ATIVIDADE ANTIOMICROBIANA E ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE
PRÓPOLIS OBTIDOS ATRAVÉS DA EXTRAÇÃO POR FLUIDO SUPERCRÍTICO
Juliana Cristina Pereira Calado1;
Leticia Cavalcanti dos Santos2;
Fernando Antonio Cabral3;
Maria Cristina Marcucci4
Área do Conhecimento: Ciências da Vida.
Palavras-chaves: própolis; atividade entimicrobiana; atividade antioxidante; extração supercrítica
INTRODUÇÃO
A própolis é uma resina natural produzida pelas
abelhas e utilizada pela população para o tratamento de
inúmeras condições médicas, incluindo inflamação,
dor e infecções bacterianas. Quimicamente, a própolis
apresenta diversos compostos, sendo que na denominada
de “verde” estão presentes vários compostos fenólicos.
Recentemente, foi demonstrada a tipificação das amostras
de própolis no Brasil, associando-as a atividades biológicas
específicas. A tipificação é um processo importante que
emprega marcadores químicos para caracterizar amostras
de própolis provenientes de regiões geográficas distintas.
A finalidade deste projeto é quantificar os marcadores
químicos da própolis verde e de frações obtidas através da
extração por fluido supercrítico, empregando-se a CLAE.
Concomitantemente, será avaliado o teor de Artepillin C, o
principal marcador da própolis em questão, em amostras de
alecrim, a principal fonte vegetal para a elaboração desta
própolis. Paralemente, será avaliada a atividade biológica
desta própolis, frações e de amostras de alecrim em
ensaios biológicos, tais como ação antioxidante e atividade
antimicrobiana, entre outros. Para isso, serão utilizados
métodos químicos através de CLAE, e métodos e ensaios
biológicos in vitro, além da quimiometria que será empregada
para estabelecer correlações entre a composição química e
as atividades antioxidante e antimicrobiana. Midorikawa
et al (2001) identificaram a presença de Artepillin C,
ácido 4-hidroxi-3-prenilcinâmico, ácido p-cumárico e
canferide em amostras de própolis brasileira. Sawaya et al
(2004) usaram cromatogramas obtidos por “electrospray
ionization mass spectrometry” para caracterizar e
identificar amostras de própolis oriundas da Europa, EUA,
África e das diferentes regiões do Brasil, identificando os
seguintes componentes: ácido p-cumárico, 3-metoxi-4hidroxicinamaldeido, 2,2-dimetil-6-carboxietenil-2H-1-
benzopirano, ácido 3-prenil-4-hidroxicinâmico, crisina,
pinocembrina, ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico
(Artepillin C), ácido dicafeoilquímico, entre outros. Pelo
exposto, baseando-se no fato de que a própolis é um
produto de alto valor no mercado internacional e o Brasil
possui um grande potencial para a sua produção, já que
produz própolis de excelente qualidade (considerada hoje
a melhor do mundo), verificou-se a não existência no
Brasil de nenhuma pesquisa usando CO2 supercrítico para
fracionar a própolis. Porém, esta técnica que emprega a
propriedade anti-solvente para o fracionamento da própolis
já é realidade no Japão (JAFRA, 2004), produzindo assim
um produto diferenciado e de altíssimo valor agregado.
Considerando também a possibilidade de encapsular os
princípios ativos de própolis usando o dióxido de carbono
como solvente ou anti-solvente, os objetivos que serão
especificados no próximo item foram estabelecidos como
proposta para este trabalho.
OBJETIVOS
Avaliar o conteúdo de substâncias fenólicas
através da cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) quantitativa dos extratos de própolis obtidos
através da técnica de extração por fluido supercrítico.
Comparativamente, determinar o teor de Artepillin C em
amostras de alecrim, a fonte vegetal para a elaboração
da própolis verde. Verificar a atividade antimicrobiana e
antioxidante das amostras.
Estudante do Curso de Biomedicina; e-mail: [email protected]
Estudante do Curso de Biomedicina; e-mail: [email protected]
Professor da Universidade Estadual de Campinas; e-mail: [email protected]
Professor da Universidade Bandeirante de São Paulo; e-mail: [email protected]
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METODOLOGIA
Uma amostra de própolis bruta do tipo verde, de
boa qualidade, proveniente da região sudeste do Brasil foi
fornecida pela Bioessens Ltda. A amostra contém 8,2 mg/
g de ácido p-cumárico e 44,0 mg/g de Artepillin C. Esta
amostra foi fracionada no Laboratório Extrae (Laboratório
de Extração Termodinâmica Aplicada e Equilíbrio) da
Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp.
As amostras de alecrim (Baccharis dracunculifolia)
foram cedidas pelo Centro Plurisdisciplinar de Pesquisas
Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da Unicamp.
Metodologia para a Obtenção do Extrato
Etanólico da Própolis (EEP)
O extrato etanólico de própolis foi obtido através
da mistura de 3 gramas de própolis bruta com 10 ml de
álcool etílico p.a. (ou na mesma proporção) em agitador
magnético na temperatura ambiente por 1 dia. Após esse
procedimento, a amostra foi filtrada para a separação da
porção insolúvel, o filtrado armazenado em freezer por
24 horas e filtrado novamente para a redução do teor de
gordura no extrato. O solvente foi evaporado em estufa
a temperatura de 50°C até a obtenção do extrato seco de
própolis.
Cálculo do teor de sólidos solúveis
Para cada um dos extratos, tanto o etanólico
como os obtidos por extração supercrítica com CO2,
foi observado o seguinte procedimento: foi pesado um
becker de 25 ml e anotado o peso. 5 ml do extrato foram
pipetados no becker e este levado à estufa a 60 ºC até a
secura. O becker foi retirado e resfriou-se o que nele havia
no dessecador. Pesou-se e repetiu-se a operação até peso
constante. O procedimento foi realizado em triplicata.
Análise da própolis por CLAE
Uma quantidade de aproximadamente 50mg da
própolis bruta e de todas as frações obtidas por extração
em fluido supercrítico foram solubilizadas com 5ml de
metanol a quente, filtrada em papel de filtro e passada por
um filtro Millipore (0,45µ, Sartorius) para a análise por
cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa
(CLAE). A composição química das amostras da própolis
foi avaliada por CLAE (cromatógrafo LaChrom, modelo
D-7000, Fapesp proc. 95/09306-5) empregando-se uma
coluna C18 em fase reversa e um gradiente linear (fluxo
de 1 ml/min) composto de metanol e água acidificada com
5% de ácido fórmico. Foi utilizado um detector de rede de
diodos na detecção dos picos.
Atividade biológica e antioxidante
Aatividade antioxidante foi avaliada empregandose o radical difenil-picril-hidrazila, conforme o método
descrito por Hatano et al, 1989 e Banskota et al, 2000.
Atividade antimicrobiana in vitro
Os microrganismos empregados nos testes
foram: Staphylococcus aureus (S.aureus) ATCC 29213,
Salmonella ATCC 33277, Escherichia coli (E.coli) ATCC
25922, Candida albicans (C.albicans) ATCC 10231 e
Bacillus cereus (B.cereus). As culturas de bactérias foram
mantidas a –20ºC em TSB + 15% de glicerol e reativadas
em meio apropriado para cada cepa.
Difusão em disco
A atividade antimicrobiana da amostra de
própolis e das frações dela obtidas e dos extratos de
alecrim foi avaliada pelo método de difusão em disco
(ensaio preliminar) para confirmar suas atividades contra
os microrganismos C. albicans, E. coli e S. aureus, sendo
estipulada qualitativamente pelo método de difusão em
disco preconizado pelo Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI, 2005). As placas foram incubadas a 37o
C, exceto para a C.albicans (24oC) por 24 horas e, em
seguida, o halo de inibição (em mm) foi medido com um
paquímetro.
Diluição em agar
O método de diluição em agar, descrito pelo
CLSI (2005), foi utilizado para ser comparado com o da
macrodiluição descrita a seguir. A concentração inibitória
mínima (CIM) da amostra de própolis, das frações dela
obtidas e dos extratos de alecrim foi avaliada como se
segue. As concentrações finais dos extratos hidroalcoólicos,
a partir do estoque a 1%, foram 0,005%, 0,010%,
0,015%, 0,020%, 0,025%, 0,030% e 0,035%. Estas foram
individualmente diluídas em meio de cultura ágar MullerHinton (Merck). O inóculo (C. albicans, E. coli, S. aureus,
Salmonella e B. cereus) foi preparado através de suspensão
direta de colônias com turvação equivalente a 0,5 da escala
de McFarland em 5,0 ml de solução salina a 0,85%. Em
seguida, foi diluído 1/10 para ser obtida uma concentração
de 107 UFC/ml (unidades formadoras de colônias por
mililitro). 1 μl de cada inóculo foi distribuído na superfície
do ágar, sendo que a concentração final do inóculo foi de
aproximadamente 104 UFC. Uma placa contendo somente
meio de cultura e os inóculos bacterianos foi utilizada
como controle. Todas as placas foram incubadas a 35o C
por 20h. A CIM foi determinada a partir da placa em que
não houve crescimento bacteriano. Este teste foi realizado
somente com o material que apresentou halo de inibição,
conforme descrito no item anterior.
Leitura e interpretação dos resultados
Para o método de difusão em disco, os resultados
foram interpretados de acordo com halo de inibição
alcançado pela própolis para cada microrganismo sendo
a leitura dos resultados realizada a partir da medição
do diâmetro dos halos em milímetros. Para o método
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de diluição em Agar, a CIM foi determinada a partir da
placa em que não houve crescimento bacteriano, sendo
os resultados expressos como positivo (houve inibição) e
negativo (não houve inibição).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com respeito à atividade antioxidante,
empregando-se o DPPH, as amostras se comportaram
de maneira distinta, isto é, algumas apresentaram boa
atividade antioxidante, quando comparada com a da
própolis bruta. O valor de CE50% expressa a concentração
que elimina 50% dos radicais livres, isto é, quanto menor
esta concentração, maior a atividade. A amostra C3 foi a
que apresentou a melhor atividade antioxidante (CE50% =
7,91) sendo comparada a da própolis bruta (CE50% = 7,58).
Os valores são mostrados na tabela 1.
A atividade antimicrobiana das frações foi
avaliada contra alguns microrganismos. A maioria
das frações da própolis não inibiu os microrganismos
testados, sendo que as amostras C1 a C9 apresentaram
halo de inibição, empregando-se o método de difusão
em disco. A amostra PB101 foi a que apresentou o maior
halo de inibição (10 mm). Outras amostras da série Pb
e SC também apresentaram halos de inibição. O extrato
etanólico de própolis avaliado, apresentou halo de inibição
somente contra S.aureus (10 mm) sendo que não foi
possível realizar o ensaio com o microrganismo E.coli
pois foi necessária a sua reativação. As amostras C5 e C9
apresentaram atividade antimicrobiana na concentração de
50 µg/ml contra o B.cereus. A amostra Pb101 aprensentou
atividade comprovada contra B.cereus e S.aureus na
concentração de 100 µg/ml, bem como o EEP contra os
mesmos microrganismos nesta concentração. Nenhuma
das amostras apresentou atividade antimicrobiana contra
C.albicans. A amostra C5 inibiu a Salmonella numa
concentração de 300 µg/ml. A tabela 6 mostra o controle
microbiano, indicando a ausência do crescimento da E.coli,
motivo pelo qual não foi realizado o ensaio de diluição
em agar. As amostras de alecrim foram avaliadas quanto
à sua atividade antioxidante e antimicrobiana (difusão
em disco). As amostras testadas não apresentaram boa
atividade antioxidante, quando comparadas com a própolis
(resultados não mostrados). Estas amostras também não
apresentaram atividade antimicrobiana.
CONCLUSÕES
Os resultados encontrados mostram um caminho
promissor para o uso da extração supercrítica na obtenção
de frações de própolis ricas em compostos fenólicos, com
atividade antioxidante e antimicrobiana, conforme indicam
os resultados. Os dados foram incorporados ao projeto com
própolis do laboratório Extrae do Prof. Dr. Fernando Cabral
da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp. A
parceria firmada com o prof. Cabral foi consolidada através
dos resultados mostrados no presente relatório.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BANSKOTA, A. H., TEZUKA, Y., ADNYANA, I.K.,
MIDORIKAWA, K., MATSUSHIGE, K., MESSAGE,
D., HUERTAS, A. A. G.,KADOTA, S. (2000). Journal of
Ethnopharmacology 72, 239-246.
CLSI (2008). Clinical Laboratory Standards Institute.
www.clsi.org.
HATANO, T., EDAMATSU, R., MORI, A., FUJITA, Y.,
YASUHARA, T., YOSHIDA, T., OKUDA, T. (1989).
Chemical and Pharmaceutical Bulletin 37, 2016-2021.
JAFRA (2004) http://jafra.gr.jp/propolis-e-html
SAWAYA, A.C.H.F., TOMAZELA, D.M., CUNHA IBS,
BANKOVA, V.S., MARCUCCI, M.C., CUSTODIO, A.R.,
EBERLIN M.N. (2004). Analyst, 129, 739-744.
Tabela 1 Resultados da atividade antioxidante expressos em CE50 (concentração que elimina 50% dos radicais livres
em µg/ml)
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