UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE VETERINÁRIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PARASITOLOGIA VETERINÁRIA TESE COMPETÊNCIA VETORIAL DE Aedes albopictus (SKUSE, 1894) PROVENIENTE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL, PARA Dirofilaria immitis (LEIDY, 1856) RAILLIET & HENRY 1911. MARIA LUCIA CARNEIRO SERRÃO 2004 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE VETERINÁRIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS COMPETÊNCIA VETORIAL DE Aedes albopictus (SKUSE, 1894) PROVENIENTE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL, PARA Dirofilaria immitis (LEIDY, 1856) RAILLIET & HENRY 1911. MARIA LUCIA CARNEIRO SERRÃO Sob a orientação do Professor Dr. Adivaldo Henrique da Fonseca e co-orientação da Professora Dra. Norma Vollmer Labarthe Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Veterinárias, Área de concentração em Parasitologia Veterinária. Seropédica, RJ Fevereiro de 2004 ii UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE VETERINÁRIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MARIA LUCIA CARNEIRO SERRÃO Tese submetida ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área de Concentração em Parasitologia Veterinária, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor, em Ciências Veterinárias. TESE APROVADA EM 17/02/2004 _________________________________________________ Prof. Dr. Adivaldo Henrique da Fonseca (DSc.) UFRRJ Orientador _____________________________________________ Prof. Dra. Norma Vollmer Labarthe (DSc.) UFF Co-orientador __________________________________________________ Prof. Dr. Jorge Guerrero (PhD) University of Pennsylvania __________________________________________________ Dr. Ricardo Lourenço de Oliveira (DSc.) Fiocruz __________________________________________________ Prof. Dr. Jairo Dias Barreira (DSc.) UFRRJ iii AGRADECIMENTOS À CAPES pelo apoio financeiro recebido. Ao Profº Dr. Adivaldo Henrique da Fonseca pela orientação, confiança e oportunidade de realizar este projeto. À Profª Dra. Norma Labarthe pelos ensinamentos, colaboração e apoio nos momentos difíceis, pela orientação e profissionalismo. Aos Centros de Controle de Zoonoses de Niterói e de Santa Cruz e ao Departamento de Vigilância Ambiental de Maricá pela autorização para que realizássemos a coleta de sangue durante a campanha de vacinação. À Profª Dra. Maria Júlia Salim Pereira pela leitura crítica da tese. À Profª Dra. Nádia Almosny do Laboratório de Patologia Clínica da Faculdade de Veterinária da UFF pelo empréstimo do microscópio e permissão para realizar as fotografias necessárias. Ao Dr. Ricardo Lourenço de Oliveira do Laboratório de Transmissores de Hematozoários do Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz pela cessão de ovos de Ae. aegypti do Rio de Janeiro e da linhagem Rockefeller. Ao Dr. Mário Alberto do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos, do Departamento de Bioquímica Médica, do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ, pela cessão de ovos de Ae. aegypti da linhagem Liverpool. À Profª Ana Maria Dieckman pela cessão das imagens de Teresópolis. Aos colegas Marcos Ishizaki, Raphaela Barbieri, Renata Ferreira, Simone Silva, Carlos Roberto Lamego, Alessandra Pinho, Priscila Damato, Flavya Mendes de Almeida e Bruno Pinho pela colaboração nos trabalhos de campo. À Liliane Willi, Yuri Fontenele Melo, Maria Carolina Ferreira Faria, Grazielle Marques, Aline Serricella Branco e Nildimar Honório pela amizade e ajuda incondicional e irrestrita em todos os momentos que precisei. À Heloisa N. Diniz e Genilton Vieira pelo auxílio na elaboração das imagens. À Profª Núbia Karla O. Almeida pela realização da análise estatística. Às amigas Monique Mota, Simone Benevento e Larissa Arantes pelo apoio, incentivo, carinho, amizade e companheirismo. iv À amiga Dinair Couto Lima pelos ensinamentos, conselhos e dicas e, em especial, pela ajuda incondicional, incansável e inestimável sem a qual este trabalho não teria sido realizado. Ao Madruga e seus proprietários, minha profunda e eterna gratidão. À Kyra, Candy, Arusha, Bonnie, Drica, Meg e Morgana por existirem e fazerem parte da minha vida. A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a minha formação e na realização deste trabalho. v RESUMO SERRÃO, Maria Lúcia Carneiro. Competência vetorial de Aedes albopictus (Skuse, 1894), proveniente do Estado do Rio de Janeiro, Brasil, para Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Railliet & Henry 1911. Seropédica: UFRRJ, 2004. 89p. (Tese, Doutorado em Ciências Veterinárias, Parasitologia Veterinária). A dirofilariose é uma doença que se apresenta distribuída mundialmente, tendo como agente etiológico o nematóide Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) que acomete várias espécies animais. O parasito é transmitido por mosquitos, principalmente dos gêneros Aedes, Culex ou Anopheles, o que impõe a necessidade de convívio entre cães portadores de microfilaremia, populações de mosquitos transmissores e hospedeiros vertebrados susceptíveis para que a transmissão ocorra. Várias espécies de mosquitos estão envolvidas na transmissão de D. immitis ao redor do mundo, dentre elas a espécie Aedes albopictus, que embora seja vetor conhecido em alguns países, no Brasil, sua competência ou capacidade vetorial à D. immitis são desconhecidas. Objetivando conhecer ou atualizar a freqüência de dirofilariose canina foram coletadas amostras de sangue para pesquisa de microfilárias de cães de Ambaí (Nova Iguaçu), Itaipu (Niterói) e Itaipuaçu (Maricá). Objetivou-se também avaliar a competência vetorial da espécie Ae. albopictus ao helminto e para tanto se capturou mosquitos em Ambaí, Itaipu, Itaipuaçu e Albuquerque (Teresópolis). As populações de cada localidade foram mantidas em laboratório e alimentadas artificialmente com sangue contendo microfilárias de D. immitis (~ 1670mf/ml de sangue). A freqüência de infecção canina foi de 0,9% em Ambaí e 7% em Itaipu e Itaipuaçu. A proporção de mosquitos infectados logo após a alimentação variou de 81,44% a 96,23% e a média de microfilárias ingeridas entre as diferentes populações variou de 3,21±3,97 a 6,87±5,81. A mortalidade dos mosquitos infectados foi alta, variando de 79,72% a 87,36%. Dezesseis dias após a infecção, os indivíduos que sobreviveram foram dissecados para pesquisa de larvas. As populações de Ambaí e Itaipuaçu apresentaram aproximadamente a mesma proporção de mosquitos infectados (24,64% e 25,90%, respectivamente) e taxa de infectividade (1,45% e 1,31%, respectivamente) e as populações de Itaipu (43,21%) e Albuquerque (47,19%) também mostraram proporções semelhantes entre si. A taxa de infectividade da população de Itaipu foi alta (34,57%) e na população de Albuquerque não foi possível encontrar nenhum mosquito infectante. A média de larvas infectantes encontradas na cabeça ou probóscida dos mosquitos variou de 0,01±0,12 a 1,39±2,60. A eficiência vetorial das populações de Ambaí, Itaipuaçu e Albuquerque foi baixa, sugerindo que estas populações não sejam capazes de transmitir D. immitis. Por outro lado, o índice de eficiência vetorial encontrado na população Ae. albopictus de Itaipu (27,85%) indica que esta população pode participar da transmissão do nematóide, principalmente quando comparada à espécie Ae. aegypti linhagem Liverpool (54,05%). Portanto, pelo menos uma população dentre aquelas da espécie Ae. albopictus introduzida no Brasil é susceptível à infecção por D. immitis, Palavras chave: Dirofilariose canina - Epidemiologia - Transmissão vi ABSTRACT SERRÃO, Maria Lúcia Carneiro. Vectorial competence of Aedes albopictus (Skuse, 1894) from the State of Rio de Janeiro, Brazil, to Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Railliet & Henry 1911. Seropédica: UFRRJ, 2004. 89p. (Thesis, Doctor in Veterinary Science, Animal Parasitology). Heartworm is a disease of worldwide distribution. It is caused by the nematode Dirofilaria immitis (Leidy, 1856). This nematode may infect different mammal species including dogs, cats and man. The parasite is transmitted by mosquitoes, mainly those of the genus Aedes, Culex or Anopheles. To have successful transmission there is need of microfilaremic dogs, vector mosquitoes and susceptible definite hosts to live together. Many different mosquito species are known to be vectors of D. immitis around the world, among those, Aedes albopictus, although recognized as a vector in some countries, in Brazil its competence or capacity of vectoring D. immitis is unknown. Aiming to update the frequency of canine heartworm infection at Ambaí (Nova Iguaçu), Itaipú (Niterói) and Itaipuaçú (Maricá), blood samples of dogs living in those sites were collected for microfilaria detection. Aiming to determine the vectorial competence of the Brazilian population of Ae.albopictus to vector the nematode, specimens from Ambaí, Itaipú, Itaipuaçú and Albuquerque (Teresópolis) were collected, kept at laboratory conditions and artificially infected by microfilaremic blood meals (~1670mf/mL of blood). Canine heartworm infection rate was 7% in both Itaipu and Itaipuaçu and 0.9% in Ambaí. The proportion of infected mosquitoes right after infecting meals varied from 81.44% to 96.23% and the mean number of ingested microfilariae among the different populations varied from 3.21±3.97 to 6.87±5.81. The mortality of infected mosquitoes was high, varying from 79.72% to 87.36%. Mosquitoes surviving up to the sixteenth day after infection were dissected for detection of larvae. Populations from Ambaí and Itaipuaçú showed approximately the same proportion of infected mosquitoes (24.64% and 25.90%, respectively) and infectivity rate (1.45% and 1.31%, respectively) and the populations from Itaipú (43.21%) and Albuquerque (47.19%) also showed similar proportions. Infectivity rate of Itaipú population was as high as 34.57% and in the Albuquerque population there was no infective mosquito. The mean numbers of infective larvae found in the head or proboscis of mosquitoes varied from 0.01±0.12 to 1.39±2.60. The vectorial efficiency of Ambaí, Itaipuaçú and Albuquerque populations was low, suggesting that these populations are unsuitable for vectoring D. immitis. On the other hand, the vectorial efficiency of Ae. albopictus from Itaipú (27.85%) indicates that this species it may participate of the transmission chain of the nematode, especially when compared to Ae. aegypti, Liverpool strain (54.05%). Therefore, at least one population among those Ae. albopictus introduced in Brazil may be an efficient vector of D. immitis. Key words: Canine heartworm - Epidemiology - Transmission vii ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 - Número de fêmeas das espécies Aedes albopictus e Aedes aegypti de diferentes origens geográficas, parcial ou completamente ingurgitadas, após oferecimento de fonte sangüínea contendo microfilárias de Dirofilaria immitis, num sistema artificial .............................................. 45 Tabela 2 - Número de fêmeas das espécies Aedes albopictus e Aedes aegypti, de diferentes origens geográficas, ingurgitadas total ou parcialmente, portadoras de microfilárias (mf) de Dirofilaria immitis logo após a alimentação infectante ............................................................................ 46 Tabela 3 - Mortalidade de fêmeas das espécies Aedes albopictus e Aedes aegypti de diferentes origens geográficas, alimentadas com sangue contendo microfilárias de Dirofilaria immitis nos diferentes períodos pósinfecção (PI) .......................................................................................... 49 Tabela 4 - Taxas de infecção (TX) e de infectividade (TI) e número e localização das larvas de Dirofilaria immitis encontradas nos mosquitos das espécies Aedes albopictus e Aedes aegypti, de diferentes origens geográficas, aos 16 dias pós-infecção ...................................................... 50 Tabela 5 - Número médio de microfilárias (mf) de Dirofilaria immitis ingeridas e de larvas de terceiro estádio (L3) e índice de eficiência vetorial (IEV) das espécies Aedes albopictus e Aedes aegypti, de diferentes origens geográficas, após alimentação artificial ................................................... 51 viii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 - Mapa do Estado do Rio de Janeiro, mostrando a localização dos municípios de Nova Iguaçu, Niterói, Maricá e Teresópolis, locais escolhidos para a coleta de mosquitos da espécie Aedes albopictus ....... 35 Figura 2 - Sistema artificial para alimentação sangüínea de mosquitos: a) meio de circulação de água aquecida; b) gaiola de papelão; c) aparato de vidro . 41 Figura 3 - Larvas de Dirofilaria immitis em diferentes estágios, encontradas na espécie Aedes albopictus infectada experimentalmente. a: microfilária no intestino médio (400x); b: larvas em desenvolvimento nos tubos de Malpighi (400x); c: larvas infectantes na cabeça (100x); d: larvas infectantes saindo da probóscida (400x) ................................................. 48 ix SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1 2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 3 2.1 Aedes albopictus (Skuse, 1894) .................................................................. 3 2.1.1 TAXONOMIA ................................................................................................ 3 2.1.2 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA ......................................................................... 4 2.1.2.1 Nos Continentes: África e Oceania ....................................................... 4 2.1.2.2 No Continente Europeu ......................................................................... 5 2.1.2.3 No Continente Americano ..................................................................... 5 2.1.2.3.1 Brasil .............................................................................................. 8 2.1.3 EXPANSÃO GEOGRÁFICA E ORIGEM .............................................................. 9 2.1.4 BIOLOGIA ..................................................................................................... 11 2.1.5 Ae. albopictus COMO VETOR DE PATÓGENOS ................................................ 14 2.1.5.1 Protozoários e vírus ............................................................................... 14 2.1.5.2 Dirofilaria immitis ................................................................................ 16 2.1.5.2.1 Susceptibilidade da espécie Ae. albopictus à infecção por D. immitis ...... 17 2.1.6 INTERAÇÃO Ae. albopictus COM Ascogregarina taiwanensis E Wolbachia sp. ......................................................................................................................... 18 2.2 Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) ............................................................... 20 2.2.1 TAXONOMIA ................................................................................................. 20 2.2.2 BIOLOGIA ..................................................................................................... 20 2.2.3 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA ......................................................................... 23 2.2.4 VETORES ...................................................................................................... 27 2.2.5 RELAÇÃO PARASITA-HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO ....................................... 32 3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 35 3.1 DESCRIÇÃO DAS ÁREAS ESCOLHIDAS .............................................................. 35 3.2 PESQUISA DA INFECÇÃO POR Dirofilaria immitis EM CANINOS ...................... 37 3.3 ESTABELECIMENTO DE COLÔNIAS DE Aedes albopictus (Skuse, 1894) e Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) ............................................................................ 38 3.3.1 OBTENÇÃO DE MOSQUITOS ........................................................................... 38 3.3.2 MANUTENÇÃO DAS COLÔNIAS ...................................................................... 38 3.3.3 OBTENÇÃO DE FÊMEAS PARA INFECÇÃO POR D. immitis ............................... 39 x 3.4 FONTE DE INFECÇÃO POR D. immitis .............................................................. 39 3.5 INFECÇÕES EXPERIMENTAIS ............................................................................ 40 3.6 DISSECÇÃO DE MOSQUITOS .............................................................................. 41 3.6.1 DISSECÇÃO PARA AVALIAÇÃO DA INGESTÃO DE MICROFILÁRIAS .................. 41 3.6.2 DISSECÇÃO PARA AVALIAÇÃO DA COMPETÊNCIA VETORIAL ......................... 42 3.7 AVALIAÇÃO DA COMPETÊNCIA VETORIAL DE Ae. albopictus NA TRANSMISSÃO DE D. immitis .................................................................................. 42 3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 43 4 RESULTADOS ......................................................................................................... 44 5 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 52 6 CONCLUSÕES ................................................................................................ 59 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 60 ANEXOS ............................................................................................................ 87 GLOSSÁRIO ...................................................................................................... 89 xi 1 INTRODUÇÃO As doenças infecciosas e parasitárias transmitidas por artrópodes continuam a ter um importante papel na humanidade. Estas doenças têm, ainda hoje, forte impacto na vida de milhões de pessoas e animais ao redor do mundo. O aumento de viagens internacionais pelas pessoas, acompanhadas por seus animais de estimação colaboram para a dispersão global destas doenças. A dirofilariose, doença parasitária comum entre canídeos em várias partes do mundo, tem o nematóide Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Railliet & Henry 1911 como agente etiológico. O ciclo biológico do parasito inclui passagem obrigatória por seus hospedeiros intermediários, os culicídeos. Apesar de mais de setenta espécies de mosquitos, em diversas regiões do mundo, já terem tido sua competência vetorial comprovada, apenas algumas espécies pertencentes aos gêneros Aedes, Anopheles ou Culex são reconhecidamente transmissoras sob condições naturais. Para que a transmissão do filarídeo ocorra é necessário o convívio entre cães portadores de microfilaremia, populações susceptíveis de mosquitos transmissores e de hospedeiros vertebrados. A espécie Aedes albopictus (Skuse, 1894), de origem asiática e considerada a segunda espécie de Culicidae em importância sanitária para os seres humanos, teve o seu primeiro registro nas Américas em 1985. Esta espécie chegou no continente americano por transporte marítimo e colonizou rapidamente grande extensão, ocupando principalmente os ambientes urbanos e periurbanos. Nos Estados Unidos da América este vetor está envolvido na transmissão de parasitos ou patógenos nativos. Esta espécie já foi encontrada naturalmente infectada com D. immitis naquele país, assim como no Japão e em Taiwan. No Brasil, a dirofilariose canina apresenta alta prevalência nas regiões costeiras, onde a presença de vetores parece abundante. O Estado do Rio de Janeiro é uma das regiões em que há maior número de investigações sobre a prevalência da doença e sobre a composição da fauna culicídica e ainda, uma das poucas áreas onde já foram apontados os naturais vetores primários da dirofilariose canina. A rápida dispersão de Ae. albopictus pelo País desde a sua provável introdução em 1986, preocupa as autoridades sanitárias, uma vez que pode participar em ciclos de 1 arboviroses, sendo capaz de aumentar o risco de transmissão de várias viroses indígenas e introduzir algumas exóticas, como a Dengue. Embora Ae. albopictus seja importante vetor de D. immitis em outros países, no Brasil ainda não há estudos laboratoriais ou de campo que comprovem sua participação na transmissão de dirofilariose canina. Entretanto, caso essa espécie apresente capacidade vetorial, poderá mudar o quadro epidemiológico do parasito, uma vez que seus hábitos e dispersão são diferentes daquelas espécies reconhecidamente vetoras no País. Por isso, este estudo teve a finalidade de conhecer ou atualizar a freqüência de dirofilariose canina no Estado do Rio de Janeiro e verificar a competência vetorial da espécie Ae. albopictus proveniente de diferentes regiões geográficas dessa unidade federativa, ao nematóide D. immitis. 2 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Aedes albopictus (Skuse, 1894) 2.1.1 Taxonomia Atualmente, a posição taxonômica da espécie, segundo FORATTINI (2002), é a seguinte: Reino: Animalia Filo: Arthropoda Classe: Insecta Ordem: Díptera Subordem: Nematocera Família: Culicidae Subfamília: Culicinae Tribo: Aedini Gênero: Aedes Meigen, 1818 Subgênero: Stegomyia Theobald, 1901 Grupo: Scutellaris Espécie: Aedes albopictus (Skuse, 1894) Aedes albopictus foi descrito por Skuse em 1894 como Culex albopictus, a partir de exemplares coletados em Calcutá, Índia (BARRAUD, 1928). Pouco mais tarde, em 1901, Theobald descreveu a mesma espécie nomeando-a Stegomyia scutellaris. Até 1917, vários pesquisadores sinonimizaram a espécie, quando então Edwards incluiu-a no gênero Aedes, subgênero Stegomyia. A espécie é originária da selva tropical do Sudeste Asiático (SMITH, 1956). O subgênero Stegomyia constitui amplo e característico grupo de aedinos cuja biogeografia encontra-se praticamente restrita às regiões do chamado Velho Mundo. No entanto, duas espécies foram introduzidas na região neotropical: Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) e Ae. albopictus. Até o momento, são as únicas espécies deste subgênero, presentes no continente americano (PAPAVERO & GUIMARÃES, 2000). Os adultos de Ae. albopictus são escuros e praticamente de tonalidade negra. O clípeo mostra-se inteiramente escuro; o toro possui tufo de escamas prateadas internamente e no escudo destaca-se a presença de linha longitudinal mediana, de escamas prateadas (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994). A espécie Ae. albopictus já foi anteriormente conhecida como Culex albopictus Skuse 1894; Stegomyia scutellaris (Walker) Theobald 1901; Stegomyia scutellaris 3 samarensis Ludlow 1903; Stegomyia nigritia Ludlow 1910 e Stegomyia quasinigritia Ludlow 1911, até a denominação atual Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse) Edwards 1917. 2.1.2 Distribuição Geográfica Historicamente, Ae. albopictus é uma espécie com extraordinária capacidade de colonização. Esteve longo tempo confinada nos limites de algumas ilhas do Oceano Índico, como Madagascar, Mauricius, Reunion, Seychelles, Marianas, Bonin e o arquipélago Chagos, das ilhas Havaianas no Oceano Pacífico e de países na região oriental da Ásia (Japão, China, Índia, Nepal, Tailândia, Vietnã, Laos, Malásia, Filipinas, Taiwan e Coréia) (SURTEES, 1966; KAMIMURA, 1968; HONG et al., 1971; LAMBRECHT & VAN SOMEREN, 1971; HUANG, 1972; HO et al., 1973; MORI & WADA, 1978). Uma alarmante e repentina mudança no painel geográfico ocorreu durante a década de 80, devido ao transporte passivo de ovos e de formas imaturas em recipientes artificiais. Aedes albopictus dispersou-se de tal forma, que atualmente pode ser encontrada no Continente Americano, na África, na Europa Meridional e várias ilhas do Oceano Pacífico, como ilhas Carolinas, Salomão, Santa Cruz e Fidji (ELLIOT, 1980; PASHLEY & PASHLEY, 1983; FONTENILLE & RODHAIN, 1989; LAILLE et al., 1990). Na atualidade sabe-se que a espécie existe em todos os continentes exceto na Antártida (HAWLEY, 1988; ESTRADA-FRANCO & CRAIG, 1995; MITCHELL, 1995; LOUNIBOS, 2002). 2.1.2.1 Nos Continentes: África e Oceania A intrigante ausência de Ae. albopictus no continente africano foi desfeita pela sua detecção na Nigéria, em 1991, quando ovos e larvas foram encontrados em áreas silvestres durante investigações epidemiológicas (SAVAGE et al., 1992). Na Austrália, carregamentos de pneus infestados com Ae. albopictus foram encontrados nas cidades de Brisbane, em 1988 e Darwin, em 1989 (KAY et al., 1990). O mesmo modo de introdução da espécie foi descrito quatro anos mais tarde na Nova Zelândia (CALDER & LAIRD, 1994). 4 2.1.2.2 No Continente Europeu A Albânia foi o primeiro país europeu a relatar a introdução da espécie Ae. albopictus. Exemplares adultos ou imaturos foram coletados na pequena cidade de Laç, em agosto de 1979, em pneus e recipientes de água (ADHAMI & REITER, 1998). Provavelmente, a espécie entrou no País pelo único porto marítimo e principal porta de entrada de mercadorias vindas da China (VAZEILLE-FALCOZ et al., 1999). Em 1990, na Itália, uma única fêmea de Ae. albopictus foi coletada e identificada na cidade de Genova, região da Ligúria (SABATINI et al., 1990). Um ano depois, a primeira população da espécie foi encontrada na cidade de Pádua, região de Veneto. Foram coletados espécimes adultos ou imaturos numa grande variedade de recipientes peridomiciliares e em pneus (DALLA POZZA & MAJORI, 1992). Desde então, infestações pelo mosquito já foram descritas em nove regiões e 107 municípios pertencentes a 22 províncias italianas, atingindo todo o nordeste e parte central da Itália (KNUDSEN et al., 1996, ROMI et al., 1999). As infestações da Albânia e Itália não tiveram a mesma origem pois os indivíduos achados na Itália parecem ter vindo da América do Norte (DALLA POZZA et al., 1994). O recente achado de Ae. albopictus na França (1999) (SHAFFNER & KARCH, 2000) demonstra a capacidade de dispersão da espécie, com o risco de outros países europeus também serem infestados, já que a capacidade da espécie se adaptar a uma grande variedade de habitats e tolerar baixas temperaturas é grande (MITCHELL, 1995; KNUDSEN et al., 1996). 2.1.2.3 No Continente Americano O continente americano foi invadido e ocupado por este vetor, nos anos 80, a partir de localidades no sul dos Estados Unidos da América (EUA). Antes do seu estabelecimento nas vizinhanças de Houston, Texas em 1985 (SPRENGER & WUITHIRANYAGOOL, 1986), Ae. albopictus tinha sido detectada anteriormente em carregamentos de pneus em portos norte-americanos (PRATT et al., 1946; EADS, 1972) e num cemitério no Tennessee (REITER & DARSIE, 1984). Em 1986, Ae. albopictus foi encontrada em cidades adjacentes a Houston, em New Orleans e arredores, Louisiana e em Memphis, Tennessee. Em junho e julho, a espécie foi reportada em Gulfport, Mississippi e em Jacksonville, Florida (MOORE et al., 1988). 5 Ainda no mesmo ano, um estudo epidemiológico conduzido em 41 cidades e povoados norte-americanos mostrou que a espécie Ae. albopictus estava amplamente disseminada no sul dos EUA, porém com distribuição localizada e descontínua (CDC, 1986). Alguns meses mais tarde, em setembro de 1986, um levantamento realizado em seis estados demonstrou que aqueles localizados ao norte do país estavam menos infestados do que os estados do Texas, Louisiana e Mississippi. No inverno deste mesmo ano, Ae. albopictus já estava presente em 42 cidades de 12 estados localizados no sudeste, leste, nordeste e centro-oeste dos EUA (CDC, 1988). Em 1987, o programa foi expandido, incluindo 59 cidades. Infestações adicionais de Ae. albopictus foram encontradas em mais cinco estados e várias cidades onde não havia focos anteriormente, sugerindo expansão do vetor (MOORE et al., 1988). Em julho e agosto de 1987, oito cidades reconhecidamente infestadas com Ae. albopictus nos estados do Texas, Louisiana, Florida, Missouri, Tennessee e Indiana foram estudadas em detalhe para determinar a distância na qual espécimes teriam dispersado-se do foco original (CDC, 1987). Os pesquisadores notaram que houve um decréscimo notável na dominância de Ae. albopictus à medida que aumentou a distância do foco (Houston) (MOORE et al., 1990). Durante o ano de 1988 a espécie foi encontrada na Carolina do Sul, aumentando para 17 o número de estados infestados (FRANCY et al., 1990). A partir daí a espécie foi se expandindo pelo país e em 1992, 22 estados já registravam sua presença (ESTRADA-FRANCO & CRAIG, 1995; MEKURIA & HYATT, 1995). Em 1997, Ae. albopictus era encontrada em 678 condados de 25 estados (MOORE & MITCHELL, 1997) e o mais recente levantamento da distribuição norte-americana da espécie revela que 919 condados em 26 estados (Alabama, Arkansas, Delaware, Florida, Georgia, Iowa, Illinois, Indiana, Kansas, Kentucky, Louisiana, Maryland, Minnesota, Missouri, Mississippi, North Carolina, Nebraska, New Jersey, Ohio, Oklahoma, Pennsylvania, South Carolina, Tennessee, Texas, Virginia e West Virginia) estão infestados (RIGHTOR et al., 1987; PEACOCK et al., 1988; SWEENEY et al., 1988; CILEK et al., 1989; FOSTER, 1989; SMITH et al., 1990; HOBBS et al., 1991; O’MEARA et al., 1992; NIEBYLSKI & CRAIG, 1994; WOMAK et al., 1995; CRANS et al., 1996; MOORE, 2001). Nos estados da Florida, Georgia, North Carolina, South Carolina e Tennessee não há um só condado livre da infestação (O’MEARA et al., 1995, WOMACK et al., 1995; MOORE, 1999; DARSIE & WARD, 2000). 6 Atualmente, Ae. albopictus já colonizou todo o sudeste e uma grande área no leste dos EUA e alguns estados do centro-oeste americano (RIAGU-PEREZ et al., 1994; ESTRADA-FRANCO & CRAIG, 1995; MOORE, 1999). Prosseguindo em sua dispersão, a espécie tem seu primeiro registro no México em 1988, em um pneu na cidade de Matamoros, próxima à fronteira com o Texas (IBÁÑEZ-BERNAL & MARTÍNEZ-CAMPOS, 1994). Nos anos seguintes, a espécie foi encontrada em mais três cidades vizinhas ao Estado do Texas. Especula-se que a espécie possa ter sido introduzida em território mexicano por meio do comércio de pneus usados (TOVAR & MARTINEZ, 1994). Na Guatemala encontraram-se os primeiros exemplares de Ae. albopictus em ambiente rural, próximo à fronteira com o México. O achado ocorreu no decurso de pesquisas entomológicas realizadas em 1995. Em seguida, a espécie foi localizada no principal porto marítimo de exportação para os EUA, na costa do Pacífico. Em todas as coletas realizadas em ambiente urbano na Guatemala, Ae. albopictus foi a segunda espécie mais freqüente depois de Ae. aegypti. Em contraste, no ambiente rural, Ae. albopictus foi mais freqüente nas coletas do que a espécie Ae. aegypti (OGATA & SAMAYOA, 1996). O encontro da espécie Ae. albopictus no território da República Dominicana, em área urbana e silvestre foi relatado por Peña em 1993. Dois anos mais tarde, o sistema de vigilância do Programa Nacional Cubano de Erradicação do Ae. aegypti coletou formas imaturas de Ae. albopictus em armadilhas para larvas (BROCHE & BORJA, 1999). Estes pesquisadores sugeriram que a espécie Ae. albopictus tenha sido introduzida no país por meio de carregamento procedente da República Dominicana ou México, pelo porto de Havana. O primeiro registro da presença de Ae. albopictus na Colômbia data de 1998 durante investigação epidemiológica de doenças tropicais. Foram capturados oito exemplares adultos na cidade de Letícia, fronteira com o Brasil (VÉLEZ et al., 1998). Infestações de Ae. albopictus também já foram reconhecidas na Bolívia, El Salvador, Ilhas Cayman e Barbados (REITER, 1998). A presença da espécie Ae. albopictus na Argentina foi registrada em 1998, em San Antonio, Província de Misiones, a partir de material coletado em recipiente em local sombreado, no jardim de uma casa, situada a 100 metros do rio San Antonio, fronteira com o Brasil (ROSSI et al., 1999). 7 2.1.2.3.1 Brasil No Brasil, a espécie Ae. albopictus foi encontrada pela primeira vez em 1986, na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Município de Itaguaí, Estado do Rio de Janeiro. A identificação da espécie é creditada e mencionada por diversos pesquisadores como sendo de FORATTINI (1986), já que o primeiro registro foi de sua autoria. Entretanto, um dos pesquisadores que vivenciou os fatos da época relata que, algumas larvas existentes num pneu de trator foram coletadas pelo Prof. Eugênio Izeckson e entregues ao Dr. Hugo de Souza Lopes, pesquisador da Fundação Oswaldo Cruz para que fossem identificadas. No laboratório de Entomologia, Dr. Hugo e mais dois pesquisadores examinaram os exemplares e os identificaram como Ae. albopictus. Contudo, como à época não havia registro desta espécie no Rio de Janeiro e nenhum espécime para que a devida comparação fosse feita, indivíduos adultos foram enviados para o Laboratório de Entomologia da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo, e a identificação foi confirmada pelo Dr. Oswaldo Forattini (comunicação pessoal1). Neste mesmo ano, registrou-se a ocorrência desta espécie em mais três Estados: Minas Gerais, Espírito Santo e São Paulo. Em Minas Gerais, larvas de Ae. albopictus foram encontradas no peridomicílio de uma casa localizada no distrito de Venda Nova, em Belo Horizonte (NEVES & ESPÍNOLA, 1986). Um levantamento realizado pela Superintendência de Campanhas de Saúde Pública (SUCAM) no Estado do Espírito Santo encontrou formas adultas ou imaturas da espécie em praticamente toda a metade sul do Estado (FERREIRA NETO et al., 1987). Exemplares imaturos de Ae. albopictus foram coletados em uma área urbana de um município do Estado de São Paulo, próximo à divisa com o Estado do Rio de Janeiro, em setembro de 1986 (BRITO et al., 1986). Registros da ocorrência de Ae. albopictus no Estado de São Paulo até 1995 mostram que dos 626 municípios paulistas, 617 já estavam infestados pela espécie de mosquito. Estes dados demonstram a velocidade de ocupação da espécie no Estado em pouco tempo, ultrapassando até o número de municípios infestados por Ae. aegypti (GLASSER & GOMES, 2000, 2002). Dez anos depois do primeiro registro de Ae. albopictus no Brasil, a espécie foi encontrada na cidade de Curitiba, Estado do Paraná (1996), onde foram coletadas duas fêmeas (SANT’ANA, 1996). O primeiro registro da presença de Ae. albopictus no Mato 1 Ricardo Lourenço de Oliveira - Fiocruz 8 Grosso do Sul foi no município de Douradina em 1997, onde foram encontradas formas imaturas da espécie (SANTOS & NASCIMENTO, 1998). A espécie também já foi encontrada em área rural do Estado (GOMES et al., 1999). Acredita-se que o exemplar tenha imigrado para o Estado por transporte rodoviário, proveniente de algum Estado onde sua ocorrência já fôra relatada (SANTOS & NASCIMENTO, 1998). Em 2000, foi registrada a presença de Ae. albopictus em remanescentes de Mata Atlântica, localizada em área urbana de Recife, Pernambuco (ALBUQUERQUE et al., 2000). No Estado de Santa Catarina, em 2001, foram capturadas três fêmeas adultas na Praia de Itaguaçu, na Ilha de São Francisco do Sul, litoral norte do Estado (LÖWENBERG-NETO & NAVARRO-SILVA, 2002). As publicações mais recentes relatam a invasão desta espécie em dois Estados do Norte do país. No Pará, foram capturados 42 exemplares de mosquitos adultos em área urbana (SEGURA et al., 2003) e no município de Manaus, Amazonas, foram capturados dois exemplares (FÉ et al., 2003). Apesar da primeira publicação existente no País referir-se ao achado de 1986, alguns pesquisadores acreditam que Ae. albopictus já estava no Brasil desde 1976. No entanto, não há documentos que registrem tal ocorrência (comunicação pessoal2). Tanto assim, que de acordo com a FUNASA (Fundação Nacional de Saúde), em 1987 já era possível detectar a presença dessa espécie em mais de 50 municípios brasileiros. Esses dados da FUNASA levam a crer que esta espécie tenha colonizado o país muito antes do que se pensa. Seja como for, 11 anos depois do primeiro relato (1986), Ae. albopictus já se encontrava presente em todos os municípios do Estado do Rio de Janeiro (comunicação pessoal2). Essa espécie vem se disseminando por todo o país, de tal forma que, até 2002 já infestava cerca de 20 dos 27 estados brasileiros, não havendo relatos nos estados do Amapá, Roraima, Acre, Tocantins, Piauí, Ceará e Sergipe (SANTOS, 2003). 2.1.3 Expansão Geográfica e Origem Antes de 1985, a distribuição de Ae. albopictus, espécie também conhecida como “tigre asiático”, era restrita à Ásia, seu local nativo e algumas ilhas do Oceano Pacífico. Acredita-se que sua expansão esteja relacionada com o intenso comércio de pneus usados ao redor do mundo, podendo carrear ovos ou formas imaturas (RAI, 1991). A velocidade com que essa espécie se dispersou para outros países leva a crer 2 Alan Gallardo - FUNASA 9 que os transportes aéreo e rodoviário, além do marítimo, exerceram um importante papel nessa expansão. Outro fator que contribui para essa dispersão é o fato de não existirem atividades de controle de vetores e de vigilância entomológica adequadas na maior parte dos países infestados (ESTRADA-FRANCO & CRAIG, 1995). A introdução de Ae. albopictus nos EUA ocorreu pela importação de pneus que continham larvas e ovos de Ae. albopictus vindos da Ásia (Japão ou Taiwan) (MONATH, 1986; SPRENGER & WUITHIRANYAGOOL, 1986; HAWLEY et al., 1987; REITER & SPRENGER, 1987; CRAVEN et al., 1988; FRANCY et al., 1990; O’MEARA et al., 1992, 1993, 1995; REITER, 1998). No estado da Flórida, além do comércio de pneus, há outros três fatores específicos que parecem contribuir para a disseminação da espécie: 1) extensa disponibilidade de habitats aquáticos apropriados e 2) diminuição das populações de Ae. aegypti (O’MEARA et al., 1993). O início da infestação no Brasil, embora também pareça estar relacionada com o transporte marítimo (OPS, 1987), não permite concluir sobre a sua origem. Para a Organização Panamericana da Saúde (1987) a espécie pode ter entrado no país, possivelmente em internódios de bambus, vinda do sudeste Asiático. Já RAI (1991) acredita que espécimes oriundos da América do Norte iniciaram a colonização. A terceira hipótese, sugerida por diversos autores (FORATTINI, 1986; MARQUES & MIRANDA, 1992; CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994; SANT’ANA, 1996; SANTOS E NASCIMENTO, 1998), aponta o Japão como origem, através do intercâmbio marítimo desse país com o sistema portuário do Estado do Espírito Santo. Em 1991, KAMBHAMPATI e colaboradores conduziram um estudo a fim de traçar geneticamente a origem geográfica de 57 populações de Ae. albopictus procedentes dos Estados Unidos da América, Japão, China e Brasil. Esses estudos demonstraram que cepas norte-americanas e brasileiras são similares às populações de Ae. albopictus de zonas temperadas do Japão (nordeste da Ásia). No entanto, estudos de perfis de DNA mitocondrial em indivíduos oriundos dos EUA e do Brasil, mostraram que as populações brasileiras continham haplotipos específicos diferentes daqueles encontrados nos norte-americanos. Portanto, não há evidências de contato genético desde a introdução da espécie nos dois continentes, sugerindo que estas populações continuam a evoluir independentemente (BIRUNGI & MUNSTERMANN, 2002). Embora as duas populações tenham colonizado os respectivos continentes quase ao mesmo tempo, as análises enzimáticas sugerem que a história de colonização seja distinta. 10 Estudos recentes realizados com amostras brasileiras e norte-americanas demonstraram que Ae. albopictus de diferentes localidades no Brasil têm alta variação genética entre elas e também, quando comparadas às amostras dos Estados Unidos da América. Observou-se também que amostras de Ae. albopictus eram mais diferenciadas dentro de uma cidade do que aquelas coletadas numa distância geográfica maior (AYRES et al. 2002, LOURENÇO-DE-OLIVEIRA et al., 2003). Padrões similares de variação isoenzimática detectados em populações nativas da Ásia sugerem que a diferenciação genética local é característica desta espécie (BLACK et al., 1988). O sucesso da espécie Ae. albopictus como invasora parece resultar de vários aspectos de sua biologia, como: adaptabilidade a diferentes habitats, hábitos alimentares ecléticos, resistência dos ovos à dessecação, adaptabilidade a diferentes condições climáticas e capacidade de viver em ambientes antrópicos (HAWLEY, 1988; FOCKS et al., 1994). 2.1.4 Biologia Aedes albopictus é uma espécie de mosquito que combina hábitos silvestres e urbanos, com capacidade de ovipor em criadouros naturais ou artificiais (GILOTRA et al., 1967; CHAN et al., 1971; HAWLEY, 1988), que contenham água limpa, pobre em sais minerais e matéria orgânica (BARRERA, 1996; JULIANO, 1998). Já foi encontrado em habitats naturais como ocos de árvores, internódios de bambu, escavações em pedras e axilas de plantas como bromeliáceas. Na zona urbana, utiliza uma extensa variedade de recipientes artificiais como pneus, latas, vidros, cacos de garrafas, vasos de cemitérios, tonéis, latões, caixas d’água, pratos sob vasos, armadilhas para formigas ou bebedouros de água para animais (GILOTRA et al., 1967; CHAN et al., 1971; HAWLEY, 1988; MOORE et al., 1988; FORATTINI et al., 1998a,b, 2001). Os recipientes naturais como ocos de árvores e bromeliáceas parecem estar entre os habitats onde as larvas de Ae. albopictus são mais freqüentemente encontradas nas áreas semi-urbanas dos Estados Unidos da América e do Brasil (GOMES et al., 1992; O’MEARA et al., 1993). A primeira vez que se coletaram formas imaturas da espécie em oco de árvore no Brasil, foi em 1988, no Estado de São Paulo (GOMES & MARQUES, 1988). O encontro de formas imaturas da espécie criando-se em bromélias tem importante significado epidemiológico, já que essas plantas vêm sendo cada vez mais usadas, para fins decorativos, em varandas de domicílios, quintais (peridomicílio) 11 e muitas vezes fixadas em árvores (NATAL et al., 1997; FORATTINI et al., 1998b). Dentre os criadouros artificiais de Ae. albopictus, pneus têm merecido atenção da vigilância epidemiológica pois são freqüentemente colonizados por esses mosquitos, representando importante foco de manutenção da espécie durante todo o ano (SOUZASANTOS, 1999; HONÓRIO & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 2001). A predominância de seus criadouros é em áreas rurais ou semi-urbanas, ao redor dos domicílios, com alguma sombra ou abrigo em vegetação baixa, mas também podendo ser encontrado no ambiente doméstico (GILOTRA, 1967; CHAN et al., 1971). Os ovos de Ae. albopictus são depositados em pequena quantidade em cada criadouro, ficam sobre a água ou aderidos à parede do recipiente que os contém (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA,1994). A resistência à dessecação depende do completo embrionamento e da exposição à umidade relativa de 70-80% nas primeiras 24 horas. Em experimentos laboratoriais, o período máximo de sobrevivência à dessecação foi de 243 dias, com temperatura variando de 16ºC a 25ºC e umidade relativa entre 60% e 70%. Nestas condições, após 2 meses houve a eclosão de 94,7% dos ovos (ESTRADA-FRANCO & CRAIG, 1995). Os ovos do Ae. albopictus são capazes de resistir a baixas temperaturas, o que permite à espécie ultrapassar o período de inverno, em regiões de alta latitude (35º a 65º). Essa capacidade, conhecida como diapausa, é caracterizada por estado de suspensão de funções e desenvolvimento que é desencadeada por baixas temperaturas, fotoperíodo curto, dessecação ou hipóxia/anóxia (HAWLEY, 1988; FOCKS et al., 1994). Provavelmente foi este fenômeno que permitiu ao Ae. albopictus colonizar rapidamente a região norte dos EUA. Para as cepas tropicais, a sobrevivência parece depender da eclosão errática, mais do que da diapausa. Considera-se que Ae. albopictus seja uma espécie com diapausa facultativa (ESTRADA-FRANCO & CRAIG, 1995). Estudos sobre o comportamento hematofágico das fêmeas de Ae. albopictus mostram que esta espécie tende a ser eclética com características oportunistas (SULLIVAN et al., 1971; SAVAGE et al., 1993). Na natureza, as fêmeas alimentam-se de ampla variedade de hospedeiros, porém, os mamíferos exercem maior atratibilidade sobre elas. Diversos trabalhos utilizando o teste de precipitina demonstram a atração deste mosquito por seres humanos, coelhos, cervos, cães, gatos, porcos, vacas, cavalos, ratos, tartarugas, mãos pelada, além de alguns tipos de aves como passariformes, columbiformes, ciconiformes ou galináceos (HESS et al., 1968; SAVAGE et al., 1993; NIEBYLSKI & CRAIG, 1994). Fêmeas capturadas em áreas silvestres próximas a 12 habitações humanas continham tanto sangue humano quanto de animais domésticos (COLLESS, 1959; HESS et al., 1968; TEMPELIS et al., 1970; SULLIVAN et al., 1971). No Brasil, no município de Belo Horizonte, MG, capturas com iscas humanas e animais mostraram que seres humanos atraíram maior número de fêmeas de Ae. albopictus (71,6%), seguidos por bovinos (22,8%) e cães (5,6%) (NEVES & SILVA, 1989). O comportamento eclético de Ae. albopictus faz com que a hematofagia dependa da abundância relativa de vertebrados e, portanto, varia entre regiões ou dentro de uma mesma região. Aedes albopictus são mais atraídos por seres humanos, mas a disponibilidade de hospedeiros parece ser fundamental na conduta das populações de mosquitos (HO et al., 1973). É uma espécie que convive em zonas adjacentes aos seres humanos, mostrando comportamento zoofílico, portanto, pode participar dos ciclos zoonóticos silvestres e transmitir enfermidades ao seres humanos e animais (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994). Em média, as fêmeas de Ae. albopictus ingerem sangue pela primeira vez dois dias após a emersão (DEL ROSÁRIO, 1963). A atividade horária de hematofagia já foi estudada por diversos pesquisadores e, de modo geral, observou-se que a atividade matutina das fêmeas de Ae. albopictus se dá entre 6:00 e 8:00 e a vespertina logo depois do pôr do sol, de 17:30 às 18:30 (HO et al., 1973; BASIO & SANTOS-BASIO, 1974; ESTRADA-FRANCO & CRAIG, 1995; MARQUES & GOMES, 1997). No entanto, observou-se que as fêmeas dessa espécie picam ao longo de todo o dia e no peridomicílio (PANT et al., 1973; FORATTINI et al., 2000), enquanto Ae. scapularis, por exemplo, apresenta maior atividade hematofágica no final da tarde, período correspondente ao crepúsculo vespertino (FORATTINI et al., 2000). A abundância de adultos de Ae. albopictus depende principalmente da temperatura e das chuvas, que variará segundo a região onde se localiza. Aqui no Brasil, na região do Vale do Paraíba, a espécie é mais abundante nos meses chuvosos de janeiro a maio, correspondentes às estações verão/outono (MARQUES & GOMES, 1997; FORATTINI et al., 2000), assim como em Singapura, Malásia (HO et al., 1971) e em New Orleans, EUA (ESTRADA-FRANCO & CRAIG, 1995). Dispersão ativa e passiva são fatores importantes na determinação da distribuição das espécies. A dispersão de Ae. albopictus pode ocorrer em todas as fases de desenvolvimento, porém com eficiência diferente. A autonomia de vôo de cepas 13 norte-americanas de Ae. albopictus de Potosi, Missouri foi de 525 metros para fêmeas e 225 metros para machos. No entanto, observou-se que 90% dos espécimes permanecem num raio de 100 metros (NIEBYLSKI & CRAIG, 1994). No Brasil, cepas de Nova Iguaçu, Rio de Janeiro se dispersaram num raio de 800 metros, distância máxima estabelecida no estudo. Entretanto, o autor sugeriu que o vetor poderia estar se dispersando além do raio estudado (HONÓRIO, 1999). A maior parte dos dados sobre longevidade de adultos de Ae. albopictus são provenientes de investigação em laboratórios. Nessas condições, a longevidade máxima observada, sob condições controladas de temperatura e umidade, variou desde 30 até 117 dias (HYLTON, 1969; HIEN, 1976; GAO et al., 1984; XAVIER et al., 1991). 2.1.5 Ae. albopictus como vetor de patógenos 2.1.5.1 Protozoários e vírus Aedes albopictus é susceptível à infecção com Plasmodium gallinaceum e capaz de transmitir o protozoário para outras aves. Esta característica faz com que Ae. albopictus seja um modelo útil para estudos de malária (RUSSEL & MENON, 1942). Vários estudos de competência vetorial envolvendo principalmente cepas americanas de Ae. albopictus, demonstraram que a espécie é capaz de transmitir 23 arboviroses e o vírus Nodamura (SHROYER, 1986; MITCHELL, 1991; MOORE & MITCHELL, 1997). É vetor potencial de sete vírus do gênero Alphavirus (Chikungunya, Encefalite Eqüina do Leste, Mayaro, Ross River, Encefalite Eqüina do Oeste, Encefalite Eqüina Venezuelana e virus Sindbis) (MITCHELL et al., 1987; BEAMAN & TURELL, 1991; SMITH & FRANCY, 1991; TURELL et al., 1992, 1994; DOHM et al., 1995), de oito vírus do gênero Flavivirus (Dengue, sorotipos 1, 2, 3 e 4, Encefalite Japonesa, Febre do Oeste do Nilo, Febre amarela e Encefalite St. Louis) (MITCHELL et al., 1987; SAVAGE et al., 1994; TURELL et al.. 2000, 2001) e de oito vírus pertencentes à família Bunyaviridae (Jamestown Canyon, Keystone, La Crosse, Oropouche, Potosi, Rift Valley fever, San Angelo e Trivittatus) (TESH & GUBLER, 1975; GRIMSTAD et al., 1989; MITCHELL, 1991; SMITH & FRANCY, 1991; MITCHELL, 1995). A susceptibilidade a essa variedade de vírus pode depender das diferentes populações geográficas (TESH et al., 1976; BEAMAN & TURELL, 1991; TURELL et al., 1992). Embora Ae. albopictus seja vetor competente para essas arboviroses em 14 condições experimentais, na natureza somente foi encontrado infectado com os vírus Dengue, Encefalite Japonesa, Potosi, Keystone, Tensaw, Febre do Oeste do Nilo e Encefalite Eqüina do Leste (MITCHELL et al., 1992; HOLICK, 2002). Com exceção do vírus Dengue, o papel do Ae. albopictus nos ciclos de transmissão natural destes cinco vírus não está claro. Dos cinco isolamentos, provavelmente o mais alarmante, junto com o vírus Dengue, seja o do vírus da Encefalite Eqüina do Leste (EEE) (MITCHELL et al., 1992). No Brasil, em 1993, isolou-se pela primeira vez o vírus DEN-1 de uma larva de Ae. albopictus naturalmente infectada, na cidade de Campos Altos, Minas Gerais (SERUFO et al., 1993). Anteriormente, estudos haviam sido realizados com cepas de Ae. albopictus coletadas em Anchieta e Santa Teresa (Espírito Santo) e em São Paulo, demonstrando sua capacidade de transmitir verticalmente os sorotipos 1 e 4 do vírus Dengue (MILLER & BALLINGER, 1988; MITCHELL & MILLER, 1990). Os pesquisadores sugeriram à época, que cepas brasileiras teriam o potencial de exercer um papel de manutenção do vírus na natureza e que poderiam tornar-se vetores do vírus da dengue em futuras epidemias no país. A alta incidência anual de dengue no Brasil, com mais de 740.000 casos registrados em 2002 (FUNASA, 2003), faz com que Ae. albopictus possa exercer algum papel na transmissão. Além do dengue, a febre amarela é outra arbovirose importante no Brasil e estudos experimentais indicam que cepas de Ae. albopictus de Cariacica, Espírito Santo são susceptíveis à infecção oral com este vírus (MITCHELL et al., 1987; MILLER & BALLINGER, 1988; MILLER et al., 1989). Conforme mencionado por FRANCY e colaboradores (1990) “existe a possibilidade de que outros vírus, que até o momento não tinham infectado seres humanos em grau apreciável devido aos hábitos de alimentação de seus vetores artrópodes excluírem o ser humano, possam ser transmitidos a este pelo Ae. albopictus, como conseqüência de seu hábito hematofágico agressivo em relação aos seres humanos e a outros hospedeiros mamíferos”. Esta hipótese pode ser extrapolada para outros patógenos em que Ae. albopictus seja vetor experimental ou natural. No Japão, EUA, Taiwan e Malásia, esta espécie é importante vetor de Dirofilaria immitis, no entanto, no Brasil, ainda não há estudos que comprovem nem sua competência e nem sua capacidade vetorial para este filarídeo. 15 2.1.5.2 Dirofilaria immitis Existem diversas publicações analisando a competência e a capacidade vetorial de Ae. albopictus à D. immitis. Esses estudos foram conduzidos sob condições controladas em laboratório ou em estudos realizados a campo, sofrendo as influências naturais da região onde foram executados. A maioria dos trabalhos em laboratório foi realizada no continente asiático, origem geográfica da espécie. O primeiro estudo mostrando que Ae. albopictus é um potencial vetor de D. immitis foi realizado com espécimes coletados em Tóquio, no Japão (INOUE, 1937). Um ano depois, o mesmo estudo foi feito no Vietnam, por GALLIARD & DANG-VAN-NGU (1938). Anos mais tarde, os estudos para avaliar a competência vetorial da espécie foram intensificados em vários países deste continente como Filipinas (KARTMAN, 1953), China (FU, 1958), Singapura (CHELLAPPAH & CHELLAPPAH, 1968), Japão (KEEGAN et al., 1967; INTERMILL & FREDERICK, 1970; SUENAGA, 1972; KONISHI, 1989a; ZYTOON et al., 1992), Tailândia (CHOOCHOTE et al., 1987) e Taiwan (WU et al., 1988; LAI, 2000, 2001). Na Europa, somente dois estudos foram realizados mostrando que Ae. albopictus permite o desenvolvimento de larvas até a forma infectante em seu organismo; um deles em Londres, na Inglaterra (WEBBER & HAWKING, 1955) e outro, mais recente, em Civitavecchia na Itália, onde os autores sugerem que esta espécie pode contribuir para a dispersão de D. immitis no país (CANCRINI et al., 1995). Nos EUA, o primeiro estudo com Ae. albopictus foi realizado logo após sua introdução no país (1987-1988), com duas linhagens da Carolina do Norte. Os pesquisadores encontraram larvas de primeiro e segundo estádios deterioradas nos tubos de Malpighi, sugerindo interrupção no desenvolvimento do parasito. Este achado levou os autores a concluírem que Ae. albopictus não era um vetor potencial de D. immitis no país (APPERSON et al., 1989). No entanto, estudos realizados mais tarde, com diferentes populações de Ae. albopictus de diversos estados do país, demonstrou sua competência vetorial (SCOLES, 1994; SCOLES & DICKSON, 1995). Estudos conduzidos sob condições naturais revelam que, até o momento, Ae. albopictus é um vetor potencial de D. immitis em alguns países da Ásia e nos EUA. A primeira vez que a espécie Ae. albopictus foi encontrada naturalmente infectada foi em 1973, na cidade de Nagasaki, no Japão (SUENAGA & ITOH, 1973). Foram coletados 21/791 (2,7%) mosquitos da espécie infectados, sendo Ae. albopictus considerado um 16 dos vetores secundários importantes na cidade, hipótese também sugerida por ODA e colaboradores (1995) anos mais tarde, num estudo conduzido na mesma cidade. Outros achados ainda no Japão incluem 1,8% (13/2093) de mosquitos infectados na cidade de Omura (SUENAGA, 1975) e 0,08% (5/6135) na cidade de Miki (KONISHI, 1989b). Aedes albopictus também já foi identificado como vetor de D. immitis na Malásia (SULAIMAN & JEFFERY, 1986) e em Taiwan, com prevalência entre 1,3% e 3,7% de mosquitos infectados (WU et al., 1988, 1997; LAI et al., 2001). O primeiro relato da espécie Ae. albopictus encontrada infectada naturalmente com Dirofilaria sp. nos EUA foi em 1994, em New Orleans, Louisiana. Foram coletados 163 espécimens e encontraram três deles com larvas de primeiro estádio nos tubos de Malpighi (COMISKEY & WESSON, 1995). Na mesma cidade, foi encontrado um mosquito albergando uma larva de terceiro estádio dentre 456 indivíduos examinados, implicando a espécie como vetora de D. immitis em New Orleans (SCOLES, 1997). Em Ft. Pierce, na Flórida, estádios imaturos (larvas de primeiro e segundo estádios) do gênero Dirofilaria foram encontrados nos tubos de Malpighi de 6 do total de 220 fêmeas coletadas, indicando que Ae. albopictus podem ser infectados naturalmente com D. immitis na Flórida (NAYAR & KNIGHT,1999). 2.1.5.2.1 Susceptibilidade da espécie Ae. albopictus à infecção por D. immitis Vários estudos relatam o grau de susceptibilidade de populações de Ae. albopictus em regiões do mundo onde a espécie ocorre. KARTMAN (1953), trabalhando com uma linhagem originalmente coletada nas Filipinas, encontrou somente 10% de Ae. albopictus infectados, embora fosse um hospedeiro altamente eficiente. No Japão há vários trabalhos estudando a susceptibilidade da espécie, com percentuais de mosquitos infectantes desde 1,6% (1/64) (KEEGAN et al., 1967), 3,9% com 3,5 L3/mosquito (INTERMILL & FREDERICK, 1970), 20% (SUENAGA, 1972) até 1040% de Ae. albopictus com larvas de terceiro estádio (KONISHI, 1989a). Numa linhagem de Singapura observou-se 13,3% (27/203) mosquitos infectantes com média de 7,6 L3 por mosquito (CHELLAPPAH & CHELLAPPAH, 1968), taxa muito próxima ao encontrado na Tailândia, com 15,69% de indivíduos com L3 e média de 3,25 L3 por mosquito (CHOOCHOTE et al., 1987). A competência vetorial de Ae. albopictus originário de Taiwan foi avaliada após alimentação sanguínea com diferentes concentrações de microfilárias. O estudo revelou que a média de larvas infectantes por mosquito variou de 1,7 a 3,1 e que a taxa de infecção de 19 a 21,5%. A eficiência 17 vetorial da espécie variou de 6,75 a 13,79, sendo que o maior índice foi alcançado quando os mosquitos se alimentaram com sangue contendo 2500 mf/mL, a menor concentração usada no estudo (LAI et al., 2000). As taxas de susceptibilidade das populações americanas são relativamente maiores do que as populações asiáticas. Num estudo recente, houve variação significativa na susceptibilidade à D. immitis entre 11 linhagens americanas estudadas. A susceptibilidade foi maior que 30% em uma das populações (INDY) e maior que 20% em cinco outras populações (CORPUS, GENTILLY, MEMPHIS, NEW ORL e ROCKINGHAM). Estes valores indicam fortemente a possibilidade da espécie Ae. albopictus participar da transmissão de D. immitis nos EUA. Dentre as 11 linhagens estudadas, duas eram provenientes do estado do Texas e uma delas (HOUSTON) mostrou nível muito baixo de infectividade, ao contrário da linhagem CORPUS. Embora nenhuma linhagem tenha sido completamente refratária, três delas foram susceptíveis em níveis tão baixos que foram consideradas refratárias (aproximadamente 5%). As populações estudadas albergavam de 1,0 a 4,6 L3/mosquito infectante. Observou-se ainda que não houve uma relação entre a distribuição geográfica das linhagens e as altas taxas de susceptibilidade (SCOLES, 1994). Interessante ressaltar um estudo conduzido com sete linhagens de uma mesma cidade, New Orleans, LA, cuja susceptibilidade variou de 24% até 74% e encontrou-se de 3,6 a 9,4 L3 por mosquito infectante (SCOLES, 1994, 1997), demonstrando que há uma variação substancial na susceptibilidade entre as populações de Ae. albopictus dos EUA e que algumas delas são vetoras competentes de D. immitis (SCOLES 1994, 1997; SCOLES & DICKSON, 1995). Aedes albopictus é uma espécie que responde rapidamente à seleção para susceptibilidade à D. immitis. A susceptibilidade de uma linhagem de New Orleans, LA, aumentou de 23% para 70% em cinco gerações, sugerindo que com o passar do tempo Ae. albopictus pode adaptar-se à infecção com linhagens de D. immitis encontradas nos EUA (SCOLES, 1994). 2.1.6 Interação Ae. albopictus com Ascogregarina taiwanensis e Wolbachia sp. Espécies do gênero Ascogregarina (syn. Ascocystis; Lankesteria) infectam vários mosquitos, especialmente aqueles do gênero Aedes (WARD et al., 1982; BLACKMORE et al., 1995) e são espécie específicas (LIEN & LEVINE, 1980). 18 Ascogregarina taiwanensis (Lien & Levine) foi descrita em Aedes albopictus capturados em Taiwan (LIEN & LEVINE, 1980) e desenvolve-se extracelularmente após um curto estádio de vida intracelular, no intestino da larva do mosquito infectado. Os oocistos de Ascogregarina habitam a luz dos tubos de Malpighi de mosquitos adultos e são liberados durante defecação ou oviposição. Seu desenvolvimento está aparentemente sincronizado com o hospedeiro (CHEN & YANG, 1996; CHEN et al., 1997; CHEN, 1999; CHEN & FAN-CHIANG, 2001). Parasitos do gênero Ascogregarina não parecem ser deletérios para seu hospedeiro natural (McGRAY et al., 1970; WALSH & OLSON, 1976) embora possam ser patogênicos para espécies de mosquitos nos quais não se desenvolvam normalmente (ROWTON et al., 1987). Este parasito tem sido descrito em Ae. albopictus na Índia (RAY, 1933), China (FENG, 1933), Malásia (ELSE & DANGSUPA, 1974) e nos EUA nos Estados de Illinois, Missouri e Florida (MUNSTERMANN & WESSON, 1990). Ainda há dúvidas se Ascogregarina afeta o desenvolvimento de estádios larvais de D. immitis em Ae. albopictus, pois a larva de D. immitis também se desenvolve tanto intra quanto extracelularmente nos tubos de Malpighi (NAYAR & KNIGHT, 1999). Anteriormente, BEIER & HARRIS (1983) mostraram que o desenvolvimento da larva de D. immitis em Aedes triseriatus (Say) e a sobrevivência de fêmeas foram similares em mosquitos infectados ou não, com Ascogregarina barrettii. Entretanto, em Aedes aegypti (L) infectado com Ascogregarina (Acocystis) culicis (Ross) houve menor taxa de sobrevivência e desenvolvimento de poucas larvas infectantes (SNELLER, 1979). Um estudo realizado recentemente mostrou que o desenvolvimento da larva de D. immitis em Ae. albopictus não foi afetado pela co-infecção com Ascogregarina taiwanensis, embora ambos os parasitos infectem os tubos de Malpighi (NAYAR & KNIGHT, 1999). Uma bactéria intracelular do gênero Wolbachia infecta diversos artrópodes, incluindo importantes insetos (WERREN et al., 1995; JEYAPRAKASH & HOY, 2000). Os efeitos causados pela infecção com Wolbachia foram originalmente observados em Culex pipiens L. como um fator citoplasmático por transmissão vertical que causava incompatibilidade unidirecional (LAVEN, 1951). Sabe-se atualmente que infecções com Wolbachia induzem incompatilidade citoplasmática, feminilização, morte de machos ou partenogênese (WERREN, 1997; BOURTZIS et al., 1998). Embora algumas populações de hospedeiros incluam indivíduos infectados e não infectados, indivíduos não infectados são raros (DOBSON & RATTANADECHAKUL, 19 2001) e a freqüência de infecção com Wolbachia em populações coletadas no campo, como em Ae. albopictus, pode chegar a 100% (KITTAYAPONG et al., 2002a,b). Aedes albopictus infectados por Wolbachia foram descobertos por WRIGHT & BARR (1980), que relataram a presença da bactéria em ovários de mosquitos coletados na Tailândia. 2.2 Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) 2.2.1 Taxonomia Classificação sistemática do agente etiológico segundo ANDERSON & BAIN (1976): Reino: Animalia Filo: Nematelmintos Classe: Nematoda Ordem: Spirurida Superfamília: Filarioidea Família: Onchocercidae Leiper, 1911 Subfamília: Dirofilariinae Sandground, 1921 Gênero: Dirofilaria Railliet & Henry, 1911 Espécie: Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Raillet & Henry, 1911 Dirofilaria immitis foi primeiramente descrito por Leidy em 1850, como Filaria canis cordis. Pouco mais tarde, em 1856, o próprio autor da espécie renomeou-a como Filaria immitis (LEIDY, 1856). O gênero Dirofilaria foi estabelecido em 1911 por Railliet e Henry, que designaram F. immitis como a espécie tipo e uma revisão do gênero apresenta uma relação de todas as espécies sinonimizadas a D. immitis (ANDERSON, 1952). 2.2.2 Biologia As espécies do gênero Dirofilaria são, na fase adulta, nematóides longos, de coloração esbranquiçada, com extremidade anterior circundada por papilas cefálicas pequenas e esôfago indistintamente dividido em porção anterior muscular e posterior glandular. Apresentam acentuado dimorfismo sexual. Os machos medem de 12 a 20 cm de comprimento, apresentando a cauda espiralada, dois espículos diferentes em tamanho e em forma, sem gubernáculo. As fêmeas medem de 25 a 31 cm de comprimento, apresentando extremidade caudal arredondada e vulva ligeiramente abaixo da junção do esôfago com o intestino (ANDERSON, 1952; SOULSBY, 1968; LOK, 1988). 20 As microfilárias de D. immitis não possuem bainha, medem em média 308 µm (295-325 µm) de comprimento e 7 µm (5-7,5 µm) de espessura e são encontradas em quantidades variáveis na corrente sangüínea de cães (LOK, 1988). Quando amostras de sangue são submetidas à técnica de KNOTT (1939) modificada por NEWTON & WRIGHT (1956), as microfilárias apresentam-se com o corpo e extremidade caudal estendidas e com a extremidade cefálica afilada (ANDERSON, 1952). Assim como a maioria dos filarídeos, os membros do gênero Dirofilaria necessitam de hospedeiro intermediário artrópode para a realização do seu ciclo vital (LEVINE, 1968). Esse gênero é o único na família Onchocercidae cujas larvas desenvolvem-se em tubos de Malpighi de mosquitos da família Culicidae (SYMES, 1960; WALTERS & LAVOIPIERRE, 1982; SAUERMAN & NAYAR, 1983). TAYLOR (1960) acompanhou a evolução das larvas de D. immitis no mosquito Aedes aegypti a 26°C com 80% de umidade relativa e descreveu três estádios evolutivos no hospedeiro invertebrado, com uma ecdise entre cada um deles. Durante o repasto sangüíneo, as fêmeas de culicídeos ingerem sangue do cão parasitado juntamente com as larvas de primeiro estádio de D. immitis (LOK, 1988). Essas microfilárias permanecem no intestino médio do mosquito durante as primeiras 24h, assemelhando-se ainda à forma encontrada no sangue canino. Nas próximas 24h, as larvas migram para as porções distais dos tubos de Malpighi, onde penetram nas células primárias (TAYLOR, 1960; BRADLEY & NAYAR, 1987). A seguir, as larvas encurtam-se e aumentam seu diâmetro, atingindo o estádio chamado “salsichóide”. Este estádio apresenta a metade anterior do corpo mais delgada que a metade posterior que, por sua vez, tem uma fina cauda. As larvas salsichóides medem, em média, 130 µm em comprimento e 30 µm em diâmetro. Estruturas tais como, anel nervoso, células musculares e sistema digestivo composto de esôfago, intestino e reto já são distinguíveis nesse estádio (TAYLOR, 1960). Aproximadamente ao sexto dia, as larvas migram das células primárias para a luz dos tubos de Malpighi, onde fazem a primeira e segunda mudas. Por volta do nono ao décimo terceiro dia, as larvas já estão no segundo estádio e todas as estruturas internas estão mais evidentes. A larva torna-se alongada e muito ativa (TAYLOR, 1960) medindo em média, 500 µm em comprimento e 25 µm em diâmetro (ANDO, 1984). As larvas de terceiro estádio, que começam a aparecer a partir do décimo quarto dia após a ingestão das microfilárias, apresentam um pequeno tubo cuticular, ligando a 21 cavidade bucal ao esôfago. O trato digestivo se abre para o exterior através da cavidade bucal e do ânus. A larva de terceiro estádio é a forma infectante para o hospedeiro vertebrado (TAYLOR, 1960) e sua forma alongada é importante, pois facilita seu deslocamento pelas peças bucais estreitas do mosquito, assim como através dos finos capilares sangüíneos do cão. As larvas infectantes medem 1000 µm em comprimento e 20 µm em diâmetro, em média (ANDO, 1984). Essas larvas infectantes perfuram as extremidades distais dos tubos de Malpighi e migram pela hemocele, indo se localizar nos espaços cefálicos e na probóscida do mosquito (KARTMAN, 1953; TAYLOR, 1960; ABRAHAM, 1988). Quando as larvas de terceiro estádio se encontram na probóscida dos mosquitos e eles fazem seu próximo repasto sangüíneo, estas larvas migram ativamente para a pele do mamífero, penetram através do orifício produzido pela picada e permanecem temporariamente no tecido subcutâneo (ABRAHAM, 1988). Três a quatro dias depois essas larvas fazem outra muda, passam ao quarto estádio (12 a 15 mm de comprimento) e iniciam a sua migração somática em direção ao tórax do cão. A última muda ocorre 50 a 70 dias após a infecção. As larvas de quinto estádio ou adultos jovens (3,2 a 11 cm de comprimento) alcançam o ventrículo direito e as artérias pulmonares de cães em 70 a 110 dias pós-infecção. Três meses depois atingem a maturidade sexual e o ciclo se completa, com a liberação de microfilárias na circulação (KUME & ITAGAKI, 1955; ORIHEL, 1961; KNIGHT, 1987). As microfilárias são encontradas na circulação periférica aproximadamente seis meses após a infecção e aí podem sobreviver por dois anos. O número de microfilárias na circulação é independente do número de parasitos adultos que o cão alberga (GRIEVE at al., 1983). Dirofilaria immitis, assim como algumas espécies de nematóides pertencentes à Família Onchocercidae, albergam uma bactéria intracelular do gênero Wolbachia (SIRONI et al., 1995; BANDI et al., 1998; HENKLE-DÜHRSEN et al., 1998). Essa bactéria foi identificada em nematóides filarídeos em meados dos anos 70 (McLAREN et al., 1975; KOZEK & FIGUEROA, 1977) e acredita-se que ela seja necessária para seu desenvolvimento, reprodução e, possivelmente, sua sobrevivência (BANDI et al., 1999; HOERAUF et al., 1999; LANGWORTHY et al., 2000). Entretanto, a natureza da relação entre a bactéria e o nematóide ainda não está claramente definida (CASIRAGHI et al., 2002). Há evidências que Wolbachia seja transmitida verticalmente para sua prole, podendo ser observada nas cordas hipodérmicas laterais de machos e fêmeas, no trato reprodutivo de fêmeas adultas (oogônia, oócitos, embriões e microfilária) 22 (McLAREN et al., 1975; KOZEK & FIGUEROA, 1977; SIRONI et al., 1995) e também nas larvas presentes no mosquito vetor (McLAREN et al., 1975; SIRONI et al., 1995). 2.2.3 Distribuição Geográfica Cães infectados por D. immitis já foram encontrados em todos os continentes, embora com freqüências diferentes. Deve-se manter em mente que essa espécie de parasito depende de um ciclo complexo e, portanto, susceptível a muitos fatores diferentes. Por isso, é possível encontrar focos de alta prevalência vizinhos de locais com prevalência baixa. Além disso, dependendo da movimentação de cães e da alteração do ambiente, urbanização e controle da população de mosquitos, por exemplo, os focos podem mudar de local. Assim, um estudo realizado há tempos poderá não refletir a realidade daquele local, alguns anos depois (LABARTHE et al., 2002). No continente asiático, cães infectados por D. immitis foram observados em somente quatro países: Japão, Taiwan, Coréia do Sul e Tailândia. Em Taiwan, as taxas de infecção variam de acordo com a região do país, e os estudos demonstram que a expansão da dirofilariose canina foi muito rápida nos últimos anos. No sul da ilha, a prevalência é de 37,8% (LEE et al., 1995); na região central varia entre 16,8% e 28,8% (TIN & WANG, 1994) e no norte do país encontra-se maior número de cães infectados, com prevalência variando de 5,2% até 58,5% (WANG, 1997). Na Coréia do Sul, a prevalência de D. immitis em cães varia de 1,5% (YOON et al., 2002) a 40% (SONG et al., 2003), sendo que, em áreas costeiras encontra-se maior número de cães parasitados do que em áreas no interior do país. Não há levantamentos recentes sobre a dirofilariose canina no Japão. Os estudos existentes são das décadas de 70 a 90 e se concentram principalmente no oeste do país. Os relatos demonstram que a infecção por D. immitis diminuiu consideravelmente ao longo dos anos, passando de 43,9% em 1973 (SUENAGA & ITOH, 1973) para 8,1% em 1994 (ODA et al., 1995), fato atribuído à diminuição no número de Cx. pipiens pallens, o principal vetor de D. immitis nesta região do Japão (ODA et al., 1995). Na Tailândia, a prevalência de dirofilariose no norte do país é de 46,67% (CHOOCHOTE et al., 1987). Em Sidney, Austrália, a prevalência é de 14,1% (BIDGOOD & COLLINS, 1996), enquanto na região sul do mesmo país é de 1,1% (COPLAND et al., 1992). Na Europa, a dirofilariose canina é encontrada principalmente nos países mediterrâneos. Em Portugal, a infecção é mais comum no sul do país, com prevalência 23 variando entre 10% a 30% (ARAÚJO, 1996; GUERRERO et al., 1992). Na França, a prevalência é baixa, não ultrapassando 1%, com distribuição predominante ao longo da costa mediterrânea (GUERRERO et al., 1989, 1992). Já a Espanha é uma das regiões enzoóticas de D. immitis, onde a prevalência da doença é mais alta no sul da Península Ibérica e nas Ilhas Canárias (MONTOYA et al., 1998). A prevalência nacional varia entre 3,7% e 2,1%, com predominância na costa mediterrânea sul (6,6%) (GUERRERO et al., 1989, 1992) e no delta do rio Ebro (33,8%) (GALIANA, 1995). A maior taxa de infecção foi encontrada nas Ilhas Canárias, durante três anos de estudos, 67,02% em 1994, 58,92% em 1995 e 52,18% em 1996 (MONTOYA et al., 1998). Dados coletados em estudos repetidos demonstram expansão da dirofilariose em algumas regiões da Espanha (GUERRERO et al., 1992, 1995). A maior área endêmica de dirofilariose canina na Europa é ao longo do Vale do Rio Pó, no norte da Itália (GENCHI et al., 1992, 1993; ROSSI et al., 1996). A prevalência nesta área varia entre 50% e 80% de infecção em cães que não recebem tratamento profilático (GENCHI et al., 1992, 1993). Nos últimos 30 anos, a infecção por D. immitis tem se dispersado para áreas alpinas no norte da Itália, como observado na cidade de Piedmont (ROSSI et al., 1996) e, mais recentemente, para regiões ao norte e leste do país (GENCHI et al., 1998), embora a temperatura nas regiões central e sul da Itália seja mais favorável à transmissão do parasito (KNIGHT, 1993). Embora poucos dados estejam disponíveis, a prevalência de dirofilariose canina varia de 2 a 17% na Eslovênia (GENCHI et al., 1998), Bulgária (KANEV et al., 1996), Grécia (PAPAZAHARIADOU et al., 1994) e Turquia (GENCHI et al., 1998), chegando a 65% na Romênia (OLTEANU, 1996). Um número crescente de casos tem sido diagnosticado em países situados ao norte da Europa (Suíça, Áustria, Alemanha, Reino Unido, Holanda, Suécia e Hungria), em razão da importação ou viagens de cães por regiões onde a freqüência do parasito é alta (GENCHI et al., 1998). Na África, a dirofilariose foi diagnosticada em quatro de 13 cães nativos da província de Zambézia, Moçambique, confirmando a ocorrência do parasito na região três décadas após o primeiro relato (SCHWAN & DURAND, 2002). Nas Américas, a doença é conhecida na maioria dos países. No Canadá, estudos anuais têm mostrado que, a prevalência é baixa (0,16%) e que focos de infecção canina são encontrados em Ontário (0,19%), Manitoba (0,18%), Quebec (0,09%) e Okanagan Valley (0,04%) (KLOTINS et al., 2000). Nos EUA, a dirofilariose canina era 24 inicialmente reconhecida como enzoótica na costa sudeste. Entretanto, sua ocorrência não se restringe aos Estados mais ao sul, como Flórida (59,4%), Alabama (42%), Mississipi (15%) e Louisiana (28%-44%), onde se registram as maiores taxas de infecção por D. immitis. No decorrer dos anos, a dirofilariose transformou-se num problema ao longo de toda a costa sudeste e também no centro-oeste, incluindo os Estados de Nebraska, Illinois, Indiana, Michigan, Wisconsin e Minnesota. Há também relatos de infecção em cães nativos de Estados a oeste do rio Mississipi, principalmente na Califórnia, onde a prevalência varia de 5,9% até 34,3% (TODARO et al., 1977; PINGER, 1982; WALTERS & LAVOIPIERRE, 1984; PAPPAS & LUNZMAN, 1985; DIEDRICK & BOYCE, 1986; LOK, 1988; COURTNEY & ZENG, 1989; PATTON & FAULKNER, 1992; ZIMMERMAN et al., 1992; JONES et al., 1993; KNAPP et al., 1993; WALTERS, 1995). No México, a prevalência nacional é de 7,5%, com taxas mais elevadas (20% a 42%) em cidades localizadas na costa do Golfo (GUERRERO et al., 1992). Na América Central, a dirofilariose canina é freqüente, principalmente na região das Antilhas. Nas ilhas caribenhas, a infecção é enzoótica e a prevalência varia muito entre as ilhas que compõem o arquipélago. Nas Bahamas, a prevalência é de 54,3% (GRIEVE et al., 1986); em Cuba, varia de 6,9% a 63,2% (SOTOLONGO, 1977; DUMENIGO et al., 1982); em Porto Rico, as taxas variam de 3,1% a 20,4%; na República Dominicana, a prevalência é de 18% e em Curaçao, varia entre 9% e 10,5% (KOZEK et al., 1995). Além das Antilhas, há relato de cães infectados na Costa Rica, embora a prevalência seja baixa (2,3%) (SANCHO et al., 1989). Na América do Sul, a infecção por D. immitis vem sendo diagnosticada em todos os países onde é pesquisada, à exceção do Chile (ALCAÍNO et al., 1984). Na Argentina, a prevalência geral está entre 3,5% e 12,7%, sendo que nos subúrbios de Buenos Aires, as taxas de infecção são mais altas, 17,7% ao norte e 23,5% ao sul dos arredores da cidade (GUERRERO et al., 1992; ROSA et al., 2002). Na Colômbia, a prevalência oscila entre 3,8% e 4,8% (GUERRERO et al., 1989, 1992). A dirofilariose canina é relatada em todas as regiões do Brasil. Um estudo conduzido recentemente revelou que, 14 anos depois, a prevalência nacional caiu de 7,9% (GUERRERO et al., 1989) para 2% (LABARTHE et al., 2003). Quando se avalia a distribuição da infecção por região, nota-se que ela varia consideravelmente até mesmo em estados da mesma região do país. Na região Norte, a prevalência de D. immitis varia de 8,8% a 10,7% no Pará (SOUZA et al., 1995); no 25 Maranhão é de 12,8% (AHID et al., 1999) e no Piauí é de 18,7% (MENDONÇA et al., 1994); na região Nordeste, a prevalência é de 12,4% na Paraíba, (ARCOVERDE et al., 1994); varia de 2,3% a 17,41% em Pernambuco (ALVES et al., 1997, 1999) e nas Alagoas é de 12,5% (CALHEIROS et al., 1994); na região Centro-Oeste, o único Estado onde há registro da doença é Mato Grosso, onde a prevalência varia de 9,6% a 11,2% (FERNANDES et al., 1999, 2000); na região Sudeste já foram relatados 4 casos em Uberlândia, Minas Gerais (BARBOSA et al., 1996); no Espírito Santo, a prevalência é de 12,5% (KASAI et al., 1981), 3,8% no Rio de Janeiro (LABARTHE et al., 2003) e varia de 0,9% a 45% em São Paulo (LARSSON, 1990; YADA et al., 1994; DUQUEARAÚJO et al., 1995); na região Sul, a prevalência varia de 12% a 15% em Santa Catarina e de 1,1% no Rio Grande do Sul (LABARTHE et al., 1992; ARAÚJO et al., 2003). Dentre todos os Estados brasileiros onde já se registrou a presença de D. immitis, o Rio de Janeiro é um dos que apresentam maior número de relatos. Observa-se que as áreas costeiras fluminenses sempre foram reconhecidas como as que apresentam o maior número de casos de dirofilariose no Estado (DACORSO FILHO et al., 1953; LANGENEGGER et al., 1962; LABARTHE et al., 1988, 1990, 1997; SOUZA, 1992). Entretanto, quando se examinaram cães de sua região serrana (Petrópolis e Teresópolis), foi encontrada alta freqüência de animais portadores da infecção (25,6%). Embora esta taxa ainda esteja abaixo das registradas nas regiões costeiras, parece excessivamente alta. Há indícios de que esses resultados não possam ser repetidos, principalmente em Teresópolis, onde outro estudo foi conduzido e, de 400 animais examinados, nenhum estava parasitado (MUNIZ, 2001). Por outro lado, como a prevalência de uma localidade é variável no tempo, fenômeno como o que se observou na Região Oceânica de Niterói, que em cinco anos passou de 37% para 15% (LABARTHE et al., 1998) também pode ter ocorrido em Teresópolis, assim como na Barra da Tijuca, que diminuiu de 31% (LABARTHE et al., 1997) para 1,96% (COSTA, 2002). A pressão que leva a essa flutuação rápida da prevalência não é compreendida (LABARTHE et al., 2002). 2.2.4 Vetores O primeiro estudo implicando mosquitos (Diptera: Culicidae) como hospedeiros intermediários de D. immitis foi realizado em 1900 por Grassi e Noé. Atualmente mais 26 de 60 espécies de culicídeos pertencentes aos gêneros Aedes, Anopheles, Culex, Mansonia, Coquillettidia e Psorophora são considerados como capazes de transmitir o parasito em condições naturais ou experimentais (LEVINE, 1968; LUDLAM et al., 1970). Na natureza, entretanto, poucas espécies foram incriminadas como vetores naturais de D. immitis, já que algumas nunca foram encontradas naturalmente infectadas com este parasito e outras, embora susceptíveis à infecção em condições experimentais, não desempenhem papel de transmissores em condições naturais (CHRISTENSEN & ANDREWS, 1976; HENDRIX et al., 1986). Existem diversas publicações analisando competência e capacidade vetorial de diferentes espécies de mosquitos. Esses estudos foram conduzidos sob condições controladas em laboratório ou em estudos realizados a campo. Os trabalhos em laboratório (competência vetorial) mostram que muitas espécies de mosquitos, de várias regiões do mundo, são susceptíveis e permitem o desenvolvimento de larvas até a forma infectante em seu organismo. Dentre essas espécies, as mais estudadas são: Ae. aegypti, Ae. albopictus, Aedes canadensis (Theobald), Aedes notoscriptus (Skuse), Aedes sierrensis (Ludlow), Aedes sollicitans (Walker), Aedes taeniorhynchus (Wiedemann), Aedes togoi (Theobald), Aedes triseriatus (Say), Aedes trivittatus (Coquillett), Aedes vexans (Meigen), Aedes vigilax (Skuse), Anopheles punctipennis (Say), Anopheles quadrimaculatus Say, Culex annulirostris Skuse, Culex quinquefasciatus Say, Culex tarsalis Coquillett, Culex tritaeniorhynchus Giles, Mansonia titillans (Walker) e Mansonia uniformis (Theobald) (YEN, 1938; BEMRICK & MOORHOUSE, 1968; INTERMILL & FREDERICK, 1970; NAYAR & SAUERMAN, 1975; BICKLEY et al., 1977; CHRISTENSEN, 1977; BUXTON & MULLEN, 1981; SULAIMAN, 1983; ROBERTS et al., 1985; BRADLEY & NAYAR, 1987; CHOOCHOTE et al., 1987; APPERSON et al., 1989; KONISHI, 1989b; RUSSEL, 1990; RUSSEL & GEARY, 1992; ZYTOON et al., 1992; SCOLES et al., 1993; LOFTIN et al., 1995; NAYAR & KNIGHT, 1999; MAHMOOD, 2000; PARKER, 2000; JUNKUM et al., 2003). No Brasil, poucas investigações foram realizadas para verificar a competência vetorial das espécies de mosquitos existentes como vetores de D. immitis. Aedes fluviatilis (Lutz), Ochlerotatus scapularis (Rondani), Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus são as únicas espécies estudadas até o momento que demonstraram ser susceptíveis à D. immitis (KASAI & WILLIAMS, 1986; MACEDO et al., 1998; BRITO et al., 1999; AHID et al., 2000; SERRÃO et al., 2001). Dentre as quatro espécies, Ae. fluviatilis não 27 parece reunir características para, sob condições naturais, ser vetor eficiente (KASAI & WILLIAMS, 1986). Estudos conduzidos sob condições naturais (capacidade vetorial) vêm sendo efetuados em diferentes partes do mundo e mostram que várias espécies de mosquitos podem estar envolvidas na transmissão de D. immitis. Na ilhas do Oceano Pacífico, Aedes fijiensis Marks, Aedes pseudoscutellaris (Theobald), Aedes polynesiensis Marks, Aedes samoanus (Gruemberg), Culex fatigans Wiedemann e Cx. annulirostris foram encontrados albergando larvas infectantes de D. immitis (SYMES, 1960; SAMARAWICKEMA et al., 1992); na Austrália, Cx. annulirostris e Ae. notoscriptus foram apontados como vetores primários, Anopheles annulipes Walker e Cx. quinquefasciatus como secundários e Aedes alboannulatus (Macquart), Aedes rubrithorax (Marcquart) e Culex australicus Dobrotworsky e Drummond como vetores eventuais (RUSSEL, 1985). Em quatro países asiáticos, Japão, Malásia, Taiwan e Tailândia, quatro vetores naturais são conhecidos: Ae. albopictus, Cx. tritaeniorhynchus, Cx. quinquefasciatus e Mansonia uniformis (CHOOCHOTE et al., 1986; SULAIMAN & JEFFERY, 1986; KONISHI, 1989b; LAI et al., 2001). Nos EUA, 22 espécies de mosquitos (Ae. albopictus, Ae. canadensis, Ae. cantator, Ae. excrucians (Walker), Ae. sierrensis, Ae. sollicitans, Ae. sticticus (Meigen), Ae. stimulans, Ae. taeniorhynchus, Ae. triseriatus, Ae. trivittatus, Ae. vexans, An. bradleyi, An. crucians, An. freeborni, An. punctipennis, An. quadrimaculatus, Cx. nigripalpus Theobald, Cx. pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. salinarius, Psorophora ferox) já foram coletadas naturalmente infectadas com D. immitis em 17 estados (BUXTON & MULLEN, 1980; JOHNSON & HARRELL, 1986; ERNST & SLOCOMBE, 1984; HRIBAR & GERHARDT, 1985; ARNOTT & EDMAN, 1978; TOLBERT & JOHNSON, 1982; WALTERS & LAVOIPIERRE, 1982; SAUERMAN & NAYAR, 1983; PARKER, 1986; VILLAVASO & STEELMAN, 1970; SCOLES, 1997; COMISKEY & WESSON, 1995; WALTER, 1995; COURTNEY & CHRISTENSEN, 1983) e dezoito delas podem ser encontradas no sul e leste do país. Há importantes diferenças regionais entre as espécies vetoras naturais, e de todas as espécies relacionadas acima, somente Ae. vexans foi encontrado naturalmente infectado em todas as regiões do país. Anopheles punctipennis já foi implicado como vetor em todas as regiões exceto no oeste americano. No Brasil, recentemente descobriram-se os vetores na Região Sudeste. LOURENÇO DE OLIVEIRA & DEANE (1995) encontraram larvas indistinguíveis de 28 D. immitis nos tubos de Malpighi de um exemplar de Ae. taeniorhynchus e um de Oc. scapularis, sugerindo que esses mosquitos sejam possíveis vetores naturais na baixada litorânea do Rio de Janeiro. Mais tarde, esses mosquitos foram considerados como vetores primários e Cx. quinquefasciatus como secundário da dirofilariose canina na região oceânica de Niterói, Estado do Rio de Janeiro (LABARTHE et al., 1998). Na região Nordeste, duas espécies de mosquitos já foram encontradas naturalmente infectadas com larvas de D. immitis. Em Maceió, Alagoas, oito (0,1%) fêmeas de Cx. quinquefasciatus foram encontradas albergando larvas do parasito nos tubos de Malpighi (BRITO et al., 2001). Em São Luís, Maranhão, 0,1% (1/906) dos Cx. quinquefasciatus e 0,5% (1/194) dos Ae. taeniorhynchus capturados estavam infectados. A fêmea de Cx. quinquefasciatus albergava três larvas de terceiro estádio nos tubos de Malpighi e foram encontradas duas larvas de segundo estádio nos tubos de Malpighi na única fêmea infectada da espécie Ae. taeniorhynchus. Embora as taxas de infecção natural encontrada entre os culicídeos dissecados tenham sido consideradas baixas pelos autores, eles apontaram estas duas espécies como vetores potenciais da dirofilariose no Estado do Maranhão (AHID & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1999). Embora a espécie Oc. scapularis tenha sido capturada tanto em Maceió, quanto em São Luís, nenhum indivíduo encontrava-se infectado. Esses resultados indicam a possibilidade de Ae. taeniorhynchus ser um vetor primário da dirofilariose canina em todo o litoral brasileiro, do Nordeste ao Sudeste (AHID & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1999) e Oc. scapularis considerado vetor primário no Sudeste do Brasil (LOURENÇO DE OLIVEIRA & DEANE, 1995; LABARTHE et al., 1998). O desenvolvimento da larva de D. immitis e sua migração para a probóscida do mosquito não constitui, por si só, evidência que este mosquito possa agir como vetor. Competência vetorial envolve outros critérios que devem ser considerados na incriminação de uma espécie em particular. Fatores ecológicos e biológicos também são importantes, como por exemplo: prevalência e distribuição sazonal; hábitos alimentares; susceptibilidade ao parasito; identificação de mosquitos infectados no campo e capacidade de dispersão. A afinidade de mosquitos para habitats silvestres, domiciliares ou peridomiciliares pode influenciar sua competência vetorial sob diferentes condições naturais. Ae. canadensis, Ae. stimulans e Aedes sticticus são espécies que colonizam habitats silvestres (ARNOTT & EDMAN, 1978; MAGNARELLI, 1978; BUXTON & MULLEN, 1980), enquanto que Cx. quinquefasciatus, Anopheles punctipennis e Ae. 29 vexans (VILLAVASO & STEELMAN, 1970; TOLBERT & JOHNSON, 1982) vivem em ambientes domiciliares e peridomiciliares. Esse comportamento variável pode contribuir para a diferença de competência vetorial de D. immitis entre as espécies. Outra consideração importante é a sazonalidade. Espécies de mosquitos que apresentem abundância associada a múltiplas gerações por ano, tais como Ae. sollicitans (LUDLAM, 1970) e Ae. vexans (HENDRIX et al., 1980), terão maiores chances de infectarem-se e posteriormente transmitirem o verme aos hospedeiros mamíferos. Entretanto, espécies com somente um pico populacional anual tais como Ae. sticticus (BUXTON & MULLEN, 1980), Ae. canadensis e Ae. stimulans (MAGNARELLI, 1978) também exercem um papel significativo na transmissão. A capacidade de vôo determina a aptidão de mosquitos vetores de dispersar infecções. Espécies tais como Ae. vexans (HENDRIX et al., 1980), Ae. sollicitans (LUDLAM, 1970) e Ae. taeniorhynchus apresentam vôos relativamente longos, servindo para dispersar o parasito, enquanto que Ae. sierrensis que tem raio de vôo curto pode manter ativa a transmissão em focos isolados (WALTERS & LAVOIPIERRE, 1982). Deve-se considerar ainda os hábitos alimentares de certas espécies, que se traduzem em “preferência” pelo hospedeiro e freqüência de alimentação. Obviamente, as espécies vetoras de D. immitis devem estar propensas a alimentarem-se em cães, a fim de poderem ingerir e transmitir D. immitis na natureza. Como a transmissão requer pelo menos duas alimentações sangüíneas pelo mesmo indivíduo, o potencial é maior entre mosquitos que se alimentam repetidamente durante a vida. Certos aspectos da fisiologia reprodutiva podem afetar a relação entre alimentação sangüínea e desenvolvimento do ovo e, também, a freqüência de alimentação de sangue pelos vetores (O’MEARA & EVANS, 1973). Esta característica tenderia a diminuir o número de alimentações sangüíneas pelos vetores ao longo de sua vida. A necessidade de mais de uma alimentação para completar o desenvolvimento dos ovos em algumas populações de Anopheles (GILLIES, 1955; WASHINO, 1977) tenderia a aumentar o número de alimentações feitas, e conseqüentemente, o potencial para transmissão de patógenos. Deve-se ressaltar ainda que, múltiplas alimentações sangüíneas produzem efeitos substanciais no crescimento e desenvolvimento das larvas de D. immitis, resultando em maturação mais rápida, determinando a eficiência com que este parasito é transmitido para o hospedeiro vertebrado (TRAVI & ORIHEL, 1987). Longevidade é outro fator crítico que interfere na competência vetorial dos mosquitos. Vetores competentes devem sobreviver por tempo suficiente para que as 30 microfilárias se desenvolvam até larvas infectantes. A sobrevivência de mosquitos adultos está sob a influência de muitos fatores ambientais e biológicos incluindo temperatura, umidade relativa, predação e doença. Além disso, os efeitos patogênicos das larvas do helminto também influenciam a longevidade dos vetores infectados (CHRISTENSEN, 1978). Fatores ambientais afetam a transmissão de D. immitis tanto aumentando quanto reduzindo-a. Temperatura, umidade relativa, chuvas e intensidade de luz têm relação na dinâmica populacional dos vetores e podem servir para pontuar certas atividades, tais como procura pelo hospedeiro (KUTZ & DOBSON, 1974; CHRISTENSEN & HOLLANDER, 1978). Por exemplo, ovos de espécies vetoras tais como Ae. canadensis, Ae. vexans e Ae. trivittatus são depositados em solos, sujeitos a flutuações periódicas. Geração de larvas e picos populacionais subseqüentes ocorrem após inundações em razão de chuvas pesadas (KUTZ & DOBSON, 1974). Evidências circunstanciais de competência vetorial devem ser confirmadas pela identificação natural de larva de terceiro estádio do parasito nas peças bucais de mosquitos coletados no campo, antes de incriminar uma espécie de mosquito como vetora de D. immitis. Ainda assim, algumas considerações podem ser feitas sobre a capacidade vetorial de uma espécie, comparando o total de estudos nos quais tem sido encontrada infectada, com o número de estudos nos quais albergava larva infectante. Pode-se citar como exemplo duas espécies apontadas como vetores primário e secundário no Estado do Alabama, nos EUA, Ae. trivittatus e Ae. vexans, respectivamente. Embora Ae. vexans tenha sido coletado com nematóides filarídeos indistinguíveis de D. immitis em 14 estudos diferentes, albergava larva infectante em somente metade deles. Isto pode ser uma indicação de variação regional na susceptibilidade à infecção ou pode representar falha desta espécie em sobreviver por tempo suficiente para o desenvolvimento do parasito. Por outro lado, Ae. trivitttatus coletados em somente seis estudos estavam infectados e em cada caso foram encontrados indivíduos com larva infectante, indicando não somente que todas as populações amostradas podem suportar o desenvolvimento do parasito, mas também que o mosquito sobrevive tempo suficiente no campo para o parasito completar o desenvolvimento (SCOLES, 1998). 2.2.5 Relação parasito-hospedeiro intermediário 31 A manutenção do sistema vetor-parasito parece depender de ações que limitem, sem eliminar, a carga parasitária no mosquito. A carga parasitária quando moderada permite que algumas larvas cheguem à fase infectante sem abortar a infecção e nem matar o mosquito (CHRISTENSEN, 1977, 1978, 1981; NAYAR & BRADLEY, 1987). Essa capacidade que uma determinada espécie de mosquito tem em suportar o desenvolvimento da larva até o estádio infectante denomina-se susceptibilidade. Há diferentes formas para que isso aconteça: 1) mosquitos podem apresentar diferentes mecanismos que impeçam número excessivo de larvas; 2) a microfilaremia dos cães pode ser moderada; 3) mosquitos podem fazer vários repastos sangüíneos em diferentes hospedeiros até chegar à repleção ou 4) fatores ambientais. Variações na susceptibilidade entre linhagens geográficas de Ae. aegypti (ROBAUD et al., 1936; ROBAUD, 1937) e flutuações na susceptibilidade de colônias de laboratório desse culicídeo (KARTMAN, 1953) sugerem que fatores genéticos influenciam o desenvolvimento de D. immitis em mosquitos. Descobriu-se que a susceptibilidade desta espécie à infecção é regulada por um gen recessivo ligado ao sexo, que controla a evolução das larvas nos tubos de Malpighi (McGREEVY et al., 1974; SULAIMAN & TOWNSON, 1980). Os estudos demonstram que diferenças genéticas inerentes a espécies ou linhagens do vetor podem influenciar sua competência vetorial (SULAIMAN & TOWNSON, 1980; CHRISTENSEN, 1977) e salientam que pode ocorrer variação na susceptibilidade para D. immitis entre populações de espécies de mosquitos isoladas geograficamente. Existe uma variação interespecífica na susceptibilidade ao parasito e ela está associada a fatores fisiológicos e morfológicos. Fêmeas de algumas espécies de mosquitos apresentam na margem da extremidade posterior do assoalho do tubo digestivo, várias formações esclerotizadas, em dobras, onde estão implantados dentes com a margem apical serrilhada. Esse conjunto é chamado armadilha do cibário, que é o primeiro mecanismo de defesa existente em algumas espécies de culicídeos contra a infecção por D. immitis (COLUZZI & TRABUCCHI, 1968). Essa estrutura no tubo digestivo anterior danifica as microfilárias, havendo perda de motilidade e abrasão cuticular à medida que passam em direção ao estômago (BRYAN et al., 1974; McGREEVY et al., 1978). A migração de uma microfilária de D. immitis do estômago para os tubos de Malpighi do mosquito pode ser bloqueada pela coagulação do sangue. Potentes anticoagulantes na saliva de vetores eficientes, tais como An. quadrimaculatus, aparentemente inibem a formação de coágulos por tempo suficiente para que a maioria 32 das microfilárias ingerida migre para os tubos. Por outro lado, a rápida coagulação do sangue e, conseqüente aprisionamento das microfilárias, contribui parcialmente para a relativa ineficiência de vetores potenciais tais como Cx. quinquefasciatus (KARTMAN, 1953; NAYAR & SAUERMAN, 1975). Além disso, a hemoglobina que é liberada das células sangüíneas oxida-se formando cristais de oxihemoglobina que podem danificar as microfilárias, destruindo-as (NAYAR & SAUERMAN, 1975; LOWRIE, 1991). As microfilárias também podem ser eliminadas junto com as fezes do inseto, logo após o repasto sangüíneo, devido aos movimentos peristálticos do intestino (ANDO, 1984). Outro fator fisiológico que pode ocorrer é a lise da cutícula da larva por ação das próprias células dos tubos de Malpighi do vetor (TALLURI & CANCRINI, 1994). Além dos mecanismos descritos anteriormente, os mosquitos reagem imunologicamente às microfilárias através de reação de encapsulamento ou melanização das larvas. A célula do tubo de Malpighi parasitada, através de mensagens intracelulares, ativa mecanismos que lisam a cutícula e destroem o parasito (TALLURI & CANCRINI, 1994). Esta reação é um dos mais importantes efeitos moduladores na carga parasitária de vários vetores incluindo Ae. aegypti (LINDEMANN, 1977), Ae. trivittatus (CHRISTENSEN, 1981), Mansonia tittilans, Aedes sollicitans e Ae. taeniorhynchus (NAYAR & SAUERMAN, 1975). O desenvolvimento da larva pode também ser interrompido antes do estádio “salsichóide”, sem ocorrer o encapsulamento (SULAIMAN & TOWNSON, 1980; BUXTON & MULLEN, 1981). Além dos fatores fisiológicos e morfológicos, os fatores ambientais, especialmente a temperatura, afetam acentuadamente a relação D. immitis-vetor. A temperatura ambiente na qual o mosquito é mantido é crítica. A temperatura ambiente é o principal fator que controla o desenvolvimento de D. immitis num mosquito susceptível, influenciando as mudas e regulando a duração de cada estádio. Temperaturas muito altas diminuem a sobrevida dos mosquitos infectados, tornando-a curta demais para permitir o completo desenvolvimento do parasito (KUTZ & DOBSON, 1974), enquanto temperaturas baixas podem retardar ou até impedir o seu desenvolvimento (CHRISTENSEN & HOLLANDER, 1978). Estudos com An. quadrimaculatus (KUTZ & DOBSON, 1974), Ae. trivittatus (CHRISTENSEN & HOLLANDER, 1978), Ae. vexans e Ae. triseriatus (FORTIN & SLOCOMBE, 1981) demonstraram que o desenvolvimento de D. immitis cessa a temperaturas abaixo de 16ºC (CHRISTENSEN & HOLLANDER, 1978). O tempo necessário para o 33 desenvolvimento até o estádio infectante diminui à medida que a temperatura ultrapassa 16ºC até o limite de 26ºC. Um aumento significativo na taxa de mortalidade do vetor susceptível ocorre em dois momentos da infecção por D. immitis: quando as larvas de primeiro estádio invadem os tubos de Malpighi (24-48h) e quando as larvas infectantes rompem os tubos e migram para a cabeça e probóscida dos mosquitos (12º-16ºdias) (KARTMAN, 1953; KERSHAW et al., 1953; BUXTON & MULLEN, 1981). 34 3 Material e Métodos 3.1 Descrição das áreas escolhidas Os mosquitos utilizados no experimento eram originários dos municípios de Nova Iguaçu, Niterói, Maricá e Teresópolis, Estado do Rio de Janeiro (Figura 1). Mosquitos adultos ou formas imaturas foram coletados nos seguintes bairros ou distritos: Ambaí em Nova Iguaçu, Itaipu em Niterói, Itaipuaçu em Maricá e Albuquerque em Teresópolis. Estes locais foram escolhidos com base na prevalência da dirofilariose canina ou da presença de população expressiva da espécie Ae. albopictus. Figura 1 – Mapa do Estado do Rio de Janeiro, mostrando a localização dos municípios de Nova Iguaçu, Niterói, Maricá e Teresópolis, locais escolhidos para a coleta de mosquitos da espécie Aedes albopictus. Ambaí é um bairro do município de Nova Iguaçu (22º45'33"S e 43º27'04"O). O município integra a Baixada Fluminense, fazendo parte da Região Metropolitana do Rio de Janeiro e tem uma população de 862.225 habitantes. Nova Iguaçu faz divisa com os seguintes municípios: ao Norte, com Miguel Pereira; ao Sul, com Nilópolis, Rio de Janeiro e São João de Meriti; a Leste, com Duque de Caxias e Belford Roxo e Oeste, com Itaguaí, Japeri, Paracambi e Queimados. Seu único Distrito é a própria Sede, Nova Iguaçu. Seu território ocupa uma área aproximada de 537 km2, sendo que 35% desta área é coberta por floresta do tipo Mata Atlântica. Possui duas áreas de proteção ambiental, a Reserva Biológica do Tinguá e a área de proteção ambiental da Serra da Madureira e o restante apresenta predominância de área urbana, com alguns pontos de características rurais e semi-rurais. O município está situado a uma altitude de 25 35 metros, numa região de planície, tendo ao norte a Serra do Mar; ao Sul, os maciços de Jacarepaguá e da Tijuca; a Leste, a Baía de Guanabara e a Oeste, a Serra da Madureira, proporcionando um microclima característico de região litorânea tropical úmida. A precipitação pluviométrica média anual é de 1.595,3 mm e a temperatura média de 23ºC (PREFEITURA MUNICIPAL DE NOVA IGUAÇU, 2003). Não há informações sobre a ocorrência de dirofilariose canina no município. Itaipu é um distrito do município de Niterói (22°53'00"S e 43°06'13"O). O município está situado na orla oriental da Baía de Guanabara, entre o mar e as encostas ocidentais do maciço litorâneo Fluminense, fazendo limite com os seguintes municípios: a leste, Maricá; ao norte, São Gonçalo e ao sul e à oeste a Baía de Guanabara. Seu território tem área estimada de 131,8 km2, situada 5m acima do nível do mar e tem uma população de 459.451 habitantes. O município apresenta clima tropical quente, subtipo úmido (1 a 3 meses secos/ano) e temperatura média de 23,1°C. A pluviosidade média anual é de 1207mm, com as chuvas concentradas no verão. Originalmente, a Mata Atlântica ocupava boa parte do município, mas atualmente existe somente mata secundária, em manchas isoladas, sobre alguns maciços e colinas. As demais coberturas vegetais originais - restinga, mangue e brejo - são raramente encontradas (PREFEITURA MUNICIPAL DE NITERÓI, 2003). Nos últimos 10 anos a ocorrência de dirofilariose canina em Itaipu foi bastante estudada, com prevalência variando entre 0 a 32%, mostrando declínio nos últimos seis anos (comunicação pessoal3). Itaipuaçu é um distrito do município de Maricá (22º55'10"S e 42º49'07"O). O município está situado 4 m acima do nível do mar, possui uma área de 342 km2 e tem clima tropical, com variações de acordo com a proximidade do mar. A população do município é de 76.737 habitantes, sendo a maioria residente em área urbana. A região apresenta florestas do tipo tropical e planícies costeiras e é limitada pela Serra do Mar e pela longa restinga que se estende no sentido leste/oeste. Destacam-se no município as diversas lagoas, rios e canais existentes. A temperatura média é de 23ºC e a média anual de chuvas é de 1.100 mm (PREFEITURA MUNICIPAL DE MARICÁ, 2003). A ocorrência de dirofilariose canina neste município é de 35,7% (MENEZES, 1998). Albuquerque é um bairro do município de Teresópolis (22° 26' 12"S e 42° 58' 42"O). O município está localizado no topo da Serra dos Órgãos, coberto pela Mata 3 Norma Labarthe - UFF 36 Atlântica, na região serrana do estado do Rio de Janeiro. Tem uma área de 849 km2 e está localizado a 902m de altitude, sendo a mais alta cidade do Estado e com uma população de 128.079 habitantes. A temperatura média é de 16ºC, com clima seco e ameno. A média no inverno é de 13,5ºC e no verão de 21,5ºC. O município faz limite ao norte com São José do Vale do Rio Preto, Sapucaia e Sumidouro, ao sul com Guapimirim e Cachoeiras de Macacu, a leste, com Nova Friburgo e a oeste, com Petrópolis (CITYBRAZIL, 2003). Um estudo realizado em 2001 revelou que não há infecção canina por D. immitis em Teresópolis (MUNIZ, 2001). 3.2 Pesquisa da infecção por Dirofilaria immitis em caninos Para conhecer ou atualizar a freqüência de dirofilariose canina nas localidades onde capturas de mosquitos foram realizadas, coletou-se sangue de cães com mais de um ano de idade em Ambaí, Itaipu e Itaipuaçu, para pesquisa de microfilárias na circulação. As coletas foram feitas tanto em domicílio quanto durante as campanhas municipais de vacinação contra raiva urbana no ano de 2001, sempre com o consentimento dos proprietários. Foram coletadas 112 amostras de sangue canino em Ambaí, 100 amostras em Itaipu e 71 amostras de sangue em Itaipuaçu. As amostras foram obtidas por venopunção cefálica, acondicionadas em tubos contendo EDTA e mantidas a 4°C até o processamento, que era realizado em, no máximo, 72 horas após a coleta, na Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense. O diagnóstico foi feito através da identificação de microfilárias de D. immitis usando-se as técnicas de KNOTT (1939), modificada por NEWTON & WRIGHT (1956) e NAN (ALMOSNY et al., 1991). Em Ambaí, por não haver registro anterior de cães infectados por D. immitis, pesquisou-se a presença de antígeno do parasito adulto pelo método imunoenzimático (ELISA)3 para garantir a identificação do filarídeo. Os dados referentes a cada animal foram registrados em fichas próprias onde se anotou todas as informações disponíveis (Anexo I). Foram considerados casos autóctones, cães portadores de microfilárias de D. immitis que nasceram, foram criados em Ambaí, Itaipu ou Itaipuaçu e que nunca saíram de lá (cães nativos). 4 SNAP 3DX® - Laboratório IDEXX 37 A pesquisa da freqüência de dirofilariose em Teresópolis não foi repetida, já que foi recentemente estudada por MUNIZ (2001), que não encontrou microfilárias de D. immitis na circulação sangüínea de nenhum dos 400 cães examinados, nem vermes adultos nas 40 necrópsias realizadas. 3.3 Estabelecimento de colônias de Aedes albopictus (Skuse, 1894) e Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) Foram formadas quatro colônias distintas de Ae. albopictus e três de Ae. aegypti. 3.3.1 Obtenção de mosquitos Exemplares de Ae. albopictus de Ambaí, Itaipu e Itaipuaçu foram capturados para formar três colônias distintas da espécie. Os mosquitos foram capturados com auxílio de voluntários humanos, utilizando-se tubo aspirador, entre dezembro de 2000 e março de 2001. A quarta colônia era originária do bairro de Albuquerque, Teresópolis e, devido à dificuldade em capturar fêmeas adultas, optou-se pela coleta de larvas que foram criadas para obtenção de adultos. Estas larvas foram coletadas em agosto de 2001. Duas linhagens e uma população de Ae. aegypti, cuja susceptibilidade a infecções por D. immitis é conhecida, foram utilizadas como controles padrão de susceptibilidade ou de refratariedade. A população de Ae. aegypti era proveniente de uma colônia estabelecida a partir de exemplares coletados na cidade do Rio de Janeiro (susceptível) e mantida no insetário do Laboratório de Transmissores de Hematozoários (LTH), do Departamento de Entomologia, da Fundação Oswaldo Cruz. Uma das linhagens, denominada Rockefeller (Rock) (refratária), também foi cedida pelo LTH e a outra, denominada Liverpool (susceptível), foi cedida pelo Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos, do Departamento de Bioquímica Médica, do Instituto de Ciências Biomédicas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro. A linhagem Liverpool foi utilizada como controle da infectividade das microfilárias de D. immitis. 3.3.2 Manutenção das colônias As fêmeas de Ae. albopictus de cada localidade receberam alimentação sangüínea de voluntários humanos ou pombos, a fim de que pudessem ovipôr e então 38 formar a primeira geração de descendentes (F1), estabelecendo assim uma colônia para cada população. Essas fêmeas foram mantidas com fonte de solução de sacarose a 10%, ad libitum, em gaiolas de madeira teladas, medindo 50x50x50cm. Em cada gaiola havia copos plásticos com papel de filtro umedecido com água destilada, para que as fêmeas pudessem ovipôr após a alimentação sangüínea semanal. Os ovos obtidos foram mantidos nesse papel de filtro, que depois de seco foi submerso em água desclorificada para eclosão. À medida que as larvas eclodiam, foram transferidas para cubas plásticas e alimentadas com ração comercial para peixe4 até a fase de pupa. As pupas foram separadas em pequenos copos plásticos contendo água desclorificada, e transferidas para as gaiolas teladas onde ocorria a emergência das formas aladas. Entre a 15ª e 20ª geração, os ovos obtidos foram armazenados em recipiente aerado para posterior eclosão. Os mosquitos obtidos a partir desses ovos foram usados nas infecções experimentais. 3.3.3 Obtenção de fêmeas para infecção por D. immitis Os ovos de Ae. albopictus armazenados em papel filtro foram imersos em água, com baixo teor de oxigênio dissolvido. As larvas recém eclodidas foram criadas até a fase de pupa com ração comercial para peixe5. Após a emergência, os mosquitos foram alimentados com solução de sacarose a 10% e mantidos em temperatura (27±2ºC) e umidade relativa (80±10%) controladas. 3.4 Fonte de infecção por D. immitis A procura por um cão doador de microfilárias de D. immitis concentrou-se em Itaipu, Niterói. Como a ocorrência de dirofilariose na região é bem estudada, buscou-se nas fichas arquivadas no laboratório de Imunoparasitologia da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense, os animais positivos para microfilárias de D. immitis. O primeiro animal examinado foi uma cadela do bairro de Itaipu e tinha 1100mf/mL na circulação. Foi então realizado um protocolo experimental utilizando-se essa concentração de microfilárias para infectar os mosquitos, no entanto, no final do experimento, os mosquitos não se apresentavam infectados. Examinaram-se mais seis cães desse mesmo bairro e todos apresentaram microfilaremia insuficiente para ser 4 Tetramin 39 utilizada no experimento. Finalmente, encontrou-se um cão de Itaipu que apresentava 3200mf/mL. Era um cão de 10 anos de idade, nascido e criado em Itaipu, naturalmente infectado com D. immitis. Então, com o consentimento livre e esclarecido dos proprietários, o sangue deste animal foi utilizado durante todo o trabalho. O cão foi mantido com os proprietários, alimentado com ração comercial e água ad libitum. Visando o bem estar do animal, ele recebeu uma dose de vacina polivalente contra cinomose, adenovírus tipo 2, coronavírus, parainfluenza, parvovirose e leptospirose canina5 e uma dose de vacina anti-rábica6. Amostras sangüíneas foram coletadas em heparina duas horas antes de cada experimento, a fim de se determinar o número de microfilárias por mililitro (mL) de sangue do cão. Para tanto, foram confeccionados dez esfregaços de 20µl de sangue que foram deixados à temperatura ambiente por 24 horas para secar. As lâminas foram então colocadas em uma estufa, a 121°C por 30 minutos e, em seguida, coradas por Giemsa e lavadas com água destilada. A contagem das microfilárias em microscópio óptico foi feita com a preparação seca. A concentração de microfilárias no sangue do cão usado para alimentação artificial foi calculada contando-se o número de microfilárias em 20 µl de sangue parasitado, multiplicando-se o resultado por 50. A parasitemia do cão foi, em média, de 1670 microfilárias/mL de sangue. 3.5 Infecções experimentais Fêmeas de Ae. albopictus e Ae. aegypti com 4 a 7 dias de idade foram separadas dos machos em gaiolas cilíndricas de papelão (9cm de altura x 9cm de diâmetro), com a abertura superior coberta por filó e com uma abertura lateral obliterada com uma manga de tecido. Essas fêmeas foram mantidas em jejum durante as 48 horas que antecediam a alimentação sangüínea infectante por D. immitis, sem ajuste da microfilaremia apresentada pelo cão. As infecções das duas espécies foram realizadas simultâneamente. Foram utilizadas 2364 fêmeas de Ambaí, 2494 fêmeas de Itaipu, 5375 fêmeas de Itaipuaçu e 1614 fêmeas de Albuquerque nas alimentações infectantes. Fêmeas de Ae. aegypti da população do Rio de Janeiro (4765), da linhagem Rock (1713) e da linhagem Liverpool (1275) receberam alimentação sangüínea infectante da mesma forma e ao mesmo tempo que as demais. Para cada população de Ae. albopictus foi utilizado um 5 Vanguard® HTLP 5/CV-L – Laboratórios Pfizer Ltda. 40 grupo controle da viabilidade dos mosquitos, alimentados com sangue de um cão livre de infecção por D. immitis (sangue sem microfilárias). Para cada grupo foram utilizadas de 670 a 1551 fêmeas. A alimentação foi feita utilizando-se membrana artificial7 fixada a um aparato de vidro (RUTLEDGE et al., 1964) onde o sangue do cão foi mantido à temperatura de 37°C, por meio de circulação de água aquecida (Figura 2). O repasto sangüíneo infectante foi oferecido durante 40 minutos, quando então, as fêmeas que estivessem parcial ou totalmente repletas, foram contadas e transferidas para gaiolas cilíndricas de papelão e mantidas com solução de sacarose a 10% e sob condições ambientais controladas (27 ± 2,0°C e 80 ± 10%). No 8º dia pós-infecção foi oferecida uma alimentação sangüínea às fêmeas a fim de aumentar sua sobrevida. A mortalidade dos mosquitos foi registrada diariamente e no 16º dia pós-infecção, todos os mosquitos sobreviventes foram dissecados. No total, foram realizadas 18 repetições das infecções experimentais. c a b Figura 2 – Sistema artificial para alimentação sangüínea de mosquitos: a) meio de circulação de água aquecida; b) gaiola de papelão; c) aparato de vidro. 3.6 Dissecção de mosquitos 3.6.1 Dissecção para avaliação da ingestão de microfilárias 6 7 Defensor® - Laboratórios Pfizer Ltda. Membrana Baudruche - Joseph Long Inc. 41 Imediatamente após cada alimentação infectante, o mínimo de 10% ou o máximo de dez fêmeas do total de ingurgitadas de cada população foram dissecadas. Foram anestesiadas em atmosfera de clorofórmio e dissecadas em solução de cloreto de sódio 0,6%, ao microscópio estereoscópico. Para tal, asas, pernas e cabeça foram retiradas e, sobre uma lâmina de vidro, apenas o trato alimentar, incluindo os tubos de Malpighi, foi removido para uma gota de salina, tracionando-se levemente os segmentos subterminais do abdômen do mosquito com auxílio de agulhas hipodérmicas. Uma lamínula foi colocada sobre o material, que foi examinado em aumento de 100 e 400 vezes ao microscópio óptico. Para melhor visualização das larvas, quando necessário foi feita leve compressão sobre a lamínula. Para minimizar o efeito do tempo entre o final do repasto sangüíneo e a dissecção, foi realizado um rodízio entre as populações dissecando-se seqüencialmente a metade de cada grupo e a outra metade na ordem inversa. 3.6.2 Dissecção para avaliação da competência vetorial Os mosquitos foram anestesiados em atmosfera de clorofórmio e dissecados em solução de cloreto de sódio 0,6%, ao microscópio estereoscópico. Para tal, asas e pernas foram retiradas e, sobre uma lâmina de vidro, a cabeça do mosquito foi removida para uma gota de solução salina e o trato alimentar, incluindo os tubos de Malpighi, foi removido para outra gota de salina, tracionando-se levemente os segmentos subterminais do abdômen do mosquito com auxílio de agulhas hipodérmicas. O restante do corpo do inseto foi colocado numa terceira gota de salina e comprimido levemente entre lâmina e lamínula. Lamínulas foram colocadas sobre cada uma das porções dissecadas, que foram observadas em aumento de 100 e 400 vezes ao microscópio óptico. Para melhor visualização das larvas, quando necessário foi feita leve compressão sobre a lamínula. 3.7 Avaliação da competência vetorial de Ae. albopictus para transmitir D. immitis Para estimar a média de microfilárias/mosquito, imediatamente após o final do repasto sanguíneo, um mínimo de 10% ou o máximo de dez fêmeas de cada grupo foram dissecadas e a média de microfilárias ingeridas foi calculada dividindo-se o total 42 de microfilárias encontradas no intestino médio pelo número de fêmeas dissecadas por grupo. A mortalidade das fêmeas ingurgitadas foi registrada diariamente. A avaliação da eficiência das diferentes populações de Ae. albopictus foi feita pela dissecção no 16º dia. Para evitar uma possível perda de larvas infectantes, no 14º dia a fonte de sacarose foi retirada. As larvas encontradas nos diferentes órgãos foram contadas e classificadas quanto ao estágio de desenvolvimento de acordo com o critério proposto por KERSHAW e colaboradores (1953) e TAYLOR (1960). A média de larvas de terceiro estádio foi calculada dividindo-se o total de larvas encontradas na cabeça ou probóscida pelo número de fêmeas dissecadas. O índice de eficiência do vetor (IEV) (KARTMAN, 1954) foi calculado dividindo-se a média de larvas de terceiro estágio encontradas nos mosquitos dissecados, pela média de microfilárias ingeridas nos mosquitos dissecados e convertendo-se para porcentagem, como a seguir: IEV (%) = média nº L3 x 100 / média de microfilárias ingeridas 3.8 Análise estatística A significância de diferenças entre as variáveis (proporção de ingurgitamento após alimentação, taxa de infecção e taxa de infectividade) foi determinada através de tabelas de contingência pela prova do qui-quadrado (χ2), fixando-se o nível de significância em 95%. As análises do número médio de microfilárias ingeridas logo após alimentação e do número médio de larvas de terceiro estágio na cabeça ou probóscida dos mosquitos foram realizadas utilizando-se o teste de Duncan a fim de transformar os dados numa forma logarítmica para análise de variância ao nível de 5%. 43 4 RESULTADOS A análise de 283 amostras de sangue de cães residentes em Ambaí, Itaipu e Itaipuaçu mostrou que, em todas essas localidades o parasito D. immitis circula entre cães. Em Ambaí, Nova Iguaçu, uma amostra (1/112) apresentou microfilárias de D. immitis (0,9%). Essa amostra foi analisada quanto à presença de antígenos do parasito adulto, que confirmou o resultado encontrado. A freqüência de infecção canina foi semelhante em duas das localidades escolhidas, Itaipu, em Niterói e Itaipuaçu, em Maricá. Em Itaipu, de 100 amostras examinadas, sete eram microfilarêmicas (7%) e em Itaipuaçu, de 71 amostras de sangue canino, cinco apresentavam microfilárias do parasito (7%). Segundo informação dos proprietários, todos os animais infectados eram casos autóctones dos locais onde foram realizadas as coletas de sangue. De um total de 11847 fêmeas de Ae. albopictus colocadas para se alimentarem artificialmente com sangue contendo microfilárias de D. immitis, somente 32,12% (3805) estavam parcial ou totalmente repletas após a alimentação infectante, enquanto 50,46% (3912/7753) do total de fêmeas de Ae. aegypti estavam alimentadas após o repasto sangüíneo, havendo, portanto, uma diferença significativa (p<0,05) entre as espécies. A proporção de fêmeas de Ae. albopictus ingurgitadas total ou parcialmente variou de 23,10 a 39,10% entre as diferentes populações e entre as fêmeas de Ae. aegypti a proporção variou de 46,32 a 62,74% (Tabela 1). 44 Tabela 1 – Número de fêmeas das espécies Aedes albopictus e Aedes aegypti de diferentes origens geográficas, parcial ou completamente ingurgitadas, após oferecimento de fonte sangüínea contendo microfilárias de Dirofilaria immitis, num sistema artificial. Espécies Ae. albopictus Ae. aegypti Colocadas para se alimentarem Parcial ou completamente ingurgitadas % Ambaí 2364 546 23,10 Itaipu 2494 799 32,04 Itaipuaçu 5375 1829 34,03 Albuquerque 1614 631 39,10 Rock 1713 905 52,83 Rio de Janeiro 4765 2207 46,32 Liverpool 1275 800 62,74 Origens Nem todos os mosquitos dissecados imediatamente após a alimentação sangüínea continham microfilárias (mf) de D. immitis no intestino médio (Figura 3a), já que as taxas de ingestão (nº mosquitos com mf/dissecados) variaram de 81,44 a 96,23%. O número de microfilárias encontrado variou de 0 a 117 mf/mosquito, sendo que a maioria dos mosquitos que foi encontrada com microfilárias tinha entre 1 e 34 mf/mosquito. Acima de 34 mf/mosquito, somente um indíviduo da espécie Ae. aegypti, linhagem Rock continha 117 parasitos no intestino médio. Esse achado de 117 mf/mosquito, embora demonstre a possibilidade de ingestão de grande número de microfilárias por um só indivíduo, não foi incluído nas análises estatísticas. Houve grande variação no número de microfilárias ingeridas entre as populações e ao analisarem-se as populações de Ae. albopictus foi possível observar que duas (Ambaí e Itaipuaçu) das quatro populações testadas ingeriram quantidade de parasitos semelhante (p>0,05) (Tabela 2). Ao comparar-se a quantidade de microfilárias ingeridas entre as populações de Ae. albopictus e as linhagens e população de Ae. aegypti, foi possível notar que Ambaí e Itaipuaçu apresentaram comportamento semelhante à linhagem Liverpool, enquanto Itaipu e Albuquerque, semelhante à população do Rio de Janeiro (p>0,05). Não houve diferença significativa na quantidade de microfilárias ingeridas entre a população de Albuquerque e a linhagem Rock (Tabela 2). 45 Tabela 2 – Número de fêmeas das espécies Aedes albopictus e Aedes aegypti, de diferentes origens geográficas, ingurgitadas total ou parcialmente, portadoras de microfilárias (mf) de Dirofilaria immitis logo após a alimentação infectante. Espécies Ae. albopictus Origens Nº de mosq. com mf/dissecados (TIG) Mf no estômago/mosq. Dissecado X ± DP Ambaí 69/81 (85,19) 4,09±3,63a Itaipu 79/97 (81,44) 4,99±4,86a,b 123/151 (81,46) 3,21±3,97a,c Albuquerque 51/53 (96,23) 6,87±5,81d Rock 61/68 (89,70) 7,62±6,05d 111/130 (85,38) 6,42±6,27b,d 68/81 (83,95) 3,09±2,92a Itaipuaçu Ae. aegypti Após alimentação infectante Rio de Janeiro Liverpool Teste Duncan. Valores na coluna seguidos por diferentes letras são estatisticamente diferentes com p < 0,05. Obs: Houve diferença significativa (p<0,05) entre Itaipu e Itaipuaçu Taxa de ingestão (TIG)= nº de mosquitos com microfilárias/dissecados x 100 X: média de microfilárias; DP: desvio padrão A taxa de mortalidade dos mosquitos variou entre as diferentes populações de Ae. albopictus, no entanto, em todas elas, a maior mortalidade ocorreu somente nas primeiras 48h após a ingestão de microfilárias (p<0,05), quando 55,57 a 74,96% deles já havia morrido. Quando foram comparadas as taxas de mortalidade desde 24h até o 16º dia pós-infecção das diferentes populações de Ae. albopictus, notou-se diferença significativa entre os grupos infectados e os seus respectivos controles (p<0,05), embora chame atenção o fato dos mosquitos da população de Albuquerque terem apresentado maior mortalidade no seu grupo controle, demonstrando que não foi possível adaptar esta população às condições de colônia (Tabela 3). Os indivíduos da linhagem Rock ingeriram mais microfilárias do que as todas as outras seis populações (p<0,05) (Tabela 2), porém isto não resultou em maior taxa de mortalidade em 48 horas (Tabela 3). As taxas de infecção (nº de mosquitos infectados/dissecados) das populações de Ae. albopictus variaram de 24,64 a 47,19% (Tabela 4). Dentre elas, a menor taxa encontrada, na população de Ambaí, foi maior do que a encontrada no controle padrão 46 de refratariedade à espécie D. immitis (Ae. aegypti linhagem Rock) e a maior taxa, de Albuquerque, foi menor do que a do controle padrão de susceptibilidade ao parasito (Ae. aegypti linhagem Liverpool). Cabe ressaltar que as populações Ae. albopictus de Itaipu e de Albuquerque se infectaram tanto quanto Ae. aegypti do Rio de Janeiro (p>0,05) (Tabela 4). Embora os mosquitos da espécie Ae. albopictus de Albuquerque tenham apresentado maior proporção de infectados e tenham ingerido mais microfilárias do que as outras populações da mesma espécie, neles nenhuma larva se desenvolveu até o estádio infectante (L3). Esse fato só se repetiu entre indivíduos da espécie Ae. aegypti, linhagem Rock (Tabela 4). Na população de Itaipu, 66% (225/343) das larvas encontradas, 16 dias após a infecção, eram larvas de terceiro estádio, localizadas na cabeça ou probóscida dos mosquitos, semelhante ao encontrado na espécie Ae. aegypti, linhagem Liverpool (792/1156 – 68%) (p>0,05). Os mosquitos da população de Itaipuaçu ingeriram igual número de microfilárias quando comparados aos mosquitos da linhagem Liverpool (p>0,05) (Tabela 2), no entanto, somente seis larvas (3,1%) completaram o desenvolvimento até larva de terceiro estádio na cabeça ou probóscida (Tabela 4). A população Ae. albopictus de Itaipu e a população Ae. aegypti do Rio de Janeiro se comportaram de maneira semelhante no que se refere à capacidade de permitir o desenvolvimento de larvas de D. immitis até o estádio infectante, na cabeça ou probóscida (Figuras 3b, 3c e 3d) em um grande número de mosquitos, diferentemente das outras populações. A linhagem Liverpool apresentou comportamento semelhante, mas com taxa de infectividade (52,64%) (nº de mosquitos infectantes/dissecados) significativamente maior (p<0,05) (Tabela 4). Embora a população de Itaipu não tenha apresentado a maior taxa de infecção entre as populações de Ae. albopictus testadas, foi a que apresentou maior taxa de infectividade (34,57%) (p<0,05). Quando comparada com os controles, essa população comportou-se de forma semelhante à população Ae. aegypti do Rio de Janeiro, mais eficiente do que a linhagem Rock embora menos do que a linhagem Liverpool (Tabela 4). As taxas de infectividade das populações Ae. albopictus de Ambaí e Itaipuaçu foram semelhantes entre si (p>0,05), porém menores do que as de Itaipu (Tabela 4). 47 Figura 3 – Larvas de Dirofilaria immitis em diferentes estágios, encontradas na espécie Aedes albopictus infectada experimentalmente. a: microfilária no intestino médio (400x); b: larvas em desenvolvimento nos tubos de Malpighi (400x); c: larvas infectantes na cabeça (100x); d: larvas infectantes saindo da probóscida (400x). 48 Tabela 3 – Mortalidade de fêmeas das espécies Aedes albopictus e Aedes aegypti de diferentes origens geográficas, alimentadas com sangue contendo microfilárias de Dirofilaria immitis nos diferentes períodos pós-infecção (PI). Espécies Origens Total de mosquitos ingurgitados 24-48h Controle Ambaí Ae. albopictus Itaipu Itaipuaçu Albuquerque Rock 296 269 542 150 - Teste 546 799 1829 631 905 3-13 dias PI Rio de Janeiro - 2207 Teste Controle Teste Controle Teste Controle Teste (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 99a 329b 78 145 1 3 178c 477d (33,45) (60,26) (26,35) (26,56) (0,34) (0,55) (60,13) (87,36) 82a 444b 62 191 8c 2d 152e 637f (30,48) (55,57) (23,05) (23,90) (2,97) (0,25) (56,51) (79,72) 163a 1108b 122 414 33c 2d 318e 1524f (30,07) (60,58) (22,51) (22,63) (6,09) (0,11) (58,67) (83,32) 125a 473b 23 64 2 5 150c 542d (83,33) (74,96) (15,33) (10,14) (1,33) (0,79) (100) (85,89) - 362 - 163 - 18 - 543 - 1120 (18,01) - (50,75) Liverpool - 800 14-16 dias PI Controle (40,00) Ae. aegypti Total de mosquitos mortos Mortalidade de mosquitos - 210 573 (1,99) - (25,96) - (26,25) 117 (14,63) 16 (60) - (0,72) - 0 1709 (77,43) - 327 (40,87) Teste χ2 – Valores em linha seguidos por diferentes letras são estatisticamente diferentes com p < 0,05. 49 Tabela 4 – Taxas de infecção (TX) e de infectividade (TI) e número e localização das larvas de Dirofilaria immitis encontradas nos mosquitos das espécies Aedes albopictus e Aedes aegypti, de diferentes origens geográficas, aos 16 dias pós-infecção. Espécies Origens Nº mosq. infectados/dissec. (TX) Ae. albopictus Ae. aegypti Nº L1, L2 e L3* Nº mosquitos infectantes/dissec. (TI) Nº L3** Total de larvas Ambaí 17/69 (24,64)a 38 1/69 (1,45)a 1 39 Itaipu 70/162 (43,21)b 118 56/162 (34,57)b 225 343 Itaipuaçu 79/305 (25,90)a 185 4/305 (1,31)a 6 191 Albuquerque 42/89 (47,19)b 144 0/89 (0)c 0 144 Rock 8/362 (2,21)c 15 0/362 (0)c 0 15 Rio de Janeiro 212/498 (42,57)b 270 172/498 (34,54)b 720 990 Liverpool 310/473 (65,54)d 364 249/473 (52,64)d 792 1156 Teste χ2 – Valores nas colunas seguidos por diferentes letras são estatisticamente diferentes com p < 0,05. Taxa de infecção (TX) = nº de mosquitos infectados/dissecados x 100 Taxa de infectividade (TI) = nº de mosquitos infectantes/dissecados x 100 Obs: Na população de Albuquerque não há larvas de terceiro estádio. * Número de larvas encontradas nos túbulos de Malpighi, tórax ou abdome de mosquitos infectados ** Número de larvas de terceiro estádio encontradas na cabeça ou probóscida de mosquitos infectantes Embora a população Ae. albopictus de Itaipuaçu e a linhagem Liverpool de Ae. aegypti tenham ingerido quantidade semelhante de microfilárias, Liverpool albergava maior número de L3/fêmea dissecada (p<0,05), confirmando o comportamento dessa linhagem como padrão de susceptibilidade à D. immitis (Tabela 5). Ainda que a quantidade de microfilárias ingeridas pela população Ae. albopictus de Itaipu tenha sido semelhante à de Ambaí (p>0,05), somente a de Itaipu permitiu o desenvolvimento de larvas de terceiro estádio comparável à população Ae. aegypti do Rio de Janeiro e à linhagem Liverpool de Ae. aegypti (Tabela 5). Cabe ressaltar que, apesar da população do Rio de Janeiro e a linhagem Liverpool de Ae. aegypti terem ingerido quantidades diferentes de microfilárias, o número médio de larvas infectantes na cabeça ou probóscida dos mosquitos foi semelhante (p>0,05), o que demonstra que a população Ae. aegypti do Rio de Janeiro é susceptível de forma semelhante à linhagem Liverpool de Ae. aegypti (Tabela 5). 50 A eficiência vetorial (IEV) da população Ae. albopictus de Itaipu foi semelhante à encontrada nos mosquitos da população do Rio de Janeiro e foram as populações que apresentaram IEV mais próximo à linhagem Liverpool, padrão de susceptibilidade à D. immitis (Tabela 5). Tabela 5 – Número médio de microfilárias (mf) de Dirofilaria immitis ingeridas e de larvas de terceiro estádio (L3) e índice de eficiência vetorial (IEV) das espécies Aedes albopictus e Aedes aegypti, de diferentes origens geográficas, após alimentação artificial. Mf*±DP L3**±DP IEV***(%) Ambaí 4,09±3,63a 0,01±0,12a 0,24 Itaipu 4,99±4,86a,b 1,39±2,60b 27,85 a,c a Espécies Ae. albopictus Origens Itaipuaçu Ae. aegypti 3,21±3,97 d Albuquerque 6,87±5,81 Rock 7,62±6,05d Rio de Janeiro Liverpool b,d 6,42±6,27 3,09±2,92 a 0,02±0,20 0 a 0,62 0 0a 0 1,45±2,81 b 22,59 1,67±2,28 b 54,05 Teste Duncan.Valores nas colunas seguidos por diferentes letras são estatisticamente diferentes com p< 0,05. Obs: Houve diferença significativa (p<0,05) entre Itaipu e Itaipuaçu * Número médio de microfilárias (mf) encontradas no estômago de mosquitos após alimentação sanguínea ** Número médio de larvas de terceiro estádio em mosquitos no 16º dia após alimentação sanguínea *** Índice de eficiência vetorial (%) = nº de L3 x 100/ nº de mf ingeridas 51 5 DISCUSSÃO A dirofilariose canina foi uma enfermidade freqüente em Itaipu e Itaipuaçu, confirmando que nessas duas regiões costeiras do Estado do Rio de Janeiro onde o estudo foi realizado, infecções pelo parasito são freqüentes. De fato, freqüências altas da infecção já foram descritas em áreas litorâneas do Estado (7,8 a 43,4%) (LABARTHE et al., 1988, 1990, 1997). A freqüência encontrada em Itaipu (7%) corrobora a informação de que a prevalência de cães parasitados em Itaipu vem diminuindo nos últimos anos (dados não publicados). Entretanto, como o parasito continua circulando entre a população canina desta região, esta diminuição da freqüência da infecção pode ser temporária, em vista da flutuação de alguns dos fatores indispensáveis à transmissão tais como: 1) população canina susceptível; 2) abundância de cães portadores de microfilaremia e, 3) abundância de vetores competentes (GENCHI et al., 1992; GUERRERO et al., 1992; KNIGHT & LOK, 1995). O mesmo pode estar ocorrendo em Itaipuaçu, já que a prevalência diminuiu de 35,7% (MENEZES, 1998) para os atuais 7%. Em Ambaí, Nova Iguaçu, região onde até então não havia nenhuma informação sobre a presença do parasito, observou-se um animal infectado com D. immitis. Embora a freqüência tenha sido baixa (0,9%) demonstra que o parasito está presente, e o fato do cão ser autóctone demonstra que há transmissão no local. Como anteriormente a presença do parasito na região era desconhecida, é possível que algum animal tenha sido levado para a região e servido como fonte de infecção para os vetores locais, como já foi mostrado em outras localidades (GUERRERO, 1988; GENCHI et al., 1988; GUERRERO et al., 1992). É possível que o deslocamento de cães microfilarêmicos para essas áreas contribua para o estabelecimento de novos focos. Ao considerar-se a proporção de fêmeas ingurgitadas experimentalmente com sangue canino, a espécie Ae. aegypti mostrou-se melhor adaptada ao sistema artificial utilizado do que a espécie Ae. albopictus, já que 50,5% de todas as fêmeas estavam parcial ou totalmente repletas ao final do repasto sangüíneo. Essa diferença de comportamento pode ser explicada pelo fato das linhagens de Ae. aegypti serem mantidas em condições de laboratório há bastante tempo e, por isso, habituadas ao sistema de alimentação utilizado. A dificuldade para se alimentar em aparato artificial 52 também já foi observada com a espécie Cx. tritaeniorhynchus quando foi adaptada a condições laboratoriais (KONISHI, 1989a). Pôde-se observar ainda que, aproximadamente 10 minutos após o início do repasto sangüíneo, grande parte das fêmeas de Ae. aegypti já estava ingurgitada, ao contrário das fêmeas de Ae. albopictus em que não se notou sinais de repleção até 30 minutos após o início do repasto. De fato, a literatura relata que fêmeas de Ae. aegypti são rápidas e persistentes e que o ato de hematofagia pode durar menos de dois minutos (FORATTINI, 2002). As maiores taxas de mortalidade ocorreram nas primeiras 48 horas após a infecção de Ae. albopictus ou Ae. aegypti (Tabela 3), semelhante ao relatado em outros estudos experimentais (BUXTON & MULLEN, 1981; APPERSON et al., 1989; KONISHI, 1989a; NAYAR & KNIGHT, 1999). Ao considerar-se que houve diferença significativa quanto à mortalidade entre as populações de Ae. albopictus (Ambaí, Itaipu e Itaipuaçu) infectadas e os seus respectivos controles, pode-se atribuir essa mortalidade à infecção. Entretanto, a população Ae. albopictus de Albuquerque apresentou comportamento inverso, pois inexplicavelmente morreram mais indivíduos do grupo controle do que do infectado. Em nenhuma das quatro populações de Ae. albopictus foi possível observar outro pico de mortalidade entre os mosquitos infectados como seria esperado, o que corresponderia ao período de migração das larvas dos tubos de Malpighi para a cabeça ou probóscida (14º ao 16º dias) dos mosquitos. Todas as fêmeas parcialmente ingurgitadas foram selecionadas neste estudo, já que observações anteriores mostraram que não há relação entre a quantidade de sangue ingerido e o número de microfilárias presentes no intestino médio dos mosquitos (dados não publicados). Ao se dissecarem as fêmeas tanto das populações de Ae. albopictus quanto das linhagens e população de Ae. aegypti, observou-se que mesmo algumas totalmente ingurgitadas não albergavam nenhum parasito, ao contrário de outras que, apesar de parcialmente repletas, apresentavam várias larvas no intestino médio. Dentre os indivíduos que se alimentaram, houve variação significativa no número de microfilárias ingeridas quando foram comparadas as diferentes populações de Ae.albopictus entre si, entre as diferentes linhagens e população de Ae. aegypti e também ao se comparar todos os indivíduos da espécie Ae. albopictus com todos da espécie Ae. aegypti. Como foram realizadas várias repetições com cada uma das populações ou linhagens estudadas, supor distribuição irregular de microfilárias nos aparatos, como já sugerido anteriormente (KARTMAN, 1953) não parece provável. Entretanto, não há na literatura outra sugestão que possa explicar tal diferença, até 53 porque mosquitos da espécie Ae. aegypti têm dimensões geralmente maiores do que indivíduos da espécie Ae. albopictus (NASCI, 1986; HONÓRIO, 1999) e neste estudo, a linhagem Ae. aegypti de Liverpool ingeriu número menor de microfilárias do que a população Ae. albopictus de Albuquerque. Essa variação, no entanto, já foi observada entre diferentes populações de Ae. albopictus dos EUA (SCOLES, 1994) e também em estudos com diferentes linhagens de Ae. aegypti (BUXTON & MULLEN, 1981). O comportamento da população Ae. albopictus de Ambaí e de Itaipuaçu foi igual em praticamente todos os aspectos, até no que diz respeito ao desenvolvimento tardio das larvas de D. immitis. Contudo, menor quantidade de formas imaturas foi encontrada nos tubos de Malpighi das fêmeas de Ambaí (38) em comparação a Itaipuaçu (185), levando a crer que os indivíduos da população de Ambaí que sobreviveram, albergavam poucas ou nenhuma larva, resultando em taxa de infecção e taxa de infectividade baixas (Tabela 4). Considerando que houve somente uma fêmea, albergando uma só larva de terceiro estádio na população de Ambaí, e que o nível de susceptibilidade de uma espécie varia em função da quantidade de larvas infectantes presentes na cabeça ou probóscida (SCOLES, 1994), pode-se dizer que a população de Ambaí foi pouco susceptível à infecção por D. immitis. O comportamento da população Ae. albopictus de Itaipuaçu quanto à quantidade de microfilárias ingeridas foi igual ao da linhagem Liverpool. No entanto, quando se observa a proporção de mosquitos infectantes (1,31%) e o número médio de larvas de terceiro estádio (0,02±0,20) nos indivíduos da população de Itaipuaçu, percebe-se que o nível de susceptibilidade desta população é inferior ao da linhagem Liverpool (52,64% 1,67±2,28). Esses resultados provavelmente estão relacionados com a taxa de mortalidade, que na população de Itaipuaçu foi maior (83,32%) que na de Liverpool (40,87%), e assim, os mosquitos que sobreviveram à infecção, albergavam um número menor de larvas do que a linhagem Liverpool, comprometendo a produção de larvas de terceiro estádio. Além disso, na população de Itaipuaçu o desenvolvimento do parasito demonstrou ser mais lento, já que 95% (75/79) dos mosquitos infectados no 16º dia pósinfecção ainda albergava larvas de primeiro e segundo estádios nos tubos de Malpighi (Tabela 4), fenômeno já observado na população Ae. albopictus do estado de North Carolina, EUA (APPERSON et al., 1989). Embora a população de Itaipuaçu pudesse ser considerada vetora em potencial, o pequeno número de larvas de terceiro estádio encontrado na cabeça ou probóscida sugere que essa população foi pouco susceptível ao parasito. Além disso, como nessa população é necessário um tempo mais longo para as 54 larvas completarem o desenvolvimento, o risco de transmissão que a população Ae. albopictus de Itaipuaçu poderia representar diminui, já que os indivíduos podem morrer antes das larvas alcançarem as peças bucais. O número médio de L3/fêmea de Ae. albopictus da população de Itaipu foi de 1,39±2,60 com uma parasitemia em torno de 1670 microfilárias/mL de sangue. Ao se comparar estes resultados com um estudo que avaliou a competência vetorial desta espécie em Taiwan, com diferentes densidades de microfilárias, nota-se que o número de larvas infectantes (1,71±1,23) (LAI et al., 2000) foi muito próximo ao encontrado na população de Itaipu, porém em mosquitos que ingeriram sangue com 2500mf/mL. Isto pode indicar que somente um número limitado de larvas pode desenvolver-se nos mosquitos dessa espécie, mesmo que façam o repasto num cão com parasitemia alta. Além disso, a ingestão de um baixo número de microfilárias favorece a sobrevivência dos mosquitos e a produção de larvas de terceiro estádio (NAYAR & KNIGHT, 1999). A mortalidade das populações de Ae. albopictus foi alta, mas a população de Itaipu foi a que apresentou menor taxa de mortalidade, com valor muito próximo ao da população Ae. aegypti do Rio de Janeiro e tendo ingerido igual número de microfilárias. Aliás, o comportamento dessas duas populações foi semelhante em todos os aspectos. Quando se comparou a capacidade de permitirem o desenvolvimento de larvas até a forma infectante, o comportamento das populações de Itaipu e do Rio de Janeiro foi igual ao da linhagem Liverpool, embora o número de indivíduos infectantes da linhagem Liverpool tenha sido significativamente maior. Considerando que quanto maior o número de larvas de terceiro estádio na cabeça ou probóscida, maior a susceptibilidade dos mosquitos, a população de Itaipu foi tão susceptível (34,6%) quanto a linhagem mais susceptível (INDY) (32,9%) dentre as linhagens estudadas de Ae. albopictus dos EUA (SCOLES, 1994). Ao se analisar o índice de eficiência vetorial, que expressa o potencial vetorial dos mosquitos, a população Ae. albopictus de Itaipu (27,85%) foi vetora mais eficiente do que a população de Taiwan (19,73%) (LAI et al., 2001), tão eficiente quanto algumas populações dos EUA (1,7% a 33%) (SCOLES, 1994) e menos eficiente do que a população das Filipinas (60%) (KARTMAN, 1953). Ao se comparar a susceptibilidade da população Ae. aegypti do Rio de Janeiro (34,5%) com estudos avaliando a competência vetorial desta espécie em outras regiões do país, percebeu-se que a linhagem estudada tem maior potencial, por exemplo, do que a população de Maceió, Alagoas (12%) (BRITO et al., 1999). Embora a população Ae. aegypti do Maranhão 55 (64,3%) (AHID et al., 2000) tenha demonstrado ser vetora mais susceptível à D. immitis, mostrou-se menos eficiente na transmissão do parasito do que a população do Rio de Janeiro. Vale lembrar que essa população do Rio de Janeiro já se mostrou parcialmente susceptível (SERRÃO et al., 2001) e que no presente estudo, apresentou eficiência 3,6 vezes maior do que anteriormente (6,3%). Talvez a diferença encontrada entre os estudos anterior e atual possa ser atribuída tanto ao sangue humano usado na diluição do experimento anterior quanto ao anticoagulante. As variações tanto de susceptibilidade à infecção por D. immitis quanto de eficiência vetorial observadas nas populações de Ae. albopictus estudadas também podem ser notadas entre as populações Ae. aegypti de diferentes regiões do país (Alagoas, Maranhão e Rio de Janeiro). Como as populações brasileiras de Ae. albopictus apresentam alta variação genética e são muito diferenciadas dentro de uma mesma região (LOURENÇO-DE-OLIVEIRA et al., 2003), é possível que a variação na competência vetorial seja explicada pela diversidade genética das populações de Ae. albopictus estudadas. Na espécie Ae. aegypti, a susceptibilidade à infecção é regulada por um gen recessivo ligado ao sexo, que controla a evolução das larvas nos tubos de Malpighi (McGREEVY et al., 1974, SULAIMAN & TOWNSON, 1980), o que provavelmente determina a diferença encontrada entre as populações de Ae. aegypti do Rio de Janeiro, Alagoas e do Maranhão. O fato das fêmeas da população Ae. albopictus de Albuquerque terem ingerido mais microfilárias do que as outras populações da mesma espécie, pode explicar a alta taxa de mortalidade observada (74,96%) 48 h após a alimentação, embora todos os mosquitos do grupo controle estivessem mortos 16 dias após a infecção. Coincidentemente, larvas de terceiro estádio não foram detectadas na cabeça ou probóscida da população de Albuquerque, a única localidade onde não há registro de cães infectados por D. immitis (MUNIZ, 2001). Tal fato também já fora observado na espécie Cx. quinquefasciatus de Rondônia (AHID et al., 2000), local onde a prevalência da dirofilariose canina é nula (LIMA et al., 1996). O ciclo do filarídeo parece ser mais lento na população de Albuquerque, tal qual as populações de Ambaí e Itaipuaçu, o que poderia justificar a ausência de larvas de terceiro estádio (L3) na cabeça ou probóscida dos mosquitos ao 16º dia. Esse comportamento leva a crer que haja alguma barreira nos tubos de Malpighi destas populações que retarde o desenvolvimento das larvas. A população de Albuquerque, em particular, demonstrou ser menos susceptível à D. immitis do que as populações de Ambaí e Itaipuaçu. 56 Diferenças em diversas linhagens de Ae. aegypti e Ae. albopictus em permitir o desenvolvimento de larvas de D. immitis até o estádio infectante já tinham sido relatadas (BUXTON & MULLEN, 1981; APPERSON et al., 1989). A linhagem Liverpool e as populações do Rio de Janeiro e de Itaipu tinham mais larvas infectantes do que larvas de 1º e 2º estádios 16 dias após a infecção, quando comparadas com a linhagem Rock e a população de Albuquerque, nas quais não foram encontradas larvas infectantes na cabeça e probóscida, embora larvas de 1º e 2º estádios tivessem sido encontradas. Embora não fosse objeto desse estudo, observou-se a presença de Ascogregarina taiwanensis em algumas fêmeas das populações de Ae. albopictus infectadas com D. immitis, parasito comum dos tubos de Malpighi de culicídeos adultos. Esta co-infecção já foi anteriormente relatada em populações de Ae. albopictus de New Orleans (COMISKEY & WESSON, 1995) e da Florida, EUA, sem afetar o desenvolvimento do filarídeo (NAYAR & KNIGHT, 1999). As fêmeas de Ae. albopictus apresentam comportamento hematofágico eclético, alimentando-se preferencialmente em mamíferos. Cães já demonstraram exercer atratibilidade sobre Ae. albopictus capturados no bairro do Engenho de Mato (GOMES, 2000), região oceânica de Niterói. O fato da população de Itaipu ter apresentado alto nível de susceptibilidade e eficiência vetorial, associado ao fato dos mosquitos serem atraídos pelos cães, indica a possibilidade dos mosquitos desta espécie estar envolvida na transmissão de D. immitis na região, embora até o momento nenhum indivíduo tenha sido encontrado albergando D. immitis (LABARTHE et al., 1998). Na região oceânica de Niterói, onde a transmissão é mantida por Ochlerotattus scapularis e Aedes taeniorhynchus (vetores primários) (LABARTHE et al., 1998, MACEDO et al., 1998), Ae. albopictus pode se apresentar como possível vetor, que teria papel importante na manutenção da transmissão, já que esta espécie está presente durante todo o ano, não apresentando flutuação na abundância populacional (FORATTINI, 2002). Além disso, produz quantidade significativa de larvas de terceiro estádio. Como Ae. albopictus é uma espécie com hábitos alimentares diurnos, o risco de transmissão aumenta ainda mais para aqueles cães que ficam fora de casa durante o dia. Outro aspecto importante são os ecótopos utilizados por essa espécie, que a aproxima de habitações, podendo aumentar a incidência de infecções humanas. Embora a demonstração da competência vetorial de uma espécie ou população não estabeleça sua capacidade vetorial, estudos experimentais fornecem indícios que permitem inferir sobre a capacidade vetorial de uma espécie. Portanto, o fato da 57 população Ae. albopictus de Itaipu ter mostrado competência vetorial significativa sugere que possa participar da cadeia de transmissão do parasito D. immitis no Estado do Rio de Janeiro. 58 6 CONCLUSÕES O estudo da freqüência de dirofilariose canina e da competência vetorial da espécie Ae. albopictus ao parasito D. immitis, no Estado do Rio de Janeiro permitiu concluir que: 1. A dirofilariose canina é uma enfermidade freqüente (7%) em Itaipu, Niterói, RJ e em Itaipuaçu, Maricá, RJ e com baixa freqüência em Ambaí, Nova Iguaçu (0,9%). 2. As populações Ae. albopictus de Ambaí, Itaipu e Itaipuaçu foram capazes de se infectar e permitir o desenvolvimento do filarídeo D. immitis até larva de terceiro estádio. 3. As populações de Ae. albopictus infectadas por D. immitis apresentaram alta mortalidade. 4. As populações Ae. albopictus de Ambaí e Itaipuaçu apresentaram baixa competência vetorial. 5. A população Ae. albopictus de Albuquerque não foi vetor susceptível à D. immitis. 6. A população Ae. albopictus de Itaipu foi a mais susceptível à infecção por D. immitis e a que apresentou maior eficiência vetorial para transmissão do parasito. 59 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABRAHAM, D. Biology of Dirofilaria immitis. In: BOREHAM, P. F.; ATWELL, R. B. Dirofilariasis. CRC Press Florida, p. 29-46, 1988. ADHAMI, J.; REITER, P. Introduction and establishment of Aedes (Stegomyia) albopictus Skuse (Diptera: Culicidae) in Albania. Journal of the American Mosquito Control Association, v. 14, p. 340-343, 1998. AHID, S. M. M.; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, R. Mosquitos vetores potenciais de dirofilariose canina na Região Nordeste do Brasil. Revista de Saúde Pública, v. 33, n. 6, p. 560-565, 1999. AHID, S. M. 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Amostra Universidade Federal Fluminense FACULDADE DE VETERINÁRIA data PROJETO PREVALÊNCIA ANO _______ 1 – VETERINÁRIO CÓDIGO NOME 2 – CLINICA CÓDIGO NOME LOCAL 3 – PROPRIETÁRIO DO ANIMAL NOME TELEFONE ENDEREÇO (RUA, N°, BAIRRO, CIDADE, ESTADO) CEP 4 – ANIMAL NOME REGIÃO [ ] COR PREDOMINANTE 1-[ ] BRANCA 2-[ BAIRRO/CIDADE [ ] VIAGENS [ ] ] PRETA 3-[ ] DOURADA PELAGEM 1–[ ] CURTO SEXO MACHO / FÊMEA 4-[ APTO ALTURA SIM / NÃO APTO ] MARROM 5-[ ] CINZA TIPO DE PELAGEM 2 – [ ] MÉDIO 3–[ ] LONGO IDAD RAÇA [ ] E 1–[ PESO ] COM SUBPÊLO 2 – [ ] SEM SUBPÊLO FREQUÊNCIA DA TOSA TIPO DE TOSA TOSA SIM / NÃO FINALIDADE DO CÃO 1-[ ] GUARDA PREVENTIV O 2–[ ] COMPANHIA 3–[ ] OUTROS FREQUÊNCIA/QUAL? HISTÓRIA CLÍNICA/QUAL? SIM / NÃO __________________ NASCEU NA REGIÃO? SIM / NÃO POSSUI GATOS? SIM / NÃO MICROFILÁRIA ELISA POSITIVO / NEGATIVO POSITIVO / NEGATIVO HÁ QUANTO TEMPO VIVE NO LOCAL? QUANTOS? [ ] FÊMEAS [ ] MACHOS ______________________________________ Assinatura do Veterinário 88 GLOSSÁRIO Estádio – intervalo entre cada duas mudas consecutivas de formas larvárias de um nematóide ou de um artrópode (REY, 2003). Índice de eficiência vetorial (IEV) – número médio de larvas de terceiro estágio encontrado na cabeça ou probóscida/número médio de microfilárias ingeridas x 100. Infecção - Contaminação ou invasão do corpo por um microrganismo parasito, que pode ser um agente patogênico ou não, principalmente vírus, bactérias, fungos, protozoários ou helmintos (REY, 2003). Infectividade - Caráter de um agente de doença que compreende capacidade de penetração, sobrevida e multiplicação em determinado hospedeiro (REY, 2003) Linhagem (lab) – raças ou variedades de animais para experimentação, produzidas por endogamia (inbreeding) ou mutação (REY, 2003). Mosquito refratário (sin. Resistente) – aquele que não suporta o desenvolvimento da larva de Dirofilaria immitis até o estágio infectante (L3), embora algum desenvolvimento possa ocorrer. Mosquito susceptível – aquele que permite o desenvolvimento da larva de D. immitis até o estágio infectante (L3). Mosquitos infectados – indivíduos que albergam larvas de D. immitis de qualquer estágio. Mosquitos infectantes – indivíduos que albergam larvas de terceiro estágio na cabeça ou probóscida. População – designa conjunto de indivíduos (organismos) interférteis e, ou seja, que transferem entre si a informação gênica, vivendo em determinada área ou região (FORATTINI, 1996). Prevalência – designa a medida da freqüência de determinada doença, pelo número de casos existentes em período de tempo estabelecido, independentemente de serem novos ou antigos (FORATTINI, 1996). Refratariedade – nome genérico designando a característica da espécie que, como um todo, se revela não receptível à ação de fator determinante (FORATTINI, 1996). Susceptibilidade – designa a característica do organismo receptível à ação de fator determinante (FORATTINI, 1996). Taxa de infecção – número de mosquitos infectados/dissecados x 100. Taxa de infectividade – número de mosquitos infectantes/dissecados x 100. 89