hCG
MÉTODO:
ELISA
FINALIDADE:
Teste de ELISA para a determinação quantitativa de Gonadotrofina Coriônica
Humana (hCG) em soro humano. Para uso profissional. Somente para uso
diagnóstico in vitro.
PRINCÍPIO:
O teste hCG ELISA se baseia na técnica clássica de ELISA direto. Ele faz uso de um
sistema de alta afinidade Biotina-Estreptavidina. A superfície das cavidades de
microtitulação foi coberta com estreptavidina. Na primeira etapa da incubação,
amostras, calibradores ou controles, enzima-conjugado [anti-hCG (cabra)peroxidase] e um segundo anti-hCG-monoclonal-biotinalado são homogeneizados
para formar um imunocomplexo que é ligado à superfície das cavidades pela forte
interação da biotina com a estreptavidina. No final da incubação enzima conjugado
em excesso e antígenos na ligados são retirados através da lavagem. Substrato é
adicionado (etapa 2). Uma cor azul se desenvolve e se torna amarela após a adição
da Solução Stop. A intensidade da cor é diretamente proporcional a concentração de
hCG na amostra. A absorbância dos calibradores e amostras é determinada usando
leitoras de tiras e microplacas de ELISA ou sistemas automatizados ELISA (Como a
linha HUMAREADER ou ELISYS da Human). A concentração das amostras
desconhecidas é interpolada a partir de uma curva dose resposta gerada por soros
controles com concentrações conhecidas de hCG.
SIGNIFICADO CLÍNICO:
A gonadotrofina coriônica humana (hCG) é um hormônio glicoprotéico, secretado
pelas células trofoblásticas do tecido placentário. A principal função fisiológica do
hormônio é manter o corpo lúteo durante os estágios da gravidez. O hCG é o
marcador mais importante para a gravidez. Enquanto os níveis de hCG em mulheres
não-grávidas e homens saudáveis tipicamente está abaixo de 1 - 2 UI/L, após a
concepção inicia-se a elevação de hCG e pode alcançar níveis de 10 - 30 UI/L dentro
da primeira semana de gravidez. Durante a gravidez normal os valores de hCG
dobram a cada 1,3 - 2 dias, alcançando um pico entre 8 - 12 semanas. Após este
pico o nível de hCG declina levemente para um plato que é mantido durante a
gravidez. Após o parto o nível de hCG declina rapidamente para o normal.
IDENTIFICAÇÃO E ARMAZENAMENTO:
Conservar entre 2-8°C.
MIC- 12 Tiras de Microtitulação (em suporte para tiras)
Tiras descartáveis com 8 cavidades cobertas com estreptavidina.
CAL- 6 x 2,0 mL Calibradores de A a F - Pronto para uso.
Calibradores (humanos) para hCG nas concentrações de 0 (A); 5 (B); 25 (C);
50 (D); 100 (E) e 250 UI/L (F) de HCG.
CON- 13,0 mL Anticorpo-Enzima Conjugado
Anti-HCG (cabra), HRP-marcado, anti-HCG (monoclonal, rato), biotinalado 1,0
µg/mL; 2-metil-4-isotiazolina-3-ona (MIT) 150 mg/L; 5-bromo-5-nitro-1,3
dioxano (BND) 150 mg/L; anfotericina 0,0005%.
WS- 20 mL Solução de lavagem
Concentrada para 1000 mL, Salina tamponada TRIS 250 mM; Tween 20
0,2%; 2-metil-4-isotiazolina-3-ona (MIT) 150 mg/L; 5-bromo-5-nitro-1,3
dioxano (BND) 150 mg/L.
SUB- 14 mL Reagente Substrato
3,3´, 5,5´-tetrametilbenzidina (TMB) < 0,55 g/L e H2O2 0,3% em tampão
acetato de sódio 0,05M.
STOP- 7,5 mL Solução Stop
Ácido sulfúrico 0,5 mol/L
Tiras Adesivas
Conservantes: Concentração total < 0,04%.
PADRONIZAÇÃO:
Os calibradores do teste são padronizados contra o 3rd IS 75/537 para hCG.
ESTABILIDADE:
Os reagentes são estáveis até a data de validade impressa no rótulo, quando
armazenados entre 2 e 8ºC. Depois de abertos os reagentes devem ser
armazenados entre 2 e 8ºC e usados dentro de 60 dias (ver nota).
NOTA:
Os reagentes são estáveis até a data de validade impressa no rótulo, quando
armazenados entre 2 e 8ºC, mesmo depois de abertos. Entretanto a contaminação
está diretamente relacionada com o número de vezes que os reagentes são abertos
e utilizados. O limite de 60 dias depois do primeiro uso é por razões de segurança. O
manuseio cuidadoso dentro das Boas Práticas de Laboratório oferece a oportunidade
de utilização dos reagentes após os 60 dias (Isto inclui: frascos bem tampados após
o uso, tirar da geladeira somente o reagente que vai ser usado, soluções estoque
devem ser colocadas de volta na geladeira quando não estiverem sendo usadas). Os
critérios de validação deverão sempre ser encontrados.
TRANSPORTE:
O transporte do kit deve ser feito pela rota mais direta evitando-se as chegadas nos
finais de semana e feriados no local de destino. O kit não é afetado pelo transporte
desde que seja entregue ao destinatário no período máximo de 7 dias e em uma
temperatura de até 37ºC.
TERMOS E CONDIÇOES DE GARANTIA:
O fabricante garante a qualidade do produto, se este for armazenado como descrito
acima e em sua embalagem original.
PREPARO DOS REAGENTES:
Todos os reagentes devem estar a temperatura ambiente (15 a 25ºC) antes do uso.
Reagentes não utilizados devem ser sempre armazenados entre 2 e 8ºC.
Solução de Lavagem de Uso WASH
Uma turbidez ligeira, que pode aparecer na solução WS concentrada,
desaparecerá completamente na diluição.
Diluir a Solução de lavagem concentrada WS para 1000 mL com água recém
destilada ou deionizada em um recipiente adequado. Enxaguar o frasco várias vezes.
Estabilidade: 60 dias entre 15 e 25ºC.
Tiras de Microtitulação MIC
As tiras são lacradas em uma bolsa de alumínio com dessecante. Antes de serem
abertas, as tiras devem ficar a temperatura ambiente. As tiras não utilizadas devem
retornar para a bolsa plástica com o dessecante. As tiras armazenadas desta
maneira entre 2 e 8ºC podem ser usadas até o vencimento da data de validade
impressa no rótulo de caixa. Não tocar na borda superior ou no fundo das cavidades
com os dedos. Ver nota.
AMOSTRA:
• SORO.
• Amostras podem ser armazenadas por 5 dias entre 2 e 8ºC, até 30 dias a - 20ºC.
• Congelar e descongelar somente uma vez. Amostras descongeladas devem ser
homogeneizadas. Eliminar material em suspensão por centrifugação ou filtração.
• Não utilizar amostras altamente lipêmicas ou hemolisadas.
PRECAUÇÕES:
Não ingerir ou aspirar os reagentes. Evitar contato com os olhos, pele e mucosas.
• A Solução Stop STOP contém ácido sulfúrico, manuseá-la com cuidado porque
pode irritar os olhos e a pele. Em contato com os olhos enxaguar abundantemente e
contatar um médico.
Cada unidade doadora de sangue humano utilizado no preparo do CAL foi testada e
se encontrou negativa para a presença de anticorpos HIV-1/2; HCV e HBsAg. Apesar
de terem sido utilizados testes validados com alto grau de confiabilidade, nenhum
deles pode assegurar que produtos que contenham derivados de fluidos humanos
sejam incapazes de provocar doenças. Portanto, os cuidados habituais de
biossegurança devem ser aplicados na manipulação desse produto. Para o descarte
seguro dos reagentes e materiais biológicos, sugere-se utilizar as regulamentações
normativas locais, estaduais ou federais para a preservação ambiental.
Todo o material contendo amostras de pacientes ou controles deve ser inativado
por procedimentos validados (autoclavação ou tratamento químico).
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO:
Cronômetro
Pipetas e ponteiras
Leitora de ELISA
Lavadora de ELISA
PROCEDIMENTOS:
Seguir os procedimentos exatamente como descritos.
Importante:
P1. Não misturar ou usar componentes com número de lote diferente. Não trocar a
tampa dos frascos (risco de contaminação). Não usar reagentes após o vencimento
da data de validade.
P2. Não usar reagentes que possam estar contaminados ou tenham a aparência ou
cheiro diferente do usual.
P3. Marcar CAL, amostras e controles cuidadosamente na folha fornecida junto com
o kit.
P4. Selecionar o número necessário de Tiras de Microtitulação MIC, e colocá-las
firmemente no suporte.
P5. Realizar duplicatas dos CAL, amostras e controles. Pipetá-los no fundo da
cavidade.
P6. Adicionar sempre os reagentes na mesma ordem, cronometrando para
minimizar a diferença do tempo de reação entre as cavidades. Isto é
importante para a reprodutibilidade dos resultados. A pipetagem das amostras não
deve exceder a 10 minutos. Se o tempo for superior a 10 minutos, pipetar os
calibradores nas posições indicadas na metade do tempo da pipetagem das
amostras. Se mais de 1 placa for utilizada, realizar uma curva para cada placa.
P7. Evitar/remover bolhas de ar antes das incubações e leitura de absorbância.
P8. A adição da SUB inicia uma reação cinética, que é finalizada pela adição da
STOP. Evitar luz forte durante o desenvolvimento de cor.
PROCEDIMENTO DE LAVAGEM:
O Procedimento de lavagem é crítico. Lavagem insuficiente resulta em pouca
precisão ou absorbâncias falsamente elevadas.
L1: Remover as tiras adesivas, aspirar o conteúdo das cavidades, adicionar WASH,
aspirar novamente após 30 segundos de tempo de espera. Repetir a lavagem duas
vezes.
L2: No caso de lavadoras automáticas, realizar um prime com a WASH e lavar as
tiras 3 vezes. Verificar se a lavadora enche todas as cavidades completamente e
aspira eficientemente após 30 segundos (líquido remanescente deve ser < 15 L).
L3: Após a lavagem, remover o líquido remanescente batendo a placa invertida em
um papel absorvente.
Esquema de pipetagem:
Reagentes e amostras devem estar em temperatura ambiente antes do uso.
ETAPA1
CAVIDADE (µL)
A1...D2
E2
(Calibradores)
(Amostras)
25
--CAL A-F, em duplicata
Amostras, Controles, em duplicata
--25
100
100
CON
Homogeneizar gentilmente e cobrir as MIC com as tiras adesivas.
Incubar 60 minutos entre 20-25ºC
Lavar 3 vezes como descrito em Procedimento de Lavagem
300
WASH
ETAPA 2
100
SUB
300
100
Não agitar MIC depois da adição do SUB
Incubar 15 minutos entre 20-25ºC (ver P8)
50
50
STOP
Homogeneizar cuidadosamente. Medir a absorbância em 450 nm o mais rápido
possível ou no máximo dentro de 30 minutos após o término da reação. Utilizar
como comprimento de onda de referência 630-690 nm (se disponível).
REV. 06/13
VALIDAÇÃO DO TESTE:
Os resultados do teste são válidos sempre que os seguintes critérios sejam
encontrados:
CAL
FAIXA ACEITÁVEL (DO)
CAL A
<0,05
CAL B
> 2,00 x absorbância CAL A
CAL C
> 3,00 x absorbância CAL B
CAL D
> 1,45 x absorbância CAL C
CAL E
> 1,45 x absorbância CAL D
CAL F
> 1,35 x absorbância CAL E
CAL F
> 1,50
As diferenças entre as duplicatas de CAL não devem exceder a 10%.
CÁLCULO:
Plotar as absorbâncias medidas contra as concentrações de CAL em um gráfico
linear. A interpolação apropriada dos pontos de medição plotados resulta em uma
curva de calibração, onde a concentração do analito de cada amostra pode ser
determinada. Para o cálculo das concentrações do analito, selecionar a opção de
curva apropriada e validada (por exemplo, ponto a ponto).
Amostras com concentração de hCG acima de 250IU/L devem ser diluídas com soro
normal masculino e testadas novamente. Para obter a concentração da amostra,
multiplicar pelo fator de diluição.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:
Como o hCG pode também ser secretado por uma variedade de neoplasmas
trofoblásticos e não-trofoblásticos, tais casos devem ser eliminados antes do
diagnóstico da gravidez.
Pacientes sob terapia hormonal podem apresentar resultados falso positivos devido
ao uso de hCG ou estimulação das células secretoras de hCG.
Microabortos espontâneos e abortos terapeuticamente induzidos podem levar a um
rápido decréscimo e consequentemente níveis baixos de hCG, embora em certos
casos o hCG possa persistir por algumas semanas.
Gravidez ectópica usualmente apresenta valores baixos de hCG comparados com a
gravidez normal. Entretanto, devido à extensa variação fisiológica uma
determinação única poderá não ser suficiente para diagnosticar uma gravidez
ectópica de uma gravidez normal. Em tais casos tem sido recomendado determinar
a duplicação dos valores de hCG que pode ser por volta de 1,3 - 2 dias na gravidez
normal. O atraso desta duplicação pode ser um indicador para a gravidez ectópica. O
diagnóstico final não deve se basear somente em determinações de hCG. Outros
procedimentos diagnósticos devem ser incluídos.
VALORES ESPERADOS:
Níveis de HCG durante uma gravidez normal.
Tempo após a concepção
HCG, UI/L
1ª semana
10 – 30
2ª semana
30 – 100
3ª semana
100 – 1000
4ª semana
1000 – 10000
2º - 3º mês
30000 - > 100000
2º trimestre
10000 – 30000
3º trimestre
5000 - 15000
Cada laboratório deve estabelecer seus próprios valores esperados, utilizando a
instrumentação, os métodos de coleta de sangue e as técnicas de realização dos
testes comumente utilizados no laboratório.
Média Y:
25,59
Mediana: 11,96
Média X:
27,16
Mediana: 12,95
Equação: Y = 0,1500 + 0,9492
r = 0,9492
APRESENTAÇÃO:
Referência
N°. testes
53040
96
DEPARTAMENTO DE SERVIÇOS ASSOCIADOS:
Para esclarecimentos de dúvidas do consumidor quanto ao produto:
Telefax (31) 3067-6400 E-mail: [email protected]
N.º DO LOTE, DATA DE FABRICAÇÃO, DATA DE VALIDADE VIDE RÓTULO DO
PRODUTO.
BIBLIOGRAFIA:
.Kosasa T. S., Journal of Reproductive Medicine 26, 201-6 (1981).
.Danzer H. et al., Fertility and Sterility 34, 336-40 (1980).
.Braunstein G. D. et.al., American Journal of Obstetrics and Gynecology 126, 67881 (1976).
.Goldstein D. P. and Kosasa T. S., Clinical Application, Gynecology 6, 145-84
(1975).
.Batzer F., Fertilily and Sterility 34, 1 -12 (1980).
.Braunstein G. D. et al., American Journal of Obstetrics and Gynecology 131, 25-32
(1978).
Produzido por Human GmbH Max-Planck-Ring 21, D 65205, Wiesbaden, Alemanha
e Distribuído por In Vitro Diagnóstica Ltda
Rua Cromita, 278, Distrito Industrial – Itabira/MG. CEP: 35903-053
Telefone: 31-3067-6400 – Fax: 31-3067-6401
e-mail: [email protected]
Resp. Téc.: Patrícia C. C. Vilela – CRF 4463
Reg. M.S. 10303460179
SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS UTILIZADOS NOS RÓTULOS DO PRODUTO
O conteúdo é suficiente para <n> testes
Data limite de utilização
Limite de temperatura (conservar a)
Número do Catálogo
Consultar Instrução de Uso
Número do lote
Produto Diagnóstico In Vitro
Data de Fabricação
REPETIBILIDADE E REPRODUTIBILIDADE:
A repetibilidade e reprodutibilidade foram avaliadas pelo emprego de soros controle
com concentração alta, média e baixa de HCG.
Repetibilidade
Reprodutibilidade
Média,
DP,
Média,
DP,
N
CV, %
N
CV, %
ng/dL
ng/dL
ng/dL
ng/dL
Nível 1
20
6,10
0,27
4,47
20
6,24
0,50
Nível 2
20
29,12
1,62
5,56
20
27,34
1,65
6,04
Nível 3
20
123,04
4,69
3,82
20
133,04
6,44
4,84
SENSIBILIDADE:
O teste HCG Elisa teve uma sensibilidade de cerca de 0,8 UI/L de HCG.
ESPECIFICIDADE:
A especificidade foi testada pela adição de substâncias potenciais a reação cruzada.
Estas substâncias foram adicionadas a uma matriz de soro em várias concentrações
e suas respectivas doses respostas foram comparadas com as obtidas com a
gonadotrofina coriônica purificada. Não há reação cruzada com as substâncias nas
concentrações abaixo:
Substância
Concentração adicionada
hLH
1000 IU/mL
FSH
1000 IU/mL
TSH
1000 IU/mL
INTERFERENTES:
Substâncias capazes de interferir no teste foram adicionadas a uma matriz de soro
em várias concentrações e suas respectivas doses respostas foram comparadas com
as obtidas com a gonadotrofina coriônica purificada. Não há interferência das
substâncias nas concentrações abaixo:
Substância
Concentração adicionada
Hemólise
30 µL/mL
Lípides
50 µg/mL
Bilirrubina
200 µg/mL
Fatores Reumatóides
1000 kIU/mL
COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS - EXATIDÃO:
O HCG foi comparado contra um kit ELISA concorrente. 176 amostras clínicas foram
testadas por um laboratório externo, empregando-se o kit concorrente. As mesmas
amostras foram então testadas pelo HCG Human. Os dados individuais foram
avaliados por uma análise de regressão não-paramétrica, de acordo com Passing &
Bablok e pelo menos pela regressão quadrada.
Número de amostras HCG Elisa (Y): 176
Número de amostras concorrente (X): 176
REV. 06/13