Serviço de Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Terapia genética no controlo da
dor crónica
Francisca Santos
Nilza Pinto
Orientadoras Dra. Isabel Martins e Prof. Isaura Tavares
Maio 2005
Porto
«An unpleasant sensory and emotional
experience which we primarily associate
with tissue damage or describe in terms of
tissue damage, or both» (IASP)
Sistema endógeno de controlo da dor
Um dos tratamentos mais utilizados no
alívio da dor crónica são opiáceos
como a morfina e compostos similares.
• efeitos colaterais
• habituação
Terapia genética
tratamento
alternativo
Tecnologia cujo objectivo é corrigir a expressão
de genes alvo implicados no desenvolvimento
de doenças:
- Sobre-expressar esse gene alvo
- Ou diminuir a sua expressão
Através do uso de vectores que transportam o gene
terapêutico até às células-alvo.
Tipos de vectores: víricos e não víricos
Os mais utilizados são os víricos
Penetram naturalmente nas células
Os vectores víricos são derivados de vírus por
substituição da componente patogénica por genes
terapêuticos.
Terapia genética da dor
Utilização de vectores víricos que promovem a libertação de opiáceos na
medula espinhal
Fink et al., apresentado
NIH
Pohl et ao
al., 2003
Terapia genética da dor
Utilização de vectores víricos que promovem a libertação de opiáceos na
medula espinhal
Fink et al., apresentado ao NIH
Outros alvos:
Regiões do encéfalo que controlam a
transmissão da dor na medula a partir de
determinadas estruturas do bolbo
raquidiano
Bolbo
raquidiano
ventrolateral
antinociceptivo
VLM
Injecção do HSV-1 (Herpes Simplex Virus -1)
VLM
activar os
neurónios
antinociceptivos
do VLM
Construção do vector
ICP4
TK
hCMV-P
lacZ
UL
ICP4
US
PA
• Delecção do gene ICP4
• Inserção da cassete (promotor de citomegalovírus e
transgene) no gene da timidine kinase
Não
replicativo
• Transgene lacZ: beta galactosidase detectada por imunocitoquímica
Com base em estudos prévios:
-
O HSV-1 tem grande afinidade pelos neurónios e migra
retrogradamente do terminal axonal até ao corpo celular
- Os estudos de marcação retrógrada com traçadores
neuroanatómicos mostraram que os corpos celulares dos
neurónios aferentes ao VLM ocorriam no encéfalo e na
medula espinhal
Mas, com o HSV-1 só se observaram corpos celulares que
exprimiam a beta-galactosidase em alguns núcleos do
encéfalo. Não foram detectados corpos celulares na
medula espinhal
SELECTIVIDADE DE MIGRAÇÃO?
Objectivo do trabalho
Detectar o DNA do vector para concluir sobre a sua migração
Tentou-se encontrar o genoma vírico na medula
espinhal por PCR
Metodologia
•
Injecção estereotáxica do vector no VLM
• Sacrifício por decapitação (10 dias após injecção)
• Dissecção:
1) Bolbo raquidiano (imunocitoquímica)
2) Medulas (DNA)
Medulas:
Bolbos:
Extracção de DNA
Cortes de congelação
PCR
Electroforese
Imunocitoquímica
Injecção estereotáxica do vector
- Com a suspensão
vírica n=4
- Com soro fisiológico
n=1
Dissecção do bolbo e medula


Decapitação 10 dias após injecção
Dissecção
 Rato C+ e C-: bolbo congelado a – 80ºC
 Restantes:
– bolbo
fixador (paraformaldeído 4% - 4hsacarose 30%)
– medula espinhal (alargamentos cervical e
torácico) congeladas a -80ºC
Reacção imunocitoquímica de detecção
da beta-galactosidase
• Objectivo: verificar local de injecção
•
Metodologia
– A) Cortes finos (40µm) no micrótomo de congelação dos bolbos
fixados
– B) Reacção imunocitoquímica
Anticorpo secundário
Anticorpo primário
Beta-galactosidase
Extracção de DNA
• Objectivo : Extracção de DNA para posterior amplificação por PCR
• Material
• Bolbos dos C+ e C• Medulas dos animais com injecção no VLM
• Metodologia
-Digestão com proteinase K
-
Precipitação das proteínas
Precipitação do DNA com isopropanol
Ressuspensão do DNA em 20µl de água bi-destilada
Quantificação do DNA pela leitura da densidade óptica a
260nm
PCR
• Princípio da técnica : O PCR (PCR - Polymerase Chain Reaction) permite
seleccionar e amplificar sequências específicas de uma cadeia de DNA
graças à utilização de oligonucleotídeos : “primers”
• Vários protocolos
– Primers para amplificar o transgene lacZ da construção vírica
• 95ºC- 45 sec
• 60ºC- 30 sec
• 72ºC -45 sec
• 30 ciclos
– Primers para amplificar o gene da timidina kinase do HSV-1
• Optimizar o protocolo
Electroforese
• Gel de agarose a 2%
• Visualização das bandas de DNA depois à adição de brometo
de etídio
Resultados
- Reacção imunocitoquímica : local de injecção
Os ratos cujo local de injecção estava no VLM foram utilizados para amplificação
do DNA vírico na medula
Rato3
Rato2
Rato1
Controlo+
Controlo-
Branco
Amplificação do gene lacZ no alargamento torácico da medula espinhal
TK
hCMV-P
R
ICP4
ICP4
US
PA
lacZ
L
200pb
UL
Amplificação do gene da TK nos segmentos torácicos da
medula espinhal
TK
TK
hCMV-P
L
lacZ
PA
60ºC
R
A B
Optimização do protocolo
DNA do controlo+
1) Temperatura de annealing a 60 e 62ºC
2) Concentração de MgCl2 (cofactor da Taq
Polimerase) a A:2,5mM e B:4mM
3) Betaina optimiza condições de PCR
estabilizando o DNA
4) Condições escolhidas Temperatura de
annealing 60ºC -2,5mM de MgCl2
95ºC-45sec
60ºC-30sec
72ºC-45sec
30 ciclos
300pb
62ºC
A
B
Amplificação do gene da TK nos segmentos cervicais e
torácicos da medula espinhal
Rato3
Rato1
Rato2
• Mesma quantidade de DNA total por
amostra:5000ng/microg
Controlo+
Branco
Controlo-
Alargamento cervical
•Diferenças de quantidade de DNA vírico
no alargamento cervical e torácico
300pb
Alargamento torácico
300pb
Perspectivas futuras:
1- Questão técnica: quantificação de DNA por real time PCR ou DNA standard
2- Alargar o estudo a áreas encefálicas para aprofundar a selectividade da
expressão beta-galactosidase
3- Esclarecer os mecanismos que impedem a detecção da beta-galactosidase
Bibliografia
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Mata M, Glorioso J, Fink DJ. Development of HSV-mediated gene
transfer for the treatment of cronic pain. Experimental Neurology.
2003 Jun; 184(2003)S25-S29
Pohl M, Meunier A, Hamon M, Braz J. Gene Therapy of Cronic Pain.
Current Gene Therapy. 2003 Mar; 3(3):223-38
Wilson SP, Yeomans DC, Bender MA, Lu Y, Goins WF, Glorioso
JC.Antihyperalgesic effects of infection with a preproenkephalinenconding herpes virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999 Mar;
96(1999)
Wilson SP,Yeomans DC. Genetic Therapy for Pain Management.
Current Review of Pain. 2000; 4:445-450
Lopes JMC. Fisiopatologia da Dor. Biblioteca da Dor. Permanyer
Portugal
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/ge
netherapy.shtml
http://www.dor.med.br/cronica2.html
http://www.painworkshop.com/pain/pain1/content/html/pt/pain1_1.html
Agradecimentos
• Dr.ª Isabel Martins e Prof. Isaura Tavares pela orientação
facultada ao longo da realização do nosso trabalho;
• Laboratório de Biologia Celular e Molecular e Instituto de
Histologia e Embriologia Abel Salazar pelo espaço e material
disponibilizado;
• Dr.ª Sandra Rebelo pela amizade;
• E, ainda, a todos os nossos amigos!