no
CVLM, não encontramos diferença entre os grupos, indicando que a hipertensão
renovascular e exercício físico não interferiram no seu estado redox. Contudo,
nossos dados estão em contradição com o observado na literatura. Dados do
nosso laboratório mostrou que a microinjeção de vitamina C no CVLM de ratos
2R1C induziu maior resposta hipotensora em comparação com SHAM, indicando
maior presença de EROs nessa região
11
. Entretanto, esse estudo não verificou a
participação do peróxido de hidrogênio e catalase no CVLM, já que a vitamina C
tem ação sobre o anion superóxido. Foi observado também na literatura que o
CVLM teve resposta oposta à Ang-II em comparação com o RVLM
49
, esse dado
indica que o CVLM reage diferentemente a determinados componentes do SRA, o
que poderia também ocorrer com alguns compostos oxidantes e antioxidantes.
Como os dados da literatura são escasso em relação ao estresse oxidativo no
CVLM, novos estudos devem ser conduzidos a fim de esclarecer essa questão.
68
Em relação ao efeito da hipertensão e do exercício físico sobre o estado
redox em órgãos periféricos, os dados mostram que a artéria aorta apresentou
maior concentração de TBARS no grupo 2R1C-SD submetido a 4 e 8 semanas de
exercício físico, em comparação com SHAM-SD, enquanto o exercício físico
normalizou essas concentrações no grupo 2R1C-EX. Entretanto, a atividade da
catalase aumentou no grupo 2R1C-EX apenas nos animais submetidos ao
protocolo de 4 semanas, em comparação com 2R1C-SD. A produção de EROs na
artéria ocorre principalmente no músculo liso vascular e na túnica adventícia
136
sendo as principais cascatas enzimáticas responsáveis pela disfunção endotelial
as vias da xantina oxidase, eNOS e NADPH oxidase
137
. Dados da literatura
mostram que a adição de xantina oxidase em cultura de músculo liso vascular de
aorta induz a formação de anion superóxido, resultando em contração e
proliferação celular, sendo essa condição mais acentuada em ratos hipertensos
138
. Como o modelo experimental 2R1C é angiotensina dependente, estudos
indicam que, neste caso, a NADPH pode ser a principal formadora de EROs nos
vasos. A Ang-II aumenta em três vezes a produção de anion superóxido e em
cinco vezes o acúmulo de H2O2 no músculo liso vascular de SHR. Enquanto a
Ang-II ativa ERK/2 através do anion superóxido, o H 2O2 induz proliferação celular
através da estimulação de MAP kinase p38. No vaso, o H2O2 estimula o aumento
da atividade do mRNA da eNOS, o que induz a formação de NO e, em menor
quantidade, a formação de anion superóxido. Neste caso o anion superóxido
remove rapidamente o NO para formar ONOO. Tanto o anion superóxido como o
H2O2 podem se transformar em OH°, no qual através da cicloxigenase COX1
catalisa a produção de agentes vasoconstritores
29; 139
.
Por outro lado, a
estimulação da NADPH pela Ang-II é acompanhada por um aumento da atividade
da p22phox, tendo seu efeito inibido pelo p22phox antisense, que também tem efeito
inibitório sobre a expressão da catalase no músculo liso vascular
139
. Os
resultados do presente estudo estão de acordo com a literatura, onde o exercício
físico promoveu efeito antioxidante na artéria aorta. Os exercícios aeróbios
mostram efeito protetor contra a peroxidação lipídica induzida pelas EROs no
vaso, reduz a ocorrência de doenças cardiovasculares associadas com estresse
oxidativo e aumenta a expressão do mRNA da SOD e GPx 140. Dados da literatura
mostram que o exercício físico moderado realizado por 8 semanas foi capaz de
69
reduzir a expressão de gp91phox na aorta de SHR, mas não alterou a expressão
da catalase, o que está em concordância com os dados do presente estudo 97.
Nos rins, os dados do presente estudo mostraram que houve aumento da
concentração de TBARS no rim esquerdo nos grupos 2R1C-SD e 2R1C-EX dos
ratos submetidos aos protocolos de 4 e 8 semanas. Não houve aumento do
TBARS no rim direito dos animais hipertensos. Entretanto, a atividade da catalase
aumentou no rim esquerdo do grupo 2R1C-EX dos protocolos de 4 e 8 semanas.
E houve redução da atividade da catalase no rim esquerdo do grupo 2R1C-SD
exercitado por 4 semanas. Como ocorre no miocárdio, a Ang-II induz nos rins
aumento da produção de EROs e conseqüente peroxidação lipídica
141; 142
. O
aumento do TBARS no rim esquerdo pode estar associado ao procedimento de
estenose da artéria renal. Os resultados estão de acordo com dados da literatura
onde um estudo mostrou que o estresse oxidativo renal na hipertensão
renovascular está associado com alterações cardiovasculares e simpáticas,
devido a mudanças na expressão de AT1, NADPH e em enzimas antioxidantes 81.
Foi evidenciado que o rim clipado apresentou maior expressão de AT1, p47 phox e
gp91phox, em comparação com grupo controle
81
. Estudos em ratos diabéticos
mostraram que o exercício físico de baixa intensidade apresentou efeitos
benéficos na função renal, como redução da albuminúria, aumento da SOD e
redução dos níveis de 8-OHdg, um marcador de dano oxidativo no DNA
143; 144
.O
exercício físico também alterou marcadores de estresse oxidativo no rim de ratos
com doença renal crônica. Ratos com doença renal crônica apresentaram níveis
elevados de creatinina e uréia na urina, aumento de superóxido renal, enquanto o
exercício físico foi capaz de reduzir a produção de superóxido e aumentou a
atividade da SOD e GPx
145
. Os dados da literatura em conjunto com os
resultados do presente estudo sugerem que o exercício influencia as respostas
antioxidantes e reduz os compostos oxidantes no rim não clipado de animais
hipertensos.
O presente estudo mostrou que o exercício físico realizado por quatro e oito
semanas foi eficaz na redução da concentração de TBARS no ventrículo
esquerdo de ratos 2R1C-EX, em comparação com 2R1C-SD. Enquanto a
atividade da catalase aumentou no ventrículo esquerdo do grupo 2R1C-EX
apenas nos animais exercitados por 4 semanas. A produção excessiva de TBARS
e redução da atividade da catalase no ventrículo esquerdo nos ratos 2R1C-SD
70
ocorreram provavelmente devido a um aumento dos níveis de Ang-II,
característico desse modelo experimental. De fato a Ang-II é um indutor de
produção de EROs, via ativação da NADPH no coração e rins
141; 142
. A Ang-II
também está associada com produção de colágeno e fibronectina, concomitante
ao aumento de EROs no miocárdio
146
. Quanto ao efeito do exercício sobre o
estresse oxidativo cardíaco, nossos dados estão de acordo com outros estudos
que mostraram a capacidade do exercício em aprimorar as defesas antioxidantes,
especificamente a catalase, GPx e SOD e redução de MDA no coração de ratos
147; 148
. Esses dados sugerem que o exercício regular pode induzir efeitos
benéficos na preservação da estrutura e funcionalidade cardíaca, por influência
positiva nas defesas antioxidantes.
Diversas evidências mostram que o exercício físico regular melhora o
equilíbrio redox. Um estudo com humanos obesos mostrou que o exercício
realizado por 12 semanas, 30 a 60 minutos diários foi capaz de reduzir o estresse
oxidativo muscular e sistêmico, bem como os marcadores circulantes de
inflamação
149
. Os efeitos do exercício sobre o estresse oxidativo parecem ser
dependentes do tipo de treinamento. Exercício agudo de alta intensidade tem
característica geradora de compostos oxidantes, enquanto o exercício moderado
regular melhora a função antioxidante. O alto consumo de oxigênio e geração de
EROs induzido pelo exercício físico regular promove respostas adaptativas do
sistema antioxidante, como aumento da expressão de enzimas antioxidantes
150;
151
.
Os resultados em conjunto mostraram que o exercício físico realizado por 4
semanas apresentou maiores benefícios em relação à atividade da catalase em
comparação às 8 semanas de exercícios. O exercício por 4 semanas nos ratos
2R1C-EX, em comparação com 2R1C-SD, aumentou a atividade da catalase no
hipotálamo, RVLM, ventrículo esquerdo, aorta e rins enquanto o exercício por 8
semanas aumentou a atividade da catalase apenas no RVLM e rins. Dados do
nosso laboratório (Maia et al.) mostraram que o exercício físico por 8 semanas
não foi capaz de normalizar a bradicardia reflexa e hipertrofia concêntrica do
coração em ratos 2R1C. Esses resultados mostram que o benefício adaptativo do
exercício até 6 semanas são sobrepostos por fatores inerentes à hipertensão
arterial, especialmente a Ang-II, na qual tem a capacidade de modular neurônios
glutamatérgicos no RVLM e piorar a bradicardia reflexa, sugerindo que a partir da
71
sexta semana de exercício físico regular (sem ajuste de carga ou volume) os
efeitos fisiopatológicos da hipertensão se sobrepõem aos efeitos benéficos do
exercício.
7. Conclusão
Os resultados do presente estudo mostraram que uma menor resposta
cardiovascular induzida pela microinjeção de L-arginina no RVLM de ratos 2R1CSD pode ser atribuída a altos níveis de NO endógeno e estresse oxidativo em
ratos hipertensos. Essa possibilidade é reforçada pelos nossos resultados, onde
ratos 2R1C-SD apresentaram aumento da expressão do mRNA das isoformas de
NOS, p22phox e TBARS e, uma redução do mRNA da Cu/ZnSOD e catalase no
RVLM. O exercício físico foi capaz de reverter a expressão das NOS e catalase
do RVLM de ratos hipertensos, provavelmente reduzindo os níveis de NO e
peróxido de hidrogênio. Somado a isso, o exercício físico reduziu a concentração
de TBARS e aumentou a atividade da catalase no RVLM de ratos 2R1C. Esses
dados sugerem que o balanço entre NO e EROs no RVLM é importante para a
manutenção do estado hipertensivo, enquanto o exercício físico restaura esse
desequilíbrio entre NO e EROs, pelo menos no RVLM, uma importante área do
controle simpático do sistema circulatório, contribuindo assim para a redução da
pressão arterial. Somado a isso, o exercício físico foi eficaz na restauração do
balanço redox no ventrículo esquerdo, aorta e rins dos ratos hipertensos.
72
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9. Produção Acadêmica
9.1 Artigos Completos Publicados em Periódicos
Nitric oxide at the CVLM is involved in the attenuation of the reflex bradycardia in
renovascular hypertensive rats. Nitric Oxide, v.26, p.118-125, 2012.
Time-course effects of aerobic exercise training on cardiovascular and renal
parameters in 2K1C renovascular hypertensive rats (Aceito para publicação no
Brazilian Journal of Medical and Biological Research)
Exercise training restores oxidative stress and nitric oxide synthases in the rostral
ventrolateral medulla of renovascular hypertensive rats (Aceito para publicação no
Free Radical Research)
9.2 Apresentação em Eventos Científicos
Natação promove efeito antioxidante no hipotálamo, coração, rins e aorta de ratos
com hipertensão renovascular. XIX Simpósio Brasileiro de Fisiologia
Cardiovascular (2015).
Exercício físico normaliza catalase e TBARS no bulbo ventrolateral rostral,
hipotálamo, ventrículo esquerdo e aorta de ratos com hipertensão renovascular.
XVIII Simpósio Brasileiro de Fisiologia Cardiovascular (2014).
Exercício físico restaura a expressão de eNOS e iNOS e modula a resposta
hipertensora induzida pela l-arginina no bulbo ventrolateral rostral de ratos
hipertensos. I International Symposium on Biological Sciences (2014).
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