UVV - CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA
PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
CONCENTRAÇÕES DE TESTOSTERONA PLASMÁTICA
EM UMA POPULACAO JUVENIL DE Chelonia mydas, NO
EFLUENTE INDUSTRIAL DE UMA COMPANHIA
SIDERÚRGICA - VITÓRIA, ESPÍRITO SANTO
Jannine Garcia Forattini
VILA VELHA – ES
Fevereiro de 2011
UVV - CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA
CONCENTRAÇÕES DE TESTOSTERONA PLASMÁTICA
EM UMA POPULACAO JUVENIL DE Chelonia mydas, NO
EFLUENTE INDUSTRIAL DE UMA COMPANHIA
SIDERÚRGICA - VITÓRIA, ESPÍRITO SANTO
Jannine Garcia Forattini
Orientadora: Profa. Dra. Flaviana Lima Guião Leite
Dissertação apresentada ao Programa
de Mestrado em Ciência Animal do
Centro Universitário Vila Velha, para
a obtenção do título de Mestre em
Ciência Animal.
VILA VELHA – ES
Fevereiro de 2011
Catalogação na publicação elaborada pela Biblioteca Central / UVV-ES
F692c
Forattini, Jannine Garcia.
Concentrações de testosterona plasmática em uma população juvenil
de chelonia mydas no efluente industrial de uma companhia siderúrgica
– Vitória, Espírito Santo / Jannine Garcia Forattini. – 2011.
48 f.: il.
Orientador: Profª. Drª. Flaviana Lima Guião Leite.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Centro Universitário Vila
Velha, 2011.
Inclui bibliografias.
1. Tartaruga marinha. 2. Testosterona. I. Leite, Flaviana Lima Guião.
II. Centro Universitário Vila Velha. III. Título.
CDD 597.92
Dedico este trabalho aos meus pais e noivo.
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom e vontade de cuidar dos animais.
Aos meus pais pelo carinho de sempre.
Ao meu noivo pelas noites em claro, compreensão e ajuda.
A Flaviana, amiga e orientadora, sempre com palavras de incentivo.
A Cecília pelo apoio irrestrito.
A Evelise, Marcillo, a equipe e o projeto ICM-Bio/TAMAR, sem eles nada teria
acontecido.
Ao Claudio e Priscila por me receberam de braços abertos na USP e ao Laboratório de
Dosagens Hormonais do Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (LDH-VRA-FMVZUSP) pelos kits de radioimunoensaio.
Aos meus queridos professores Dominik e Romildo por não medirem esforços em me
ajudar.
Ao Dr. David Owens, pela paciência e interesse em me auxiliar e por dividir sua
sabedoria e artigos enviados para colaboração deste trabalho.
A Companhia Siderurgica ArcelorMittal por ceder seu espaço para as pesquisas
conservacionistas.
A FAPES pelo auxilio financeiro.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Válvula de escape (“TEDs” – Turtle Excluder Device) em redes de
arrasto para tartarugas marinhas...................................................................
14
FIgura 2 -
Tartaruga verde, Chelonia mydas, em fase juvenil e filhote................... 16
Figura 3 -
Cadeia carbônica da testosterona............................................................
Figura 4 -
Sistema urogenital de uma tartaruga marinha......................................... 26
Figura 5 -
Imagem das gônadas de tartarugas marinhas da espécie Caretta
caretta, através de videolaparoscopia ....................................................
19
26
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Valores de média, desvio padrão, mínimo e máximo encontrados para
o comprimento curvilineo de carapaca (CCC), largura curvilinea de
carapaça (LCC), peso e testosterona para os grupos de machos,
fêmeas, indeterminados e total de tartarugas verdes, Chelonia mydas,
capturadas no efluente final da Companhia Siderúrgica ArcelorMittal . 32
Tabela 2 -
Valores de contagem por minuto (CPM), capacidade de ligação (cap
lig), ligacao não especifica (LNE), sensibilidade, coeficiente de
variação intra ensaio e coeficiente de variação inter ensaio...................
Tabela 3 -
Comparação entre o número de fêmeas e o número de machos através
do teste da binomial................................................................................
Tabela 4 -
33
34
Teste t pareado para as amostras obtidas em dois momentos diferentes
de um mesmo animal..............................................................................
34
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 -
Relação entre o comprimento curvilíneo de carapaça (CCC) e o peso
de Chelonia mydas capturas na Companhia Siderúrgica ArcelorMittal,
através de regressão linear (r2)................................................................
Gráfico 2 -
36
Relação entre o titulo de testosterona e o comprimento curvilíneo de
carapaça (CCC) de Chelonia mydas capturadas na Companhia
Siderúrgica ArcelorMittal através de regressão linear (r2)...................... 37
Gráfico 3 -
Concentrações de testosterona (ng/dl) das amostras plasmáticas
obtidas de tartarugas verdes capturadas no efluente final da
Companhia Siderúrgica ArcelorMittal, Espírito Santo...........................
39
SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO................................................................................................
11
2 REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................
13
2.1 Tartarugas Marinhas...................................................................................
13
2.1.1 Chelonia mydas..................................................................................
15
2.2 Determinação sexual dependente da temperatura.......................................
17
2.3 Testosterona................................................................................................
19
2.4 Proporção sexual.........................................................................................
21
2.5 Métodos de sexagem de acordo com a faixa etária....................................
23
2.5.1 Sexagem em ovos e filhotes de tartarugas marinhas..........................
23
2.5.2 Sexagem em tartarugas marinhas juvenis...........................................
24
2.5.3 Sexagem em tartarugas marinhas adultas...........................................
27
2.6 Radioimunoensaio......................................................................................
28
3 OBJETIVO.....................................................................................................
29
4 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................
29
4.1 Área de estudo............................................................................................
29
4.2 Captura........................................................................................................
30
4.3 Biometria....................................................................................................
30
4.4 Coleta de amostra de sangue.......................................................................
30
4.5 Análise hormonal........................................................................................
31
4.6 Análise estatística.......................................................................................
31
5 RESULTADOS................................................................................................
32
6 DISCUSSÃO....................................................................................................
35
7 CONCLUSÃO..................................................................................................
41
8 REFERÊNCIAS...............................................................................................
42
Forattini, J.G. Concentrações de Testosterona Plasmática em uma População Juvenil de
Chelonia mydas no Efluente Industrial de uma Companhia Siderúrgica – Vitória,
Espirito Santo
RESUMO: A espécie Chelonia mydas, popularmente conhecida como “tartaruga verde”,
habita o oceano Atlântico, Pacifico, Mediterrâneo e parte do Índico. Após o nascimento, o
filhote migra para alto mar até se tornar juvenil e migrará para áreas costeiras para
alimentação. Pouco se sabe sobre estes animais nesta fase que pode durar ate mais de 25
anos. Por serem animais que possuem uma fase juvenil prolongada, atingindo a maturidade
sexual tardiamente, tem vida longa e os locais usados por elas para o acasalamento e
alimentação são distantes entre si, torna-se essencial a obtenção de informações sobre seu
status reprodutivo e fisiológico. Por estes motivos, faz-se necessário a coleta de
informações biológicas de todos os estágios de vida para auxiliar na conservação desta
espécie, sendo a determinação sexual de grande importância em estudos evolutivos e na
conservação destes animais. O objetivo do presente trabalho foi determinar as
concentrações de testosterona plasmática em uma população de Chelonia mydas juvenis
através de radioimunoensaio. Foram capturados durante os meses de Janeiro a Junho de
2010, no efluente final da companhia siderúrgica ArcelorMittal 67 tartarugas verdes,
Chelonia mydas, todas juvenis e em bom estado nutricional, com ausência de
fibropapilomatose e sinais clínicos de outras doenças. Estes animais foram classificados
como juvenis através de biometria onde o comprimento curvilíneo de carapaça (CCC) foi
de 27,6 a 53,4 cm (38,4 ± 5,09 cm), a largura curvilínea de carapaça (LCC) de 26,1 a 49,7
cm (34,6 ± 4,6 cm) e o peso de 2,6 a 20,2 kg (6,8 ± 2,9 kg). Foram puncionados 4ml de
sangue do seio venoso cervical de cada animal, alguns dos quais foram recapturados e
coletados mais de uma vez totalizando assim 84 amostras. As amostras foram armazenadas
em tubos contendo heparina para obtenção de plasma por meio de centrifugação e
armazenada a -20°C ate processamento As analises laboratoriais foram realizadas em
Setembro de 2010 no Laboratório de Dosagens Hormonais do Departamento de
Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de
São Paulo (LDH-VRA-FMVZ-USP) através da utilização de kits comerciais para dosagem
de testosterona por radioimunoensaio (Coat-a-Count, DPC, Los Angeles, CA, USA). Alem
destas 84 amostras, 03 amostras foram fornecidas pelo TAMAR de tartarugas juvenis da
mesma espécie, porém que se encontravam em estresse crônico e posteriormente vieram a
óbito onde foi possível classificar o sexo através da análise das gônadas pela necropsia,
completando assim 87 amostras. Destes, 76 amostras apresentaram títulos de testosterona
abaixo de 0.98 ng/dl, e as demais apresentaram títulos entre 3,13 a 113,16 ng/dl.
Comparando estes resultados com os encontrados em outras regiões, foi possível classificar
61 fêmeas, 2 machos e 4 indeterminados, o que gera uma proporção sexual de 30.5F:1.0M.
Palavras-Chave: radioimunoensaio. tartaruga verde. testosterona.
Forattini, J. G Plasmatic Concentrations of Testosterone in a Juvenile Population of
Chelonia mydas, Encountered at an Industrial Effluent of a Steel Company – Vitória,
Espírito Santo.
ABSTRACT: The species, Chelonia mydas, most commonly known as “Green turtle”
lives in the Atlantic, Pacific, Mediterranean and part of the Indian Ocean. After birth,
the hatchling remains at open sea until it has reached the juvenile phase, where it will
stay at feeding grounds around coastal areas. Little is known about this phase that can
last over 25 years. The need for obtaining information about the reproductive and
physiological status of these animals are considered essential seeing that these are
animals that are known to have a long juvenile phase, are late in reaching sexual
maturity, has a long life span and feeding and reproductive locations are distant from
one another. For these reasons, it’s extremely important to collect biological
information of all life stages as to help in the conservation of these species, and a way to
do so is determining the sex ratio. The goal of the present paper is to determine
plasmatic concentrations of testosterone in a juvenile population of Chelonia mydas,
conducted by radioimmunoassay. To do so, 67 juvenile green turtles, all considered
healthy and without fibropapilloma tumors and other clinical signs of diseases, were
captured from January to June, 2010 in the final effluent of a steel company,
ArcelorMittal. They were all classified as juvenile because of the size of their straight
carapace length (SLC) which varied from 27,6 to 53,4 cm (38,4 ± 5,09 cm), while their
width varied from 26,1 to 49,7cm (34,6 ± 4,6 cm) and weight from 2,6 to 20,2 kg (6,8 ±
2,9 kg). 4 ml were drawn from the bilateral cervical sinus from each animal, some of
which were captured more than once, totalizing 84 samples. Samples were collected
into tubes containing Heparin to obtain plasma, which after centrifuged, was separated
and stored at -20°C until processing. Laboratory analyses were done in September 2010
at the Laboratório de Dosagens Hormonais do Departamento de Reprodução Animal da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (LDHVRA-FMVZ-USP) through Radioimmunoassay kits for testosterone (Coat-a-Count,
DPC, Los Angeles, CA, USA). Another three samples were donated from TAMAR that
were collected from three juvenile green turtles that were encountered in chronic stress
and later necropsy was performed to confirm their sex, completing 87 samples. 76 of
these samples had testosterone titers lower than 0,98ng/dl and the rest obtained titers
that ranged from 3,13 to 113,16 ng/dl. Comparing these results to ones encountered
from a different location, it was possible to classify 61 sea turtles as females, 2 males
and 4 as undetermined, which originates a highly female biased sex ratio of 30.5F:1.0M.
Key words: green sea turtle. radioimmunoassay. testosterone.
11
1 INTRODUÇÃO
As tartarugas marinhas encontram-se na terra desde a era Mesozóica, há 100 milhões de anos
(POUGH; HEISER; MCFARLAND, 1999) sendo consideradas como um grupo de animais
mais antigos do planeta.
A espécie Chelonia mydas está atualmente incluída na lista da IUCN (International Union for
the Conservation of Nature – União Internacional para a Conservação da Natureza) no status
“ameaçada de extinção” (POLIDORO et al., 2008).
Como a maioria dos répteis, as tartarugas marinhas têm o seu sexo determinado pela
temperatura de incubação do ninho, onde temperaturas mais altas produzem um maior número
de fêmeas e temperaturas mais baixas, maiores números de machos (CUBAS; BAPTISTOTTE,
2007).
A maioria das ações conservacionistas visam o aumento populacional de uma espécie em risco
de extinção. Para animais que têm o sexo determinado pela temperatura, estas medidas não são
suficientes visto que em uma população, poderá haver predominância de apenas um sexo, o que
não garantiria a sobrevivência da espécie.
Um exemplo foi a utilização de caixas de isopor com o objetivo de proteger os ovos destes
animais de predadores e outras ameaças externas (MORREALE et al., 1982). Esta técnica
obteve sucesso, pois estava havendo aumento no número de filhotes eclodidos por ninho,
porém, foi descoberto que a temperatura encontrada dentro da caixa de 2 a 3°C mais baixa que
a encontrada no ninho, o que levaria a uma produção de quase 100% de machos
(MROSOVSKY; YNTEMA, 1980).
Além disso, a determinação da proporção sexual de tartarugas marinhas auxilia indiretamente
na preservação do ambiente utilizado por estes para nidificação como, por exemplo, na
vegetação costeira. Um trabalho realizado por Kamel e Mrosovsky (2006) determinou que
91,4% das fêmeas preferem áreas com vegetação para ovipostura. Nestas áreas, a temperatura
12
do ninho chegava a ser 2°C mais baixa que em áreas sem vegetação ou apenas com palmeiras,
proporcionando assim, uma temperatura mais próxima da temperatura pivotal.
A proporção sexual pode ser determinada nas diferentes faixas etárias, sendo que, para
Chelonia mydas, a faixa etária ideal é a juvenil, pois esta representa uma condensação de vários
ninhos de diferentes praias e regiões, visto que ao atingirem esta fase, as tartarugas marinhas se
encontram em locais de alimentação em comum onde permanecerão durante anos. Além disso,
estes animais ainda não apresentam características comportamentais ligados ao sexo como
migração, evitando assim o risco de ter uma proporção maior de um sexo devido à ausência do
outro (DIEZ; VAN DAM, 2003).
Por não terem dimorfismo sexual e havendo a necessidade em determinar o sexo de grandes
números de tartarugas em um grupo, tornou se necessário a utilização de uma técnica confiável
e de fácil aplicação. A técnica mais utilizada é a dosagem de testosterona através de
radioimunoensaio por ser fácil de ser realizada, pois necessita apenas da coleta de sangue e
processamento laboratorial. Desde 1978, esta técnica vem sendo utilizada para determinação da
proporção sexual em diversos grupos e espécies de tartarugas marinhas (WIBBELS; OWENS;
LIMPUS, 2000). No Brasil, não existe relato da realização de estudos para a definição da
proporção sexual em grupos de Chelonia mydas.
O objetivo deste trabalho foi identificar o sexo determinar a proporção sexual de uma
população de Chelonia mydas juvenis encontradas no efluente final da Companhia Siderúrgica
ArcelorMittal, através de dosagem de testosterona por radioimunoensaio.
Este estudo foi executado através da cooperação entre o Programa de Mestrado em Ciência
Animal do Centro Universitário Vila Velha, Projeto TAMAR - ICMBio e o Laboratório de
Dosagens Hormonais do Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
13
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 TARTARUGAS MARINHAS
Os quelônios estão presentes no mundo desde o período Triássico da era Mesozóica. Existem
duas linhagens de quelônios que se diferem na forma de retração do pescoço, ou seja, os que
retraem a cabeça para dentro do casco horizontalmente são conhecidos como os Pleurodira. Já
os que retraem o pescoço formando um S vertical são os Cryptodira e é nesta linhagem que se
encontram as tartarugas marinhas (POUGH; HEISER; MCFARLAND, 1999).
As tartarugas marinhas são divididas em duas famílias: a família Dermochelyidae, gênero
Dermochelys, onde se encontra apenas uma espécie, Dermochelys coriacea, mais conhecida
como tartaruga de couro, e a familia Cheloniidae que possuem dois grupos: Grupo Chelonini
que consiste no gênero Chelonia (C. mydas), e o Grupo Carettini que é subdividido em quatro
gêneros: gênero Caretta (C. caretta), gênero Eretmochelys (E. imbricata), gênero Lepidochelys
(L. olivacea e L. kempii) e, por último, o gênero Natator (N. depressus – flat back turtle)
(POUGH; HEISER; MCFARLAND, 1999).
Uma das grandes ameaças à população de tartarugas marinhas é o homem que, através da caça
tanto em alto mar quanto na areia durante a nidificação, do consumo desenfreado de ovos
(SPOTILA, 2004), destruição da vegetação natural das praias, favorecendo assim uma
produção maior de fêmeas em um ninho (KAMEL; MROSOVOSKY, 2006), poluição dos
mares que leva a ingestão acidental de lixo e plásticos e da captura acidental em redes de pesca
(HARMS et al., 2003), tem ameaçado cada vez mais as espécies. Além disso, as doenças estão
cada vez mais presentes como, por exemplo, a fibropapilomatose que aumentou drasticamente
sua incidência desde 1982 (AGUIRRE; BALAZS, 2000). A espécie Chelonia mydas está
atualmente incluída na lista da IUCN (International Union for the Conservation of Nature –
União Internacional para a Conservação da Natureza) (POLIDORO et al., 2008).
A captura acidental durante a pesca tem sido considerada a maior ameaça às tartarugas
marinhas sendo que o arrasto de camarão é o método de pesca que mais causa a morte destes
animais por afogamento (PUPO; SOTO; HANAZAKI, 2006; SILVA et al., 2007). Uma
14
solução para isso foi a criação de uma espécie de válvula de escape para as tartarugas nestas
redes chamadas de TEDS (Turtle Excluder Device) (HARMS et al., 2003). No Brasil, existe
uma lei que obriga o uso desses TEDS, mas devido a alguns fatores como falta de fiscalização,
esta lei não é cumprida (SILVA et al., 2007).
Figura 1- Ilustração de uma válvula de escape (“TEDs” – Turtle Excluder Device) em redes de
arrasto para tartarugas marinhas.
Por terem uma área de alimentação distinta da área de reprodução, houve uma forte pressão
internacional para que houvesse proteção das tartarugas marinhas em todas as fases de suas
vidas, com isso, todos os países teriam que colaborar com criações de projetos de conservação.
Em 1980, foi criado o Programa de Conservação Nacional da Tartaruga Marinha (Projeto
TAMAR), junto com o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente (IBAMA) e em 1986, foi
garantida a proteção total a todas as espécies de tartarugas marinhas com ocorrência no litoral
capixaba (MARCOVALDI; MARCOVALDI, 1999).
Como as tartarugas marinhas são animais que se caracterizam com uma fase juvenil
prolongada, atingem a maturidade sexual tardiamente, possuem vida longa e os locais usados
15
por elas para o acasalamento e alimentação são distantes entre si, torna-se essencial a obtenção
de informações sobre seu status reprodutivo e fisiológico (HAMANN et al., 2006, POLIDORO
et al., 2008). Estas características associadas às ameaças vindas das atividades humanas são os
motivos pelos quais estes animais estão em risco de extinção (POLIDORO et al., 2008).
Levando estas características e ameaças em consideração, torna-se necessário a coleta de
informações biológicas de todos os estágios de vida, tanto de animais de cativeiro quanto de
vida livre, para auxiliar na conservação das espécies de tartarugas marinhas (BOLTEN;
BJORNDAL, 1992; HAMANN et al., 2006). Por isso, em 1973, foi criado o “Endangered
Species Act” que visa à implementação de planos administrativos que irão, efetivamente,
proteger e recuperar populações de tartarugas marinhas listadas como ameaçadas ou em perigo
de extinção (BRAUN-MCNEILL et al., 2007).
2.1.1 Chelonia mydas
Entre as sete espécies de tartarugas marinhas que habitam os oceanos, destaca-se a mais
popular, a Chelonia mydas, conhecida como tartaruga verde ou “green turtle”. O peso dos
adultos pode variar entre 70 e 230 kg (CUBAS; BAPTISTOTTE, 2007), enquanto que o
comprimento curvilíneo de carapaça tem de 80 a 122 cm (SPOTILA, 2004). Possuem carapaça
enegrecida e plastrão branco quando filhotes. O plastrão tende a ficar amarelo cremoso ou rosa
e a carapaça marrom escuro ou claro quando juvenis enquanto que os adultos têm coloração
oliva ou verde-cinza. Diferem-se das demais tartarugas marinhas por possuírem um par de
placas pré-frontais, 4 placas laterais e 4 placas infra-marginais sem poros (WYNEKEN, 2001).
16
Figura 2 - Tartaruga verde, Chelonia mydas (wordpress.com, 2011)
Os oceanos tropicais e subtropicais servem de local para alimentação e nidificação desta
espécie (ENCALADA, et al., 1996; SPOTILA, 2004) sendo que as tartarugas juvenis tendem a
permanecer nestas áreas durante muitos anos. Já as juvenis encontradas em ambientes
temperados precisam retornar para as áreas subtropicais durante o inverno para não sofrerem
com as temperaturas baixas (MUSICK; LIMPUS, 1997). As tartarugas verdes são encontradas
desde os EUA até a América do Sul, habitando assim, o oceano Atlântico, além do Pacífico,
Mediterrâneo e parte do Índico (SPOTILA, 2004).
Após o nascimento, a Chelonia mydas assume uma fase pelágica (MUSICK; LIMPUS, 1997) e
onívora onde ela permanecerá em alto mar se alimentando de diferentes tipos de alimentos que
possam ser encontrado como algas, ctenophores e caramujos. Após atingirem fase juvenil que,
dependendo da região poderá ocorrer quando o indivíduo atingir 20 ou 25 cm de comprimento
de carapaça (SPOTILA, 2004), estas tartarugas migram para uma fase nerítica e
predominantemente herbívora onde permanecerão no litoral ou em recifes se alimentando de
capim marinho como, Thalassia testudinum, Syringodium, Halophila e Posidonia e, em menor
quantidade, as algas como as Chaetomorpha, Sargassum e Hypnea (BJORNDAL, 1980;
SPOTILA, 2004).
17
O crescimento lento e a maturidade sexual tardia da espécie Chelonia mydas podem ser
justificados pela sua alimentação pobre em proteína, concluindo assim que estas características
têm mais a ver com um fator nutricional que um fator genético, visto que tartarugas verdes em
cativeiro fornecidas uma dieta rica em proteína apresentaram um crescimento mais rápido e
conseqüentemente, atingiram a maturidade sexual mais precocemente (BJORNDAL, 1980;
SPOTILA, 2004). Assim, a maturidade sexual da Chelonia mydas sofre grandes oscilações,
podendo ser atingida dos 8 aos 15 anos ou mais em cativeiro (WOOD; WOOD, 1980) e aos 25
até os 40 anos de idade em vida livre, a depender assim da oferta e disponibilidade de alimento
(SPOTILA, 2004).
Deixando a fase juvenil, a tartaruga marinha entra em uma fase conhecida como pré-adulta ou
sub-adulta onde ocorrem algumas mudanças reprodutivas como uma transição de um ciclo
andrógeno relacionada à temperatura para um novo ciclo relacionado ao fotoperiodo (OWENS,
1997). Já sexualmente maduras, as fêmeas fazem até sete posturas em uma mesma temporada
reprodutiva sendo que cada ninho poderá conter uma média de 110 ovos. O intervalo entre cada
postura varia de 12 a 14 dias, sendo que o intervalo entre as épocas de nidificação pode ocorrer
após 4 a 6 anos. Tem sido comprovado através de estudos genéticos que as fêmeas de C. mydas
tendem a realizar a desova no mesmo local de seu nascimento (SPOTILA, 2004).
2.2 DETERMINAÇÃO SEXUAL DEPENDENTE DA TEMPERATURA
Em diversos répteis, incluindo as tartarugas marinhas, a determinação sexual é dependente da
temperatura de incubação. Em relação às tartarugas marinhas, temperaturas mais baixas
produzem um maior numero de machos enquanto que temperaturas mais altas tendem a
produzir mais fêmeas (WIBBELS et al., 1987; GEORGES; LIMPUS; STOUTJESDIJK, 1994;
OWENS, 1997; WIBBELS, 2003; CUBAS; BAPTISTOTTE, 2007).
Segundo Desvages, Girondont e Pieau (1993), um elemento importante durante a fase
embrionária para a diferenciação sexual é o gene P-450. Este gene seria termossensível e
produz uma enzima conhecida como aromatase, que por sua vez age na gônada convertendo
18
substrato de esteróide andrógeno em estrógeno que por sua vez, inicia o desenvolvimento de
uma gônada feminina. Caso não haja essa variação abrupta de temperatura, não há produção de
aromatase levando ao desenvolvimento de uma gônada masculina.
Dentro da determinação sexual das tartarugas marinhas, existe uma temperatura capaz de
produzir uma proporção sexual de 1:1. Esta temperatura é denominada de temperatura pivotal e
pode variar entre e dentro de uma mesma espécie (WIBBELS, 2003). Acredita se que é
possível esperar uma diversidade na proporção sexual de diferentes populações devido à
variedade na relação entre a temperatura pivotal e a temperatura da praia (MROSOVSKY,
1994).
Apesar das variações na temperatura pivotal entre as espécies, Mrosovsky (1994) e Wibbels
(2003) encontraram uma temperatura pivotal comum para todas as espécies de tartarugas
marinhas sendo o mesmo em torno de 29°C. Já Morreale e outros (1982) encontrou que, para
Chelonia mydas,, temperaturas a baixo de 28°C produziriam em torno de 90 a 100% machos,
temperaturas entre 28,5°C e 30,2°C produziriam maior numero de fêmeas enquanto que
temperaturas acima de 30,5°C teriam 94 a 100% de produção de fêmeas.
A formação do sexo dos embriões de tartarugas marinhas independe da temperatura constante
do ninho e sim de um período conhecido como periodo termossensivel que ocorre durante o
terço médio de incubação. É nesse período que ocorrerá a formação sexual dos embriões
(YNTEMA; MROSOVSKY, 1980; STANDORA; SPOTILA, 1985).
Segundo Mrosovsky e Yntema (1980), a temperatura do ninho tende a aumentar devido ao
calor metabólico produzido pelo desenvolvimento dos embriões. Para que este calor metabólico
seja capaz de interferir na produção de machos e fêmeas, é necessário que o mesmo aumente
em pelo menos 1°C durante o terço médio de incubação, ou seja, durante o período
termossensível.
19
2.3 TESTOSTERONA
A testosterona é um hormônio esteróide composto por 19 carbonos (C), tendo dois grupos
metílicos no C-3 e C-10, um grupo cetônico no C-3, uma dupla ligação entre C-4 e C-5 e um
grupo hidroxílico no C-17 (FRIEDEN; LIPNER, 1975, apud LEITE, 2002).
Figura 3 - Cadeia carbônica da testosterona (FRIEDEN; LIPNER, 1975, apud LEITE, 2002)
Há produção deste hormônio nas tartarugas marinhas não só pelas gônadas de machos e
fêmeas, mas também, em menor quantidade, pelas glândulas adrenais (JESSOP et al., 2004).
Estudos endócrinos em tartarugas marinhas de cativeiro diferem-se das de vida livre devido a
fatores como alimentação, onde tartarugas de cativeiro possuem uma oferta maior e constante
de alimento, migração, onde em cativeiro, não há ocorrência de tal comportamento, e mudanças
térmicas, pois tartarugas marinhas de cativeiro possuem condições térmicas constantes. Esses
fatores podem alterar ciclos endócrinos e assim, não servindo de resultados comparáveis com
os encontrados em tartarugas de vida livre (WIBBELS; OWENS; AMOSS, 1987).
A produção de testosterona em tartarugas marinhas juvenis tem se mostrado extremamente
variável, ocorrendo queda na sua produção quando há aumento de cortisol circulante, como em
casos de estresse por captura, ou estresse crônico como inanição ou doenças (JESSOP et al.,
2004) ou ainda quando o animal se encontra em determinado período do ano com temperaturas
aquáticas e ambientais mais baixas (OWENS, 1997).
Tartarugas marinhas juvenis e pré-adultos tendem a produzir mais testosterona com o aumento
de idade (OWENS, 1997), e no início da puberdade, os testículos aumentam significativamente
a secreção de testosterona (WIBBELS, 2003). Durante essa fase, a testosterona estimula o
20
desenvolvimento de algumas características sexuais secundárias como o crescimento e
curvatura das garras nas nadadeiras peitorais, usadas para segurar a fêmea durante a cópula
(OWENS, 1997), um aumento no comprimento e espessura da cauda e o amolecimento do
plastrão para melhor encaixar a fêmea durante a cópula (HAMANN; LIMPUS; OWENS,
2003).
Um estudo realizado por Licht e outros (1980, apud WHITTIER; CORRIE; LIMPUS, 1997)
com Chlonia mydas fêmeas revelou um aumento tanto de testosterona quanto de progesterona
durante a temporada de reprodução, sugerindo assim que a testosterona poderá ter participação
importante nas características comportamentais durante o cortejo e acasalamento desta espécie.
Por ser poligâmica, a Chelonia mydas macho apresenta um nível de testosterona circulante
menor que os animais monogâmicos durante a fase reprodutiva devido à ausência ou
infrequencia de comportamento agressivo entre os machos e a necessidade em demarcar seu
território. O mesmo irá apresentar um aumento de testosterona durante a cópula, porém, esse
aumento ainda não será maior que o aumento apresentado por animais monogâmicos (JESSOP
et al., 1999).
Em fêmeas iniciando o ciclo reprodutivo, há um aumento tanto em testosterona quanto em
estrógeno. A migração para áreas de reprodução só iniciará quando houver queda significativa
na produção de estrógeno enquanto que a testosterona atingirá seu máximo durante a
temporada (HAMANN; LIMPUS; OWENS, 2003). Já durante o período de nidificação, a
concentração de testosterona tende a decrescer de acordo com os episódios progressivos de
ovipostura em uma mesma temporada (WHITTIER; CORRIE; LIMPUS, 1997).
Devido às possíveis alterações causadas pelo estresse de captura e à sua sensibilidade térmica, é
sempre recomendado fazer a coleta de sangue em tartarugas marinhas para dosagem de
testosterona o mais rápido possível, de preferência, até 15 minutos após sua captura a fim de
evitar tais alterações (OWENS, 1997).
21
2.4 PROPORÇÃO SEXUAL
Um dos métodos para se obter dados sobre o status evolutivo e reprodutivo de Chelonia mydas
é através da determinação da proporção sexual em um grupo, que tem tanto uma importância
ecológica quanto conservacionista (WIBBELS et al., 1993).
Estudos relacionados à proporção sexual natural em tartarugas marinhas tem sido de grande
interesse visto o descobrimento comum de diversas populações compostos predominantemente
por fêmeas aliado a preocupação dos efeitos possíveis que podem ocorrer devido às mudanças
climáticas globais, podendo favorecer ainda mais o surgimento de tartarugas marinhas fêmeas.
Além do mais, conhecer a proporção sexual natural de um grupo de tartarugas marinhas pode
ajudar a desmascarar dados sobre o tamanho real de uma população visto que eventualmente,
um grupo poderá sofrer com a predominância de um sexo (KAMEL; MROSOVSKY, 2006).
Uma questão importante que deve ser levada em consideração ao estudar a proporção sexual
em tartarugas marinhas é se há possibilidade de haver mortes referentes ao tipo de sexo do
animal, pois isto levaria a uma proporção sexual dinâmica para cada faixa etária. Exemplo
disso são as fêmeas que, durante a fase reprodutiva, são mais suscetíveis a mortalidade, pois,
durante a nidificação, elas sofrem um gasto energético maior e ficam mais expostas a predação.
Outro exemplo são os filhotes que também podem sofrer mortalidade referente ao sexo visto
que os indivíduos que eclodem no inicio da temporada podem sofrer maior mortalidade que
aqueles que eclodem no final devido à fatores como disponibilidade de alimento e condições da
água (WIBBELS et al., 1987; WIBBELS, 2003).
Como o sexo das tartarugas marinhas é dependente da temperatura, a definição da proporção
sexual torna-se particularmente importante a esta espécie, pois auxilia tanto na tentativa de
explicar a importância biológica deste processo em termos evolucionários quanto na modulação
populacional destes animais (OWENS, 1997) além de determinar seu crescimento populacional
(DELGADO; CANARIO; DELLINGER, 2010). Para Magnuson e outros (1990, apud
BOLTEN et al., 1992), consideram o estudo da proporção sexual em grupos de tartarugas
marinhas de vida livre como uma prioridade na conservação destes animais.
22
Com o aquecimento global, é possível que haja alterações drásticas na produção de machos e
fêmeas nos ninhos de tartarugas marinhas, possivelmente tornando-se necessário a manipulação
dos ovos, pelo homem, para evitar a produção de apenas um sexo (MROSOVSKY, 1994). Para
isto, é de extrema importância um estudo prévio sobre a proporção sexual natural de cada
espécie e seu efeito no sucesso reprodutivo e evolutivo das tartarugas marinhas evitando assim,
gerar um efeito negativo na recuperação da população destes animais (WIBBELS, 2003).
Assim, pode ser dito que a maioria das manipulações humanas de ovos de tartarugas marinhas
têm o potencial de alterar a proporção sexual dos filhotes produzidos (GODFREY; BARRETO;
MROSOVSKY, 1997).
Além do aquecimento global, outro fator que pode alterar a proporção sexual das tartarugas
marinhas é o desmatamento da vegetação litorânea. Um estudo realizado por Kamel e
Mrosovsky (2006) concluiu que a temperatura dos ninhos encontrados em meios vegetativos
era 2°C a menos que os encontrados em regiões apenas com areia e radiação solar direta o que
resultava em ninhos com maior tempo de incubação e com uma proporção maior de machos do
que de fêmeas. Alem disso, foi visto que 91,4% das tartarugas fêmeas optavam por realizar
ovipostura nas regiões com vegetação enquanto apenas 8,6% fizeram seus ninhos em regiões
sem vegetação. Outro fator visto foi que a temperatura em ninhos localizados em áreas com
palmeiras era a mesma que a temperatura encontrada em áreas sem vegetação, levando a
conclusão que a sombra gerada pelas palmeiras é insuficiente para auxiliar na produção de
machos. Isso torna a preservação da mata litorânea um fator importante na proporção sexual
das tartarugas marinhas, pois preservando a vegetação, estaria preservando diretamente o
habitat que favorece uma produção equilibrada de machos e fêmeas em diferentes ninhos de
tartarugas marinhas.
Por serem listados como animais ameaçados de extinção, muitos programas de manejo e
conservação, como a criação em cativeiro ou incubação artificial dos ovos, são criados
mundialmente na tentativa de aumentar o numero de tartarugas marinhas que atingem a
maturidade sexual, porém, estes mesmos programas podem alterar a proporção sexual de uma
população de tartarugas marinhas e, consequentemente o sucesso reprodutivo do mesmo
(WIBBELS et al.,1987). Um exemplo da manipulação de ovos de tartarugas marinhas com
23
intenções conservacionistas foi a utilização de caixas de isopor na tentativa de proteger e
aumentar o numero de filhotes eclodidos por ninho. Por ter uma temperatura mais baixa que da
areia (1 a 3°C menor), a caixa de isopor favorecia o nascimento de machos. Muitas vezes esse
favorecimento chegava a ser 100% do ninho, o que resultaria em problemas reprodutivos para a
espécie futuramente, surgindo assim a necessidade de estudos da proporção sexual natural das
tartarugas marinhas (MROSOVSKY; YNTEMA, 1980).
Assim, para que seja possível reconhecer quando uma proporção sexual sofreu alteração, é
necessário que saiba primeiramente a proporção sexual natural daquele grupo de tartarugas
marinhas (GODFREY; BARRETO; MROSOVSKY, 1997).
2.5 MÉTODOS DE SEXAGEM DE ACORDO COM A FAIXA ETÁRIA
Existem diversas metodologias para a identificação sexual de tartarugas marinhas sendo que a
escolha do método esta relacionado à faixa etária do animal (CASALE et al., 2006).
2.5.1 Sexagem em ovos e filhotes de tartarugas marinhas
Uma forma segura e definitiva de determinar o sexo de filhotes de tartarugas marinhas é através
da dissecação
e avaliação histopatológica das
gônadas
(GODFREY; BARRETO;
MROSOVSKY, 1997; WIBBELS, 2003) que possuem características sexo-especificas, sendo
que a gônada das fêmeas possui córtex bem desenvolvido e região medular pobremente
organizada enquanto que a gônada do macho possui região cortical pouco definida e região
medular bem organizada. O inconveniente deste método é o sacrifício dos filhotes a serem
estudados, surgindo assim, a necessidade de obter métodos não invasivos (WIBBELS, 2003).
Assim, devido às dificuldades em determinar o sexo de filhotes associado ao dilema
conservacionista em relação ao sacrifício destes animais para estudos de proporção sexual,
tornou se necessário a adoção de métodos indiretos que sugerissem o sexo de filhotes de
tartarugas marinhas (OWENS, 1997).
24
Um destes métodos que sugere a proporção sexual de tartarugas marinhas é a mensuração
diária da temperatura média dos ninhos (GODFREY; BARRETO; MROSOVSKY, 1997;
WIBBELS, 2003). Para isto, é necessário que a temperatura pivotal e o método utilizado sejam
conhecidos, pois, existe uma temperatura pivotal especifica para cada espécie e uma variedade
de metodologias que possam ser utilizadas (WIBBELS, 2003). Variações podem ocorrer ao
utilizar a temperatura do ninho para determinar a proporção sexual como, por exemplo, a
localização do ninho onde, ninhos próximos à água ou vegetação tendem a ter uma temperatura
mais baixa enquanto que os ninhos com radiação solar direta tendem a ter temperaturas mais
altas (GODFREY; BARRETO; MROSOVSKY, 1997; WIBBELS, 2003), a temporada em que
os dados foram coletados, podendo haver variações anuais (a depender de fatores como
temperatura e hora de nidificação) (WIBBELS, 2003), e as alterações de temperatura causadas
pelo calor metabólico, que é produzido pelo próprio ovo (CARR; HIRTH, 1961, apud
GODFREY; BARRETO; MROSOVSKY, 1997).
Portanto, segundo Wibbels e outros (1987), para determinar a proporção sexual em ninhos de
tartarugas marinhas, é de extrema importância coletar dados específicos como a densidade do
ninho relacionada a época do ano e localização do ninho na praia.
Outro método não invasivo sugerido por Gross e outros (1995) para a identificação do sexo de
filhotes de tartarugas marinhas é a dosagem de metabólitos de testosterona e estradiol presente
no liquido corioalantóico e aminiotico encontrados nos ovos após eclosão dos filhotes. Apesar
de ser um método confiável e simples de ser aplicado, seus resultados não representariam uma
proporção sexual real visto que um pequeno numero de filhotes sobreviverão até a fase juvenil
e adulta.
2.5.2 Sexagem em tartarugas marinhas juvenis
A determinação do sexo de tartarugas marinhas imaturas (juvenis e subadultos) é difícil, pois
estes não apresentam dimorfismo sexual externo (OWENS, 1997), sendo assim, necessário a
implementação de técnicas para sexagem destes animais. Foram testados cinco metodologias na
tentativa de identificar o sexo de tartarugas marinhas:
25
Um dos métodos testados foi a tentativa de identificação do cariótipo, mas, segundo Bickham e
outros (1980, apud STANDORA; SPOTILA, 1985), não foi possível pois não foram
encontrados cromossomos sexuais heteromórficos nas células de tartarugas marinhas.
Outra técnica, baseada na identificação de antígenos H-Y, foi possível através de um ensaio de
citotoxidade de antígenos H-Y realizado e publicado por Wellins (1987, apud WIBBELS;
OWENS; LIMPUS, 2000) onde foi encontrada uma concentração maior destes antígenos em
células sanguíneas de machos que nas de fêmeas, porem, apesar dos resultados, existem várias
desvantagens, pois necessita de uma série de procedimentos bioquímicos, visualização direta de
aproximadamente 200 células por amostra o que o torna trabalhoso, além de uma validação
rigorosa e com maior número amostral. Outra desvantagem é a necessidade em utilizar sangue
fresco, pois amostras com mais de 24 horas de coleta sofrem modificações.
DNA “fingerprinting” permitiu a obtenção de fragmentos específicos para machos de C. mydas
e L. kempi utilizadas no teste. Com isso, foi concluído por Demas e outros (1990, apud
WIBBELS; OWENS; LIMPUS, 2000) a possibilidade de utilizar este método para sexagem de
tartarugas marinhas, porém, uma validação rigorosa do mesmo seria necessário. Apesar dos
resultados, este teste é extremamente trabalhoso, devido à necessidade em extrair o DNA de
cada amostra, além de outros procedimentos, o que o torna desfavorável quando estiver
utilizando um grande número amostral.
Uma forma precisa e definitiva de determinar o sexo de tartarugas marinhas jovens é através de
videolaparoscopia abdominal onde será visualizada a gônada de cada animal. As gônadas das
tartarugas marinhas são órgãos pares localizadas na cavidade celomática, caudal aos pulmões e
aderidas ao peritônio ficando sobrepostos aos rins. Macroscopicamente, as gônadas dos machos
possuem aspecto liso com coloração variando do branco pálido ao laranja, geralmente irrigado
por um sistema capilar menos desenvolvido enquanto que as gônadas femininas possuem
aspecto granular com folículos parcialmente desenvolvidos (DELGADO; CANARIO;
DELLINGER, 2010). Apesar de ser um método confiável, existem dificuldades em se realizar
o mesmo a campo, pois além de consumir grande período de tempo, é extremamente invasivo e
26
requer treinamento cirúrgico prévio (WIBBELS et al., 1987; WITZELL et al., 2005) o que o
torna desaconselhado para grandes grupos de tartarugas marinhas.
Figura 4 - Sistema urogenital da tartaruga marinha (WYNEKEN, 2001).
Figura 5 – Imagem obtida das gônadas de tartarugas marinhas da espécie Caretta caretta, através de
videolaparoscopia onde o ovário tem aspecto granular devido a presença de folículos ovarianos (A) e o
testículo com aspecto liso (B) (DELGADO; CANÁRIO; DELLINGER, 2010)
27
Segundo Wibbels e outros (1987), o método mais utilizado para definição sexual em tartarugas
marinhas jovens é a dosagem de testosterona sérica através de Radioimmunoensaio (RIA) por
ser preciso e confiável alem de prático, sendo um método menos invasivo que a laparoscopia
abdominal e de fácil realização, pois consiste apenas na coleta de sangue a campo, o que
consequentemente, permitiria uma maior amostragem em menor espaço de tempo (OWENS et
al., 1978). É preciso levar algumas características em consideração ao utilizar este método para
determinação sexual em tartarugas marinhas como, por exemplo, a estação do ano e o nível de
estresse que o animal em questão se encontra, pois, os níveis de testosterona tendem a diminuir
em temperaturas mais baixas e quando há altos níveis de cortisol circulante (OWENS, 1997).
Além da praticidade, este teste oferece outras vantagens como a possibilidade de se testar
grandes números de tartarugas marinhas utilizando apenas um kit de RIA e também a
possibilidade em armazenar amostras a -20°C ou menos por tempo prolongado tendo mínima
ou nenhuma degradação devido a estabilidade da testosterona (WIBBELS; OWENS; LIMPUS,
2000).
2.5.3 Sexagem de tartarugas marinhas adultas
Ao contrário dos juvenis, os adultos possuem dimorfismo sexual onde os machos desenvolvem
uma musculatura da cauda maior durante a puberdade. Deve-se ter cautela em adotar esta
característica para determinar o sexo de tartarugas marinhas, pois há possibilidade de se
confundir machos juvenis grandes com fêmeas adultas pequenas (WIBBELS, 2003). Os testes
utilizados para sexagem de tartarugas marinhas adultas são os mesmos utilizados em juvenis.
Existe dificuldade ao estudar a proporção sexual em tartarugas marinhas adultas (WIBBELS et
al., 1987), pois estes animais exibem características sexo-dependente como, por exemplo,
comportamento sexual e migração sexo-dependente, o que geraria uma proporção sexual com
erro sistemático (DIEZ; VAN DAM, 2003). A fim de evitar isso, a dosagem de testosterona
nesta faixa etária deve ser realizada nos animais encontrados em áreas de alimentação durante
um período não migratório (WIBBELS, 2003).
28
Devido às dificuldades em definir a proporção sexual em grupos de tartarugas marinhas
adultas, tem sido proposto utilizar juvenis, pois estes possuem pouco ou nenhum
comportamento relacionado ao sexo, portanto não haverá influência na probabilidade de
captura destes animais (MROSOVSKY; PROVANCHA, 1991; DIEZ; VAN DAM, 2003) e por
este grupo representar a reunião de grupos diferentes de filhotes de tartarugas marinhas ao
longo de vários anos (WIBBELS, 2003).
2.6 RADIOIMUNOENSAIO
A técnica de radioiminoensaio, considerada umas das mais sensíveis para detecção de
anticorpos ou antígenos, foi desenvolvida por dois endocrinologistas na tentativa de determinar
os níveis de complexos insulina-antiinsulina em diabéticos (KINDT; GOLDSBY; OSBORNE,
2008). Hoje, ela é utilizada para medir níveis de hormônios no sangue e fluidos (JANEWAY,
2008), além de concentrações de proteínas séricas, drogas e vitaminas.
Sua técnica consiste na ligação competitiva entre um antígeno radiomarcado, sendo o marcador
mais utilizado o Iodo125 (I125), e um antígeno não-marcado com um anticorpo de alta afinidade.
O primeiro passo da técnica, é a construção de uma curva padrão através da adição de níveis
variáveis de uma preparação padrão conhecida, não marcada. Assim, o ensaio poderá medir a
quantidade de antígenos em amostras desconhecidas através da comparação com a curva
padrão. Amostras como soro, plasma, e outros fluidos corporais são considerados a amostra
teste, onde contem o antígeno não marcado. Este será adicionado a mistura do ensaio que
contêm o antígeno marcado e o anticorpo especifico, onde um competirá com o outro pelos
sítios de ligação (anticorpos). Para separar os complexos formados entre antígeno e anticorpo, a
amostra é precipitada, sendo neste precipitado o local onde será medido a radioatividade em um
contador especifico. A quantidade de antígeno marcado não ligado será obtido através da
subtração do valor da quantidade total de antígeno marcado adicionada a amostra. Tipos de
radioimunoensaio de fase sólida foram desenvolvidos na tentativa de facilitar a separação dos
complexos antígeno-anticorpo do antígeno não ligado (KINDT; GOLDSBY; OSBORNE,
2008).
29
O teste utilizado no presente trabalho consiste em uma técnica de Radioimunoensaio de fase
sólida. Recebe denominação de “Coat-a-Count” devido à película de anticorpos encontrada no
fundo dos tubos de ensaio. O Iodo125 (I125) é o elemento traçador que irá marcar o antígeno
dentro da amostra. O anticorpo e o antígeno marcado irão competir pelos mesmos sítios de
ligação, portanto, os resultados serão inversamente proporcionais: quanto maior a quantidade
de antígeno marcado com iodo estiver ligada nos sítios, menor quantidade de testosterona
estará presente na amostra.
Variações nas técnicas de radioimunoensaio devem ser levadas em consideração quando
comparações entre estudos hormonais forem feitos (GREGORY et al., 1996).
3 OBJETIVO
O presente trabalho teve como objetivo determinar as concentrações de testosterona plasmática
em tartarugas marinhas juvenis da espécie Chelonia mydas encontradas no efluente da
siderúrgica industrial da ArcelorMittal Tubarão através da dosagem do hormônio esteroidal
testosterona, utilizando kits comerciais para radioimunoensaio.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ÁREA DE ESTUDO
A coleta de amostras foi realizada na companhia siderúrgica ArcelorMittal Tubarão, localizado
a 14 km ao norte da cidade de Vitória, no estado do Espírito Santo, Brasil. O local onde se
concentram as tartarugas marinhas se encontra na parte terminal do canal-efluente da
ArcelorMittal Tubarão (20°15’50’’S e 40°13’44’’W), tendo uma extensão de 290 m e cerca de
30 m de largura, com uma média de 2 m de profundidade. Após serem previamente tratados,
esgotos domésticos e industriais são lançados no canal pelo sistema de drenagem.
30
Outra característica da região é a temperatura elevada da água que é utilizada no resfriamento
das máquinas. Com isso, a água local acaba tendo em média, 7,9°C acima da temperatura do
mar, sendo que no ponto de captação a temperatura é em média 23,5°C, enquanto que efluente
final possui uma média de 31,4°C. Devido q estas características e a disponibilidade de
nutrientes, há um ambiente propício a multiplicação de algas, o que provavelmente leva as
tartarugas verdes a permanecerem nesta região para se alimentar (TOREZINI, et al., 2010
4.2 CAPTURA
O estudo foi realizado com um intervalo mínimo de sete dias entre as coletas durante os meses
de Janeiro a Junho. O método de captura que se mostrou mais eficiente nesta região foi através
do uso de tarrafa, podendo eventualmente haver captura manual. Após captura, o animal foi
contido fisicamente através da imobilização de suas nadadeiras peitorais para coleta de sangue
e biometria.
4.3 BIOMETRIA
Após contenção física, foram registrados de cada animal, as medidas de comprimento
curvilíneo da carapaça (CCC), largura curvilínea da carapaça (LCC) e peso. Os mesmos que
foram encontrados sem identificação tiveram a colocação de marcas de monelinconel (National
Band and Tag Co., USA) nas nadadeiras dianteiras, conforme metodologia padrão adotada pelo
Projeto ICM-Bio/IBAMA (MARCOVALDI; MARCOVALDI, 1999).
4.4 COLETA DE AMOSTRAS DE SANGUE
A fim de evitar possíveis variações causadas pelo estresse, priorizava-se a coleta de sangue
imediatamente após a captura da tartaruga marinha. Após assepsia da região cervical com
álcool iodado, foi coletado 4 ml de sangue do seio venoso cervical (OWENS; RUIZ, 1980 apud
SANTOS, 2005) de cada animal através de material descartável sendo, seringas de 5 ml e
agulhas 25x7 e repassado para tubos de ensaio contendo heparina, o anticoagulante utilizado
em pesquisas com tartarugas marinhas para a obtenção de plasma. Este sangue armazenado em
bolsas térmicas com gelo até centrifugação. O tempo entre a coleta e a centrifugação não
31
ultrapassou três horas. As amostras foram centrifugadas à 3500 rpm/min durante 10 minutos e
posteriormente, o plasma separado com o uso de micropipetas e armazenados a -20 °C em
criotubos de 2 ml até analise laboratorial.
4.5 ANÁLISE HORMONAL
As análises laboratoriais foram realizadas em Setembro de 2010 no Laboratório de Dosagens
Hormonais do Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo (LDH-VRA-FMVZ-USP) através da utilização de kits
comerciais para dosagem de testosterona por radioimunoensaio (Coat-a-Count, DPC, Los
Angeles, CA, USA).
Para a realização do radioimunoensaio, as amostras foram descongeladas a temperatura
ambiente e numeradas para identificação. As amostras foram subdivididas através de pipetas de
50µl em tubos de ensaio em duplicata. Foi adicionado 1 ml de Iodo125 em cada tubo e estes
colocados em banho maria durante três horas, possibilitando a decantação do material e
formação de complexos antígeno-anticorpo. Após este tempo, os tubos de ensaio contendo as
amostras foram colocados em uma grade de esponja, a parte liquida das amostras, chamada de
dejeto, foi descartada em uma pia própria e os tubos virados com a abertura do tubo de ensaio
para baixo sobre papel toalha, a fim de garantir que todo o dejeto fosse desprezado, preparando
assim as amostras para análise. Os tubos foram então colocados no equipamento Cobra Autogamma Packard® para análise, obtendo assim os títulos de testosterona.
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores foram descritos por meio de medidas descritoras, como média e desvio padrão,
tabelas e gráficos. Para determinação dos valores de referência foi determinada a faixa
compreendida entre o percentil 2,5 e 97,5. A comparação entre os níveis de testosterona quando
houve captura do mesmo animal em dois momentos distintos, foi feita apartir do teste t
pareado. A comparação entre machos e fêmeas foi feita pelo teste da Binomial. As diversas
32
análises foram realizadas utilizando o programa SPSS15.0® e o nível de significância adotada
foi de 5%.
5 RESULTADOS
O peso encontrado para Chelonia mydas variou entre 2,6 a 20,2 kg (6,8 ± 2,9 kg). O
comprimento curvilíneo de carapaça (CCC) obteve valor mínimo de 27,6 cm enquanto que o
maior foi de 53,4 cm (38,4 ± 5,09 cm). Já o valor mínimo encontrado para a largura curvilínea
de carapaça foi de 26,1 cm e o maior de 49,7 cm (34,6 ± 4,6 cm). Os demais valores estão
descritos na Tabela 1.
33
O coeficiente de variação inter-ensaio foi de 4,48 a 7,16%. Os mesmos valores foram obtidos
para o coeficiente de variação intra-ensaio. A sensibilidade do teste foi de 93% (0,98 ng/dl), a
capacidade de ligação foi de 38% e ligação não especifica foi de 0,57%. Seus valores estão
descritos na Tabela 2. Para o cálculo de coeficiente de variação, foram utilizados dois
controles, um de valor baixo e outro com concentração mais alta. Estes foram colocados no
início e no final de cada ensaio. A resposta obtida significa que o tempo em que o ensaio
ocorreu foi satisfatório, ou seja, que os dados gerados são confiáveis e não variaram acima de
10%.
Foi possível capturar 67 animais, todos em boas condições corporais à inspeção. Destes, 14
animais foram capturados mais de uma vez, o que resultou em 31 amostras provenientes de
animais repetidos. Alem destas amostras, três foram fornecidas pelo Projeto TAMAR/ICMBio,
completando então 87 amostras. As amostras fornecidas pelo Projeto TAMAR/ICMBio foram
provenientes de Chelonia mydas, juvenis, com fibropapilomas, que foram capturadas em 2009.
Estes se encontravam em estresse crônico vindo a óbito posteriormente onde foi possível
realizar necropsia e visualização direta das gônadas onde foi possível classificar um como
macho e duas como fêmeas. Os três animais obtiveram níveis de testosterona abaixo de 0,98
ng/dl.
34
Das 87 amostras coletadas, 76 amostras apresentaram títulos de testosterona abaixo de 0,98
ng/dl enquanto que nas demais amostras os valores de testosterona ficaram entre 3,13 ng/dl e
113, 16 ng/dl.
De acordo com os resultados obtidos pelo teste da binomial, onde o valor de P foi menor de
0,05, existe uma diferença significativa entre a proporção de machos e fêmeas. Estes resultados
estão descritos na Tabela 3.
Tabela 3 – Dados comparativos entre o número de fêmeas com o número de machos
através do teste da binomial.
Das 31 amostras obtidas dos animais capturados mais de uma vez, apenas três tiveram valores
diferenciados. Para confirmar que não houve diferença entre as duas coletas, foi feito um teste t
pareado onde pôde ser observado que p obteve valor maior que 0,05, ou seja, não houve
diferença significativa estatisticamente no nível de 5% de significância. Os resultados estão
descritos na Tabela 4.
Tabela 4 – Resultados do teste t pareado para as
amostras obtidas em dois momentos diferentes de
um mesmo animal.
35
6 DISCUSSÃO
Visto que o menor tamanho encontrado para o comprimento curvilíneo de carapaça em
Chelonia mydas adulta foi de 80 cm (BALAZS; FORSYTH; KAM, 1987, apud WIBBELS et
al., 1993), os animais capturados para o presente trabalho podem ser todos classificados como
juvenis pois o maior comprimento encontrado foi de 53,4 cm.
Devido à diversidade encontrada no tamanho das tartarugas marinhas capturadas para o
presente trabalho, deve ser levada em consideração a ocorrência de uma condensação de
diversos grupos de tartarugas eclodidas de ninhos diferentes em tempos distintos (WIBBELS et
al., 1993). Assim, pode ser dito que o resultado encontrado para a proporção sexual do grupo de
tartarugas verdes encontradas no efluente final da companhia siderúrgica ArcelorMittal é, na
verdade, a união da proporção sexual de diversos filhotes recém eclodidos de diferentes ninhos.
Foram comparados os valores de comprimento curvilíneo de carapaça com o peso através de
regressão linear, obtendo-se assim um valor de 0,93, ou seja, houve 93% de similaridade entre
os dois dados, o que significa que quanto maior o comprimento da tartaruga marinha, maior o
seu peso. Estes dados estão apresentados no gráfico 1:
36
comprimento curvilíneo carapaça (cm)
65
60
2
55
r =0.93
50
45
40
35
30
25
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
peso (kg)
Gráfico 1- Relação entre o comprimento curvilíneo de carapaça (CCC) e
o peso encontrado de Chelonia mydas capturas na companhia siderúrgica
ArcelorMittal, através de regressão linear (r2).
Também foi comparado através de regressão linear o nível de testosterona com o comprimento
curvilíneo de carapaça das tartarugas (descrito no gráfico 2). O resultado obtido foi de 0,01, ou
seja, 1% de similaridade, o que significa que o nível de testosterona não esta correlacionado
com o tamanho da tartaruga e vice-versa.
37
120
Testosterona (ng/dl)
100
80
2
r =0,01
60
40
20
0
-20
25
30
35
40
45
50
55
Comprimento curvilineo de carapaça (cm)
Gráfico 2- Relação entre o titulo de testosterona e o comprimento
curvilíneo de carapaça de Chelonia mydas capturadas na companhia
siderúrgica ArcelorMittal através de regressão linear (r2).
Para podermos comparar alguns resultados de diferentes pesquisadores em estudos similares ao
aqui apresentado há a necessidade de uma correção nos valores obtidos por tais pesquisadores,
pois segundo Lee e Owens (2005) foi encontrado um erro técnico no radioimunoensaio, devido
a um cálculo incorreto utilizado para obtenção de dosagem de testosterona no Owens Lab desde
1980, o que resultou em níveis hormonais muito abaixo do real. Para correção, os resultados
encontrados em alguns artigos publicados (BOLTEN et al., 1992; OWENS, 1997; OWENS;
MORRIS, 1985; PLOTKIN et al., 1995; ROSTAL et al., 1998; WIBBELS; OWENS; LIMPUS,
2001; WIBBELS; OWENS; AMOSS, 1987; WIBBELS et al., 1987; WIBBELS et al., 1993)
devem ser multiplicados por 10, obtendo-se assim, a titulação real de testosterona. Apesar do
erro, as proporções sexuais encontradas permanecem inalteradas (OWENS, comunic. pessoal).
Os resultados encontrados no presente trabalho em nada sofreram com os erros encontrados em
38
trabalhos passados, porém, é um fator a ser considerado principalmente por motivos
comparativos.
Os resultados encontrados foram comparados aos resultados obtidos em uma pesquisa realizada
com Chelonia mydas juvenis encontradas no sul das Bahamas (BOLTEN et al., 1992). Os
autores relatam a captura de 120 tartarugas juvenis com comprimento curvilíneo de carapaça
(CCC) variando de 20 a 70 cm porém, não foi informado a largura curvilínea de carapaça
(LCC) e peso. De acordo com este trabalho, foram encontrados valores até 100 pg/ml (10
ng/dl) de testosterona para tartarugas fêmeas e acima de 200 pg/ml (20 ng/dl) para machos. As
tartarugas que obtiveram valores entre 10 e 20 ng/dl não puderam ser classificadas como
machos ou fêmeas, tendo assim seu sexo indeterminado. Os valores encontrados para
testosterona neste trabalho tiveram que ser multiplicados por 10, visto o erro relatado
anteriormente.
Existem alguns trabalhos de radioimunoensaio em Chelonia mydas juvenis (OWENS et al.,
1978; WIBBELS et al., 1993;) e em outras espécies e faixas etárias (WIBBELS; OWENS;
AMOSS, 1987; OWENS, 1997; BRAUN-MCNEILL et al., 2007) porém, o presente trabalho
foi comparado aos resultados de Bolten e outros (1992), por apresentarem algumas
características em comum como mesma espécie, faixa etária, e clima atmosférico e aquático
similares.
Das amostras obtidas neste trabalho, 79 apresentaram valores de testosterona abaixo de 10
ng/dl, 5 ficaram entre 10 e 20 ng/dl enquanto que três amostras tiveram resultados acima de 20
ng/dl. Assim, utilizando como referência os valores obtidos por Bolten e outros (1992), e
levando em consideração o fato de haver 17 amostras que são provenientes de animais
recapturados e três animais que já tiveram o sexo determinado através de necropsia, totalizando
assim 67 animais capturados no efluente final da companhia siderúrgica ArcelorMittal, foram
classificados como 61 fêmeas e 2 machos.
39
Apesar de não ter sido possível identificar o sexo de quatro animais (testosterona entre 10 e 20
ng/dl), a classificação destes em machos ou fêmeas levaria a pouca ou nenhuma alteração na
proporção sexual final da população em estudo.
120,00
110,00
Testosterona (ng/dl)
100,00
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Amostras
Testosterona (ng/ml)
Limite 1
Limite 2
Gráfico 3: Concentrações de testosterona (ng/dl) das amostras plasmáticas obtidas de
tartarugas verdes capturadas no efluente final da ArcelorMittal, Espírito Santo. Os valores
obtidos foram comparados com os de outra pesquisa. O limite 1 representa a concentração
máxima de testosterona para as fêmeas enquanto que o limite 2 representa a concentração
mínima de testosterona para os machos
Comparando o número de fêmeas com machos, foi possível chegar a uma proporção de
30.5F:1.00M, o que difere significativamente das proporções encontradas por algumas
pesquisas feitas com tartarugas juvenis. Bolten e outros (1992) encontraram uma proporção de
1.4F:1.0M no sul do Bahamas. Já Wibbels e outros (1993) encontraram uma proporção de
0.96F:1.0M no arquipélago havaiano. Em outras espécies, também juvenis, a proporção
também é bastante diferente. Wibbels e outros (1987) encontraram uma proporção de
1.94F:1.0M para a espécie Caretta caretta encontrada na costa atlântica dos Estados Unidos,
Braun-McNiell e outros (2007) encontraram também para Caretta caretta encontradas na
Carolina do Norte, Estados Unidos, uma proporção de 2.9F:1.0M.
40
A proporção encontrada no presente trabalho foi semelhante aos dados registrados nas
necropsias realizadas no estado do Espírito Santo em Chelonia mydas encontradas mortas ou
muito debilitadas que posteriormente vieram a óbito (BAPTISTOTTE, 2010, comunic.
pessoal).
Dos 14 animais recapturados, três tiveram valores diferenciados enquanto que os demais não
foram observados diferenças entre as duas coletas. Destes três animais que tiveram diferenças
entre as duas coletas, dois mantiveram sua classificação sexual enquanto que um teve
diminuição no nível de testosterona sendo classificado no primeiro momento como
indeterminado e posteriormente como fêmea. Isso pode ser explicado por alterações na amostra
como, por exemplo, quantidade amostral insuficiente ou presença de hemólise.
Apesar de uma das tartarugas que vieram a óbito ser identificada como macho, seu titulo de
testosterona foi abaixo da sensibilidade do teste (0,98 ng/dl), o que, pela determinação sexual
por testosterona, o classificaria como fêmea. Porem, esta redução de testosterona pode ser
atribuída ao estresse crônico que o animal apresentava devido a sua forma debilitada. Segundo
Gregory e outros. (1996), estresse crônico eleva os níveis de cortisol circulante o que gera uma
queda na produção de testosterona.
Um estudo realizado por Jessop e outros (2004) demonstrou que apesar de tartarugas marinhas
juvenis responderem ao estresse por captura através do aumento de cortisol circulante, não
houve queda na quantidade de testosterona sérica ate cinco horas após captura. Os autores
correlacionam isso ao fato dos locais responsáveis pela síntese de testosterona em tartarugas
marinhas juvenis serem ainda insensíveis aos efeitos inibitórios dos glicocorticóides. Assim,
descarta-se a possibilidade de haver alterações nos títulos de testosterona do presente trabalho
visto que a coleta de sangue para dosagem de testosterona foi priorizada, sendo feito assim,
imediatamente após captura das tartarugas marinhas.
Quando em temperaturas aquáticas abaixo de 20°C, as tartarugas marinhas juvenis machos
tendem a diminuir sua produção de testosterona, o que levaria a resultados de proporção sexual
falsos visto que estes indivíduos poderiam ter níveis de testosterona que os classificassem como
41
fêmeas (OWENS, 2010, comum. pessoal). Isso não é o caso das tartarugas verdes encontradas
no efluente visto que registros feitos de 2001 a 2006 constataram que a temperatura encontrada
nas águas ao redor do local de estudo teve variação entre 23,4 °C a 28,3 °C (SMITH et al.,
2008). Além disso, todos os animais capturados encontravam-se em boas condições corporais à
inspeção e com ausência de fibropapilomas o que também exclui o risco de queda na produção
de testosterona por estresse.
Acredita-se que, apesar da temperatura ser mais elevada no canal em relação ao mar, o mesmo
não deve ser um fator de estresse para a população de Chelonia mydas encontradas ali visto que
estes animais são conhecidos por selecionar cuidadosamente seu local para alimentação,
permanecendo apenas onde é tolerável (OWENS, 2011, comum. pessoal) e por possuírem livre
acesso ao efluente, acredita-se que os mesmos não permaneceriam no local caso o mesmo
infligisse qualquer resposta de estresse. Um trabalho realizado por Torezani e outros (2010)
encontrou que Chelonia mydas encontradas no efluente tendem a permanecer no local ou em
áreas ao redor do efluente por um curto período tempo, utilizando estes locais como áreas para
alimentação e crescimento durante um determinado período de suas vidas.
7 CONCLUSÃO
Concui-se através dos resultados obtidos que:
- Os níveis de testosterona encontrados foram de 0,98 a 113,16 ng/dl, onde comparando com
valores obtidos de outro trabalho (BOLTEN, et al., 1992), foi possível classificar 61 fêmeas, 2
machos e 4 indeterminados, o que resultou em uma proporção de 30,5F:1,0M;
- Torna-se necessário mais estudos sobre determinação sexual não apenas em juvenis mas em
todas as faixas etárias na tentativa de determinar as diferentes proporções sexuais de cada
população e espécie de tartarugas marinhas além da necessidade de estudos futuros sobre os
efeitos que a temperatura mais elevada do efluente na Companhia Siderurgica ArcelorMittal
possa ter sobre a fisiologia e taxas hormonais das tartarugas verdes encontradas ali.
42
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